RU2557987C1 - Способ получения средства внутриклеточной доставки биологически активных низкомолекулярных соединений, на основе наночастиц - Google Patents
Способ получения средства внутриклеточной доставки биологически активных низкомолекулярных соединений, на основе наночастиц Download PDFInfo
- Publication number
- RU2557987C1 RU2557987C1 RU2014126130/15A RU2014126130A RU2557987C1 RU 2557987 C1 RU2557987 C1 RU 2557987C1 RU 2014126130/15 A RU2014126130/15 A RU 2014126130/15A RU 2014126130 A RU2014126130 A RU 2014126130A RU 2557987 C1 RU2557987 C1 RU 2557987C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mixture
- biologically active
- rpm
- peg
- selenium
- Prior art date
Links
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title abstract description 7
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 50
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000011669 selenium Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 14
- BIVUUOPIAYRCAP-UHFFFAOYSA-N aminoazanium;chloride Chemical compound Cl.NN BIVUUOPIAYRCAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims abstract description 11
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 8
- IVYPNXXAYMYVSP-UHFFFAOYSA-N Indole-3-carbinol Natural products C1=CC=C2C(CO)=CNC2=C1 IVYPNXXAYMYVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- RUMVKBSXRDGBGO-UHFFFAOYSA-N indole-3-carbinol Chemical compound C1=CC=C[C]2C(CO)=CN=C21 RUMVKBSXRDGBGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 235000002279 indole-3-carbinol Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 18
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 12
- QYHFIVBSNOWOCQ-UHFFFAOYSA-N selenic acid Chemical compound O[Se](O)(=O)=O QYHFIVBSNOWOCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 39
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 229960004011 methenamine Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 4
- 229940000207 selenious acid Drugs 0.000 abstract 1
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-N selenous acid Chemical compound O[Se](O)=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 15
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 11
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 9
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 8
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 229910021426 porous silicon Inorganic materials 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- YFGBQHOOROIVKG-BHDDXSALSA-N (2R)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[(2S)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 YFGBQHOOROIVKG-BHDDXSALSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102400000988 Met-enkephalin Human genes 0.000 description 3
- 108010042237 Methionine Enkephalin Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 2
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N methyl cyanide Natural products CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical class C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102000006587 Glutathione peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 108700016172 Glutathione peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical group OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940125681 anticonvulsant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910052729 chemical element Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 206010019692 hepatic necrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003326 hypnotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000147 hypnotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000149 liver necrosis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005543 nano-size silicon particle Substances 0.000 description 1
- 239000007908 nanoemulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000004223 radioprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229940125723 sedative agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 description 1
- 239000011856 silicon-based particle Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000003204 tranquilizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002936 tranquilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области фармакологии и медицины, в частности к способу получения средства внутриклеточной доставки биологически активного низкомолекулярного соединения. Способ осуществляют следующим образом: готовят смесь 1 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора селенистой кислоты в 8 мл ПЭГ 400, интенсивно перемешивают на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 7,55; далее готовят смесь 2 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора солянокислого гидразина в 8 мл ПЭГ 400, интенсивно перемешивают на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 0,68. При интенсивном перемешивании в смесь 1 вносится смесь 2 по каплям. Полученный раствор ставят на диализ против дистиллированной воды, удаляя ПЭГ 400 и солянокислый гидразин, избыток воды отгоняют на роторном испарителе при 60 об/мин и 70°C. В полученный раствор вносится низкомолекулярное соединение, выбранное из группы: гентамицин, гексаметилентетрамин, метионин, цефалексин, индол-3-карбинол, доводят pH до 7,2-7,4. При этом компоненты смешивают в количестве, обеспечивающем содержание их в средстве, в масс. %:
2 табл., 3 пр., 1 ил.
Description
Изобретение относится к области фармакологии и медицины, в том числе ветеринарной медицины, и может быть использовано как эффективное средство внутриклеточной доставки низкомолекулярных лекарственных веществ и биологически активных молекул при лечении болезней различного генеза.
