RU2567004C2

RU2567004C2 - Method of separating fibroblasts, method of creating thereof-based biotransplant (versions) and method of regenerating human tissues (versions)

Info

Publication number: RU2567004C2
Application number: RU2013150642/10A
Authority: RU
Inventors: Глеб Владимирович Козлов
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Экселлент Кволити Брендинг"
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-10-27
Also published as: RU2013150642A

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to field of biotechnology and can be applied for regeneration of tissues of mesodermal origin with application of adult organism fibroblasts. Sampling of skin tissues is carried out, obtained bioptate is washed in physiological solution with human albumin, after which it is processed with solution of dispase in culture medium DMEM-LG with glucose content 1 g/l until epidermis is separated from derma. Obtained derma is washed with DMEM-LG and mechanically crushed, derma fragments are distributed around Petri dish and poured with DMEM-LG with foetal bovine serum (FBS), solution of non-essential amino acids (MEM NEAA) and antibiotics. After that, cells are cultivated until fibroblasts fill the entire bottom surface of dish, then they are removed with enzyme, washed, filtered and precipitated by centrifugation. Cell sediment is suspended in growth medium and cultured in flasks in CO₂-incubator until confluent monolayer is obtained, after which cells are removed with enzyme, precipitated and passaged until required therapeutic quantity. Obtained fibroblasts are used for manufacturing transplants for human tissue regeneration.

EFFECT: invention makes it possible to reduce bioptate volume and obtain homogeneous culture of fibroblasts with high degree of adaptation and activity.

29 cl, 8 dwg, 1 tbl, 7 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к области биомедицины, в частности к способам выделения и культивирования аутологичных/аллогенных фибробластов или фибробластоподобных клеток, способам получения биотрансплантатов и их применению для регенерации тканей человека. Способы могут найти применение в регенеративной медицине, косметологии, пластической хирургии, медицине катастроф, комбустиологии и других областях медицины.The invention relates to the field of biomedicine, in particular to methods for the isolation and cultivation of autologous / allogeneic fibroblasts or fibroblast-like cells, methods for producing biotransplants and their use for the regeneration of human tissues. The methods can find application in regenerative medicine, cosmetology, plastic surgery, disaster medicine, combustiology and other fields of medicine.

Уровень техникиState of the art

В последние годы активно развиваются новые перспективные направления биомедицины - клеточная терапия и тканевая инженерия, которые с успехом применяются в репарационной, или регенеративной, медицине. Известно, что в организме восстановление поврежденных тканей происходит за счет региональных стволовых/прогениторных клеток. Однако с возрастом или из-за воздействия неблагоприятных факторов количество этих клеток уменьшается, а также нарушаются механизмы регуляции их активности (Rao M.S., Mattson М.Р. Stem cell and aging: expanding the possibilities // Mech. Ageing Dev. 2001. Vol. 122. P. 713-734).In recent years, promising new areas of biomedicine have been actively developing - cell therapy and tissue engineering, which are successfully used in reparative or regenerative medicine. It is known that in the body the restoration of damaged tissues occurs due to regional stem / progenitor cells. However, with age or due to the influence of adverse factors, the number of these cells decreases, and the mechanisms of regulation of their activity are disturbed (Rao MS, Mattson M.P. Stem cell and aging: expanding the possibilities // Mech. Ageing Dev. 2001. Vol. 122. P. 713-734).

Благодаря активным разработкам и внедрению новых клеточных технологий становится возможным восстановление/замена поврежденных тканей и органов с помощью выделенных и выращенных до терапевтического количества клеток. В последние годы выделены и охарактеризованы практически все типы клеток человеческого организма. Разработаны технологии, позволяющие использовать выделенные и размноженные в условиях in vitro клетки в медицине для восстановления поврежденных тканей и органов.Thanks to the active development and introduction of new cellular technologies, it becomes possible to restore / replace damaged tissues and organs with the help of cells isolated and grown to a therapeutic number. In recent years, almost all types of cells of the human body have been isolated and characterized. Technologies have been developed that allow the use of cells isolated and propagated in vitro in medicine to restore damaged tissues and organs.

В этой связи применение региональных стволовых/прогениторных клеток взрослого организма представляется очень актуальным направлением биомедицины. На сегодняшний день наиболее изученными и перспективными для применения во многих областях медицины, в том числе регенеративной медицине, являются фибробласты и мезенхимные мультипотентные стромальные клетки (ММСК).In this regard, the use of regional stem / progenitor cells of an adult organism seems to be a very relevant area of biomedicine. To date, the most studied and promising for use in many fields of medicine, including regenerative medicine, are fibroblasts and mesenchymal multipotent stromal cells (MMSCs).

Впервые мезенхимные мультипотентные стромальные клетки были получены из костного мозга по их способности прикрепляться к поверхности культуральной посуды (Fridenshtein A.J., Deriglazova U.F., Kulagina N.N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method // Exp. Hematol. 1974. Vol. 2. P. 83-92). Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки отличаются относительной простотой выделения и культивирования, способностью пролиферировать в течение длительного времени in vitro и широким спектром дифференцировки не только в клетки тканей мезенхимного происхождения, но и в клетки тканей других зародышевых листков.Mesenchymal multipotent stromal cells were first obtained from bone marrow by their ability to attach to the surface of culture dishes (Fridenshtein AJ, Deriglazova UF, Kulagina NN et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method // Exp. Hematol. 1974. Vol. 2. P. 83-92). Multipotent mesenchymal stem cells are distinguished by their relative ease of isolation and cultivation, their ability to proliferate for a long time in vitro, and a wide range of differentiation not only into tissue cells of mesenchymal origin, but also into cells of tissues of other germ layers.

Со временем были отработаны методики выделения ММСК из других тканей организма (тимус, дерма, жировая ткань, плацента, фетальные ткани и др.), наиболее легкодоступным источником из них является жировая ткань. Доказано, что введенные внутривенно ММСК мигрируют в проблемную зону, где в дальнейшем принимают активное участие в репарации поврежденной ткани.Over time, methods were developed to isolate MMSCs from other body tissues (thymus, dermis, adipose tissue, placenta, fetal tissues, etc.), the most readily available source of them is adipose tissue. It is proved that MMSCs administered intravenously migrate to the problem area, where they subsequently take an active part in the repair of damaged tissue.

Состояние кожи, прежде всего, определяется состоянием дермы. Фибробласты - основные клеточные элементы дермы, главной функцией которых является участие в метаболизме межклеточного вещества. В процессе жизнедеятельности фибробласты кожи синтезируют и выделяют большое количество биологически активных веществ: различные факторы роста, белки (коллаген, эластин), протеогликаны (преимущественно гиалуроновую кислоту), гликопротеины и т.д., которые обеспечивают коже упругость, эластичность, поддерживают водно-солевой баланс, способствуют активным обменным процессам.The condition of the skin, first of all, is determined by the state of the dermis. Fibroblasts are the main cellular elements of the dermis, the main function of which is to participate in the metabolism of intercellular substance. In the process of life, skin fibroblasts synthesize and secrete a large number of biologically active substances: various growth factors, proteins (collagen, elastin), proteoglycans (mainly hyaluronic acid), glycoproteins, etc., which provide skin firmness, elasticity, support water-salt balance, contribute to active metabolic processes.

С возрастом количество фибробластов в дерме уменьшается, а также снижается их активность, в результате чего кожа теряет упругость и эластичность, появляются морщины.With age, the number of fibroblasts in the dermis decreases, and their activity also decreases, as a result of which the skin loses firmness and elasticity, wrinkles appear.

Старение кожи - сложный процесс, многие аспекты которого до конца не изучены. Существует мнение, что одной из основных причин старения кожи является нарушение способности фибробластов кожи к делению и снижение уровня их синтетической активности. Следовательно, воздействуя на эти процессы, можно улучшить состояние кожи.Skin aging is a complex process, many aspects of which are not fully understood. There is an opinion that one of the main causes of skin aging is a violation of the ability of skin fibroblasts to divide and a decrease in the level of their synthetic activity. Therefore, acting on these processes, it is possible to improve the condition of the skin.

