RU2568979C2 - Интегрированные углеродные электродные чипы для электрического возбуждения хелатов лантанидов и способы анализа с их использованием - Google Patents
Интегрированные углеродные электродные чипы для электрического возбуждения хелатов лантанидов и способы анализа с их использованием Download PDFInfo
- Publication number
- RU2568979C2 RU2568979C2 RU2013102437/28A RU2013102437A RU2568979C2 RU 2568979 C2 RU2568979 C2 RU 2568979C2 RU 2013102437/28 A RU2013102437/28 A RU 2013102437/28A RU 2013102437 A RU2013102437 A RU 2013102437A RU 2568979 C2 RU2568979 C2 RU 2568979C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- electrodes
- carbon paste
- chip
- anode
- chelates
- Prior art date
Links
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 51
- 230000005284 excitation Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 7
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 title claims abstract description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title abstract description 16
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims abstract description 12
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003973 paint Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000007639 printing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 claims abstract 2
- 229940021013 electrolyte solution Drugs 0.000 claims abstract 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 150000001243 acetic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 claims 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011810 insulating material Substances 0.000 claims 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 claims 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000005611 electricity Effects 0.000 abstract 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 abstract 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 17
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 14
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 13
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 12
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 11
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 11
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 11
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- JLSZLCPJJYVGOC-UHFFFAOYSA-N NCC(C(CC(O)=O)=C(C=C1)C(C2=CC=CC=C2)=O)=C1O Chemical compound NCC(C(CC(O)=O)=C(C=C1)C(C2=CC=CC=C2)=O)=C1O JLSZLCPJJYVGOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 8
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000283726 Bison Species 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 239000002784 hot electron Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L peroxydisulfate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 4
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000005424 photoluminescence Methods 0.000 description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100526762 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) rpl-28 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000011111 cardboard Substances 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 2
- 239000011889 copper foil Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007772 electrode material Substances 0.000 description 2
- 238000005401 electroluminescence Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 2
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000007740 vapor deposition Methods 0.000 description 2
- HJIAMFHSAAEUKR-UHFFFAOYSA-N (2-hydroxyphenyl)-phenylmethanone Chemical compound OC1=CC=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 HJIAMFHSAAEUKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-difluorophenoxy)pyridin-3-amine Chemical compound NC1=CC=CN=C1OC1=CC=C(F)C=C1F LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FCJSHPDYVMKCHI-UHFFFAOYSA-N Benzoyl-Phenol Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)OC1=CC=CC=C1 FCJSHPDYVMKCHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical class C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRSFVGQMPYTGJY-GNSLJVCWSA-N Deprodone propionate Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)CC)[C@@]1(C)C[C@@H]2O DRSFVGQMPYTGJY-GNSLJVCWSA-N 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001024703 Homo sapiens Nck-associated protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100036946 Nck-associated protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N [(3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxyoxan-3-yl] acetate Chemical compound CC(=O)O[C@@H]1CO[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 1
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920003086 cellulose ether Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 229910021644 lanthanide ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000011527 multiparameter analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011088 parchment paper Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 239000001508 potassium citrate Substances 0.000 description 1
- 229960002635 potassium citrate Drugs 0.000 description 1
- QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K potassium citrate (anhydrous) Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011082 potassium citrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- ZXZKYYHTWHJHFT-UHFFFAOYSA-N quinoline-2,8-diol Chemical compound C1=CC(=O)NC2=C1C=CC=C2O ZXZKYYHTWHJHFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005258 radioactive decay Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002901 radioactive waste Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L sodium persulfate Substances [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- -1 terbium ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/66—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light electrically excited, e.g. electroluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Electrodes For Compound Or Non-Metal Manufacture (AREA)
- Electrolytic Production Of Metals (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способам анализа и устройствам, пригодным для детектирования электрохемилюминесценции. Изобретение применимо, в особенности, для быстрой количественной диагностики при децентрализованном анализе, когда требуются особенно дешевые материалы для электродов, ячейки, одноразовые диагностические чипы и кассеты. Устройство для электрического возбуждения хелатов лантаноидов в растворах электролитов выполнено в виде электрохимической ячейки, содержащей чип с двумя электродами с функцией анода и катода. При этом в качестве хелатов лантаноидов выбраны хелаты тербия Tb(III), а электроды выполнены из углеродистой пасты или металла с покрытием из углеродистой пасты, на изолирующем материале, по технологиям печати, распыления или нанесения серебряной краской рисунка, выполненного под покрытие его углеродистой пастой после подсушивания рисунка, с одновременным формированием катода и анода или части анода как верхнего слоя углеродистой пасты с удельным сопротивлением, преимущественно, менее 1000 Ом·см. Техническим результатом является обеспечение высокой амплитудой электрических импульсов, а также повышение чувствительности. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 8 ил.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к способам анализа и устройствам, пригодным для детектирования электрохемилюминесценции. Изобретение применимо, в особенности, для быстрой количественной диагностики при децентрализованном анализе, когда требуются особенно дешевые материалы для электродов, ячейки, одноразовые диагностические чипы и кассеты.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время существует настоятельная необходимость в быстрых, чувствительных и количественных технологиях диагностики. Такие технологии широко применимы в хозяйственном использовании, включая общественное здоровье, исследования, сельское хозяйство, охрана окружающей среды, ветеринарная медицина и отдельные отрасли промышленного производства. Повышение чувствительности, вымокая производительность, простота использования, надежность или снижение стоимости испытания являются факторами, которые, в случае реализации их в диагностических технологиях, могут найти применение в новых областях.
Очень высокая чувствительность может быть получена при использовании ряда диагностических приборов, но при высоких затратах. Ряд способов может быть сопоставим по цене, мало затратным, однако они не могут быть достаточно широко применимы в различных областях рынка. Технология, объединяющая требование высокой чувствительности с коммерческой осуществимостью и широким применением, в которой решены подобные требования, в будущем будет иметь важное место и большие возможности на рынке диагностики.
В настоящее время в приложениях диагностики используются различные методы анализа, т.е. радиоактивные метки, иммуносорбентный анализ с ферментной меткой, колориметрический анализ, и исследования, основанные на флуоресценции и хемилюминесценции, включая как анодную, так и электрохемилюминесценцию, индуцированную горячими электронами. Индуцированная горячими электронами электрохемилюминесценция (ЭХЛ) детально описана в патенте US 6251690 (Kulmala S., et al.). Каждый из этих методов имеет характерную совокупность уровня чувствительности, легкости использования, надежности, скорости и стоимости обслуживания, которые определяют положение на рынке. Различия в таких свойствах определяются физическими ограничениями методов. Например, недостатком многих приложений радиоактивного мечения является ослабление метки со временем в результате радиоактивного распада, а также исключительно высокая стоимость радиоактивных отходов как с точки зрения безопасности, так и с точки зрения окружающей среды. Применение многих чувствительных методик в децентрализованной диагностике ограничивается крайней сложностью испытаний и оборудования, поэтому измерения могут проводить только специалисты. Сложность измерений обычно прямо связана со стоимостью оборудования и/или испытания. Как пример, можно упомянуть, среди прочего, анодную электрохемилюминесценцию (АЭХЛ), которая стала коммерчески популярным методом исследования. Приборы, основанные на применении АЭХЛ, представляют собой лабораторных роботов со сложными особенностями использования, для которых требуются специальные знания; кроме того, процесс измерения включает неоднократные сложные этапы промывания и подготовки. Все упомянутые выше обстоятельства являются факторами, которые увеличивают стоимость измерений, увеличивают количество отходов и делают невозможным применить метод исследования к практическим нуждам децентрализованного анализа.