Внутриклеточная доставка лекарственных веществ и биологически активных молекул является актуальной проблемой в биологии, медицине и ветеринарии. Прямая поставка лекарств и биомолекул к органам-мишеням, малоэффективна, что связано с ферментной деградацией активных веществ, их нейтрализацией печенью и выведением из организма почками. Поэтому поиск эффективных и безопасных переносчиков к генам, клеткам и органам-мишеням является важной областью исследования.
В качестве корпускулярных носителей для биологически активных веществ используются такие структуры, как фуллерены, дендримеры, липосомы, полиакрилатные частицы, мицеллы, коллоидное золото и другие.
Наиболее перспективными разработками в данной области являются липидсодержащие (липосомальные) наносистемы, полимерные наночастицы, коллоидные частицы, а также наноносители из пористого кремния.
Данные транспортные наносистемы несовершенны и имеют ряд недостатков (в частности, недостаточная стабильность и высокая сложность технологии производства и, соответственно, чрезвычайно высокая стоимость), чем и объясняется отсутствие «адресных» лекарств в практической медицине.
В частности, липосомальные наносистемы в большинстве случаев предлагаются в виде растворов, содержащих частицы, составляющие более 100 нм. Липосомы используются в качестве «контейнера» для доставки лекарственных средств к органам мишеням.
Частицы такого размера, как правило, нестабильны и, соответственно, не представляется возможным контролировать размер частиц при формировании системы. Кроме того, при введении в организм липосомы быстро выводятся из кровотока ретикуло-эндотелиальной системой, что приводит к снижению эффективности препаратов.
Подобные недостатки присущи следующей разработке - «Иммунолипосомальная наносистема адресной доставки к коннексин-43 положительным опухолевым клеткам» (патент РФ 2422154 по кл. МПК А61К 39/00, опуб. 27.02.2011). Система включает биотинилированные моноклональные антитела к экстраклеточному фрагменту коннексина-43 (первый компонент) и ПЭГилированные липосомальные контейнеры диаметром 70-100 нм, ковалентно связанные со стрептавидином (второй компонент). Последовательное введение в живую систему первого и второго компонентов бинарной системы приводит к селективной доставке липосом к Сх-43-положительным клеткам путем специфического связывания биотинилированных антител с экстраклеточным фрагментом Сх-43 на цитолемме глиомных клеток и последующим образованием стрептавидин-биотинового комплекса.
Однако данная наносистема имеет узконаправленное действие - предназначена только для адресной доставки липосом к опухолевым клеткам. Кроме того, существенным недостатком данной системы является низкая стабильность липосом при хранении.
Известна также лекарственная форма доставки водонерастворимых и плохорастворимых лекарственных средств в виде наночастиц и способ получения системы доставки лекарственной формы (см. заявку №2006123043 по кл. МПК А61К 31/00, опуб. 20.01.2008). Способ предусматривает лиофилизацию водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ с образованием в результате этого частиц в виде сферических наноразмерных структур. Лиофилизацию осуществляют липосомами, состоящими из липидов, которые образуют при ассоциации векторное окружение вокруг ядра - липосомальную мембрану. Наночастицы имеют размеры от 5 до 1500 нм. В качестве плохорастворимых и водонерастворимых биологически активных веществ система содержит снотворные, успокаивающие, противосудорожные средства, транквилизаторы, анальгезирующие, противовоспалительные, сердечнососудистые, гормональные препараты, витамины, ферментные и стимулирующие метаболические процессы средства, противогрибковые, противоопухолевые, биологически активные пептиды и белки. Однако существенным недостатком данной системы является низкая стабильность при хранении и невозможность контролировать размер частиц при формировании системы.