Для коррекции возрастных изменений кожи в настоящее время используются самые разнообразные подходы - пилинг, шлифовка, лифтинг, введение в проблемные зоны токсина ботулизма. Широко используются мезопрепараты (мезотерапия), которые в своем составе содержат компоненты внеклеточного матрикса и соединительной ткани, синтезируемые фибробластами [Hruza GJ. Arch. Facial Plast. Surg. Vol 6, Nov/Dec 2004]. Как правило, действие мезопрепаратов направлено на стимуляцию собственных клеток кожи.To correct age-related skin changes, a variety of approaches are currently being used - peeling, resurfacing, lifting, and the introduction of botulism toxin into problem areas. Mesopreparations (mesotherapy) are widely used, which in their composition contain components of the extracellular matrix and connective tissue synthesized by fibroblasts [Hruza GJ. Arch. Facial Plast. Surg. Vol 6, Nov / Dec 2004]. As a rule, the action of mesopreparations is aimed at stimulating their own skin cells.

Однако можно решить проблему и более кардинальным путем - увеличить количество фибробластов в коже с помощью их пересадки в проблемные зоны.However, it is possible to solve the problem in a more dramatic way - to increase the number of fibroblasts in the skin by transplanting them into problem areas.

На сегодняшний день фибробласты человека полностью охарактеризованы, подтверждена их биобезопасность и клиническая эффективность применения для коррекции возрастных изменений кожи. Показано, что клетки, выращенные in vitro, способны при культивировании в соответствующих условиях сохранять свои физиологические способности и при введении в проблемную зону восстанавливают поврежденные ткани.To date, human fibroblasts are fully characterized, their biosafety and clinical efficacy for the correction of age-related skin changes have been confirmed. It was shown that cells grown in vitro are capable of maintaining their physiological abilities under cultivation under appropriate conditions and, when introduced into the problem area, repair damaged tissues.

Путем гистологических исследований биоптатов кожи показано, что введенные в кожу аутофибробласты сохраняются в течение не менее 12 месяцев и синтезируют все компоненты межклеточного матрикса [Зорин В.П. и др. КТТИ. Том YII, №2, 2012].Through histological studies of skin biopsy samples, it was shown that autofibroblasts introduced into the skin persist for at least 12 months and synthesize all components of the intercellular matrix [Zorin V.P. and other KTTI. Volume YII, No. 2, 2012].

На данный момент предлагаются различные способы регенерации тканей человека с использованием фибробластов или фибробластоподобных клеток, выделенных из различных источников взрослого организма. Основными задачами исследователей при разработке биотехнологических способов восстановления дефектных тканей являются выбор оптимального способа выделения и размножения клеток и адекватного носителя с целью их доставки в область повреждения и адаптации в дефектной области.At the moment, various methods of regenerating human tissues using fibroblasts or fibroblast-like cells isolated from various sources of the adult body are offered. The main tasks of researchers in the development of biotechnological methods for repairing defective tissues are the selection of the optimal method for isolation and reproduction of cells and an adequate carrier in order to deliver them to the area of damage and adapt in the defective area.

Известен способ выделения и культивирования аутологичных дермальных фибробластов, в котором клетки выделяют из биоптатов без ферментативной и механической обработки исходного материала, где биоптат помещается под покровное стекло и инкубируется на чашке Петри, покрытой синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином (RU 2382077, МПК C12N 5/071). Недостаток этого метода в том, что в результате получается гетерогенная популяция клеток, состоящая из фибробластов и эпителиоподобных клеток.A known method for the isolation and cultivation of autologous dermal fibroblasts, in which cells are isolated from biopsy specimens without enzymatic and mechanical processing of the starting material, where the biopsy specimen is placed under a coverslip and incubated on a Petri dish coated with a synthetic analog of the extracellular matrix poly-D-lysine (RU 2382077, IPC C12N 5/071). The disadvantage of this method is that the result is a heterogeneous population of cells consisting of fibroblasts and epithelial cells.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения косметических дефектов кожи, который заключаются в том, что кожу или липоаспират ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе трипсина (Патент РФ 2271818, А61К 35/36, C12N 5/08, А61Р 17/02; Патент РФ 2271819, А61К 35/36, C12N5/08, А61Р 17/14). Этот метод обеспечивает низкую эффективность дезагрегации ткани, что снижает количество первичного клеточного материала.A method for producing a biograft for the treatment of cosmetic skin defects is proposed, which consists in the fact that the skin or lipoaspirate is enzymatically disaggregated in a 0.25% trypsin solution (RF Patent 2271818, А61К 35/36, C12N 5/08, А61Р 17/02; RF Patent 2271819, A61K 35/36, C12N5 / 08, A61P 17/14). This method provides low tissue disaggregation efficiency, which reduces the amount of primary cellular material.

Существует способ выделения клеток, при котором биоптат кожи обрабатывается диспазой с целью отделения дермы от эпидермиса, а затем дерма механически измельчается и обрабатывается 0,01% раствором коллагеназы (Патент РФ 2335538, C12N 5/06, C12N 5/08). Известен способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что биоптат аутокожи обрабатывается 0,25%-ным раствором трипсина с целью отделения дермы от эпидермиса, а затем дерма механически измельчается и обрабатывается 0,1-0,5% раствором коллагеназы (Патент РФ 2281776, А61К 35/36). Данные методы позволяют получить более гомогенную популяцию клеток, но биологический материал подвергается дополнительной ферментативной обработке, что неизбежно сказывается на качестве и количестве получаемых клеток.There is a method for isolating cells in which a skin biopsy is treated with dyspase to separate the dermis from the epidermis, and then the dermis is mechanically ground and processed with a 0.01% collagenase solution (RF Patent 2335538, C12N 5/06, C12N 5/08). There is a method of producing a biograft for the correction of soft tissue defects, characterized in that the autologous skin biopsy is treated with a 0.25% trypsin solution to separate the dermis from the epidermis, and then the dermis is mechanically ground and processed with a 0.1-0.5% collagenase solution ( RF patent 2281776, A61K 35/36). These methods make it possible to obtain a more homogeneous population of cells, but biological material undergoes additional enzymatic treatment, which inevitably affects the quality and quantity of the obtained cells.

Известен способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что для получения фибробластов биоптат обрабатывают раствором коллагеназы II типа (Патент РФ 2428996, А61К 35/36, A61Q 19/08, C12N 5/073). Недостаток предложенного метода состоит в том, что биологический материал подвергается длительной (в течение 16-17 часов) ферментативной обработке.A known method of producing a biograft for the correction of soft tissue defects, characterized in that to obtain fibroblasts, the biopsy is treated with a type II collagenase solution (RF Patent 2428996, A61K 35/36, A61Q 19/08, C12N 5/073). The disadvantage of the proposed method is that the biological material is subjected to a prolonged (for 16-17 hours) enzymatic treatment.

Предлагаются различные носители, которые могут использоваться как самостоятельно, так и в составе биотрансплантата для введения в место дефекта.Various carriers are offered that can be used both independently and as part of a biograft for insertion into a defect site.

Известен способ введения гиалуроновой кислоты внутрикожно (Патент РФ 2194512, 2001). Недостаток метода заключается в узкой направленности действия, т.к. используется только один из многих компонентов межклеточного матрикса, синтезируемых фибробластами.A known method of introducing hyaluronic acid intradermally (RF Patent 2194512, 2001). The disadvantage of this method is the narrow focus of the action, because only one of the many components of the intercellular matrix synthesized by fibroblasts is used.

Известен способ инъекционного введения в место дефекта биотрансплантанта в виде суспензии аутологичных или аллогенных фибробластов в соответствующем количестве с использованием в качестве носителя коллагена (Патентный документ США 2002048563; Патентный документ США 2002197241). Недостаток метода в том, что в качестве носителя используется только один компонент межклеточного матрикса.There is a method of injecting a biotransplant into a defect site in the form of a suspension of autologous or allogeneic fibroblasts in an appropriate amount using collagen as a carrier (US Patent Document 2002048563; US Patent Document 2002197241). The disadvantage of this method is that only one component of the intercellular matrix is used as a carrier.

Известны способы восстановления дефектов мягких тканей путем трансплантации аутологичных дермальных фибробластов в суспензии физиологического раствора (Патент РФ 2281776, МПК А61К 35/36 и Патент США 5660850, НКИ 424/426, МПК A61F 2/02). Недостатком метода считают низкую эффективность приживляемости клеток в месте инъекций.Known methods for repairing soft tissue defects by transplantation of autologous dermal fibroblasts in a suspension of physiological saline (RF Patent 2281776, IPC A61K 35/36 and US Patent 5660850, NCI 424/426, IPC A61F 2/02). The disadvantage of this method is the low efficiency of cell engraftment at the injection site.