Коммерчески важные технологические приемы измерений основаны на идентификации и измерении аналитов в смесях с использованием так называемых маркировочных соединений. В измерениях, основанных на свойствах биологических молекул, таких как иммунологические исследования, измеряемый аналит (X) в смеси различных молекул может быть селективно присоединен к антителу в твердой фазе, а присоединенные молекулы могут быть измерены с помощью другого, также соединяющегося с (X) специфического антитела, снабженного маркером, т.е. помеченного подходящим маркирующим соединением. Примерами соединений-маркеров являются, но не ограничиваются ими, радиоактивные изотопы, ферменты, молекулы, которые поглощают свет, флуоресцируют или фосфоресцируют, хелаты некоторых металлов и т.д. Маркеры присоединяются к антителу посредством химической связи. Очищенное соединение (X) также можно маркировать и использовать для определения немаркированного (X) в неизвестном образце путем реакции сравнения. Методы измерения ДНК и РНК также основаны на селективности биологических свойств и их также можно измерять аналогичным образом. Ряд других химических и биохимических анализов можно выполнить таким же образом. В настоящее время все более желательно измерять одновременно несколько параметров от образца, чтобы снизить затраты и/или увеличить точность измерений. Одной из возможностей осуществить одновременное измерение является использование люминесцентных маркеров (флуоресцентных или фосфроресцентных) на разных длинах волн или имеющих различное время высвечивания. Разлиичные методы и стратегии измерений, которые могут быть использованы в иммунодиагностике, описаны в книге «Руководство по иммунному анализу» («The Immunoassay Handbook», ed. David Wild, Stockton Press Ltd., New York, 1994, с.1-618). Естественно, возможно измерить маркированные составы в растворах как таковые, т.е. анализируя только составы, когда они не использованы как маркеры.
Ранее было известно, что органические соединения и хелаты металлов, которые могут быть использованы в анализе в качестве соединений-маркеров, могут возбуждаться под действием света или электрохимически, так что может быть получена люминесценция, характерная для маркированных соединений. Однако, т.к. измеряемые концентрации очень малы, возникают специфические трудности. Использование флуоресценции может быть осложнено, помимо прочего, тиндалевским, рэлеевским или романовским рассеянием. При измерении биологических образцов после импульса возбуждения появляется, почти без ослабления, сильная, но короткоживущая флуоресценция подложки. В жидкой фазе используют в основном фосфоресценцию, только если ионы лантанидов используются с хелатами специально синтезированных органических молекул. Проблемой таких методик, основанных на долгоживушей фотолюминесценции маркированных соединений, является сложность и стоимость оборудования.
Вообще, особенными преимуществами ЭХЛ являются низкая стоимость электрического возбуждения и более простая структура (в сравнении с фотолюминесценцией), в которой не требуется сложной оптики возбуждения. Кроме того, можно избежать многих проблем фотолюминесценции, описанных выше. Обычная, так называемая анодная электохемилюминесценция, в которой используются электроды из инертных металлов, может быть получена на маркерах из органических люминофоров в неводных растворах с использованием относительно простого оборудования. Однако исследования биологических свойств, которые представляют основной коммерческий интерес, в большинстве случаев поводятся только в водных растворах. Образцы для исследований биологических свойств почти всегда представляют собой водные растворы, следовательно, измерительные приборы для маркеров должны работать в воде или, по меньшей мере, в мицеллярном водном растворе. Кроме того, хелаты лишь некоторых переходных металлов могут служить ЭХЛ-маркерами при анодной ЭХЛ в водных или мицеллярных водных растворах.
Поэтому с коммерческой точки зрения наиболее важным приложением анодной ЭХЛ в аналитической химии является технология, использующая производные хелатов Ru(bpy)3 2+ в качестве маркеров в мицеллярном водном растворе. Мицеллярные растворы всегда чувствительны к различным возмущающим факторам вследствие неконтролируемой сложности мицеллярного расновесия.
ЭХЛ, индуцированная горячими электронами, которая не зависит от мицелл, имеет, следовательно, значительные преимущества перед анодной ЭХЛ. Поэтому примеры для данного изобретения иллюстрируют, в основном, катодную ЭХЛ. Анодный метод также используется как в иммунном анализе, так и в исследованиях ДНК-гибридизации (Blackburn, G., et al., 1991, Clin.Chem. 37: 1534-1539; Kenten, J., et al. Clin.Chem. 33: 837-879). Этот метод коммерчески используется фирмой Roche Diagnostics. Лабораторный робот приводит в движение магнитные частицы, с помощью которых вещество-маркер для количественных измерений аналита переносится на позолоченный рабочий электрод, постоянно используемый для проведения иммунологических исследований и применений ДНК- и РНК-зондов (Massey; Richard J., et al. US 5746974; Leland; Jonathan K., et al. US 5705402). Повторная обработка магнитолатексных частиц во многих случаях затруднена, поэтому данный способ используют только для дорогостоящих лабораторных роботов (т.е. Elecsys 1010 и 2010), со сложным и точным устройством жидкостной обработки. Кроме того, постоянно работающий массивный золотой электрод нуждается в длительной очистке и предварительной обработке между последовательными анализами (Руководство по обслуживанию Elecsys, с.70).
Использование микрочастиц в электролюминесценции не обязательно оказывается оптимальным, так как в патенте US 5705402 показано, что возбуждение вещества-маркера происходит на поверхности микрочастицы, контактирующей с золотым электродом. Хотя микрочастицы малы (диаметр ок. 2800 нм), только очень малая часть поверхности сферической частицы может иметь контакт с электродом. Следовательно, только малая часть маркирующего вещества, переносимого микрочастицей, доступна для возбуждения. Рабочая эффективность далее уменьшается за счет плохой оптической прозрачности магнитного материала, содержащего частицы латекса, поэтому только часть фотонов может быть детектирована в направлении, противоположном оптически непрозрачному рабочему электроду. В этом направлении обычно располагают детектор в традиционных исследованиях. Обычная анодная ЭХЛ на основе традиционной электрохимии требует использования инертных металлов (т.е. платины или золота) или углерода в качестве рабочих электродов. Использование этих материалов для электродов ограничено, тем не менее, узким окном потенциала из-за пробоя воды (на аноде образуется кислород, на катоде - водород). Поэтому люминофоры, пригодные к использованию в качестве ЭХЛ-маркеров, не могут электрически возбуждаться обычным образом на этих традиционных инертных электродах, поскольку из-за ограниченного окна потенциала нельзя достичь достаточных потенциалов анода и катода, необходимых для реакций возбуждения. Также поэтому анодная ЭХЛ не может обеспечить одновременного возбуждения и/или обнаружить с разрешением во времени несколько различных маркеров, что необходимо для многопараметрического анализа. Анодная ЭХЛ подходит только для нужд очень больших централизованных лабораторий. Как результат крайней сложности и высокой стоимости измерительного прибора анодные прибор и метод не подходят в их известной форме для использования в сфере рынка децентрализованных анализов, т.е. по назначению врачей, в малых медицинских клиниках, или на дому у пациента.
В дополнение к обсуждавшимся выше проблемам, отдельным недостатком и для анодной ЭХЛ и катодной ЭХЛ при исследованиях биологических свойств является длительное время инкубирования, необходимое для достижения молекулами кинетического равновесия в реакции, что требуется для оптимальной точности анализа. Эта проблема может быть разрешена вполне удовлетворительно с помощью устройств с пористым диском (US 2009178924 (A1), Ala-Kleme, T. et al.) и проводником в качестве анода. Проблема электрохимии горячих электронов состоит в том, что неизвестен тип электрода, с помощью которого можно получить интегрированную на плоской поверхности систему анод/катод с одним и тем же материалом электродов и достичь, наконец, таких же хороших результатов как с оксидированным силиконом или катодами из алюминия. Проблема силикона и алюминия заключается в том, что чипы из интегрированных на плоской поверхности катода/анода, выполненные из этих материалов, не могут работать, поскольку маркеры могут возбуждаться лишь малым количеством первых импульсов возбуждения. После этого очень быстро формирующийся оксидный слой на аноде вскоре полностью перекроет прохождение тока через ячейку, а также во время формирования слоя оксида возникает твердотельная электролюминесценция высокой интенсивности (известная под названием гальванолюминесценция). Гальванолюминесценция, к сожалению, содержит также долгоживущие составляющие люминесценции, поэтому измерения электрохемилюминесценции с временным разрещением не могут быть использованы в случае хелатов лантанидов как маркеров. Можно уменьшить проблему путем защиты поверхности чипа с катодом/анодом из алюминия или силикона, но оказывается невозможным найти такой материал для электрода, который обеспечил бы успешное использование планарных чипов с катодом/анодом и возбуждением маркированных соединений в исследованиях биологических свойств.