Наиболее стабильной является высокодисперсная наносистема, предложенная в 2011 г. НИИ биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича (ИБМХ РАМН). Данная система получена на основе соевого фосфолипида и представляет собой систему для транспорта как жирорастворимых (гидрофобных), так и водорастворимых (гидрофильных) биологически активных соединений. Авторами разработки на основании скрининга лекарственных субстанций разного спектра действия была проанализирована их способность встраивания в фосфолипидную транспортную наносистему, а также проведены предварительные испытания in vitro и in vivo. По результатам указанных тестов в качестве наиболее перспективных для промышленного выпуска были выбраны препараты, содержащие низкокомолекулярные соединения лекарственных веществ доксорубицин (препарат «Доксолип») и индометацин (препарат «Индолип»), снабженные фосфолипидной транспортной наносистемой. Проведены доклинические исследования этих нанолекарств, разработан полный комплект нормативно-технической документации, необходимой для их выпуска, подготовлены документы для подачи в Министерство Здравоохранения РФ для получения разрешения на проведение клинических испытаний.
Предложенная технология позволяет получать нанолекарства в виде лиофилизированного порошка, что увеличивает их срок хранения до 5 лет, предохраняет фосфолипиды от агрегации. Однако технологический процесс, требующий наличие уникального оборудования, весьма сложный и трудоемкий. Он включает в себя получение стабильной наноэмульсии фосфолипидных частиц со включенной лекарственной субстанцией (гомогенизация высокого давления) и последующее лиофильное высушивание получаемых эмульсий. Данный фактор негативно сказывается на себестоимости готовой продукции.
Наноносители из пористого кремния представлены следующими разработками:
- «Способ получения наноразмерной системы доставки лекарственных средств на основе диоксида кремния» (патент РФ №2372890 по кл. МПК А61J 3/00, А61К 47/04, А61К 38/33, опуб. 20.11.2009),
- «Фармпрепараты с наноносителями. Производство фармпрепаратов с наноносителями из пористого кремния» (разработчики - Nanolek Holding Limited (Кипр) и ООО «Нанолек» Россия).
Наиболее близким из них к заявляемому способу является способ получения наноразмерной системы доставки лекарственных средств на основе диоксида кремния (см. патент РФ №2372890 по кл. МПК A61J 3/00, А61К 47/04, А61К 38/33, опуб. 20.11.2009), а именно - мет-энкефалина на гидрозоле наночастиц SiO2. Способ включает смешивание дистиллированной воды, соляной кислоты и тетраэтоксисилана, добавление приготовленного раствора в NaOH, упаривание и фильтрацию с получением гидрозоля SiO2, ультразвуковую обработку полученного гидрозоля SiO2, добавление мет-энкефалина и раствора ПАВ в количестве 0,5-2% от общего объема полученной системы. Система доставки мет-энкефалина способна преодолеть гематоэнцефалический барьер и доставлять лекарственное средство к клеткам головного мозга. Способ позволяет создать наночастицы с диаметром 6-10 нм. Данный препарат и система его доставки имеют узконаправленное действие - предназначено только для преодоления гематоэнцефалического барьера.
Как следует из описания проекта «Фармпрепараты с наноносителями. Производство фармпрепаратов с наноносителями из пористого кремния» (разработчики - Nanolek Holding Limited (Кипр) и ООО «Нанолек» Россия) - технология адресной доставки наноносителей из пористого кремния предполагает обеспечение пролонгации биологически активного вещества за счет сорбирования его на наночастицах пористого кремния, которые выполняют транспорт активного вещества, обеспечивая постепенное выделение из пор размером около 10 нм. На данном принципе планируется разработка группы твердых лекарственных форм, включающих препараты для лечения сердечнососудистых заболеваний, противораковые и противовирусные препараты. Действие уже известных активных веществ в этих препаратах продлевается за счет их сорбирования на наночастицах пористого кремния.
Как следует из описания, данная наносистема не подразумевает адресную доставку, а только пролонгацию действия активных веществ. Неясным остается вопрос о скорости высвобождения данных веществ из пор наночастиц. Также сомнительна вероятность дальнейшей утилизации (биодеградации) достаточно крупной кремниевой частицы (более 150 нм), находящейся в кровеносном русле. Не исключается, что данные наночастицы могут оказывать раздражающее действие на иммунную систему, что может привести впоследствии к аллергическим и аутоиммунным заболеваниям.
