RU2568872C1 - Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с - Google Patents
Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с Download PDFInfo
- Publication number
- RU2568872C1 RU2568872C1 RU2014141481/15A RU2014141481A RU2568872C1 RU 2568872 C1 RU2568872 C1 RU 2568872C1 RU 2014141481/15 A RU2014141481/15 A RU 2014141481/15A RU 2014141481 A RU2014141481 A RU 2014141481A RU 2568872 C1 RU2568872 C1 RU 2568872C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- hcv
- phage
- pseudovirions
- hepatitis
- Prior art date
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 title claims description 16
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 title claims description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title abstract 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 claims description 28
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 abstract 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 8
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 8
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 7
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 7
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 6
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 6
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 5
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical class [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091027551 Cointegrate Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- LHNIIDJCEODSHA-OQRUQETBSA-N (6r,7r)-3-[(e)-2-(2,4-dinitrophenyl)ethenyl]-8-oxo-7-[(2-thiophen-2-ylacetyl)amino]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SCC(=C(N2C1=O)C(=O)O)\C=C\C=1C(=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)C(=O)CC1=CC=CS1 LHNIIDJCEODSHA-OQRUQETBSA-N 0.000 description 2
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 2
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 2
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 2
- 241000589601 Francisella Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 2
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 description 2
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 2
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 2
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- -1 4- {2- [1- (2-methoxycarbonylamino-acetyl) -pyrrolidin-2-yl ] -3H-imidazol-4-yl} -phenyl Chemical group 0.000 description 1
- SGJHJTLXTSZBRW-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-fluoro-3,4-dihydro-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC1NC(=O)NC=C1F SGJHJTLXTSZBRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009062 ADP Ribose Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010049290 ADP Ribose Transferases Proteins 0.000 description 1
- 206010065051 Acute hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101000645498 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_10220 Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 1
- 101001132313 Clostridium pasteurianum 34.2 kDa protein in rubredoxin operon Proteins 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101800000585 Diphtheria toxin fragment A Proteins 0.000 description 1
- 102100031675 DnaJ homolog subfamily C member 5 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101000618325 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 12.4 kDa protein in mobB-Gp55 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000653284 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 9.4 kDa protein in Gp31-cd intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100026456 POU domain, class 3, transcription factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710133393 POU domain, class 3, transcription factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101000758676 Pyrococcus woesei Uncharacterized 24.7 kDa protein in gap 5'region Proteins 0.000 description 1
- 108010057277 Rev peptide 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000701835 Salmonella virus P22 Species 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037621 acute hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010009671 adenosylmethionine hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N chembl269478 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- SJDURFRPNNLLOO-LYAKTKFASA-N chembl415806 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)=CNC2=C1 SJDURFRPNNLLOO-LYAKTKFASA-N 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022925 sleep disturbance Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- JJICLMJFIKGAAU-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-9-(1,3-dihydroxypropan-2-yloxymethyl)purin-6-olate Chemical compound [Na+].NC1=NC([O-])=C2N=CN(COC(CO)CO)C2=N1 JJICLMJFIKGAAU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000009265 virologic response Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и генной инженерии и предназначено для лечения вирусного гепатита С (ВГС). Предложено лекарственное средство, содержащее модифицированные псевдовирионы фага MS2, оболочка которых создана белками «А» и «В» фага MS2, а часть геномной РНК, кодирующая «репликазу», заменена РНК, способной селективно уничтожать клетки, зараженные вирусом гепатита С или его РНК репликоном, при этом геном модифицированного псевдовириона фага MS2 характеризуется нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO 1. Изобретение обеспечивает эффективное средство для лечения хронической ВГС-инфекции. 5 ил., 1 табл., 13 прим.
Description
Изобретение относится к области медицины и генной инженерии и может быть использовано для лечения методом суицидной генотерапии вирусного гепатита С (ВГС-инфекции) всех известных субтипов.
В настоящее время проблема борьбы с ВГС-инфекцией (вирусом гепатита типа «С») приобрела глобальный характер из-за распространения вируса практически во всех странах, в том числе и в Российской Федерации, где количество ВГС-инфицированных по официальной оценке приближается к 5 миллионам человек (Богомолов П.О., Оказание медицинской помощи пациентам с хроническим гепатитом «С», Доклад Главного гепатолога МЗ Московской области, 2014). Острый гепатит С в большинстве случаев (в 70-85%) переходит в хроническую инфекцию, которая часто течет бессимптомно первые 10-15 лет, что затрудняет выявление и лечение ВГС. Как установлено, в США продолжительность жизни больных хроническим гепатитом С сокращена на 8-12 лет, если у них не было эффективного курса противовирусной терапии (Center for Disease Control and Prevention. HCV. http://www.cdc.gov/hepatitis/HCV. Accessed 8 Oct 2010). В Российской Федерации почти у 40% пациентов с хроническим гепатитом С через 20-25 лет после инфицирования выявляется цирроз печени (Самохвалов Е.И., Николаева Л.И., Альховский С.В. и др. Частота встречаемости отдельных субтипов вируса гепатита С в Московском регионе. // Вопросы вирусологии. 2013, №1, с. 36-40). Основной целью лечения является уничтожение вируса и предотвращение развития отдаленных осложнений. Успешное лечение определяют как достижение устойчивого вирусологического ответа (УВО), который подтверждается нерегистрируемыми уровнями РНК ВГС (HCV), по меньшей мере, спустя 6 месяцев после прекращения терапии (Pearlman В.L. Hepatitis С treatment update. Am. J. Med. 2004; 117(5): 344-352). Вероятность завершить терапию эффективно, т.е. достичь УВО, который включает в себя и нормализацию биохимических показателей печени, значительно выше, если терапия начата в острой фазе инфекции, но и в первые 10 лет течения хронического гепатита она больше, чем в более поздние сроки. Для ВГС характерна высокая частота генетических изменений, возникающих в процессе самовоспроизведения. Из этого следует, что практически у каждой вирусной частицы в последовательности геномной РНК есть хотя бы один и более нуклеотидов, по которым она отличается от предшественника. К настоящему времени, выделяют 7 генотипов и 67 субтипов ВГС (Donald В. Smith, Jens Bukh, Carla Kuiken, A. Scott Muerhoff, Charles M. Rice, Jack T. Stapleton, Peter Simmonds // Expanded Classification of Hepatitis С Virus Into 7 Genotypes and 67 Subtypes: Updated criteria and Genotype Assignment Web Resource. HEPATOLOGY 2014; 59[1]: 318-327).