Существует способ, где в качестве микроносителей для доставки клеток в область дефекта используют коллагеновые и/или желатиновые микросферы диаметром от 50 до 400 мкм, а предпочтительно от 100 до 300 мкм (Патент РФ 2004118437, А61К 35/36, C12N 5/08, А61Р 17/02). Недостаток метода в высокой стоимости и сложности воспроизведения.There is a method where collagen and / or gelatin microspheres with a diameter of from 50 to 400 μm, and preferably from 100 to 300 μm, are used as microcarriers for delivering cells to the defect region (RF Patent 2004118437, А61К 35/36, C12N 5/08, А61Р 17/02). The disadvantage of this method is the high cost and complexity of reproduction.

Наиболее близкими к заявленным являются способы, в которых для выделения фибробластов из биоптата кожи дерму предварительно отделяют от эпидермиса с целью получения гомогенной культуры клеток (Патент РФ 2335538, C12N 5/06, C12N 5/08; Патент РФ 2281776, А61К 35/36), а в качестве носителя используются компоненты межклеточного матрикса, синтезируемые фибробластами (Патент РФ 2428996, А61К 35/36, A61Q 19/08, C12N 5/073).Closest to the claimed are methods in which to isolate fibroblasts from a skin biopsy, the dermis is previously separated from the epidermis in order to obtain a homogeneous cell culture (RF Patent 2335538, C12N 5/06, C12N 5/08; RF Patent 2281776, A61K 35/36) and as a carrier, the components of the intercellular matrix synthesized by fibroblasts are used (RF Patent 2428996, А61К 35/36, A61Q 19/08, C12N 5/073).

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Поскольку фибробласты обладают выраженными потенциями к синтезу компонентов межклеточного матрикса: белков (коллаген, эластин), различных факторов роста, протеогликанов (преимущественно гиалуроновая кислота), гликопротеинов и др., при введении фибробластов с носителем в дерму кожи происходит активизация обменных процессов: восстанавливаются водно-солевой баланс и кровообращение, кожа приобретает упругость, эластичность, здоровый вид.Since fibroblasts have pronounced potentials for the synthesis of components of the intercellular matrix: proteins (collagen, elastin), various growth factors, proteoglycans (mainly hyaluronic acid), glycoproteins, etc., when fibroblasts with a carrier are introduced into the skin dermis, metabolic processes are activated: water-water are restored salt balance and blood circulation, the skin acquires firmness, elasticity, healthy appearance.

В связи с чем заявленное решение направлено на создание способа регенерации органов и тканей человека с использованием фибробластов или фибробластоподобных клеток, выделенных из различных тканей взрослого организма.In this connection, the claimed solution is aimed at creating a method of regeneration of human organs and tissues using fibroblasts or fibroblast-like cells isolated from various tissues of the adult body.

Общими техническими результатами заявленных изобретений являются: быстрая, эффективная и стабильная коррекция возрастных изменений кожи, которая достигается благодаря созданию биотрансплантата, основанного на использовании аутологичного или аллогенного клеточного материала, уменьшение количества первичного биоматериала за счет максимального сокращения ферментативной обработки ткани при выделении клеток и оптимизации способа его доставки в дефектную область, снижение себестоимости процедур, обеспечение легковоспроизводимости способа коррекции патологических, в том числе возрастных, изменений кожи, а также устранение вышеупомянутых недостатков, имеющихся у аналогов заявленных изобретений.The general technical results of the claimed inventions are: fast, effective and stable correction of age-related skin changes, which is achieved by creating a biograft based on the use of autologous or allogeneic cellular material, reducing the amount of primary biomaterial due to the maximum reduction of the enzymatic processing of tissue during cell isolation and optimizing its method delivery to the defective area, reducing the cost of procedures, ensuring reproducibility The manual correction of pathological, including age, skin changes, as well as the elimination of the above shortcomings, existing analogues of the claimed inventions.

Технические результаты достигаются тем, что для выделения клеток фибробластов осуществляют следующие последовательные действия.Technical results are achieved in that the following sequential actions are performed to isolate fibroblast cells.

Производят забор тканей кожи. Полученный биоптат промывают в физиологическом растворе, дополненном человеческим альбумином. Промытый биоптат подвергают обработке раствором диспазы в культуральной среде Игла в модификации Дюльбеко с содержанием глюкозы 1 г/л (ДМЕМ-LG) до отделения пленки эпидермиса от дермы, полученную дерму промывают ДМЕМ-LG и механически измельчают. Полученные фрагменты дермы распределяют по чашке Петри и заливают ДМЕМ-LG, дополненной эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), раствором заменимых аминокислот (MEM NEAA) и антибиотиками. Затем культивируют клетки, периодически сменяя культуральную среду. После того как фибробласты мигрируют из фрагментов и заполнят всю поверхность дна чашки, их снимают ферментом и отмывают культуральной средой от фермента, пропускают через фильтр и осаждают центрифугированием. Клеточный осадок суспендируют в ростовой среде и высевают на культуральные флаконы, помещают в CO₂-инкубатор и после достижения конфлуэнтного монослоя клетки снимают ферментом, осаждают и пассируют до необходимого терапевтического количества.Skin tissue is taken. The resulting biopsy is washed in physiological saline supplemented with human albumin. The washed biopsy specimen is subjected to treatment with a dispase solution in the Eagle culture medium in a Dulbecco modification with a glucose content of 1 g / L (DMEM-LG) until the epidermis film is separated from the dermis, the resulting dermis is washed with DMEM-LG and mechanically ground. The resulting dermis fragments were distributed in a Petri dish and poured with DMEM-LG supplemented with fetal calf serum (ETS), a solution of essential amino acids (MEM NEAA) and antibiotics. Then cells are cultured, periodically changing the culture medium. After fibroblasts migrate from the fragments and fill the entire surface of the bottom of the cup, they are removed by the enzyme and washed with the culture medium from the enzyme, passed through a filter and precipitated by centrifugation. The cell pellet is suspended in a growth medium and plated on culture bottles, placed in a CO ₂ incubator, and after reaching a confluent monolayer, the cells are removed by enzyme, precipitated and passaged to the required therapeutic amount.

Рекомендуемыми являются следующие параметры осуществления способа.Recommended are the following parameters for the implementation of the method.

Производят забор (т.н. биопсия) небольшого количества тканей кожи (вполне достаточно объема не более 2 мм/1 мм/1 мм).A small amount of skin tissue is taken (the so-called biopsy) (a volume of not more than 2 mm / 1 mm / 1 mm is sufficient).

Полученный материал - биоптат промывают в физиологическом растворе (0,9% раствор NaCl) с добавлением человеческого альбумина, преимущественно в концентрации последнего 1%.The resulting biopsy material is washed in physiological saline (0.9% NaCl solution) with the addition of human albumin, mainly in the concentration of the latter 1%.

Промытый биоптат подвергают обработке раствором диспазы (преимущественно в концентрации 0,1%) в культуральной среде Игла в модификации Дюльбеко с содержанием глюкозы 1 г/л (далее - ДМЕМ-LG) до отделения пленки эпидермиса от дермы (пояснение: после обработки биоптата диспазой получаем 2 компонента: эпидермис и дерму. Далее работа происходит только с дермой). Для получения лучших результатов рекомендуется проводить данную обработку в течение 3 часов на орбитальном шейкере при постоянном покачивании при температуре 37°C.The washed biopsy specimen is subjected to treatment with a dispase solution (mainly at a concentration of 0.1%) in the Eagle culture medium in the Dulbeko modification with a glucose content of 1 g / l (hereinafter - DMEM-LG) until the epidermis film is separated from the dermis (explanation: after processing the biopsy specimen we get 2 components: epidermis and dermis. Further work occurs only with the dermis). For best results, it is recommended to carry out this treatment for 3 hours on an orbital shaker with constant swaying at a temperature of 37 ° C.

Полученную после названной обработки дерму промывают ДМЕМ-LG и механически измельчают.The dermis obtained after the above treatment is washed with DMEM-LG and mechanically crushed.

Далее, фрагменты дермы распределяют по чашке Петри, например, с диаметром 6 см и заливают ДМЕМ-LG, дополненной эмбриональной телячьей сывороткой (далее - ЭТС), простым раствором заменимых аминокислот (далее - MEM-NEAA) и антибиотиками (например, пенициллин, стрептомицин или амфотерицин).Further, the dermis fragments are distributed in a Petri dish, for example, with a diameter of 6 cm and poured with DMEM-LG, supplemented with fetal calf serum (hereinafter referred to as ETS), a simple solution of interchangeable amino acids (hereinafter - MEM-NEAA) and antibiotics (e.g. penicillin, streptomycin or amphotericin).