В ходе создания чипа с катодом/анодом, в котором анодную часть чипа на стеклянном основании с электродом из алюминия предполагали покрыть углеродной пастой для предотвращения анодного окисления, к несчастью, и анодная, и катодная части были покрыты углеродной массой. Когда чипы были изготовлены, они были испытаны в измерениях, и к удивлению, Tb(III)-хелаты дали свет с высокой амплитудой электрических импульсов. Полагаем, что это было обусловлено электрохимией горячих электронов, даже при невозможности туннельной эмиссии в электродах из углерода и других проводников. Для сравнения мы попытались возбуждать также органические флуорофоры (8-гидрокси хинолон и 7-амино-4-метил кумарин), но ни одно из веществ не дало измеряемую ЭХЛ с электродами из углерода. Таким образом, возможно, мы обнаружили неизвестное прежде явление, связанное с электродами из углерода, которое подходит для электрического возбуждения хелатов тербия парой углеродных электродов. Фуллерены, углеродные нанотрубки и подобные образования в современных новых технологиях углерода были обнаружены только недавно, и химия углерода, возможно, таит множество еще неизвестных и неизученных областей. Описанное выше возбуждение может как-то быть обусловлено поверхностью электрода, находящегося в прямом контакте с ионами тербия, вместо возбуждения через лиганд. Можно также предположить, что газы, образующиеся на поверхности электродов (водород и кислород, особенно в их атомных формах), играют заметную роль в механизмах реакции. В любом случае, электрохемилюминесценция, представленная в данном изобретении, может быть эффективно использована в исследованиях биологических свойств, даже если механизмы реакции пока еще не ясны.
В соответствии с изобретением, можно изготавливать чипы с двумя электродами (электродом/электродом) - далее ЭЭ-чипы - для замены чипов с катодом/анодом. В ЭЭ-чипах не имеет значения, который из двух электродов на чипе используется как катод, а который как анод. Изготовление электродов из углеродной пасты методами печати, вероятно, является самым дешевым из возможных технологий производства электродов, вследствие чего данная инновация является прорывной с точки зрения одноразовых диагностических чипов на основе электрохемилюминесценции и кассет. Таким образом, высоко конкурентная технология электрохемилюминесценции (в сравнении с технологией электрохемилюминесценции, возбуждаемой горячими электронами) может быть осуществлена с использованием описанных в изобретении ЭЭ-чипов, которые значительно дешевле, чем чипы, используемые в катодной электрохемилюминесценции. Способы и устройства, которые делают это возможным, определены пунктами 1-10 патентной формулы.
Следует также заметить, что такая пара углеродных электродов, какая описана в данном изобретении, может быть изготовлена непосредственно на одной половине полимерной кассеты, после чего упомянутая половина сама по себе становится больше, чем обычный ЭЭ-чип. На верхней части этой половины могут происходить явления пневмоники, а также действия по извлечению, добавлению и фильтрации образцов, и добавление реагентов. Не требуется оптической прозрачности этой половины. А половина без углеродного электрода является, предпочтительно, полностью оптически прозрачной, но она также может содержать оптически прозрачную часть окна. Это окно также, при необходимости, может служить оптическим фильтром при соответствующем выборе материала.
ПЕРЕЧЕНЬ ФИГУР
Фиг.1. Простой ЭЭ-чип. Основание - стекло размером 19 мм × 19 мм или пластиковый чип (1), к верхней части которого присоединены электроды (2) и (3) с помощью двусторонней ленты, нарисованной кистью или напечатанной. Поверх осушенных электродов наклеено кольцо (4), выполненное из листов адгезивного пластика путем перфорации; кольцо наклеено на чип с помощью его собственного адгезивного материала, таким образом, что образована область ячейки (5) с внутренним диаметром 7 мм. В ячейку можно пипетировать 80-150 мкл образца или другого раствора.
Фиг.2. Основания пластикового чипа (а); ЭЭ-чип, в котором углеродные электроды выполнены на верхней части слоя из алюминия или серебристой краски, так что поверхности электрических контактов электродов свободны от углеродной пасты (б); лента с защитной пленкой снизу от перфоратора (в); установка для перфорации квадратов из ленты и самоклеющихся меток (г); ЭЭ-чип в измерительной ячейке перед введением образца.
Фиг.3. Калибровочные кривые Tb(III)-хелатов для электродов из углеродной пасты, приготовленной различным образом, (а) электроды по примеру 2, (б) электроды по примеру (3), (в) электроды по примеру 4, и (г) электроды по примеру 5.
Фиг.4. Влияние персульфата на интенсивность электрохемилюминесценции.
Фиг.5. ПДМС-чип, соединенный с ЭЭ-чипом. (1) Основание, обычно выполненное из полимера, бумаги, картона или стекла или любой их комбинации; (2) и (3) идентичные углеродные электроды, которые могут быть различным образом покрыты (по выбору); (4) ПДМС-чип с камерой инкубирования и измерительной камерой (5) на нижней поверхности и открытая камера через чип для ввода образца и добавления реагента (6), микроканалы (7), ведущие в области инкубирования, и каналы отвода воздуха (8). ПДМС-чип и ЭЭ-чип прижаты друг к другу маленькими зажимами. Кассеты могли бы также быть хорошо склеены вместе, но для предотвращения возможной блокировки микроканалов использовано соединение зажимами. Вместо зажимов можно было бы также использовать пластиковую рамку для плотного удержания всех чипов.
Фиг.6. Иммуноферментные исследования на кассете, образованной из ЭЭ-чипа и ПДМС-чипа.
Фиг.7. Исследования гибридизации на ЭЭ-чипе.
Фиг.8. Два одновременных иммуноферментных исследования на ЭЭ-чипе.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение показывает, как простое и дешевое оборудование может быть использовано для различных анализов настолько же эффективно, как и описанные выше сложные средства, в котором иммунологические исследования или ДНК-гибридизация выполняются на одноразовом ЭЭ-чипе или с использованием также пористого слоя поверх ЭЭ-чипа. За счет этих средств и измерительный прибор и измерительная ячейка достаточно дешевы для нужд децентрализованного анализа.
Данное изобретение описывает различные пути получения ЭЭ ячеек поверх различных дешевых материалов. Эти материалы включают, среди прочих, различные виды пластика, полимеры, бумагу, бумагу с различными типами покрытий и картон. Материалы, подобные этим, легко соединить с системами микроанализа или кассетами, которые выполняют все другие необходимые функции, нужные для анализа. В массовом производстве, когда прилагают усилия для производства высококачественных товаров по низким ценам, способ печати является очень хорошим выбором способа производства. Электроды, описанные в настоящем изобретении, исключительно хорошо подходят для изготовления по технологии печати, что дает значительные преимущества в соревновании на рынке.
Ранее стало известно, что углеродные электроды могут быть использованы как одноразовые аноды в аспекте электрохемилюминесценции рутения (FI 981568 (А), Kulmala, S., et al.), но единичные углеродные аноды не могут быть использованы для возбуждения хелатов тербия. Специалист в данной области не мог представить, что путем замены электрода из платины в паре электродов из углерода и платины на электрод из углерода можно получить особенную электродную систему с особенным поведением, по крайней мере, когда электроды расположены на одном уровне и близко друг от друга (пока у нас нет опыта с другой геометрией). Пока у нас нет полной определенности в понимании того, возникает ли свет, когда электроды функционируют как катоды или аноды, или реакция является результатом комбинированного эффекта промежуточных звеньев при различных полярностях. Из экспериментальных результатов оказывается, что основная часть света, по меньшей мере, образуется у катода.
Настоящее изобретение представляет значительный вклад в область средств и способов, значимых для рынка децентрализованных анализов, и делает возможным дешевое, количественное и быстрое тестирование. Это достигается путем использования ЭЭ-ячеек либо в их простейшей форме, с гидрофобным кольцом, окружающим область ячейки, либо в качестве элемента, интегрированного в более сложную кассету для анализа.