Следует отметить, что основным недостатком применяемых в настоящее время наночастиц является их высокая токсичность по сравнению с макрочастицами. Они способны проникать в неизмененном виде через клеточные барьеры, через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему, циркулировать и накапливаться в органах и тканях, вызывая более выраженные патоморфологические поражения внутренних органов (например, образование гранулем в легких, цирроз печени, гломерулонефроз), а также обладая длительным периодом полувыведения.
Токсичность наночастиц определяется их формой и размерами, при этом мельчайшие наночастицы веретенообразной формы вызывают более разрушительные эффекты в организме, нежели подобные им частицы сферической формы. При воздействии наночастиц на организм отчетливо прослеживается зависимость «доза-эффект». Клинические проявления определяются содержанием того или иного химического элемента в составе каждой конкретной наночастицы, однако при этом наблюдается значительное усиление токсического эффекта.
Кроме этого наночастицы могут оказывать раздражающее действие на иммунную систему. Поскольку выведение наночастиц из организма происходит длительное время, то постоянная миграция наноструктур по организму в малых количествах может привести к дестабилизации иммунной системы и в дальнейшем к аллергическим и аутоиммунным заболеваниям.
Изобретение направлено на решение задачи создания нетоксичного и эффективного средства внутриклеточной доставки биологически активных низкомолекулярных соединений на основе наночастиц селена, а именно на разработку способа его получения.
Для решения поставленной задачи способ осуществляется следующим образом
Сначала готовят смесь 1 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора селенистой кислоты в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 7,55, далее готовят смесь 2 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора солянокислого гидразина в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 0,68, при интенсивном перемешивании вносится в смесь 1 смесь 2 по каплям, полученный раствор ставят на диализ против дистиллированной воды удаляя ПЭГ 400 и солянокислый гидразин, избыток воды отгоняют на роторном испарителе, в полученный раствор вносится низкомолекулярное соединение, выбранное из группы гентамицин, гексаметилентетрамин, метионин, цефалексин, индол-3-карбинол. Доводят pH до 7,2-7,4.
В результате заявленного способа получают средство следующего состава, в масс. %:
| Биологически активное низкомолекулярное соединение | 0,001-5,0 |
| Селен | 0,0001-1,0 |
| Вода | остальное |
В качестве низкомолекулярного биологически активного вещества соединение может содержать гентамицин, гексаметилентетрамин, метионин, цефалексин, индол-3-карбинол.
В качестве селенсодержащего вещества используют селенистую кислоту.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано нетоксичного и эффективного средства внутриклеточной доставки низкомолекулярных биологически активных веществ и способов его получения, в котором в качестве носителя (наноплатформы) используют коллоидный селен, на который выполнено конъюгирование ряда биологически активных молекул.
Известно использование селена в качестве терапевтического средства, т.е. препарата, способного участвовать в окислительно-восстановительных процессах клеток организма (см., например, патенты РФ №2394583, №2426444, сайты http://fitoapteka.com/read/ru: http://www.naturoprof.ru, http://bezvreda.com/selen-v-pitanii/). Селен нормализует обмен протеинов и нуклеиновых кислот; регулирует специфический и неспецифический иммунитет за счет активизации функции нейтрофилов, пролифирации Т-, В-лимфоцитов, генерирование продукции антител, лимфокинов; улучшает адаптацию организма; уменьшает токсичное влияние веществ, солей тяжелых металлов, лекарств, других различных антибиотиков; предотвращает развитие окислительного процесса, свободнорадикальных болезней, в том числе атеросклероза и его осложнений, некрозов печени, панкреатитов, рассеянного склероза, паркинсонизма, других заболеваний.