Затем культивируют клетки, периодически сменяя культуральную среду. При этом оптимальными параметрами для культивирования являются: температура 37°C, 5%-ная концентрация CO₂ в воздухе и регулярная (через каждые трое суток) смена среды.Then cells are cultured, periodically changing the culture medium. The optimal parameters for cultivation are: temperature 37 ° C, 5% concentration of CO ₂ in the air and regular (every three days) change of medium.

После того как фибробласты мигрируют из фрагментов и заполнят всю поверхность дна чашки, их снимают ферментом (например, ЭДТА с добавлением трипсина в концентрации 0,05%), после чего отмывают от фермента культуральной средой, пропускают через фильтр (подойдет фильтр с размером фильтрующей ячейки 80-100 мкм) для удаления волокон и осаждают центрифугированием.After fibroblasts migrate from the fragments and fill the entire surface of the bottom of the cup, they are removed with an enzyme (for example, EDTA with trypsin at a concentration of 0.05%), then they are washed from the enzyme with culture medium, passed through a filter (a filter with a filter cell size is suitable 80-100 microns) to remove fibers and precipitated by centrifugation.

Затем клеточный осадок суспендируют в ростовой среде (Среда роста - питательная среда, содержащая все компоненты, обеспечивающие активное деление клеток, культивируемых вне организма. 1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг.) и высевают на культуральные флаконы, преимущественно из расчета 1×10⁶ клеток/см², после чего помещают в CO₂-инкубатор и после достижения конфлуэнтного монослоя клетки снимают ферментом, осаждают центрифугированием, клеточный осадок суспендируют в ростовой среде и высевают на культуральные флаконы, помещают в CO₂-инкубатор и после достижения конфлуэнтного монослоя клетки снимают ферментом, осаждают и пассируют до необходимого терапевтического количества и рассевают далее до получения необходимого терапевтического количества фибробластов.Then the cell pellet is suspended in a growth medium (Growth medium is a nutrient medium containing all the components that ensure active division of cells cultured outside the body. 1. Small Medical Encyclopedia. - M.: Medical Encyclopedia. 1991-96. 2. First aid . - M .: Big Russian Encyclopedia. 1994. 3. Encyclopedic dictionary of medical terms. - M .: Soviet encyclopedia. - 1982-1984) and seeded on culture bottles, mainly at the rate of 1 × 10 ⁶ cells / cm ² and then placed in a CO ₂ incubator and then d stizheniya confluent cell monolayer is removed by the enzyme, was precipitated by centrifugation, the cell pellet was resuspended in growth medium and plated onto culture flasks, placed in a CO ₂ incubator, and after reaching the confluent cell monolayer is removed by the enzyme, was precipitated and passaged until the desired therapeutic amount, and seeded on to obtain the desired therapeutic amount of fibroblasts.

Для применения и транспортировки выделенные и культивированные фибробласты или ММСК необходимо соединять со специализированным носителем-протектором для получения биотрансплантата.For use and transportation, isolated and cultured fibroblasts or MMSCs must be combined with a specialized protector carrier to obtain a biograft.

Биотрансплантаты с клетками, выделенные вышеописанным методом, получают следующим образом.Biografts with cells isolated by the above method are obtained as follows.

После финального пассирования выделенные клетки переводят на культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента (ССКП) или в терапевтической среде AIM-V (Gibco) (тканевая питательная среда. В частности, производится BRL, Grand Island, NY). Фибробласты собирают с помощью фермента, дважды промывают ДМЕМ-LG путем центрифугирования ресуспендирования, а затем физиологическим раствором, содержащим человеческий альбумин, суспендируют в физрастворе и смешивают с экстрактом икры осетровых рыб.After the final passage, the isolated cells are transferred to cultivation in the medium with the patient’s own blood serum (SSCP) or in the therapeutic medium AIM-V (Gibco) (tissue culture medium. In particular, BRL, Grand Island, NY). Fibroblasts are collected using an enzyme, washed twice with DMEM-LG by centrifugation of resuspension, and then with physiological saline containing human albumin, suspended in saline and mixed with sturgeon caviar extract.

При этом собирают фибробласты, например, с помощью ЭДТА с добавлением трипсина в концентрации 0,05%, а физиологический раствор содержит человеческий альбумин, предпочтительно в концентрации 1%.Fibroblasts are collected, for example, using EDTA with the addition of trypsin at a concentration of 0.05%, and physiological saline contains human albumin, preferably at a concentration of 1%.

Фибробласты суспендируют в физрастворе предпочтительно из расчета 1,2-1,3×10⁶ клеток на 1 мл биотрансплантата.Fibroblasts are suspended in saline, preferably at a rate of 1.2-1.3 × 10 ⁶ cells per 1 ml of biograft.

Рекомендуется суспензию клеток смешивать с экстрактом икры осетровых рыб в соотношении 4:1, а именно: 4 части физраствора, содержащего 1,2-1,3×10⁶ фибробластов, и 1 часть экстракта икры осетровых рыб, а в качестве экстракта применять препарат «Кавиар» (производится, в частности, ООО «Лаборатория ТОСКАНИ», Россия, ОГРН 1027720000131, в ампулах по 2 мл) в объеме 200 мкл на 1 мл трансплантата.It is recommended that the cell suspension be mixed with the extract of sturgeon caviar in a ratio of 4: 1, namely: 4 parts of saline solution containing 1.2-1.3 × 10 ⁶ fibroblasts, and 1 part of the extract of sturgeon caviar, and use the preparation “ Kaviar ”(produced, in particular, LLC TOSKANI Laboratory, Russia, OGRN 1027720000131, in 2 ml ampoules) in a volume of 200 μl per 1 ml of graft.

Информация о препарате «Кавиар» представлена, в частности, в следующих общедоступных источниках в сети Интернет:Information on the drug "Caviar" is presented, in particular, in the following publicly available sources on the Internet:

http: //www.martinex.ru/products/mesotherapy/skinasil/caviar.html;http: //www.martinex.ru/products/mesotherapy/skinasil/caviar.html;

http: //www.info-beauty.ru/inekciornnaya-kosmetologiya/38-mezoterapiya/183-kaviar.html;http: //www.info-beauty.ru/inekciornnaya-kosmetologiya/38-mezoterapiya/183-kaviar.html;

profi.fo.ru/shop/5098_%D0%BC%D0%B5%D0%B7%D0%BE%D1%82%D0%B5%D1%80%D0%B0%D0%BF%D0%B8%D1%8F%2C%D0%BA%D0%BE%D0%BD%D1%82%D1%83%D1%80%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D0%BF%D0%BB%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B8%D0%BA%D0%B0/17902_%D0%9A%D0%B0%D0%B2%D0%B8%D0%B0%D1%80._%D0%AD%D0%BA%D1%81%D1%82%D1%80%D0%B0%D0%BA%D1%82_%D0%B8%D0%BA%D1%80%D1%8B_%D0%BE%D1%81%D0%B5%D1%82%D1%80%D0%BE%D0%B2%D1%8B%D1%85_%D1%80%D1%8B%D0%B1_5%25.profi.fo.ru/shop/5098_%D0%BC%D0%B5%D0%B7%D0%BE%D1%82%D0%B5%D1%80%D0%B0%D0%BF%D0%B8% D1% 8F% 2C% D0% BA% D0% BE% D0% BD% D1% 82% D1% 83% D1% 80% D0% BD% D0% B0% D1% 8F_% D0% BF% D0% BB% D0% B0% D1% 81% D1% 82% D0% B8% D0% BA% D0% B0 / 17902_% D0% 9A% D0% B0% D0% B2% D0% B8% D0% B0% D1% 80. _% D0% AD% D0% BA% D1% 81% D1% 82% D1% 80% D0% B0% D0% BA% D1% 82_% D0% B8% D0% BA% D1% 80% D1% 8B_% D0% BE% D1% 81% D0% B5% D1% 82% D1% 80% D0% BE% D0% B2% D1% 8B% D1% 85_% D1% 80% D1% 8B% D0% B1_5% 25.

Другой вид биотрансплантата получается при смешении суспензии клеток с препаратом на основе смеси органического кремния, экстракта плаценты, гидролизата эластина и гидролизата коллагена, например с препаратом «Antiestrias» (коктейль «Антистрии» в ампулах по 2 мл) производства компании «Dietbel» (Испания) в объеме 200 мкл на 1 мл трансплантата.Another type of biograft is obtained by mixing a cell suspension with a preparation based on a mixture of organic silicon, placenta extract, elastin hydrolyzate and collagen hydrolyzate, for example with Antiestrias (Antistriria cocktail in 2 ml ampoules) manufactured by Dietbel (Spain) in a volume of 200 μl per 1 ml of graft.