В настоящее время разработано достаточно много препаратов, применяемых для лечения и профилактики ВГС-инфекции, различающихся механизмами воздействия, способами введения и лекарственными формами.
Известно, что для лечения острой ВГС-инфекции хорошо зарекомендовали себя химические препараты - ингибиторы ВГС-специфических ферментов. Так, например, известна композиция, обладающая иммуногенной активностью против ВИЧ, содержащая стериоизомеры алкил [2-(2-{5-[4-(4-{2-[1-(2-метоксикарбониламино-ацетил)-пирролидин-2-ил]-3Н-имидазол-4-ил}-фенил)-бута-1,3-диинил]-1H-имидазол-2-ил}-пирролидин-1-ил)-2-оксо-этил]-карбаматов общей формулы 1, проявляющие высокую активность по отношению к вирусу гепатита С (патент РФ 2518369, приоритет от 07.02.2013). Однако, для лечения хронической формы ВГС-инфекции применение химических препаратов -ингибиторов ВГС-специфических ферментов оказалось не эффективным из-за низкой точности копирования матрицы и, как следствие, высокой частоты образования устойчивых форм.
Известно использование интерферонов для осуществления этиотропного лечения ВГС с доказанной эффективностью (Болезни печени и желчевыводящих путей / Под ред. В.Т. Ивашкина. - М.: Изд. Дом М-Вести, 2002. - 432 с.). Интерфероны обладают комплексной активностью, включая антипролиферативное, иммуномодулирующее, противовирусное действия, а также участвуют в индукции дифференцировки клеток, из которых наиболее часто используемым, является интерферон-α [National Institute of Health Consen-sus development conference statement: Management of hepatitis С 2002 // Hepatology. - 2002. - Vol. 36, N5 (suppl. 1). - P. 3-19.]. Однако, при проведении противовирусной терапии необходимо контролировать не только эффективность лечения, но и проявления побочных эффектов, наиболее частым из которых является гриппоподобный синдром (повышение температуры, слабость, головная боль, тошнота), тромбоцитопения, нейтропения, снижение аппетита, похудание, депрессия, раздражительность, нарушение сна (Лобзин Ю.В., Жданов К.В., Волжанин В.М. и др. Вирусные гепатиты: клиника, диагностика, лечение. - СПб.: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2003. - 192 с.), что достаточно часто имеет место при использовании интерферонов. Указанные препараты также не обеспечивают достаточной эффективности при лечении хронической формы ВГС.
Известно, что для лечения острой ВГС-инфекции хорошо зарекомендовали клинические протоколы, пользующие различные препараты интерферонов-α в сочетании с рибовирином (US Patents 6277830, 6824768), нуклеозильные производные и другие ВГС-специфические ингибиторы ферментов (US Patents 6660721, 8614207), моноклональные антитела (US Patents 5308750, 6428792, 6692908, 6951646, 7105303, 7314919, 8603468, WO 2007111965, WO 2002008292, WO 2007143701, US Patent Application 2005035735), пептидные или siPHK ингибиторы ВГС-специфических ферментов (US Patent 7326536, US Patent Application 0070004635, WO 2006035061). Для повышения эффективности лечения и снижения нежелательных побочных эффектов применяют различные комбинации с использованием интерферона, как например, в патенте РФ 2394589, приоритет от 14.07.2004, где предлагается для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения вызываемой ВГС инфекции, использовать конъюгат интерферона-α с водорастворимым полимером в комбинации с рибавирином и циклоспорином А. Предполагается, что изобретение обеспечивает эффективное воздействие у пациентов с HCV инфекцией, которые изначально не отвечали на монотерапию пэгилированным интерфероном, а также комбинацией интерферона альфа с рибавирином или интерферона с циклоспорином А. Однако, результаты клинического лечения с использованием указанных препаратов показывают уровень излечения не выше 50%. При этом, ВГС-инфицированные, которые после лечения интерфероном или препаратами на его основе относятся к группе так называемых «не отвечающих», являются источником резистентных форм вируса. Клинические протоколы лечения ВГС-инфекции с помощью интерферонов-α в сочетании с рибовирином или другими ингибиторами ВГС-специфических ферментов увеличивают продолжительность периода появления резистентных форм вируса у хронически ВГС-инфицированных, достоверно не снижая процент «не отвечающих». Есть обоснованные предположения, что появлению резистентных форм вируса у хронически ВГС-инфицированных служат укороченные геномы ВГС (РНК-репликоны), способные к самостоятельной репликации в цитоплазме зараженной клетки в виде двунитевых РНК (US Patent Application 20130115592). Репликация двунитевых РНК не приводит к формированию вирусных частиц, но служит субстратом для образования рекомбинантных структур и восстановлению способности к формированию инфекционных вирусных частиц (US Patent Application 20130115592). Все это заставляет искать новые комбинационные подходы к лечению ВГС-инфекции, особенно при хроническом течении (US Patent Application 20140127158).