Предметом изобретения являются способ и устройство для возбуждения маркеров в исследованиях биологических свойств либо прямо на поверхности ЭЭ-чипов, либо с помощью пористых слоев (пористых мембран) в устройстве с ЭЭ-чипом. Способ может быть использован в иммунохимических быстрых исследованиях и ДНК-зондах. Возможно также, что со временем какие-то другие маркеры, помимо хелатов тербия, можно будет возбуждать ЭЭ-чипами и способами, описанными в данном изобретении.
Изобретение включает устройство, основной частью которого является ЭЭ-чип. Поверхность электродов в ЭЭ-чипе может быть покрыта известным образом антителами или ДНК, и молекулы-маркеры, присоединенные к покрытию, могут возбуждаться электрическими импульсами. В соответствии с изобретением часть электрода (или поверхность пористого слоя (в опции), которая контактирует с частью электрода, может быть покрыта пленками Лэнгмюра-Блоджетта или другими легко изготавливаемыми пленками, которые создают особые преимущества.
Иногда заметные преимущества достигаются при использовании пористых мембран в исследованиях биологических свойств. С помощью пористого слоя образец однородно распределяется в комплексе из электрода с покрытием антителом. Пористый слой также функционирует как однородный компенсатор потока жидкости и предотвращает образование пузырьков в системах микропневмоники, температурную диффузию и поверхностные силы, а также исключает проблемы, обусловленные такими факторами, в ячейках с микропневмоникой микропотоков или в ячейках с микрослоями.
Пленки (пористые слои, пористые мембраны), иногда использованные в изобретении на поверхностях электродов, характеризуются микропористостью и толщиной менее 100 мкм. Эти виды материалов доступны из многих коммерческих источников, таких как Millipore, MSI, Sartorius, Pall, Sigma и DuPont. Мембраны могут быть как изотропными, так и анизотропными. Технология изготовления пленок может различаться и может содержать прессование или растяжение, поры могут быть сформированы либо химически, либо физически, в анизотропных пленках, путем фазового перехода. Подходящие материалы включают ПТФЭ, поливинилидин флюорид, поликарбонат, полисульфон, нейлон и эфиры целлюлозы. Они доступны из коммерческих источников, с различными размерами пор и толщиной, и различными физико-химическими свойствами. Волокнистые материалы, которые могут быть использованы, включают волокнистые фильтры, фильтровальную бумагу, фильтрующую ткань и др.
По производственным причинам ЭЭ-чипы лучше всего держать сухими. Затем устройства готовят к работе путем добавления жидкого образца или буферного раствора на ЭЭ-чипы или на пористый слой в чипах. Так достигаются условия, подходящие для реакций исследования биологических свойств либо прямо на электродах, или между мембраной и электродом.
Существует большое количество альтернативных опций для ЭЭ-чипов, которые описывают данное изобретение. Основной выбор состоит в прямом использовании достаточно проводящей углеродной пасты для изготовления электродов на чипе, который обычно является или пластиковым, бумажным или стеклянным чипом, или полоской, а наиболее типичным является изготовление методами печати. Если проводимость углеродной пасты недостаточна, можно выполнить высоко проводящий слой под углеродной пастой из так называемой серебристой краски или тонкий металлический слой, который затем покрывают углеродной пастой. Таким образом, для получения ЭХЛ достаточно уже относительно малых напряжений, если внутри пленки проводящей углеродной пасты, на большом расстоянии, не происходит падения потенциала.
ЭЭ-чипы обычно включаются как часть в кассеты для диагностики с помощью разных способов и с использованием лучших свойств различных материалов. Целью является подготовка частей кассеты, обычно сделанных из полимеров, например, каналов и ячеек, таким образом, чтобы после добавления реагентов в сухом виде, они бы обладали всеми необходимыми функциями для диагностических измерений, обычно одноразовые кассеты никогда не открывают во время использования или после него.
Далее изобретение иллюстрируют диаграммы, примеры и чертежи (без ограничения), относящиеся к примерам.
ПРИМЕР 1. Изготовление электродов ЭЭ-чипа таким образом, что в области ячейки материал электрода состоит только из углеродной пасты.
Пара электродов, показанная на фиг.1, была нанесена углеродной пастой (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA) поверх пластикового чипа размером 10×19 мм с использованием шаблона. Фланец высотой 0,2 мм и шириной 0,5 мм был оставлен в середине чипа при его изготовлении путем фрезерования, и этот фланец был использован в качестве резистора между электродами (фиг.2(б)). После высушивания углеродной пасты был нанесен наружный слой серебристой краской (Bison electro G-22, Bison Inc, Netherlands), и этот серебристый слой почти достиг области ячейки (фиг.2). Область ячейки формировали путем присоединения перфорированного куска тефлоновой ленты (Irpola Oy, Turku, Finland) или куска обычной перфорированной ленты (квадратной формы, в отличие от куска круглой формы, показанного на фиг.1, с отверстием в середине куска, имеющим внутренний диаметр 7 мм или 8 мм) у левого конца электрода, как показано на фиг.1. И Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол хелат, и Tb(III)-N|-изотиоцианатобензил)диэтилентриамин-N1,N2,N3,N4 тетраацетат хелат можно было возбудить и измерить с временным разрешением в этой ячейке. Значительно более высокая интенсивность достигается, тем не менее, с ЭЭ-чипами по примеру 2, с которыми соответствующие хелаты других лантанидов дали, однако, значительно более низкие интенсивности, чем тербий.
ПРИМЕР 2. Изготовление ЭЭ-чипа из серебристой краски, покрытой углеродной пастой.
Пара электродов, показанная на фиг.1, была нанесена серебристой краской (Bison electro G-22, Bison Inc, Netherlands) поверх пластикового чипа размером 10×19 мм с использованием шаблона. Фланец высотой 0,2 мм и шириной 0,5 мм был оставлен в середине чипа при его изготовлении путем фрезерования, и этот фланец был использован в качестве резистора между электродами. После высыхания серебристой краски (5 часов) поверх нее был нанесен покрывающий слой углеродной пасты (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA) и оставлен для высушивания при комнатной температуре на ночь. Область ячейки сформировали путем присоединения перфорированного куска тефлоновой ленты (Irpola Oy, Turku, Finland) или куска обычной перфорированной ленты к левому концу электрода, как показано на фиг.1. Калибровочная кривая Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол хелата представлена на фиг.3 (а), открытые кружки. Измерительный инструмент состоял из счетчика фотонов Stanford Research SR400, генератора статических импульсов и электродной камеры из черного пластика с присоединенным трубчатым модулем канального фотоумножителя Perkin Elmer. При измерениях установлены следующие параметры: напряжение в импульсе -67В, заряд импульса 30 мкКл/имп, частота импульсов 20 Гц. Интенсивность ЭХЛ интегрирована по 100 импульсов возбуждения, время задержки 0,05 мс, окно измерения 6,0 мс. Использован буфер 0,05М тетраборат натрия, pH 9,2.
ПРИМЕР 3. Изготовление ЭЭ-чипа на бумаге и из углеродной пасты.
Вначале бумага для выпечки (не пропускающая жира) была покрыта серебристой краской ((Bison electro G-22, Bison Inc, Netherlands), после чего поверх серебра был нанесен слой углеродной пасты (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA). При покрытии использован шаблон для имитации шелкотрафаретной печати. После высыхания углеродной пасты при комнатной температуре в течение 2 часов, из бумаги были нарезаны полоски, подходящие для использования на основах (по фиг.2). Край бумаги у фланца на основании был покрыт углеродной пастой, чтобы серебро не имело прямого контакта с растворами электролитов. Окончательно бумага была прикреплена к пластиковому основанию двусторонней лентой (3M), бумажные кольца, образующие область ячейки, были прикреплены к чипу.
Калибровочная кривая Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол хелата представлена на фиг.3 (б), сплошные кружки. Параметры измерений те же, что в примере 2.
ПРИМЕР 4. Изготовление ЭЭ-чипа из полосок металлической фольги, покрытых углеродной пастой.