Информация о препарате раскрыта, в частности, в следующих общедоступных источниках в сети Интернет:Information about the drug is disclosed, in particular, in the following publicly available sources on the Internet:

http: //martinex.ru/products/mesotherapy/ditbel/dietbel-injection/antiestrias.html;http: //martinex.ru/products/mesotherapy/ditbel/dietbel-injection/antiestrias.html;

http: //lantana43.ru/index.php?page=shop.product_details&flypage=&product_id=35&category_id=0&option=com_virtuemart&Itemid=2http: //lantana43.ru/index.php?page=shop.product_details&flypage=&product_id=35&category_id=0&option=com_virtuemart&Itemid=2

http: //jeternel-sales.ra/catalog/items/antiestrias_regenerador_2_ml;http: //jeternel-sales.ra/catalog/items/antiestrias_regenerador_2_ml;

http: //xn--elaanijscib.xn--plai/index.php?route=product/category&path=107_240;http: //xn--elaanijscib.xn--plai/index.php?route=product/category&path=107_240;

http: //www.charm-center.ru/cosmetic/brand/dietbel.http: //www.charm-center.ru/cosmetic/brand/dietbel.

Состав предлагаемого к использованию препарата «Antiestrias» следующий: органический кремний, экстракт плаценты, гидролизат эластина, гидролизат коллагена.The composition of the proposed Antiestrias preparation is as follows: organic silicon, placenta extract, elastin hydrolyzate, collagen hydrolyzate.

Используют полученные биотрансплантаты путем введения их в дефектные ткани папульным (простое подкожное введение препарата), тоннельным (формирование линейного канала в дерме и равномерное его заполнение на обратном ходе иглы) или комбинированными методами.The obtained biografts are used by introducing them into defective tissues with papular (simple subcutaneous injection of the drug), tunnel (the formation of a linear channel in the dermis and its uniform filling on the return needle) or by combined methods.

Предложенное выше использование в качестве носителей коммерческих препаратов «Кавиар» и «Antiestrias» при создании биотрансплантатов для коррекции дефектов кожи обусловлено несколькими факторами. Мезопрепараты «Кавиар» и «Antiestrias» содержат компоненты межклеточного матрикса, синтезируемые фибробластами, такие как факторы роста кератиноцитов, фибробластов, лимфоцитов, макрофагов, витамины, микроэлементы, экстракт плаценты, гидролизат эластина, гидролизат коллагена и др., и применяются в косметологии для коррекции патологических изменений состояния кожи, в том числе возрастных. Препараты имеют удобную инъекционную форму, и, в отличие от мономерных носителей (физиологического раствора, коллагена, гиалуроновой кислоты), содержат несколько компонентов, которые комплексно усваиваются тканями, не вызывая общетоксического, аллергизирующего, местно-раздражающего действия, а их автономное введение благотворно влияет на состояние кожи. В экспериментах in vitro показано, что данные препараты способствуют поддержанию жизнеспособности и пролиферативной активности фибробластов, что позволяет использовать их в качестве благоприятного окружения для введенных клеток на время их адаптации и приживления в дефектной области.The above use of Caviar and Antiestrias commercial preparations as carriers for the creation of biografts for correction of skin defects is due to several factors. Caviar and Antiestrias mesopreparations contain components of the intercellular matrix synthesized by fibroblasts, such as growth factors of keratinocytes, fibroblasts, lymphocytes, macrophages, vitamins, trace elements, placenta extract, elastin hydrolyzate, collagen hydrolyzate, and others for correction, and are used pathological changes in the condition of the skin, including age-related. The drugs have a convenient injectable form, and, unlike monomeric carriers (physiological saline, collagen, hyaluronic acid), they contain several components that are complexly absorbed by the tissues without causing a general toxic, allergenic, and local irritating effect, and their autonomous administration has a beneficial effect on skin condition. In vitro experiments have shown that these drugs help maintain the viability and proliferative activity of fibroblasts, which allows them to be used as a favorable environment for introduced cells during their adaptation and engraftment in the defective region.

Биотрансплантат также может быть введен внутривенно, для чего готовят специальный раствор путем соединения ММСК с 1% раствором человеческого альбумина в 0,9% растворе хлорида натрия (физраствора). В экспериментах in vitro подтверждено, что данный носитель-протектор, содержащий компоненты кровяного русла, способствует адаптации клеток в условиях in vivo.A biograft can also be administered intravenously, for which a special solution is prepared by combining MMSC with a 1% solution of human albumin in a 0.9% solution of sodium chloride (saline). In vitro experiments have confirmed that this protector carrier containing bloodstream components promotes cell adaptation in vivo.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Оценка эффективности способа регенерации тканей мезенхимного происхождения с использованием фибробластов или фибробластоподобных клеток, выделенных из различных тканей взрослого организма, проводилась поэтапно и включала стадии выделения фибробластов из кожи, выделения мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из жировой ткани, их культивирования in vitro до получения необходимой клеточной массы; подготовку различных комбинаций трансплантата; исследование in vivo подготовленных трансплантатов; анализ полученных результатов.Evaluation of the effectiveness of the method of regeneration of tissues of mesenchymal origin using fibroblasts or fibroblast-like cells isolated from various tissues of an adult organism was carried out in stages and included the stages of isolation of fibroblasts from the skin, isolation of multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) from adipose tissue, and their in vitro cultivation to obtain the necessary cell mass; preparation of various graft combinations; in vivo study of prepared grafts; analysis of the results.

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами.The claimed invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Выделение и культивирование фибробластов из кожи человекаExample 1. Isolation and cultivation of fibroblasts from human skin

Фибробласты выделяли по оригинальной методике из минимального объема биоптата кожи (2 мм/1 мм/1 мм), забор которого осуществляли амбулаторно. Основной задачей при разработке метода выделения фибробластов было максимальное уменьшение объема забираемого биологического материала с одновременным увеличением выхода первичного клеточного материала. Результат достигался благодаря применению органно-ферментативного способа обработки биоптата, обеспечивающего максимальный выход фибробластов из ткани и получение гомогенной популяции (Фиг. 1). Разработанный метод позволяет из маленького объема биоматериала за короткий промежуток времени получить качественную гомогенную культуру фибробластов.Fibroblasts were isolated according to the original method from the minimum volume of skin biopsy (2 mm / 1 mm / 1 mm), the sampling of which was carried out on an outpatient basis. The main task in developing the method for isolating fibroblasts was to maximize the reduction in the amount of biological material taken, while increasing the yield of primary cellular material. The result was achieved due to the use of the organo-enzymatic method of processing the biopsy specimen, which ensures the maximum exit of fibroblasts from the tissue and obtaining a homogeneous population (Fig. 1). The developed method makes it possible to obtain a high-quality homogeneous fibroblast culture from a small volume of biomaterial in a short period of time.