Последние достижения, касающиеся лечения хронического течения ВГС-инфекции, основаны на использовании высокоспецифичных ингибиторов вирусных
ферментов (DAA - direct acting antiviral - прямое антивирусное действие) (Pamela S. Belperio, PharmD, BCTPS, AAHIVE National Public Health Clinical Pharmacist VA Office of Public Health / Population Health. Chronic Hepatitis С Virus (HCV) Infection: Treatment Considerations from the Department of Veterans Affairs National Hepatitis С Resource Center Program and the Office of Public Health; last revised on May 13, 2014). Эти препараты найдены в экспериментах на клеточных культурах, содержащих РНК-репликоны ВГС (эксперименты in vitro), что косвенно свидетельствует о признании роли РНК-репликонов в развитии патологии у инфицированных вирусом людей (in vivo). Результаты клинических испытаний DAA терапии людей с хронической формой ВГС-инфекции показывают эффективность около 85%. Однако, стоимость такого лечения составляет не менее $30 тыс. Кроме того, применяемые протоколы DAA терапии лечения хронической ВГС-инфекции, приводят, зачастую, к возникновению устойчивых вариантов (с частотой 0,5%; S. Margeridon-Thermet, R.W. Shafer. Comparison of the Mechanisms of Drug Resistance among HIV, Hepatitis B, and Hepatitis C // Viruses 2010, v. 2 (12), pp. 2696-2739). Механизмом, лежащим в основе появления устойчивых форм, зачастую, являются РНК рекомбинационные события (Е. Simon-Loriere, Е.С. Holmes. Why do RNA viruses recombine? // Nat Rev Microbiol. 2011, v. 9(8): 617-626; Domingo E., J. Sheldon, C. Perales. Viral Quasispecies Evolution // Microbiology and Molecular Biology Reviews June 2012 v. 76(2) p. 159-216).
Таким образом, применяемые в настоящее время препараты и композиции, позволяют повысить эффективность лечения и профилактики ВГС, однако нигде не говорится о полной стерилизации организма от вируса. Отсутствие такой стерилизации, согласно имеющимся данным в отношении клинического течения ВГС, приводит, спустя длительный период, к «новому» появлению вируса или его рекомбинантных форм.
Известны примеры использования для стериалицации организма от вирусов так называемой «суицидной генотерапии». В качестве суицидной генотерапии (около 12% клинических протоколов FDA) различных вирусных инфекций (http://www.eurolab.ua/encyclopedia/287/5966/), применяются гены тимидин киназы вируса простого герпеса (HSV-ТК; Goebel, Е.A., Davidson, В.L., Graham, S.М., Kern, J.A. Tumor reduction in vivo after adenoviral mediated gene transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene and ganciclovir treatment in human head and neck squamous cell carcinoma // Otolaryngology and Head and Neck Surgery 1998, v. 119, pp. 331-336), бактериального гена дезаминазы 2-окси-6-аминопиримидина (CD; Mulen С.А., М. Kilstrup, R.M. Blaese.: Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5 fluorocytosine: a negative selection system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, v. 89, №1, pp. 33-37) илифрагмент гена токсина дифтерии (DT-A), кодирующий моно АДФ-рибозил трансферазу дифтамина фактора элонгации EF2 (Qiao J., Caruso М.: PG13 Packaging Cells Produce Recombinant Retroviruses Carrying a Diphtheria Toxin Mutant Which Kills Cancer Cells // J. Virology July 2002, Vol. 76, №14, p. 7343-7348). Последовательность гена токсина дифтерии исключительно устойчива к аминокислотным заменам и ошибкам трансляции. Кроме того, его активность не требует введения в организм дополнительных низкомолекулярных субстратов (Corda D., Di Girolamo М. Functional aspects of protein mono-ADPribosylation // The EMBO Journal 2003, v. 22, №9, pp. 1953-1958). Белок обладает высокой токсичностью, благодаря которой, единственная целая молекула или ее DT-A фрагмент, способна убить клетку (Yamaizumi М., E. Mekada, T. Uchida, Y. Okada.: One molecule of diphtheria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell // Cell 1978, v. 15, pp. 245-250). Одним из видов «суицидной генотерапии» является технология АГП (антивирусной генетичиской программы), обеспечивающая селективное уничтожение клеток, зараженных вирусом гепатита типа «С» (HCV) или его инфекционной РНК и предусматривающая введение в клетки плазмиды pcDT, кодирующей псевдо HCV <<->> РНК и способной направлять синтез А-субъединицы дифтерийного токсина в зараженных HCV клетках (Патент РФ 2158139, приоритет от 04.11.1999; Патент РФ 2159285, приоритет от 06.032000). Сравнение между всеми последовательностями секвенированных изолятов (http://s2as02.genes.nig.ac.jp/) и изменчивости структуры РНК-зависимой РНК-полимеразы ВГС субтипа 1b, обозначаемой как белок NS5b (http://hcv.lanl.gov/content/sequence/HCV/variability/HCV_variability.html), позволяют положительно оценить известную стратегию АГП уничтожения клеток, зараженных ВГС или его РНК-репликонами (US Patents 7790448 и 8022197, US Patent Applications 20030215917, 20080182895, 20090035747, 20100028922, 20110053160, 20110129868, 20110245328). Однако АГП приводит к высвобождению из клеток токсических молекул А-субъединицы токсина дифтерии, которые вызывают у млекопитающих синдром увеличения сосудистой проницаемости (WO 2005052129), что негативно отразится на последствиях клинического применения технологии АГП.