Вначале изготовили пару электродов путем приклеивания полосок алюминиевой фольги поверх пластикового чипа размером 10×19 мм. Фланец высотой 0,2 мм (или, по выбору, высотой 0,3 мм или 0,4 мм) и шириной 0,5 мм был выполнен фрезерованием в середине чипа для выполнения функции резистора между электродами (фиг.1). Полоски алюминиевой фольги были покрыты углеродной пастой (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA), так что с правого края контактные области подпружиненных штифтов (которые подсоединяют чип к импульсному генератору устройства) оставались непокрытыми. Область ячейки была сформирована либо перфорированным куском тефлоновой ленты (Irpola Oy, Turku, Finland) или куском обычной перфорированной ленты на левом конце электрода соответственно фиг.1. Калибровочная кривая Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол хелата представлена на фиг.3 (в), сплошные кружки. Подобные электроды могут быть выполнены также с использованием на первом этапе алюминиевых пластин, полученных путем осаждения паров, как в примере 8. Параметры измерений те же, что в примере 2.
ПРИМЕР 5. Изготовление ЭЭ-чипа из коммерчески доступных металлических наклеек (стикеров), покрытых углеродной пастой.
Вначале изготовили пару электродов путем приклеивания стикеров из медной фольги (Screen House, Turku, Finland) их собственным адгезивным слоем поверх пластикового чипа размером 10×19 мм. Фланец высотой 0,3 мм и шириной 0,5 мм был выполнен фрезерованием в середине полоски для выполнения функции резистора между электродами (фиг.1). Полоски медной фольги покрыли углеродной пастой (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA), так что контактные области подпружиненных штифтов к импульсному генератору у правого края полоски остались непокрытыми. Область ячейки была сформирована присоединением или перфорированного куска тефлоновой ленты (Irpola Oy, Turku, Finland), или куска обычной перфорированной ленты у левого конца электрода соответственно фиг.1. Калибровочная кривая Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол хелата представлена на фиг.3 (г), сплошные кружки. Подобные электроды могут быть выполнены также с использованием на первом этапе алюминиевых пластин, полученных путем осаждения паров, как в примере 8. Параметры измерений те же, что в примере 2.
ПРИМЕР 6. Влияние персульфата на интенсивность ЭХЛ.
Вначале изготовили достаточное количество ЭЭ-чипов по методике примера 2. При изучении влияния различных примесей на электрохемилюминесценцию было отмечено, что добавление персульфата увеличивает электрохемилюминесценцию. Это означает, с наибольшей вероятностью, что персульфат распадался в ходе реакции с образованием радикала серной кислоты. Известно, что радикалы серной кислоты приводят к хемилюминесценции ионов и хелатов Tb(III) в водном растворе (S. Kulmala et al., Anal.Chim.Acta 294 (1994) 13-25).
При дальнейшем изучении влияния концентрации персульфата калия на интенсивность сигнала было отмечено, что увеличение концентрации персульфата приводило к заметному усилению интенсивности ЭХЛ Tb(III) хелата (1×10-6 М Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол) в пределах всего исследованного диапазона концентраций (фиг.4).
Возможно, что увеличение интенсивности имеет место вплоть до наивысших количеств растворенного персульфата калия (около 50 мМ), а с персульфатом натрия можно достичь даже более высоких концентраций. Параметры измерений те же, что в примере 2.
ПРИМЕР 7. Влияние кислотной и базовой обработок.
При изучении стабильности электродов в условиях воздействия кислот и в базовых условиях было обнаружено, что работа электродов улучшалась при повторном использовании. Вследствие этого провели сравнение, в котором ЭЭ-чипы, изготовленные по методике, описанной в примере 2, инкубировали в течение 15 минут в одномолярном растворе едкого натра (1М NaOH), одномолярном растворе серной кислоты (1М H2SO4), или одномолярном растворе соляной кислоты (1М HCl). После инкубирования электроды промыли дистиллированной водой и провели измерения с использованием 1 мкМ Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол хелата. Параметры измерений те же, что в примере 2. Результаты приведены ниже в таблице, и кислотная обработка, и базовая обработка отчетливо увеличили эффективность электродов.
| Таблица | ||||
| 1 мкМ Tb(III) хелат | Интенсивность ЭХЛ/фотоны | |||
| Без обработки | Обработка 1M NaOH | Обработка 1M H2SO4 | Обработка 1М HCl | |
| Измерение | 337532 | 956184 | 697300 | 538215 |
| Повторное измерение | 317307 | 921739 | 615300 | 481643 |
ПРИМЕР 8. Иммуноферментное исследование с ЭЭ-чипом, образованным в целой ячейке с ПДМС чипом.
ПДМС чип был изготовлен отливкой из силиконового эластомера Sylgard 184 (отверждающий агент в пропорции 1:10), с использованием формы в чашке Петри. Влажный ПДМС дегазировали в вакууме и выдерживали в течение 2 часов при температуре 50°C. Отвержденный ПДМС отделили от формы и нарезали на части.
ПДМС чипы имели камеру для образца и подачи реагентов у левого края (часть 6 на фиг.5), в которой реагенты, необходимые для анализа биологических свойств, высушивались перед анализом. Камера ввода образца присоединялась посредством микроканалов (часть 7 на фиг.5) к объединенной камере инкубирования и измерения (часть 5 на фиг.5). За счет капиллярных сил и гидростатического давления жидкость перемешалась в камеру инкубирования/измерения, в то время как воздух выходил из камеры через микроканалы (часть 8 на фиг.5). Камера инкубирования/измерения имела миниатюрные опоры для поддержания камеры ПДМС чипа в постоянном размере и предотвращения ее сжатия. Высота камеры инкубирования/измерения составляла 0,35 мм, объем около 15 мкл, а общая толщина ПДМС чипа составляла 5 мм.
Вначале верхнюю поверхность стеклянных чипов (19,0 мм × 10,0 мм) подвергли короткой плазменной обработке. Затем в вакууме напылили слой алюминия толщиной около 0,3 мм через маску на стеклянные чипы, прикрепленные под маской; сформировали оба электрода чипа (2 и 3 на фиг.1). После этого алюминиевые электроды дополнительно покрыли углеродной пастой (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA,USA), так что контактные области подпружиненных штифтов (к импульсному генератору) у правого края полоски остались непокрытыми.
В качестве модельного аналита использовали тиреотропный гормон человека TSH, в качестве первичного (захватывающего) антитела использован α-субблок, присоединяющий анти-TSH (МОАВ, лот: N-21310, номер по каталогу MIT0406, концентрация 6,87 мг/мл; Medix Inc, USA); в качестве вторичного (маркирующего) антитела использован β-субблок специфического анти-TSH (клон 5404, лот SPC099, концентрация 5,5 мг/мл, Medix Biochemica Oy Ab, Finland). Калибровочные стандарты для hTSH получены путем разведения из концентрированного маточного раствора Уоллака (DELFIA hTSH kit, 324 mIU/mL TSH).
Маркированное вторичное антитело (анти-TSH, клон 5404, 5,5 мг/мл, Medix Biochemica Oy Ab) было получено реакцией производных изоцианата Tb хелата Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол хелата с 80-кратным молярном избытке хелата и антитела. Реакция шла в течение ночи при pH 9,5. Маркированное антитело отделили в колонке диаметром 1 см, заполненной 5,5 см Сефадекса G-50 поверх 52 см Сефарозы 6В.
После высыхания углеродной пасты электроды были покрыты антителом в лунке, образованной лентой в области измерительной ячейки на ЭЭ-чипе, следующим образом: 150 мкл раствора, содержащего 30 мкг/мл захватывающего антитела (0,1 М MES, 0,2 М бората, 0,025% бычьего гамма-глобулина pH 6,5), добавили в камеру инкубирования и инкубировали в течение 3 часов в закрытых пластиковых емкостях с водой, содержащей азид, в нижней части под подставками. После покрытия область ячейки промыли промывочным раствором (0,05 М Трис-H2SO4 буфер, pH 7,75, 0,1% бычьего альбумина, 0,1% Tween 20, 0,1% NaN3).
0,2 М буфера натрия тетраборат (pH доведен до 7,8 с помощью H2SO4, 0,5% бычьего альбумина, 0,05% бычьего гамма-глобулина, 0,01% Tween 20 и 0,1% NaN3) был использован как буфер для иммуноферментных исследований и измерений. Сначала 25 мкл hTSH-стандарта добавили в 175 мкл иммуноферментного/измерительного буфера.