Биоптат тщательно промывали в физиологическом растворе с 1% человеческого альбумина, после чего подвергали обработке в 1 мл 0,1% раствора диспазы в ДМЕМ-LG в течение 3 часов на орбитальном шейкере при постоянном покачивании (30-40 об/мин) при температуре 37°C с целью отделения пленки эпидермиса от дермы. Эпидермис удаляли, а дерму промывали средой ДМЕМ-LG, механически измельчали ножницами на 8-10 фрагментов и полученные фрагменты распределяли по чашке Петри ⌀6 см. Через 2-3 минуты, когда фрагменты прикреплялись к поверхности чашки, их заливали средой Игла в модификации Дюльбекко с низким содержанием глюкозы (ДМЕМ-LG), содержащей 15% по объему добавляемой эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), раствор антибиотика/антимикотика (100 МЕ/мл пенициллин/100 мкг/мл стрептомицин/0,25 мкг/мл амфотерицин) и однократный (1% по объему добавляемых аминокислот) раствор заменимых аминокислот (MEM-NEAA) и помещали в CO₂-инкубатор. После того как фибробласты мигрировали из фрагментов и заполняли всю поверхность дна чашки, их снимали ферментом 0,05% трипсин-ЭДТА (ЭДТА с добавлением трипсина в концентрации 0,05%), переносили в пробирку, разбавляли средой, чтобы отмыть от фермента, пропускали через фильтр 80-100 мкм для удаления волокон и осаждали центрифугированием. Полученный осадок клеток пипетировали в ростовой среде, переносили в культуральный флакон S=150 см² и помещали в инкубатор. По достижении конфлуэнтного монослоя клетки снимали ферментом, осаждали и пассировали далее до необходимого терапевтического количества. После финального пассирования фибробласты переводили на культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента (ССКП) или в терапевтической среде AIM-V (Gibco), предназначенной для культивирования клеток и тканей человека ex vivo. Среда не содержит животных эмбриональных добавок, что исключает проявление иммунного ответа при введении клеток пациентам.The biopsy specimen was thoroughly washed in physiological saline with 1% human albumin, after which it was treated in 1 ml of a 0.1% dispase solution in DMEM-LG for 3 hours on an orbital shaker with constant shaking (30-40 rpm) at a temperature of 37 ° C to separate the epidermis film from the dermis. The epidermis was removed, and the dermis was washed with DMEM-LG medium, mechanically crushed with scissors into 8-10 fragments, and the obtained fragments were distributed in a 6 cm Petri dish. After 2-3 minutes, when the fragments were attached to the surface of the cup, they were poured with Eagle medium in the Dulbecco modification low glucose (DMEM-LG) containing 15% by volume of added fetal calf serum (ETS), antibiotic / antimycotic solution (100 IU / ml penicillin / 100 μg / ml streptomycin / 0.25 μg / ml amphotericin) and a single (1% by volume of added amino acids) Op-essential amino acids (MEM-NEAA) and placed in a CO ₂ incubator. After fibroblasts migrated from the fragments and filled the entire surface of the bottom of the plate, they were removed with the enzyme 0.05% trypsin-EDTA (EDTA with the addition of trypsin at a concentration of 0.05%), transferred to a test tube, diluted with medium to wash from the enzyme, passed through a filter of 80-100 μm to remove fibers and precipitated by centrifugation. The resulting cell pellet was pipetted in a growth medium, transferred to a culture vial S = 150 cm ² and placed in an incubator. Upon reaching a confluent monolayer, the cells were removed with an enzyme, besieged and passaged further to the required therapeutic amount. After the final passage, fibroblasts were transferred to cultivation in a medium with patient’s own blood serum (SSCP) or in AIM-V therapeutic medium (Gibco) intended for culturing human cells and tissues ex vivo. The medium does not contain animal embryonic additives, which excludes the manifestation of an immune response when cells are introduced to patients.

Необходимое для биотрансплантата количество фибробластов собирали с помощью 0,05% трипсин - ЭДТА, дважды отмывали ДМЕМ-LG путем центрифугирования - ресуспендирования, а затем физиологическим раствором с 1% человеческого альбумина и суспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия из расчета 1,2-1,3×10⁶ клеток в 1 мл биотрансплантата.The number of fibroblasts required for the biograft was collected using 0.05% trypsin - EDTA, washed twice with DMEM-LG by centrifugation - resuspension, and then with physiological saline with 1% human albumin and suspended in a 0.9% sodium chloride solution at a rate of 1.2 -1.3 × 10 ⁶ cells in 1 ml of biotransplant.

Полученную популяцию клеток оценивали по ряду показателей. Визуальный анализ прикрепленных клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии показал, что клетки имели фибробластоподобную форму, популяция клеток однородна. По результатам иммунофенотипирования (по экспрессии поверхностных антигенов) популяция полученных клеток соответствовала фибробластам (см. Таблицу ниже). Митотический индекс и время цитогенерации составляли 31‰ и 34-44 час соответственно, что согласуется со стандартными показателями. Для подтверждения стабильности хромосомного набора полученной популяции проводили кариологический анализ клеток на 5 пассаже методом GTG-окрашивания (предобработка 0.25% раствором трипсина с последующим окрашиванием красителем Гимза на фосфатном буфере pH 6.8). Показано, что линия имеет нормальный диплоидный кариотип 46, XX (Фиг. 8). Отсутствие туморогенных потенций клеток доказывали путем внутрибрюшинного введения клеток бестимусным мышам. Клетки не оказывали токсического действия и онкологически безопасны.The resulting cell population was evaluated by a number of indicators. Visual analysis of attached cells using phase-contrast microscopy showed that the cells had a fibroblast-like shape, the cell population was homogeneous. According to the results of immunophenotyping (by expression of surface antigens), the population of the obtained cells corresponded to fibroblasts (see the table below). The mitotic index and cytogenesis time were 31 ‰ and 34-44 hours, respectively, which is consistent with standard indicators. To confirm the stability of the chromosome set of the obtained population, a karyological analysis of cells at passage 5 was performed using GTG staining (pretreatment with 0.25% trypsin solution followed by staining with Giemsa dye on phosphate buffer pH 6.8). It was shown that the line has a normal diploid karyotype 46, XX (Fig. 8). The absence of tumorigenic cell potencies was proved by intraperitoneal injection of cells into athymic mice. The cells did not have a toxic effect and are oncologically safe.

Данная технология гарантирует получение гомогенной высококачественной популяции фибробластов человека и имеет высокую степень воспроизводимости.This technology guarantees a homogeneous high-quality human fibroblast population and has a high degree of reproducibility.

Длительное хранение фибробластов осуществляется в криохранилище в жидком азоте при температуре -196°C, среда для замораживания состояла из 50% ДМЕМ-LG, 40% ЭТС и 10% ДМSO.Long-term storage of fibroblasts is carried out in a cryogenic storage in liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C, the freezing medium consisted of 50% DEMEM-LG, 40% ETS and 10% DMSO.

Пример 2. Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) из жировой ткани человекаExample 2. Isolation and cultivation of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) from human adipose tissue

ММСК выделяли из жировой ткани человека, полученной во время проведения липосакции или плановой операции с информированного согласия пациента по стандартной методике [Zak Р.А., Tissue Engineering, vol. 7, №2, 2001] с модификациями.MMSCs were isolated from human adipose tissue obtained during liposuction or elective surgery with the informed consent of the patient according to the standard method [Zak P.A., Tissue Engineering, vol. 7, No. 2, 2001] with modifications.

Жировую ткань тщательно промывали в физиологическом растворе с 1% человеческого альбумина, измельчали механически и подвергали ферментативной обработке 0,075%-ным раствором смеси коллагеназы тип I и тип II в среде Игла в модификации Дюльбеко с содержанием глюкозы 1 г/л (ДМЕМ-LG) при 37°C в течение 40 минут. Коллагеназу отмывали эквивалентным объемом питательной среды (ДМЕМ-LG, дополненной 10% эмбриональной сыворотки теленка) и центрифугировали при 300 g в течение 5-7 минут. Полученный осадок ресуспендировали и пропускали через фильтры с диаметром пор 80-100 мкм для удаления неразлизированных фрагментов ткани. Полученную клеточную суспензию высевали во флаконы площадью 75 см² из расчета 10⁶ клеток/см².Adipose tissue was thoroughly washed in physiological saline with 1% human albumin, mechanically crushed, and subjected to enzymatic treatment with a 0.075% solution of a mixture of collagenase type I and type II in Igla medium in the modification of Dulbeko with a glucose content of 1 g / l (DMEM-LG) 37 ° C for 40 minutes. Collagenase was washed with an equivalent volume of culture medium (DMEM-LG supplemented with 10% fetal calf serum) and centrifuged at 300 g for 5-7 minutes. The resulting precipitate was resuspended and passed through filters with a pore diameter of 80-100 μm to remove non-lysed tissue fragments. The resulting cell suspension was seeded into vials with an area of 75 cm ² at the rate of 10 ⁶ cells / cm ² .

Культивировали ММСК в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, дополненной 15% эмбриональной сывороткой теленка, однократным раствором заменимых аминокислот (MEM-NEAA) и антибиотиками (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина) при 37°C и 5% CO₂ в воздухе. Среду меняли каждые 3-4 суток и по достижении конфлуэнтного монослоя осуществляли субкультивирование: клетки снимали с субстрата раствором 0,05% трипсин-ЭДТА и высевали на культуральные флаконы из расчета 5×10⁶ клеток/см² в ростовой среде. После финального пассирования фибробласты переводили на культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента (ССКП) или в терапевтической среде AIM-V (Gibco), предназначенной для культивирования клеток и тканей человека ex vivo. Среда не содержит животных эмбриональных добавок, что исключает проявление иммунного ответа при введении клеток пациентам.MMSCs were cultured in DMEM with a low glucose content supplemented with 15% fetal calf serum, a single solution of essential amino acids (MEM-NEAA) and antibiotics (100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) at 37 ° C and 5% CO ₂ in the air. The medium was changed every 3-4 days and, upon reaching a confluent monolayer, subculture was performed: the cells were removed from the substrate with a solution of 0.05% trypsin-EDTA and plated on culture vials at a rate of 5 × 10 ⁶ cells / cm ² in growth medium. After the final passage, the fibroblasts were transferred to cultivation in a medium with patient’s own blood serum (SSCP) or in AIM-V therapeutic medium (Gibco) intended for culturing human cells and tissues ex vivo. The medium does not contain animal embryonic additives, which excludes the manifestation of an immune response when cells are introduced to patients.