Общепризнано, что микроэлемент селен (Se) - необходимый нутриент для нормального функционирования организма человека и животных, так как он входит в состав большинства гормонов и ферментов, активно участвуя в обмене веществ. Он выполняет в организме каталитическую, структурную и регуляторную функции; взаимодействует с витаминами, ферментами и биологическими мембранами; участвует в окислительно-восстановительных процессах, клеточном дыхании, обмене жиров, белков и углеводов. Роль селена в организме во многом определяется его включением в состав одного из важнейших ферментов - глутатионпероксидазы, защищающей клетки от продуктов перекисного окисления. Таким образом, селен и его соединения проявляют значительную антиоксидантную активность. Данный элемент входит в состав и других ферментов, участвует в детоксикации ксенобиотиков, регулирует функции щитовидной и поджелудочной желез, проявляет гепатозащитный эффект, стимулирует антитоксическую защиту организма, положительно влияет на систему репродукции, обладает радиопротекторным действием.
Применение коллоидного селена в качестве наноносителя для доставки низкомолекулярных биологически активных веществ до настоящего времени неизвестно.
Преимуществом заявляемого способа доставки низкомолекулярных биологически активных веществ с помощью наночастиц на основе коллоидного селена является возможность внутриклеточного проникновения наночастицы коллоидного селена с конъюгированными на нем лекарственными веществами - низкомолекулярными соединениями. При этом биодинамика лекарственных веществ и биологически активных молекул, соединенных с коллоидным селеном, происходит лимфогенным путем и в меньшей степени подвергается ферментной деградации и нейтрализации печенью.
Также определенным преимуществом служит то, что сам коллоидный селен является частью метаболической цепочки организма и способен усваиваться во внутриклеточном пространстве. Тем самым устраняются нежелательные последствия, связанные с «утилизацией» организмом самого носителя.
Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».
Средство, полученное предложенным способом, представляет собой коллоидный раствор наночастиц селена с адсорбированными на его поверхности частицами низкомолекулярных соединений. Оно представляет собой прозрачный раствор, цвет которого варьируется от кирпично-красного до оранжевого. Средство хранят при температуре от +2 до +20°C в темном месте. Срок хранения - 1 год.
Для получения средства внутриклеточной доставки биологически активного низкомолекулярного соединения готовят смесь 1 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора селенистой кислоты в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 7,55, далее готовят смесь 2 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора солянокислого гидразина в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 0,68, при интенсивном перемешивании вносится в смесь 1 смесь 2 по каплям, полученный раствор ставят на диализ против дистиллированной воды, удаляя ПЭГ 400 и солянокислый гидразин, избыток воды отгоняют на роторном испарителе при 60 об/мин и 70°C, в полученный раствор вносится низкомолекулярное соединение, выбранное из группы гентамицин, гексаметилентетрамин, метионин, цефалексин, индол-3-карбинол, в концентрации 0,001-5,0% по массе, доводят pH до 7,2-7,4.
Доведение pH до 7,2-7,4 обусловлено необходимостью создания стабильной системы, поскольку значения кислотности выше или ниже указанных пределов приведет к разрушению коллоидного раствора.
Выбор количественного содержания селена в средстве 0,0001-1,0% масс., а также биологически активного низкомолекулярного соединения 0,001-5% масс., обусловлен необходимостью соответствия решаемой задачи. Значения концентраций компонентов обеспечивает однородность и стабильность полученного средства.
Предпочтительный путь введения средства для внутриклеточной доставки - парентеральный. Доза рассчитывается в зависимости от биологически активного вещества, используемого в системе, из расчета 0,1-7 мг на килограмм массы тела биологического организма.
Пример 1
Готовят смесь 1 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора селенистой кислоты в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 7,55, далее готовят смесь 2 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора солянокислого гидразина в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 0,68, при интенсивном перемешивании вносится в смесь 1 смесь 2 по каплям, полученный раствор ставят на диализ против дистиллированной воды, удаляя ПЭГ 400 и солянокислый гидразин, избыток воды отгоняют на роторном испарителе при 60 об/мин при 70°, в полученный раствор вносится метионин до конечной концентрации 1,7 масс. %, доводят pH до 7,2-7,4.