Известны средства адресной доставки с выраженной тропностью к гепатоцитам, которые способны переносить в клетки различные вещества, имеющие анти-ВГС активность (US Patents Application, 20090054246, 20080044437, 20070264285), из которых наиболее простыми методами выглядят основанные на применении бактериофагов (US Patents Application 20130017210). Последние удобны в контролируемом производстве и применении (Carlee Е. Ashley, Eric С. Carnes, Genevieve К. Phillips, Paul N. Durfee, Mekensey D. Buley, Christopher A. Lino, David P. Padilla, BrandyPhillips, Mark В. Carter, Cheryl. L. Willman, C. Jeffrey Brinkera, Jerri do Carmo Caldeira, Bryce Chackerian, Walker Wharton, David S. Peabody. Cell-Specific Delivery of Diverse Cargos by Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles // ACS Nano 26 July 2011; 5[7]: 5729-5745). Известны способы упаковки молекул РНК в вирион фага MS2 применяемые в рамках так называемой технологии защиты РНК от действия внешней среды - метод «армирования» РНК (US Patents 5677124, 5919625 и 5939262). Первые протоколы «армирования» РНК позволяли упаковать линейную молекулу размером не более 500 нуклеотидных звеньев, тогда как к настоящему времени опубликованы протоколы «армирования» РНК с размерами 2248 нуклеотидов (Y. Wei, С. Yang, В. Wei, Jie Huang, L. Wang, S. Meng, R. Zhang, J. Li. RNase-Resistant Virus-Like Particles Containing Long Chimeric RNA Sequences Produced by Two-Plasmid Coexpression System // JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2008, Vol. 46 [5], p. 1734-1740) и 3034 оснований (S. Zhan, J. Li, R. Xu, L. Wang, K. Zhang, R. Zhang. Armored Long RNA Controls or Standards for Branched DNA Assay for Detection of Human Immunodeficiency Virus Type // JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2009, Vol. 47[8], p. 2571-2576). Однако, длинные РНК должны иметь способность к упаковке в псевдовирионы фага MS2 и удовлетворять определенным правилам РНК-дизайна (J. Lee, W. Kladwang, М. Leea, D. Cantub, M. Azizyana, H. Kimc, A. Limpaechera, S. Yoonc, A. Treuillea, R. Das. RNA design rules from a massive open laboratory // PNAS February 11, 2014, vol. 111 [6], pp. 2122-2127). Расчеты соответствующих структур проводят на сайте http://getsatisfaction.com/EteRNAgame. Известная система продукции псевдовирионов фага MS2 с инкупсулированной в них РНК еще не является фармацевтически приемлемой. Объясняется это тем, что она ограничивается бактерией E. coli, способной выделять в среду культивирования лиополисахарид (LPS), известный как экзотоксин, и который способствует развитию сильного иммунологического ответа на препарат, в котором содержится LPS (WO 2006121232).
Таким образам из уровня техники известны способы получения псевдовирионов фага MS2, содержащие невирусную РНК, однако их применение ограничивается диагностикой ВГС-инфекции и не найдены подходы для получения фармацевтически приемлемой субстанции. Кроме того, все применяемые в настоящее время препараты и композиции, предназначенные для воздействия на различные типы и субтипы ВГС, не учитывают индивидуальные особенности структуры его генома, связанные с высокой частотой генетических изменений, приводящие к наличию у одного пациента отличающихся структур геномов. Соответственно, и применяемые DAA протоколы терапии (direct acting antiviral - прямое антивирусное действие),предназначенные для лечения хронической ВГС-инфекции, приводят, зачастую, к возникновению устойчивых вариантов.
Задачей настоящего изобретения является создание лекарственного средства для лечения хронической формы вирусного гепатита С, способного обеспечить полную стерилизации организма от клеток, зараженных РНК вирусом гепатита С, при минимизации нежелательных побочных воздействий.
Решение указанной задачи обеспечивается тем, что, в отличие от известных лекарственных средств для лечения вирусного гепатита С, новым то, что лекарственное средство содержит модифицированные псевдовирионы фага MS2, оболочка которых создана белками «А» и «В» фага MS2, а часть геномной РНК, кодирующая «репликазу», заменена РНК, способной селективно уничтожать клетки, зараженные вирусом гепатита С или его РНК репликоном, при этом геном модифицированного псевдовириона фага MS2 характеризуется нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO1.
Предлагаемая генетическая конструкция псевдовириона фага MS2 позволяет получить эффективное лекарственное средство для лечения вирусного гепатита С на основе наноструктур псевдовирионов фага MS2 с инкапсулированной в них РНК, являющейся субстратом для ВГС-специфического фермента NS5b, взаимодействие которых приводит к гибели клеток, зараженных ВГС или его репликонами, а также обеспечить технологичность микробиологического производства указанного средства, созданного с использованием генной инженерии.
Результаты исследований иллюстрируются графическими изображениями:
Фиг. 1 - нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный псевдовирион фага MS2;
Фиг. 2 - результат ПЦР (полимеразной цепной реакции) гена токсина дифтерии;
Фиг. 3 - фрагмент результата секвенирования для определения структуры токсина;
Фиг. 4 - схема образования коинтегратов T7::pAGP с результатами определения сайта интеграции.;
Фиг. 5 - титрование псевдовирионов фага MS2 на газоне штамма HBCS140;
Предлагаемое лекарственное средство может быть реализовано на базе существующего уровня техники следующей последовательностью действий.
Первоначально производят подготовительные генно-инженерные манипуляции, в том числе, по схеме (WO 2005052129), в ПЦР - получали ДНК фрагментагена (асс. №AB 602359), соответствующую ORF (открытая рамка трансляции) А-субъединице токсина дифтерии (76-654 п.о.), но, во-первых, содержащую на N-конце тетрапептид MLMM - метионил-лейцил-диметионил) и, во-вторых, имеющий замены в ORF известные специалистам. Затем на 5′-конец пристыковывают ДНК последовательность A/GCCACC. В антисмысловой ориентации на 3′-конец полученного ДНК-фрагмента вводят 3′-UTR ВГС субтипа 1b (асс. №AF 176573, фрагмент 9375-9600 о.). Полученную АГП проверяют на способность образовывать дуплексы на сайте rna.tbi.univie.ac.at/RNAz.
Одновременно с созданием АГП, из кДНК полноразмерного генома фага MS2 (pMS3.6) делетируют ORF РНК-репликазы (асс. №V 00642, 1761-3380 п.о., Княжев В.А., Сивов И.Г., Сергиенко В.И. РНК-трансдукция неинфекционными вирионами фага MS2 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2002, №3, стр. 56-63). Вновь полученный вариант плазмиды обозначен pMS3,6ΔRep.