Смесь пипетировали в камеру ввода образца (часть 6, фиг.5), в которой уже находился маркер в сухом виде. Образец растворил маркер, и смесь под действием капиллярных сил и гидростатического давления перешла в камеру инкубирования/измерений (часть 5, фиг.5) по микроканалам (часть 7, фиг.5), в то время как воздух вышел из ячейки через другие микроканалы (часть 8, фиг.5).
Через 15 минут инкубирования измерили интенсивность ЭХЛ от каждой ПДМС-ЭЭ-кассеты с использованием измерительной аппаратуры, в составе лабораторного кулоностатического импульсного генератора, счетчика фотонов Stanford Research Instruments SR400, многоканальной пересчетной схемы Nulleus MCS-II и закрытого объема для измерения ячеек, выполненного из черного пластика, с трубчатым модулем канального фотоумножителя Perkin Elmer (амплитуда импульса -45В, заряд импульса 15 мкК/имп, частота импульсов 20 Гц; интенсивность ЭХЛ интегрирована по 200 импульсам возбуждения с временем задержки 0,05 мс и окном измерения 6,0 мс) Результаты измерения показаны на фиг.6.
ПРИМЕР 9. Исследование гибридизации на ЭЭ-чипах.
ЭЭ-чипы изготовлены из осажденного алюминия и углеродной пасты так же, как в примере 6. Область ячейки в чипах образована лентой таким же образом, как в примере 1. Определяемая последовательность состояла из 120 фрагментов нуклеотидов, которая одинакова для энтеро- и риновирусов человека.
Зонд 1 (TTA-GCC-GCA-TTC-AGG-GGG-CGA-AAA-AA-C6-NH2, MedProbe AB, Sweden), комплементарный к 5'-концу определяемой последовательности, был нанесен на электроды из углеродной пасты. Для покрытия аминогруппы (APTES) были добавлены в процессе силанизации с (3-аминопропил)триэтоксисиланом на электроды, покрытые слоем оксида. Полиаденильный хвост, 6-углеродная алифатическая углеродная цепочка и замыкающая аминогруппа были добавлены к 3'-концу зонда 1. Завершающая ковалентная связь была образована с помощью двойного реагента DSS (дисукцинимидил суберат), в соответствии с инструкциями производителя.
Второй зонд «Зонд 2» ((NH2)4-GA-AAC-ACG-GAC-ACC-CAA-AGT-A) был маркирован производной изотиосианата Tb хелата (Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол хелат) путем инкубирования зонда с 80-кратным избытком хелата в 0,5 М буфере карбонат натрия (pH 9,5) в течение ночи. После инкубирования маркированная проба была очищена на колонке Сефадекса G50 (NAP-5, колонка GE Healthcare).
Гибридизация была выполнена следующим образом. Образец ДНК, мультиплицированной в полимеразной цепной реакции RT-PCR (20 мкл, разведение 1:50, 1:100 и 1:1000), был денатурирован добавлением 180 мкл NaOH (50 ммоль/л) и инкубированием при 37°C в течение 5 минут. Образцы затем нейтрализовали добавлением 200 мкл нейтрализующего буфера (6 × SSC, 0,3% Tween 20, 20 ммоль/л лимонной кислоты). 10 мкл нейтрализованного образца и маркированной пробы 2 (0,6 нг/мкл, 50 ммоль/л Трис-HCl буфера pH 7,8, 600 ммоль/л NaCl, 1% Triton X 100 и 1% блокирующего реагента (Roche)) были перенесены в новую трубку для анализа. После смешивания 3,5 мкл смеси пипетировали на мембранную часть испытываемой полоски. После гибридизации (5 минут) мембрану удалили с силиконового электрода, трижды промыли ЭЭ-чип и измерили ЭХЛ. Диаграмма разведении образца показана на фиг.7.
Параметры измерений такие же, как в примере 8.
ПРИМЕР 10. Одновременное определение двух иммуноферментных аналитов на одном ЭЭ-чипе.
С-реактивный белок (CRP) и тиреотропный гормон (TSH) определяли одновременно, так что один из электродов покрыли антителом, захватывающим CRP, а другой - антителом, захватывающим TSH.
Электроды ЭЭ-чипа были покрыты захватывающим антителом в лунках прямоугольной формы, выполненных из ленты. Прямоугольные отверстия были выполнены в ленте скальпелем с использованием шаблона. Каждая из лунок покрывала немного большую область соответствующего электрода, чем круглая область ячейки, которая по окончании предварительной подготовки была выполнена добавлением другой ленты с круглым отверстием, как на фиг.1.
Оба антитела были одновременно нанесены на электрод, каждый в свою собственную лунку в ленте. Анти-TSH (анти-hTSH, MIT0406, Medix Biotech Inc., USA) был нанесен на электрод инкубированием антитела (25 мкг/мл, 150 мкл) в течение 2 часов при комнатной температуре в растворе, содержащем 0,1 М MES, 0,03 М Н3ВО3, 0,5 мМ цитрата калия, 0,025% глутаральдегида и 0,05% бычьего гамма-глобулина. После инкубирования лунку в ленте промыли трижды промывочным раствором (50 мМ Трис-HCl буфер pH 7,8 с 0,9% NaCl, 0,09% NaNs и 0,05% Tween 20). После промывания покрытый электрод насыщали путем инкубирования насыщающего раствора (50 мМ Трис-HCl pH 7,8 с 0,9% NaCl, 0,05% NaN3 и 0,1% BSA и 6% D-сорбитола) в лунке в ленте в течение 30 мин. После насыщения лунку в ленте удалили (одновременно с одним из покрытий из анти-CRP) из области электрода и сушили ЭЭ-чип при 30°C в течение 2,5 часов.
Подобным образом, анти-CRP был нанесен путем инкубирования (в лунку в ленте на другом электроде) антитела (20 мкг/мл, 150 мкл) в течение 2 часов при комнатной температуре с 50 мМ Трис-HCl буфера (pH 7,8 с 0,05% NaN3 и 0,9% NaCl). После инкубирования углубление в ленте трижды промыли промывочным раствором (50 мМ Трис-HCl буфер pH 7,8 с 0,9% NaCl, 0,09% NaN3 и 0,05% Tween 20). После промывания покрытый электрод насыщали путем инкубирования насыщающего раствора (50 мМ Трис-HCl pH 7,8 с 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,1% BSA и 6:%D-сорбитол и 1 мМ CaCl2) в лунке в ленте в течение 30 минут. После насыщения лунку в ленте удалили (одновременно с одним из этапов покрытия анти-TSH) из области электрода и ЭЭ-чип сушили при 30°C в течение 2,5 часов.
Маркированные антитела сушили на мембране следующим образом. Антитело анти-hCRP (74 мкг/мл, Medix Biochemica Oy Ab анти-hCRP клон 6404), маркированное Tb(III) хелатом (Tb-2,6-бис[N,N-бис(карбоксиметил)аминометил-4-бензоилфенол), и антитело анти-hTSH (80 мкг/мл, клон 5404, Medix Biochemica Oy Ab), маркированное тем же Tb(III) хелатом, растворили в 50 мМ Трис-HCl буфера (pH 7,7, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5% BSA, 0,05% бычьего гамма-глобулина 0,01% Tween 20, 1 мМ CaCl2×H2O). 0,5 мкл раствора антитело-буфер пикетировали в середину мембраны (10×10 мм, Nuclepore Membrane 112110, Whatman) и сушили в течение ночи при комнатной температуре в комнатной атмосфере.
Стандартные образцы hCRP, необходимые в иммуноферментном исследовании (содержание CRP 1, 10 и 100 нг/мл), были приготовлены в тестовых трубках путем разбавления стандартного раствора CRP (Scripps, кат. № С0124) 50 мМ Трис-HCl буфером (pH 7,7, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5% BSA, 1 мМ CaCl2×H2O). Аналогичным образом стандартные образцы TSH (1, 10 и 100 мIU/мл) были приготовлены разбавлением стандарта TSH (324 мIU/мл, Wallac, DELFIA hTSH kit) буфером 50 мМ Трис-HCl (pH 7,7, 0,05% NaNa, 0,9% NaCl).