Необходимое для биотрансплантата количество ММСК собирали с помощью 0,05% трипсин-ЭДТА, отмывали путем центрифугирования - ресуспендирования дважды ДМЕМ-LG, а затем физиологическим раствором с 1% человеческого альбумина и суспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,9-1,0×10⁶ на 1 кг веса пациента.The amount of MMSC required for biotransplant was collected using 0.05% trypsin-EDTA, washed by centrifugation - resuspension twice with DMEM-LG, and then with physiological saline with 1% human albumin and suspended in 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 0.9 -1.0 × 10 ⁶ per 1 kg of patient weight.

Результаты иммунофенотипирования показали, что популяция полученных клеток соответствует по экспрессии поверхностных антигенов мезенхимным стволовым клеткам. Митотический индекс и время цитогенерации составили 34‰ и 54-62 час соответственно.The results of immunophenotyping showed that the population of the obtained cells corresponds to the expression of surface antigens to mesenchymal stem cells. The mitotic index and cytogenesis time were 34 ‰ and 54-62 hours, respectively.

Пример 3. Влияние носителей-биопротекторов на поддержание жизнеспособности и пролиферативной активности фибробластовExample 3. The influence of carriers of bioprotectors on maintaining the viability and proliferative activity of fibroblasts

Для выбора оптимального носителя-биопротектора при создании биотрансплантата тестировали 5 мезопрепаратов: №1 - «Кавиар», №2 - «Antiestrias», №3 - «Колэласт комплекс», №4 «Facial А-36», №5 - «Дмаэ комплекс».To select the optimal bioprotective carrier during the creation of the biograft, 5 mesodrugs were tested: No. 1 - "Caviar", No. 2 - "Antiestrias", No. 3 - "Kolelast complex", No. 4 "Facial A-36", No. 5 - "Dmae complex ".

Выбор именно этих препаратов обусловлен их мультисоставом и наибольшей популярностью применения в косметологии при коррекции различных изменений кожи. Выращенные фибробласты в количестве 0,2×10⁵ для тестирования каждого препарата осаждали путем центрифугирования, суспендировали в 200 мкл мезопрепарата и выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем клетки переносили в чашки, добавляли 800 мкл стандартной рабочей среды и переносили в инкубатор для культивирования (соотношение среда:мезопрепарат 4:1). В качестве контроля выращивали клетки в стандартных условиях, без добавления мезопрепарата. В результате было продемонстрировано, что препараты №1 и №2 способствуют поддержанию жизнеспособности и пролиферативной активности фибробластов (Фиг. 2, 3), препараты 3, 4 (Фиг. 4, 5) несколько отстают в росте по сравнению с контролем (Фиг. 7), а под воздействием препарата 5 клетки испытывают шок и начинают некротировать (Фиг. 6).The choice of these drugs is due to their multicomposition and the most popular use in cosmetology for the correction of various skin changes. The grown fibroblasts in an amount of 0.2 × 10 ⁵ for testing each drug were besieged by centrifugation, suspended in 200 μl of mesopreparation and kept for 2 hours at room temperature. Then the cells were transferred to plates, 800 μl of standard working medium was added and transferred to an incubator for cultivation (medium: mesoproduct ratio 4: 1). As a control, cells were grown under standard conditions, without the addition of a mesopreparation. As a result, it was demonstrated that preparations No. 1 and No. 2 contribute to maintaining the viability and proliferative activity of fibroblasts (Fig. 2, 3), while preparations 3, 4 (Fig. 4, 5) are slightly behind in growth compared to the control (Fig. 7 ), and under the influence of the preparation 5, cells experience shock and begin to necrotic (Fig. 6).

Таким образом, наиболее эффективными в качестве носителя-протектора при создании биотрансплантантов оказались препараты «Кавиар» (№1) и «Antiestrias» (№2).Thus, the Kaviar (No. 1) and Antiestrias (No. 2) drugs proved to be the most effective as a protector carrier in the creation of biografts.

Пример 4. Получение биотрансплантата 1Example 4. Obtaining biotransplant 1

Аутологичные или аллогенные фибробласты, выделенные из дермы кожи человека, суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия из расчета 1,2-1,3×10⁶ клеток на 1 мл биотрансплантата для инъекционного введения. Для приготовления биотрансплантата суспензию культуры аутологичных или аллогеных фибробластов соединяют с препаратом «Кавиар» в качестве носителя-биопротектора в соотношении 4:1 (т.е. 1 мл биотрансплантата содержит 1,2-1,3×10⁶ фибробластов, 4 части 0,9% раствора хлорида натрия и 1 часть препарата «Кавиар»).Autologous or allogeneic fibroblasts isolated from the human skin dermis are suspended in a 0.9% sodium chloride solution at a rate of 1.2-1.3 × 10 ⁶ cells per 1 ml of biotransplant for injection. To prepare a biograft, a suspension of autologous or allogeneic fibroblast culture is combined with the Caviar drug as a bioprotective carrier in a ratio of 4: 1 (i.e. 1 ml of a biograft contains 1.2-1.3 × 10 ⁶ fibroblasts, 4 parts 0, 9% solution of sodium chloride and 1 part of the drug "Caviar").

Пример 5. Получение биотрансплантата 2Example 5. Obtaining biotransplant 2

Аутологичные или аллогенные фибробласты, выделенные из дермы кожи человека, суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия из расчета 1,2-1,3×10⁶ клеток на 1 мл биотрансплантата для инъекционного введения. Для приготовления биотрансплантата суспензию культуры аутологичных или аллогеных фибробластов соединяют с препаратом «Antiestrias» в качестве носителя-биопротектора в соотношении 4:1 (т.е. 1 мл биотрансплантата содержит 1,2-1,3×10⁶ фибробластов, 4 части 0,9% раствора хлорида натрия и 1 часть препарата «Antiestrias»).Autologous or allogeneic fibroblasts isolated from the human skin dermis are suspended in a 0.9% sodium chloride solution at a rate of 1.2-1.3 × 10 ⁶ cells per 1 ml of biotransplant for injection. To prepare a biograft, a suspension of autologous or allogeneic fibroblast culture is combined with the Antiestrias preparation as a bioprotective carrier in a ratio of 4: 1 (i.e. 1 ml of a biograft contains 1.2-1.3 × 10 ⁶ fibroblasts, 4 parts 0, 9% solution of sodium chloride and 1 part of the drug "Antiestrias").

Апробация полученных биотрансплантатов проводилась на пяти добровольцах в возрасте от 37 до 62 лет. При интрадермальном введении биотрансплантатов с целью коррекции возрастных изменений разработанным способом наблюдался выраженный положительный эффект - прогрессирующее улучшение текстуры кожи, восстановление тургора, увеличение толщины дермы, уменьшение глубины морщин и др., которые стабильно сохранялись в течение 1,5-2 лет. Для более стойкого эффекта процедуру рекомендуется проводить дважды с интервалом 3 месяца.Testing of the obtained biotransplants was carried out on five volunteers aged 37 to 62 years. With the intradermal administration of biografts in order to correct age-related changes in the developed way, a pronounced positive effect was observed - a progressive improvement in skin texture, restoration of turgor, an increase in the thickness of the dermis, a decrease in the depth of wrinkles, etc., which were stably maintained for 1.5-2 years. For a more lasting effect, the procedure is recommended to be carried out twice with an interval of 3 months.

Пример 6. Получение биотрансплантата 3Example 6. Obtaining a biograft 3

Биотрансплантат для внутривенного введения содержит суспензию культуры аутологичных фибробластоподобных клеток, выделенных из жировой ткани в количестве 0,9-1,0×106 на 1 кг веса в 0,9% растворе хлорида натрия с 1% раствором альбумина в качестве носителя-биопротектора.An intravenous biograft contains a suspension of a culture of autologous fibroblast-like cells isolated from adipose tissue in an amount of 0.9-1.0 × 106 per 1 kg of body weight in a 0.9% sodium chloride solution with 1% albumin solution as a bioprotective carrier.