Бактериофаг Т7 способен к трансдукции плазмид colE1-типа, за счет образования IS481-зависимого коинтеграта между ДНК плазмиды и фага (WO 199804731). Выявить трасндуцирующие частицы можно при последующих пассажах бактериофага на RecA или RecBCsbcB мутантных реципиентных бактериях E. coli. При этом посевы следует выдерживать при комнатной температуре, при которой потомство псевдолизогенных клонов по фенотипу будет вести себя похожим образом, что описано для бактериофага Т3 (Krueger D.Н., W. Presber S. Hansen, Н.A. Rosenthal. Biological functions of the bacteriophage T3 SAMase gene // J. Virol. 1975, 16 (2), pp. 453-455). Фаговое T7 потомство, полученное от псевдолизогенов, позволяет получать Hft-лизаты (лизаты с высокой частотой трансдукции, J.N. Coetzee. Intra-species Transduction with Proteus mirabilis High Frequency Transducing Phages // Journal of General Microbiology 1976, v. 93, pp. 153-165, R.I. Chatc, D. Botstein, T. Watanabe, Y. Ogata. Specialized Transduction of Tetracycline Resis-tance by Phage P22 in Salmonella typhimurium. II. Properties of a High-Frequency-Transducing Lysate // Virology 1972, v. 60, pp. 883-898). Основываясь на информации о природе рецепторного комплекса для фага Т7 (U. Qimron, В. Marintcheva, S. Tabor, С.С. Richardson. Genome wide screens for Escherichia coli genes affecting growth of T7 bacteriophage // PNAS December 12, 2006, vol. 103[50], pp. 19039-19044), установили возможность Т7-зависимой трансдукции плзмид colE1-типа к ряду грам-отрицательных бактерий, в числе которых Escherichia coli, Salmonella enterica Typhimurium, Shigella flexnery, Bordetella parapertussis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Erwinia carotovorum, Yersinia enterocolitica, Francisella spp, Brucella abortus. В эти бактерии с помощью различных методов генетического переноса можно ввести плазмиду pMS1,9 с клонированным геном РНК-репликазыфага MS2, что позволяет определять титр псевдовиронов (например, штамм HBCS140).
Потомство клонов псевдолизогенов с pMS1,9 можно вырастить на плотных питательных средах строго при комнатной температуре и, после получения бактериальной массы, перенести клетки в условия 37°C. Прогретые псевдолизогенные бактерии начинают выделять псевдовирионы фага MS2 с упакованной в них АГП. Полученные псевдовирионы фага MS2, могут иметь тропность к гепатоцитам (Княжев В.А., Сивов И.Г., Сергиенко В.И. Бактериофаг доставляет РНК в гепатоциты // VI-ая международная конференция Канны (Франция), апрель 2002 г.), если провести их модификацию.
Модификации псевдовирионов фага MS2, содержащих АГП, следует разделить по методам их создания на генетические и химические. Генетические модификации касались введения на С-конец ORF «В»-белка различных пептидов. С этой целью, 5′-концевую последовательность ORF «В»-белка, не изменяя фазу трансляции, удлинили фрагментом, кодирующим адресный для мембраны гепатоцитов пептид CS-белка циркумспорозоитной фазы Plasmodium falciparum (19 а.о.). Еще одной генетической модификацией 5′-концевой последовательности ORF «В»-белка по указанной выше схеме было удлинение PTD-пептидом (Protein Transduction Domain). Другой генетической модификацией являются замены в позиции 55-69; 270-278; 304-321 ORF «В»-белка так, чтобы модифицированный ген кодировал белковый продукт, имеющий сайты узнаваемые протеазой NS3. РНК псевдовирионов фага MS2, содержащих АГП, с модифицированным геном «В»-белка («В*15») была устойчива к действию РНК-аз сыворотке крови здоровых людей. В сыворотке больных хронической формой гепатита «С» наблюдали разрушение РНК псевдовирионов фага MS2, содержащих АГП.
Химические модификации касались обработки РНК псевдовирионов фага MS2, содержащих АГП, 6-пептидил замещенными производными аминопенициллановой кислоты. Пептидами, используемыми для модификации, были пептид CS-белка или PTD-пептиды.
Токсичность и лечебный эффект модифицированных псевдовирионов фага MS2, содержащих АГП, контролируют по известным специалистам технологическим регламентам (анализ титра специфических иммуноглобулинов (RU 2239453) и цитотоксических лимфоцитов (RU 2514019), а так же вирусную нагрузку (RU 2468743) и показатель качества жизни (QoL-36, RU 2482844), относящейся к здоровью - Health Related Quality of Life [HRQOL]).
Привлечение добровольцев к участию в исследованиях осуществлялось с учетом положений Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (ВМА) «Этические Принципы для медицинских исследований с человеком», параграф 22 части «В».
Все манипуляции с материалами подозрительными на зараженность ВГС проводятся с учетом правил СП 3.1.3112-13, утвержденными Постановлением Главного санитарного врача РФ от 22.10.2013 №58.
Краткое описание графических изображений:
Фиг. 1 - нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный псевдовирион фага MS2 (SEQ ID NO1). Геном получен в результате рекомбинации in vitro между кДНК геномной РНК фага MS2 и антивирусной генетической программы (Патент РФ 2159285) по схеме описанной ранее (Княжев В.А., Сивов И.Г., Сергиенко В.И. Бактериофаг доставляет РНК в гепатоциты // VI-ая международная конференция Канны (Франция), апрель 2002 г.). Геном содержит четыре открытые рамки трансляции: по смысловой цепи 130-1311 п.о., 1335-1727 п.о., 1678-2109 п.о., по антисмысловой цепи 2534-1767 п.о.;
Фиг. 2 - приведен результат ПЦР гена токсина дифтерии. Продукт ПЦР, получен на матрице хромосомной ДНК токсинообразующего штамма Corynebateria diphtheriae. Дорожки нумерованы справа налево. По 4-ой (крайняя справа) результат разделения маркеров молекулярного веса фрагментов ДНК (10-1,0 т.п.н., сверху вниз). Наиболее светлыми полосами выглядят 4-2 т.п.н. На второй дорожке показан позитивный результат, когда размер продукта ПЦР имеет подвижность сравнимую с фрагментом около 1,7 т.п.н.
Фиг. 3 - приведен фрагмент результата определения структуры токсина. Указанный секвенс (последовательность нуклеотидов) соответствует части гена DT 1192-1267 а.о. с точковой заменой С1261→Т, что в результате дает мотив «ТТТТ», тогда как в GenBank «ТТТС».