Иммуноферментный анализ выполняли так, что исходно и ЭЭ-чип, и пористая мембрана были сухими. Мембрану приложили точно на верхнюю часть области ячейки ЭЭ-чипа, образованную лункой в ленте, и закрепили на месте лентой с другого конца. Начали иммуноферментный анализ с добавления 3,5 мкл обоих стандартов аналитов в середину пористой мембраны (CRP 0 нг/мл и TSH 0 мIU/мл; CRP 1 нг/мл и TSH 1 мIU/мл; CRP 10 нг/мл и TSH 10 мIU/мл; CRP 100 нг/мл и TSH 100 мIU/мл). После инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре мембрану удалили, область ячейки ЭЭ-чипа промыли промывочным буфером и добавили 80 мкл измерительного буфера (0,05 М Na2B4O7 b 2×10-4 М K2S2O8). Оба аналита были измерены таким образом, что первые 10 циклов возбуждения измеряли, когда анти-TSH - электрод работал как катод, затем изменяли полярность на другие 10 циклов, когда анти-CRP - электрод работал в качестве катода. Измерение повторили 5 раз и суммировали сигналы от обоих электродов. По результатам было установлено, что свет первично возникает на катоде, так как отклик TSH был получен от левого электрода, и видимо, такое двойное исследование работает, хотя не всегда имеет смысл измерять эти особенные составы, TSH и CRP, в одном образце. Результаты измерения представлены на фиг.8, параметры те же, что в примере 8.
Claims (4)
1. Устройство для электрического возбуждения хелатов лантаноидов в растворах электролитов, выполненное в виде электрохимической ячейки, содержащей чип с двумя электродами с функцией анода и катода, отличающееся тем, что в качестве хелатов лантаноидов выбраны хелаты тербия Tb(III), а электроды выполнены из углеродистой пасты или металла с покрытием из углеродистой пасты на изолирующем материале по технологиям печати, распыления или нанесения серебряной краской рисунка, выполненного под покрытие его углеродистой пастой после подсушивания рисунка, с одновременным формированием катода и анода или части анода как верхнего слоя углеродистой пасты с удельным сопротивлением, преимущественно, менее 1000 Ом·см.
2. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что электроды выполнены с возможностью возбуждения хемилюминесценции хелатов тербия Tb(III) импульсами напряжения разной полярности.
3. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что поверхность электродов обработана химическими веществами, включающими, преимущественно, гидрооксиды щелочных металлов и гидрооксиды щелочных редкоземельных металлов.
4. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что поверхность электродов обработана кислотой из группы, включающей сернистую кислоту, хлористоводородную кислоту, фосфорную и уксусную кислоты.
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20100246A FI20100246L (fi) | 2010-06-11 | 2010-06-11 | Menetelmät ja laitteet luminesenssin tuottamiseksi integroiduista elektrodisiruista katodisten ja bipolaaristen pulssien avulla |
| FI20100246 | 2010-06-11 | ||
| FI20100251A FI20100251A7 (fi) | 2010-06-15 | 2010-06-15 | Tarkat integroidut edulliset elektrodisirut point-of-need -analyysiä varten ja käyttömenetelmä kuumissa elektronien indusoimissa elektrokemiluminesenssijärjestelmissä |
| FI20100251 | 2010-06-15 | ||
| FI20100253 | 2010-06-16 | ||
| FI20100253A FI20100253L (fi) | 2010-06-11 | 2010-06-16 | Integroidut hiilielektrodisirut lantanidikelaattien sähköiseen virittämiseen ja näitä siruja hyödyntävät analyyttiset menetelmät |
| PCT/FI2011/000032 WO2011154590A1 (en) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | Integrated carbon electrode chips for the electric excitation of lanthanide chelates, and analytical methods using these chips. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013102437A RU2013102437A (ru) | 2014-07-20 |
| RU2568979C2 true RU2568979C2 (ru) | 2015-11-20 |
Family
ID=45097573
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013102443/28A RU2013102443A (ru) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | Недорогие электронные чипы (варианты) и способы многокомпонентного анализа и оценки на основе катодной электролюминесценции |
| RU2013102436/28A RU2013102436A (ru) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | Точные интегрированные электродные чипы для микроанализа и способ использования в системах с возбуждением электрохемилюминесценции горячими электронами |
| RU2013102437/28A RU2568979C2 (ru) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | Интегрированные углеродные электродные чипы для электрического возбуждения хелатов лантанидов и способы анализа с их использованием |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013102443/28A RU2013102443A (ru) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | Недорогие электронные чипы (варианты) и способы многокомпонентного анализа и оценки на основе катодной электролюминесценции |
| RU2013102436/28A RU2013102436A (ru) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | Точные интегрированные электродные чипы для микроанализа и способ использования в системах с возбуждением электрохемилюминесценции горячими электронами |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9535029B2 (ru) |
| EP (4) | EP2580581A4 (ru) |
| JP (2) | JP5932781B2 (ru) |
| KR (3) | KR101925156B1 (ru) |
| EA (3) | EA027942B1 (ru) |
| RU (3) | RU2013102443A (ru) |
| WO (3) | WO2011154590A1 (ru) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10451606B2 (en) * | 2013-10-21 | 2019-10-22 | The Regents Of The University Of Michigan | Nanoporous bioelectrochemical sensors for measuring redox potential in biological samples |
| CN103822961B (zh) * | 2014-03-13 | 2018-08-31 | 南京洁态环保科技有限公司 | 电化学微流芯片及其制备方法 |
| US9988677B1 (en) * | 2014-06-10 | 2018-06-05 | Mark Fleharty | DNA/RNA sequencing using a semiconducting nanopore |
| CN105445219B (zh) * | 2016-01-07 | 2017-12-26 | 上海理工大学 | 一种增强生物样品在太赫兹波段吸收光谱信号的方法 |
| KR102042513B1 (ko) | 2018-04-06 | 2019-11-27 | 아림산업(주) | 천정등용 엘이디(led)램프와 그 제조방법 |
| CN109799230B (zh) * | 2019-01-30 | 2021-09-28 | 中山大学 | 一种金属配合物及手性异构体的快速检测装置及检测方法 |
| US20220057362A1 (en) * | 2020-08-21 | 2022-02-24 | Meso Scale Technologies, Llc | Auxiliary Electrodes and Methods for Using and Manufacturing the Same |
| CA3241903A1 (en) * | 2022-01-04 | 2023-07-13 | Meso Scale Technologies, Llc. | Electrochemical cell devices and methods of manufacturing |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2217007A (en) * | 1988-03-21 | 1989-10-18 | Jouko Juhani Kankare | Electrochemical analysis of analytes in solution |
| US5308754A (en) * | 1988-03-21 | 1994-05-03 | Kankare Jouko J | Electrogenerated luminescence in solution |
| GB2347746A (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-13 | Azur Env Ltd | Detecting analytes, particularly nucleic acids, in a sample |
| RU2010124406A (ru) * | 2007-11-16 | 2011-12-27 | Акцо Нобель Н.В. (NL) | Электрод |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5746974A (en) | 1988-11-03 | 1998-05-05 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence and chemiluminescence detection |
| US5705402A (en) | 1988-11-03 | 1998-01-06 | Igen International, Inc. | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets |
| EP0637382A1 (en) | 1992-04-22 | 1995-02-08 | THE DOW CHEMICAL COMPANY (a Delaware corporation) | Polymeric film-based electrochemical sensor apparatus |
| CN1192097C (zh) * | 1995-03-10 | 2005-03-09 | 梅索磅秤技术有限公司 | 多阵列、多特异性的电化学发光检验 |
| US6140045A (en) | 1995-03-10 | 2000-10-31 | Meso Scale Technologies | Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing |
| WO1996033411A1 (en) * | 1995-04-18 | 1996-10-24 | Igen, Inc. | Electrochemiluminescence of rare earth metal chelates |
| WO1996041177A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Igen, Inc. | Simultaneous assay method using lanthanide chelates as the luminophore for multiple labels |
| FI970593A7 (fi) | 1997-02-12 | 1998-08-13 | Ala Kleme Timo | Pinnoitettujen johteiden käyttö analyyttisiin tarkoituksiin |
| US7560237B2 (en) | 1997-06-12 | 2009-07-14 | Osmetech Technology Inc. | Electronics method for the detection of analytes |
| WO2000001848A1 (en) * | 1998-07-01 | 2000-01-13 | Hitachi, Ltd. | Polynucleotide assay apparatus and polynucleotide assay method |
| FI981568A7 (fi) | 1998-07-08 | 2000-01-09 | Korpela Timo | Kertakäyttöisiä anodeja analyyttisiin tarkoituksiin |
| DK1412725T3 (en) * | 2001-06-29 | 2019-03-25 | Meso Scale Technologies Llc | Multi-well plates for LUMINESCENSE TEST MEASUREMENTS |
| WO2003023360A2 (en) | 2001-09-10 | 2003-03-20 | Meso Scale Technologies, Llc | Methods and apparatus for conducting multiple measurements on a sample |
| FI118611B (fi) | 2002-04-15 | 2008-01-15 | Labmaster Oy | Eriste-elektrodilaitteet |
| EP1546173A4 (en) * | 2002-08-06 | 2006-05-31 | Intradigm Corp | METHOD FOR DOWNSTREGULATING THE EXPRESSION OF TARGET GENES IN VIVO BY INCLUDING INTERFERING RNA |
| CN102620959B (zh) | 2002-12-26 | 2015-12-16 | 梅索磅秤技术有限公司 | 检定盒及其使用方法 |
| JP2004232998A (ja) * | 2003-01-31 | 2004-08-19 | Fuji Silysia Chemical Ltd | 水捕集装置 |
| JP4579593B2 (ja) | 2004-03-05 | 2010-11-10 | キヤノン株式会社 | 標的物質認識素子、検出方法及び装置 |
| EP1757935A4 (en) * | 2004-04-23 | 2008-01-16 | Matsushita Electric Industrial Co Ltd | GENE DETECTING METHOD AND GENE DETECTING APPARATUS |
| FI119894B (fi) * | 2005-03-30 | 2009-04-30 | Labmaster Oy | Elektrokemiluminesenssiin perustuva analyysimenetelmä ja siinä käytettävä laite |
| JP2006337351A (ja) * | 2005-05-31 | 2006-12-14 | Microtec Nition:Kk | 遺伝子の電気化学的検出方法 |
| CA2609379C (en) | 2005-06-03 | 2016-11-29 | Allen J. Bard | Electrochemistry and electrogenerated chemiluminescence with a single faradaic electrode |
| JP2008256494A (ja) * | 2007-04-04 | 2008-10-23 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 標識剤及び核酸検出方法 |
| JP4914384B2 (ja) | 2008-02-26 | 2012-04-11 | 株式会社クボタ | コンバイン |
| JP2009204375A (ja) * | 2008-02-27 | 2009-09-10 | Panasonic Corp | 生体分子検出用電極基板およびその製造方法 |
| JP2009210316A (ja) | 2008-03-03 | 2009-09-17 | Panasonic Corp | 発光測定装置 |
| JP2009222636A (ja) * | 2008-03-18 | 2009-10-01 | Panasonic Corp | 生体物質の測定方法 |
| KR101603354B1 (ko) * | 2008-04-11 | 2016-03-14 | 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 나노입자 전기발생 화학발광 증폭 방법 및 시스템 |
| FI20100251A7 (fi) | 2010-06-15 | 2012-01-10 | Sakari Kulmala | Tarkat integroidut edulliset elektrodisirut point-of-need -analyysiä varten ja käyttömenetelmä kuumissa elektronien indusoimissa elektrokemiluminesenssijärjestelmissä |
| FI20100246L (fi) | 2010-06-11 | 2011-12-12 | Sakari Kulmala | Menetelmät ja laitteet luminesenssin tuottamiseksi integroiduista elektrodisiruista katodisten ja bipolaaristen pulssien avulla |
| FI20100248A0 (fi) | 2010-06-11 | 2010-06-11 | Kristiina Maekinen | Menetelmä proteiinien tuottamiseksi |
-
2011
- 2011-06-10 WO PCT/FI2011/000032 patent/WO2011154590A1/en not_active Ceased
- 2011-06-10 EP EP11791984.5A patent/EP2580581A4/en not_active Ceased
- 2011-06-10 EA EA201300009A patent/EA027942B1/ru active IP Right Revival
- 2011-06-10 US US13/703,520 patent/US9535029B2/en active Active
- 2011-06-10 KR KR1020137000821A patent/KR101925156B1/ko active Active
- 2011-06-10 EA EA201300011A patent/EA031831B1/ru active IP Right Revival
- 2011-06-10 WO PCT/FI2011/000031 patent/WO2011154589A1/en not_active Ceased
- 2011-06-10 EP EP11791982.9A patent/EP2580579A4/en not_active Ceased
- 2011-06-10 JP JP2013513719A patent/JP5932781B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-06-10 US US13/703,393 patent/US9176092B2/en active Active
- 2011-06-10 KR KR1020137000837A patent/KR101967487B1/ko active Active
- 2011-06-10 KR KR1020137000861A patent/KR101958741B1/ko active Active
- 2011-06-10 EP EP11791983.7A patent/EP2580580A4/en not_active Withdrawn
- 2011-06-10 EA EA201300008A patent/EA201300008A1/ru unknown
- 2011-06-10 RU RU2013102443/28A patent/RU2013102443A/ru not_active Application Discontinuation
- 2011-06-10 RU RU2013102436/28A patent/RU2013102436A/ru not_active Application Discontinuation
- 2011-06-10 US US13/703,418 patent/US9377433B2/en active Active
- 2011-06-10 JP JP2013513720A patent/JP5894151B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-06-10 WO PCT/FI2011/000033 patent/WO2011154591A1/en not_active Ceased
- 2011-06-10 EP EP20213148.8A patent/EP3910325A1/en not_active Withdrawn
- 2011-06-10 RU RU2013102437/28A patent/RU2568979C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2217007A (en) * | 1988-03-21 | 1989-10-18 | Jouko Juhani Kankare | Electrochemical analysis of analytes in solution |
| US5308754A (en) * | 1988-03-21 | 1994-05-03 | Kankare Jouko J | Electrogenerated luminescence in solution |
| GB2347746A (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-13 | Azur Env Ltd | Detecting analytes, particularly nucleic acids, in a sample |
| RU2010124406A (ru) * | 2007-11-16 | 2011-12-27 | Акцо Нобель Н.В. (NL) | Электрод |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2568979C2 (ru) | Интегрированные углеродные электродные чипы для электрического возбуждения хелатов лантанидов и способы анализа с их использованием | |
| AU6573700A (en) | Method for luminescence measurements | |
| CN113884481A (zh) | 一种干式双极电化学发光芯片及其在免疫检测中的应用 | |
| CN108344792A (zh) | 一种水体中总砷快速检测方法 | |
| KR101949537B1 (ko) | 음극 및 양극 펄스로 하여 통합 전극칩에서 발광을 생성하기 위한 방법 및 장치 | |
| CN109100400A (zh) | 用于检测刀豆蛋白a的传感器及其制备方法和应用 | |
| RU2385455C2 (ru) | Устройство, состоящее из проводника, изолятора, пористой пленки, и его использование для аналитических измерений, основанных на явлении электрохемилюминесценции | |
| JP3641100B2 (ja) | 電気化学発光検出セル | |
| JPH01302144A (ja) | 溶液中での電気発生のルミネセンスに基づく分析方法 | |
| Li et al. | Ultrasensitive eletrogenerated chemiluminescence immunoassay by magnetic nanobead amplification | |
| CN114011480A (zh) | 一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒 | |
| BR102018069600A2 (pt) | dispositivo descartável para detecção de biomarcadores por eletroquimiluminescência e método de obtenção e de detecção | |
| Mahmud et al. | Robust Gold Electrode Fabrication in a Microfluidic System | |
| FI111758B (fi) | Lyoluminesenssin käyttö analyyttisiin tarkoituksiin | |
| CN117279894A (zh) | 新型电化学发光共反应物及包含其的电化学发光系统 | |
| Ylinen-Hinkka | Hot electron-induced electrochemiluminescence studies with different cathode materials and electrode geometries | |
| CN111351781A (zh) | 电化学发光分析装置和使用其分析样品的方法 | |
| Parveen et al. | ECL Instrumentation |