Пример 7. Способ доставки биотрансплантата в область дефектаExample 7. A method for delivering a biograft to a defect area

Биотрансплантат, представляющий собой суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов (1,2-1,3×10⁶/мл), вводят в область дефекта в количестве 0,8-0,9×10 клеток на 1 см (6-7 мкл биотрансплантата) методом интрадермальных инъекций с образованием папул диаметром 0,1-0,2 мм двукратно с интервалом 12 недель. На 1 зону (около 150 см²) используют 12-13×10⁶ клеток.A biograft, which is a suspension of autologous or allogeneic fibroblast culture (1.2-1.3 × 10 ⁶ / ml), is introduced into the defect area in the amount of 0.8-0.9 × 10 cells per 1 cm (6-7 μl of biotransplant ) by the method of intradermal injection with the formation of papules with a diameter of 0.1-0.2 mm twice with an interval of 12 weeks. On 1 zone (about 150 cm ² ) use 12-13 × 10 ⁶ cells.

В другом варианте биотрансплантат, представляющий собой суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов в количестве 1,2-1,3×10⁶ в 1 мл, вводят в область дефекта тоннельным способом вдоль линии морщин. Единовременно водят 9-10 мл биотрансплантата.In another embodiment, a biograft, which is a suspension of a culture of autologous or allogeneic fibroblasts in an amount of 1.2-1.3 × 10 ⁶ in 1 ml, is introduced into the defect area in a tunnel way along the wrinkle line. 9-10 ml of biotransplant are administered at a time.

В другом варианте биотрансплантат, представляющий собой суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов в количестве 1,2-1,3×10⁶ в 1 мл, вводят в область дефекта по параллельным, а затем по перпендикулярным линиями по всей длине иглы, формируя «сетку». Единовременно водят 9-10 мл биотрансплантата.In another embodiment, a biograft, which is a suspension of a culture of autologous or allogeneic fibroblasts in an amount of 1.2-1.3 × 10 ⁶ in 1 ml, is introduced into the defect area along parallel and then along perpendicular lines along the entire length of the needle, forming a “mesh” . 9-10 ml of biotransplant are administered at a time.

В другом варианте биотрансплантат, представляющий собой суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов в количестве 1,2-1,3×10⁶ в 1 мл, вводят в область дефекта комбинированным способом. Единовременно водят 9-10 мл биотрансплантата.In another embodiment, a biograft, which is a suspension of a culture of autologous or allogeneic fibroblasts in an amount of 1.2-1.3 × 10 ⁶ in 1 ml, is introduced into the defect area by a combined method. 9-10 ml of biotransplant are administered at a time.

В другом варианте биотрансплантат, содержащий суспензию культуры аутологичных фибробластоподобных клеток, выделенных из жировой ткани, в количестве 0,9-1,0×10⁶ на 1 кг веса, вводят внутривенно.In another embodiment, a biograft containing a suspension of a culture of autologous fibroblast-like cells isolated from adipose tissue in an amount of 0.9-1.0 × 10 ⁶ per 1 kg of body weight is administered intravenously.

Claims

1. A method for isolating fibroblast cells, namely, that skin tissue is sampled, the obtained biopsy is washed in physiological saline supplemented with human albumin, the washed biopsy is treated with a dispase solution in the culture medium of the Needle in Dulbeko modification with glucose content of 1 g / l (DMEM -LG) before separating the epidermis film from the dermis, the resulting dermis is washed with DMEM-LG and mechanically crushed, fragments of the dermis are distributed in a Petri dish and filled with DMEM-LG supplemented with fetal calf serum (ETS), a solution of essential amino acids (MEM NEAA) and antibiotics, cultivate cells, periodically changing the culture medium, after the fibroblasts migrate from the fragments and fill the entire surface of the bottom of the cup, they are removed by the enzyme and washed with the culture medium from the enzyme, passed through a filter and precipitated by centrifugation, the cell pellet is suspended in a growth medium and plated on culture bottles, placed in a CO ₂ incubator, and after reaching a confluent monolayer, the cells are removed by enzyme, precipitated and passaged therapeutic amount needed.

2. The method according to p. 1, characterized in that the sampling of skin tissue is carried out in a volume of not more than 2 mm / 1 mm / 1 mm.

3. The method according to p. 1, characterized in that the biopsy sample obtained by the fence is washed in physiological saline with human albumin in a concentration of the latter of 1%.

4. The method according to p. 1, characterized in that the dispase solution used for processing has a concentration of 0.1%.

5. The method according to p. 1, characterized in that the biopsy sample is treated with a dispase solution in DMEM-LG for 3 hours on an orbital shaker with constant swaying at a temperature of 37 ° C.

6. The method according to p. 1, characterized in that they use a Petri dish having a diameter of 6 cm

7. The method according to p. 1, characterized in that apply fetal calf serum (ECT) with a concentration of 15% by volume of added serum.

8. The method according to p. 1, characterized in that the cultivation of the cells is carried out at a temperature of 37 ° C and at 5% concentration of CO ₂ in the air.

9. The method according to p. 1, characterized in that when the cells are cultured, the culture medium is replaced every three days.

10. The method according to p. 1, characterized in that the enzyme using EDTA with the addition of trypsin at a concentration of 0.05%.

11. The method according to p. 1, characterized in that for the cultivation of cells as an antibiotic used penicillin, or streptomycin, or amphotericin.

12. The method according to p. 1, characterized in that to remove the fibers after cultivation, filtering through a filter having a filter cell size of 80-100 microns.

13. The method according to p. 1, characterized in that the cell pellet is plated on culture bottles at a rate of 1 × 10 cells / cm.

14. The method of creating a biograft, which consists in the fact that after the final passage, the cells isolated by the method according to claim 1 of the formula are transferred to cultivation in a medium with patient’s own blood serum (SSCP) or in AIM-V therapeutic medium (Gibco), fibroblasts are collected using the enzyme, washed twice with DMEM-LG by centrifugation - resuspension, and then with physiological saline containing human albumin, suspended in saline and mixed with sturgeon caviar extract.

15. The method according to p. 14, characterized in that the enzyme using EDTA with the addition of trypsin at a concentration of 0.05%.

16. The method according to p. 14, characterized in that for washing using physiological saline with human albumin in a concentration of the latter 1%.

17. The method according to p. 14, characterized in that the suspension is carried out in saline at a rate of 1.2-1.3 × 10 ⁶ cells per 1 ml of biotransplant.

18. The method according to p. 14, characterized in that the cell suspension is mixed with an extract of sturgeon caviar in a ratio of 4: 1, namely: 4 parts of saline containing 1.2-1.3 × 10 ⁶ fibroblasts, and 1 part of the extract sturgeon caviar.

19. The method according to p. 14, characterized in that the preparation "Caviar" is used as an extract of sturgeon fish.

20. The method according to p. 19, characterized in that the drug "Caviar" is used in a volume of 200 μl per 1 ml of graft.

21. The method of creating a biograft, which consists in the fact that after the final passage, cells isolated by the method according to claim 1 of the formula are transferred to cultivation in a medium with a patient’s own blood serum (SSCP) or in AIM-V therapeutic medium (Gibco), fibroblasts are collected using an enzyme, washed twice with DMEM-LG by centrifugation - resuspension, and then with physiological saline containing human albumin, suspended in saline and mixed with a preparation based on a mixture of organic silicon, e placenta extract, elastin hydrolyzate and collagen hydrolyzate.

22. The method according to p. 21, characterized in that the enzyme using EDTA with the addition of trypsin at a concentration of 0.05%.

23. The method according to p. 21, characterized in that for washing using physiological saline with human albumin in a concentration of the latter 1%.

24. The method according to p. 21, characterized in that the suspension is carried out in physiological saline at a rate of 1.2-1.3 × 10 ⁶ cells in 1 ml of biotransplant.

25. The method according to p. 21, characterized in that the cell suspension is mixed with a preparation based on a mixture of organic silicon, placenta extract, elastin hydrolyzate and collagen hydrolyzate in a ratio of 4: 1, namely: 4 parts of saline containing 1.2-1 , 3 × 10 ⁶ fibroblasts, and 1 part of the drug based on a mixture of organic silicon, placenta extract, elastin hydrolyzate and collagen hydrolyzate.

26. The method according to p. 21, characterized in that the preparation "Antiestrias" is used as a preparation based on a mixture of organic silicon, placenta extract, elastin hydrolyzate and collagen hydrolyzate.

27. The method according to p. 26, characterized in that the preparation "Antiestrias" is used in a volume of 200 μl per 1 ml of graft.

28. A method for regenerating human tissues, including the creation of a biograft according to claim 14 and introducing it into the defective tissue using the papular, tunnel and combined methods.

29. A method for regenerating human tissues, including creating a biograft according to claim 21 and introducing it into the defective tissue using the papular, tunnel and combined methods.