Фиг. 4 - приведена схема образования коинтегратов T7::pAGP с результатами определения сайта интеграции. Структура коинтеграта хромосомы Т7 (серый) и плазмиды рКК3 (черный). Сайт интеграции находиться после промотора A3 (позиция 740 п.о. Т7 генома). Плазмидная часть коинтеграта ограничена полноразмерными прямыми повторами IS481 (черные указатели показаны точечным контуром) и копиями CTAG (852-855 п.о. Т7 генома). Последовательности «стыков», показаны в штриховых прямоугольниках (серым и черным цветом, соответственно). В реакциях PCR амплификации (результат - на фото) использовали праймерные олигонуклеотиды(последовательности праймеров показаны на фигуре). На фото (сверху - вниз): дорожка 1 - маркеры размеров 1-0,4 т.п.о., дорожка 2 - маркеры размеров 8-1 т.п.о., дорожка 3 (нижняя) - продукты амплификации с соответствующими парами праймеров. Секвенирование продуктов амплификации выполнили согласно «Руководству» для 373А Автоматического секвенатора (Applied Biosysthems, USA), использовали наборы окрашенных ABI терминирующих нуклеотдов в реакции с Taq-полимеразной FS (Perkin Elmer, USA). Файлы экспериментальных данных (формат EMBL) сравнивали с последовательностями (асс. №J 02518) основы GENBANK.
Фиг. 5 - приведено титрование псевдовирионов фага MS2 на газоне штамма HBCS140. Негативные колонии («бляшки», указаны стрелкой) псевдовирионов фага MS2 на газоне штамма HBCS140 (разведение фаголизата 10-7, число негативных колоний - 84).
Изобретение поясняется следующими примерами:
Пример 1. Получение модифицированного ДНК фрагмента, соответствующего ORF А-субъединице токсина дифтерии.
Хомосомную ДНК токсинообразующего штамма Corynebateria diphtheriae использовали для ПЦР в качестве матрицы. Размер полученного продукта составил около 1,7 т.п.н. (Фиг. 2). Указанные на Фиг. 3 секвенс (последовательность нуклеотидов) соответствует части гена DT 1192-1267 а.о. с точковой заменой С1261→Т, что в результате дает мотив «ТТТТ», тогда как в GenBank указана последовательность «ТТТС».
Замена лидерного пептида на последовательность MLMM была проведена с помощью 99-ти членного полинуклеотида структуры 5′PO4-AATTATTTTATGAGTCCTGGTAAGG
GGATACGTTCATATGGCTAGCATGGGCGCTGATGATGTTGATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAAT-3′OH (подчеркиванием указан NdeI сайт для реклонирования). Для удобства реклонирования и выделения токсина использовали второй 57-ми членный полинуклеотид 5′PO4-TTTTTGAAATCAAAAGCGATCCGAATTCTGAAAGGTAGTGGGGT CGTGTGCTGGTAA-3′OH (подчеркиванием указан EcoRI сайт для реклонирования). Оба полинуклеотида в структуру плазмиды по месту комплиментарных последовательностей вводили RecA-зависимой реакцией замещения цепи. Гереродуплекс получали в реакции удлинения праймера с Taq-полимеразой и последующего лигирования однитевых разрывов с 5′-фосфатными концами длинных полигонуклеотидов. Вновь полученную цепь амплифицировали в ПЦР с праймерами, комплиментарными последовательностям с NdeI и EcoRI сайтами. Из продукта амплификации вырезали NdeI - EcoRI фрагмент,который клонировали в плазмиду pGEM-T, «вскрытую» указанными эндонуклеазами (схема реклонирования показана на Фиг. 4).
Пример 2. Получение плазмиды pMS3,6ΔRep.
Геномную РНК бактериофага амплифицировали в ОТ-ПЦР с праймерами указанными в публикации (Княжев В.А., Сивов И.Г., Сергиенко В.И. РНК-трансдукция неинфекционными вирионами фага MS2 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2002, №3, стр. 56-63) и после объединения двух фрагментов кДНК получили плазмиду pMS3,6, которая вызывает образование инфекционного фага в условиях индукции. В ORF гена «репликазы» методом точкового мутагенеза последовательность СААСАА заменили CCGCCG (сайт для Eco52I). Делецию гена «репликазы» (1615 п.о.) проводили эндонуклеазами рестрикции Eco52I и Sacl, обработкой ДНК плазмиды pMS3,6 с последующей восстановлением последовательности сайта для EcoRI. Полученная плазмида получила обозначение pMS3,6ΔRep.
Пример 3. Получение плазмиды pAGP (pMS3,6ΔRep, AGP).
Фрагмент кДНК, кодирующий АГП, собран по схеме (Сивов И.Г., Соболев А.Ю., Самохвалов Е.И., Сергиенко В.И. Антивирусная генетическая программа - новый тип ДНК-вакцины / /Доклады Академии наук 2001, №6, стр. 834-837) ограничен сайтами NotI-EcoRI, что позволяет заменить Eco52I-Sacl фрагмент на NotI-EcoRI фрагмент.
Пример 4. Получение псевдолизогенов по фагу Т7.
Спонтанные транспозиции IS481 выявляли при заражении штаммов E. coli pAGP. При трансдукции маркера AmpR бактериофагом Т7 реципиентами служили RecA или RecBC SbcB-штаммы E. coli, а селекцию AmpR клонов проводили при 25°C. Из материала трансдуктантов при температурах более 25°C выделялся бактериофаг Т7 (псевдолизогения). Частота образования псевдолизогенных клонов 1-5×10-9. IS481-зависимые интеграции плазмиды pAGP в геном бактериофага находятся в последовательности TGAGTGCATGA CTAGCGGATA между промотором A3 и первой ORF. Указанная последовательность находится в начале хромосомы бактериофага Т7 (841-861 п.н.).
Пример 5. Получение Hft-лизатов и трансдукция фагом Т7.
Коинтеграты T7::pAGP в потомстве выделенных псевдолизогенных клонов могли быть размножены так же как это описано для бактериофагов (RU 2209088). Для этогопотомство псевдолизогенных клонов заражали фагом Т7 при t=30°C. Полученными лизатами (соотношение титров фаг:коинтеграт=1:1) проводили трансдукцию фенотипов лекарственной устойчивости (AmpR) некоторых грамотрицательных бактерий, в числе которых Escherichia coli, Salmonella enterica Typhimurium, Shigella flexnery, Bordetella parapertussis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Erwinia carotovorum, Yersinia enterocolitica, Francisella spp, Brucella abortus.
Пример 6. Получение высокого титра псевдовирионов фага MS2, содержащих АГП.
Псевдолизогенные Т7:: pAGP клетки могли быть выращены в жидкой минимальной среде, которая «аэрировалась» на магнитной мешалке, при комнатной температуре в течение 48 часов не менее. По достижению оптической плотности, соответствующей стандарту 109 клеток на 1 мл, в среду добавляли глюкозу, тритон и дрожжевой экстракт до концентраций, характерных для L-бульона (Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J.E. Molecular Cloning: a Laboratory Manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1982.1st.2nd,3th v′s.), а также рифампицин (до 150 мкг/мл), и, подогревая среду до 38°C, продолжали «аэрацию» еще 24 часа.
Выделение псевдовирионов, проводили после осветления клеточного лизата центрифугированием (15000 об/мин) с последующим осаждением ПЭГ-6000 в присутствии NaCl, как известно специалистам. В результате всех проведенных выше процедур был получен модифицированный псевдовирион фага MS2, геном которого характеризуется нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO1.
\Пример 7. Генетические модификации псевдовирионов.
Генетические модификации псевдовирионов проводили фрагментами ДНК, кодирующими:
пептид CS-белка циркумспорозоитной фазы Pl. falciparum (DKHIEQILKKLKQPNEGEP),
или PTD пептиды: GRKKRRQRRR; NRRMKWKKPKKKRK; RQIKIWFQNRRMKWKK; VRLPPPVRLPPPVRLPPP; TRQARRNRRRRWRERQR; RRRRNRTRRNRRRVR; TRRQRTRRARRNR; KRPAAIKKAGQAKKKK; GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL; LLIILRRRIRKQAHAHSK, известные специалистам, что проводило к удлинению ORF «В»-белка в плазмиде pAGP.
Другой генетической модификацией являются замены в позиции 55-69; 270-278; 304-321 ORF «В»-белка так, чтобы модифицированный ген кодировал белковый продукт, имеющий сайты узнаваемые протеазой NS3.
Пример 8. Синтез 6-АПА модифицированных пептидов.
Полученные на пептидном синтезаторе ABI 488А (Perkin Elmer, Norwalk, Conn.) методом F-moc (метод твердофазного синтеза пептидов с флуренилметоксикарбонил/трет-бутил производными аминокислот) пептиды, требовали стадии «снятия защиты» с 15 мМ трифлуороуксусной кислотой (TFA) и проводили выделение целевого продукта методом жидкостной хроматографией высокого давления (HPLC) согласно прилагаемым инструкциям.
Лиофильно высушенные 8-ми или 12-ти членные пептиды, со структурой указанной выше, использовали для создания конъюгатов с натриевой солью бромоацетилированной 6-АПА в 100 мМ бортном буфере (pH=8.3). Конъюгаты пептидов с 6-АПА вновь выделяли с помощью HPLC и лиофилизировали. Часть препарата комбинированного «гаптена» использовали для определения его способности ковалентно присоединяться к сывороточному альбумину человека (технология в общем виде описана в US Patent 4596768).
Пример 9. Химические модификации псевдовирионов.
Для определения и количественной оценки β-лактамазной активности псевдовирионов использовали методику, основанную на изменении окраски антибиотика нитроцефина при распаде его β-лактамной связи описанную ранее (И.В. Жильцов, И.С. Веремей, В.М. Семенов, И.И. Генералов, С.К. Егоров. Механизм гидролиза β-лактамной связи под воздействием альбумина // Иммунопатология, аллергология, инфектология 2011, №3: стр. 24-31). Для проведения экспериментов мы использовали химически чистый нитроцефин производства Calbiochem. При этом максимум поглощения продукта реакции меняется с 390 нм на 486 нм. Пептиды смешивали с псевдовирионами в «молярном» соотношении 10:1 в 10 мМ фосфатном буфере (pH=8,0). Реакцию проводили при комнатной температуре в течении 24 часов. Определение титра псевдовирионов до и после модификации, позволяет оценивать конечную концентрацию частиц в растворах (коэффициент 0,2).
Пример 10. Протокол введения псевдовирионов.
Препараты для введения проверяли на токсичность с помощью теста с Limulus амебным лизатом <0,1 ед/мкг. Введение проводили двух- или трехкратно с интервалом в две недели (титры псевдовирионов определенные с помощью чувствительного штамма HBCS140). При первичном введении титр псевдовирионов был ≤108. Методы введениявнутримышечный, пероральный или ректальный. Количество введений определяли по результатам оценки кожной пробы.
Пример 11. ИФА.
Уровень антител классов IgG и IgM определяли с помощью коммерческих наборов «РекомбиБест анти-ВГС» или, для определения ВГС-антигенов, с помощью "ВГС АГ/АТ-ИФА-БЕСТ" согласно прилагаемым инструкциям.
Пример 12. Определение CTL активности.
CTL (цитотоксический лимфоцит) активность определяли методом внутрикожной пробы с синтетическими коммерческими ВГС-специфическими антигенами фирмы «РекомбиБест» или НПО «Вектор».
Пример 13. Определение эффективности лечения псевдовирионами.
Техника подсчета: Набор для количественного RT-PCR (Becton Dickinson, USA), опрос по протоколу «QoL-36».
Предлагаемое лекарственное средство позволяет обеспечить эффективное лечение хронической ВГС-инфекции посредством полной стерилизации организма от клеток,зараженных РНК вирусом гепатита С, при минимизации нежелательных побочных воздействий, упростить процесс вакцинации и может быть реализовано в амбулаторных условиях на базе имеющегося оборудования.
Claims (1)
- Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита С, отличающееся тем, что оно содержит модифицированные псевдовирионы фага MS2, оболочка которых создана белками «А» и «В» фага MS2, а часть геномной РНК, кодирующая «репликазу», заменена РНК, способной селективно уничтожать клетки, зараженные вирусом гепатита С или его РНК репликоном, при этом геном модифицированного псевдовириона фага MS2 характеризуется нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014141481/15A RU2568872C1 (ru) | 2014-10-15 | 2014-10-15 | Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014141481/15A RU2568872C1 (ru) | 2014-10-15 | 2014-10-15 | Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2568872C1 true RU2568872C1 (ru) | 2015-11-20 |
Family
ID=54598193
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014141481/15A RU2568872C1 (ru) | 2014-10-15 | 2014-10-15 | Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2568872C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021215952A1 (ru) * | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Индженик" | Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus |
| RU2811106C2 (ru) * | 2020-04-24 | 2024-01-11 | Сф Биотех Лаборатувар Данишманлик Аноним Ширкети | Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013081A1 (en) * | 1991-01-24 | 1992-08-06 | British Technology Group Ltd. | Antigen-presenting capsid with fusion ms2-coat protein |
| RU2158139C1 (ru) * | 1999-11-04 | 2000-10-27 | Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Минздрава РФ | Способ селективного уничтожения клеток (варианты) |
| EP1394255A2 (en) * | 1989-03-17 | 2004-03-03 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics and vaccines |
| RU2409667C2 (ru) * | 2004-09-21 | 2011-01-20 | Цитос Биотехнологи Аг | Вирусоподобные частицы, включающие гибридный белок белка оболочки бактериофага ар205 и антигенного полипептида |
-
2014
- 2014-10-15 RU RU2014141481/15A patent/RU2568872C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1394255A2 (en) * | 1989-03-17 | 2004-03-03 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics and vaccines |
| WO1992013081A1 (en) * | 1991-01-24 | 1992-08-06 | British Technology Group Ltd. | Antigen-presenting capsid with fusion ms2-coat protein |
| RU2158139C1 (ru) * | 1999-11-04 | 2000-10-27 | Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Минздрава РФ | Способ селективного уничтожения клеток (варианты) |
| RU2409667C2 (ru) * | 2004-09-21 | 2011-01-20 | Цитос Биотехнологи Аг | Вирусоподобные частицы, включающие гибридный белок белка оболочки бактериофага ар205 и антигенного полипептида |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DATABASE, GenBank, V00642.1, 21.10.1996 [найдено 11.06.2015]. Найдено из Интернет: URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/. * |
| DE WACHTER R. et al. Studies on the bacteriophage MS2. The untranslated 5'-terminal nucleotide sequence preceding the first cistron. Eur J Biochem. 1971 Oct 14; 22(3): 400-414. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021215952A1 (ru) * | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Индженик" | Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus |
| RU2811106C2 (ru) * | 2020-04-24 | 2024-01-11 | Сф Биотех Лаборатувар Данишманлик Аноним Ширкети | Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100519735C (zh) | 通过遗传修饰的细菌定居于粘膜而防止病毒感染的方法 | |
| Chieux et al. | Inhibition of coxsackievirus B4 replication in stably transfected cells expressing human MxA protein | |
| EP1629091B1 (fr) | Composition comprenant la polyproteine ns3/ns4 et le polypeptide ns5b du vhc, vecteurs d'expression incluant les sequences nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapeutique | |
| ES2212815T3 (es) | Virus citopaticos para la terapia y profilaxis de neoplasia. | |
| JP2015107127A (ja) | ウイルス変種およびその検出方法 | |
| US20240366792A1 (en) | Compositions and systems for rna-programmable cell editing and methods of making and using same | |
| Guillot et al. | Inhibition of hepatitis B viral entry by nucleic acid polymers in HepaRG cells and primary human hepatocytes | |
| US20120100181A1 (en) | Attenuation of Encephalitogenic Alphavirus and Uses Thereof | |
| STRAUSS et al. | Overview of viruses and virus infection | |
| RU2568872C1 (ru) | Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с | |
| Vlastos et al. | VP1 pseudocapsids, but not a glutathione‐S‐transferase VP1 fusion protein, prevent polyomavirus infection in a T‐cell immune deficient experimental mouse model | |
| US20210154249A1 (en) | Coxsackie virus b for treating tumors | |
| JPWO2004020635A1 (ja) | バクテリオファージおよび細菌感染症治療剤 | |
| KR102842575B1 (ko) | 유전자 및 단백질의 대량 카고를 인간 세포로 전달하기 위한 원핵-진핵 하이브리드 바이러스 벡터 | |
| CN102517387B (zh) | Mvp作为抗病毒药物标靶的应用 | |
| Solanki et al. | CRISPR-Cas based genome editing for eradication of human viruses | |
| CN113278051B (zh) | 一组具抗病毒作用的同源环状寡肽序列及其应用 | |
| PT1780216E (pt) | Coronavírus canino pantrópico | |
| US20030017173A1 (en) | Arrestable therapeutic viral agent | |
| Iwasaki | Multifunctional noncoding regions in the mammarenavirus genome | |
| Zehnder | Genetic code expansion as a tool for the visualisation of Hepatitis B and Delta viruses | |
| RU2375449C2 (ru) | КОДИРУЮЩАЯ ДНК (кДНК) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ ВИРУСА ГЕПАТИТА С, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ | |
| Leteane | Translational control during viral infection, investigating the role of Severe Acute Respiratory Syndrome non-structural protein 1 and Enterovirus 71 Internal Ribosome Entry Site | |
| CN120624481A (zh) | Ddost和sec61a在调控乙肝病毒抗原表达和hbv复制中的应用 | |
| CN114920817A (zh) | 一种猪干扰素λ4重组蛋白及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181016 |