Итого получаем:
| Низкомолекулярное биологически активное вещество метионин | 0,017 г/мл |
| Селен | 0,00062 г/мл |
| Вода | остальное |
В процентном соотношении от общего объема состав средства будет следующим, в масс. %:
| Низкомолекулярное биологически активное вещество метионин | 1,7 |
| Селен | 0,062 |
| Вода | до 100 |
Пример 2
Готовят смесь 1 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора селенистой кислоты в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 7,55, далее готовят смесь 2 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора солянокислого гидразина в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 0,68, при интенсивном перемешивании вносится в смесь 1 смесь 2 по каплям, полученный раствор ставят на диализ против дистиллированной воды, удаляя ПЭГ 400 и солянокислый гидразин, избыток воды отгоняют на роторном испарителе при 60 об/мин при 70°, в полученный раствор вносится гентамицин или цефалексин до конечной концентрации 1 масс. %, доводят pH до 7,2-7,4.
Итого получаем:
| Низкомолекулярное биологически активное вещество гентамицин или цефалексин | 0,095 г |
| Селен | 0,0098 г |
В процентном соотношении от общего объема состав средства будет следующим, в масс. %:
| Низкомолекулярное биологически активное вещество гентамицин или цефалексин | 1 |
| Коллоидный селен | 0,2 |
| Вода | до 100 |
Пример 3
Готовят смесь 1 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора селенистой кислоты в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 7,55, далее готовят смесь 2 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора солянокислого гидразина в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 0,68, при интенсивном перемешивании вносится в смесь 1 смесь 2 по каплям, полученный раствор ставят на диализ против дистиллированной воды, удаляя ПЭГ 400 и солянокислый гидразин, избыток воды отгоняют на роторном испарителе при 60 об/мин при 70°, в полученный раствор вносится гексаметилентетрамин до конечной концентрации 5 масс. %, доводят pH до 7,2-7,4.
Итого получаем:
| Низкомолекулярное биологически активное вещество гексаметилентетрамин | 0,05 г/мл |
| Селен | 0,00062 г/мл |
В процентном соотношении от общего объема состав средства будет следующим, в масс. %:
| Низкомолекулярное биологически активное вещество гексаметилентетрамин | 5 |
| Селен | 0,062 |
| Вода | до 100 |
Размер частиц полученного средства изучали с использованием электронной микроскопии, результаты которой показали, что средство, полученное предложенным способом, содержит частицы селена от 40 до 100 нм (см. рис. 1). На рисунке видны наночастицы с размером от 40 до 100 нм.
Влияние коллоидного селена на внутриклеточное проникновение метионина определяли по его накоплению во внутриклеточном пространстве. Измерение метионина определяли хроматографически по следующей методике:
Определение концентрации метионина осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Измерение концентрации метионина в клетках определяли на жидкостном хроматографе типа «Стайер», анализ проводили при длине волны - 288 нм, скорости потока - 0,9 см3/мин, объем вносимой пробы - 20 мкл, температура проведения анализа -30-35°C, элюэнт - ацетонитрил «для жидкостной хроматографии» - 1% раствор уксусной кислоты в соотношении 2:3 по объему. В указанных условиях хроматографируют стандартные растворы по два раза каждый. Измеряют площадь пика при времени удерживания 3,9-4,3 мин (зависит от эффективности колонки). По средним параллельных измерений, расхождение между которыми не должно превышать 5% (отн.), строят калибровочный график в координатах: площадь пика - концентрация мг/мл. Хроматографию анализируемых образцов проводят аналогично. По полученному среднему значению двух параллельных измерений (относительное стандартное отклонение которых не должно превышать 5%) из калибровочного графика находят концентрацию метионина в анализируемом растворе.
Накопление метионина наблюдали в перитонеальных клетках крыс и лимфоцитах.
Получение перитонеальных макрофагов
Перитонеальные макрофаги получали из брюшной полости крыс. Усыпленным хлороформом крысам внутрибрюшинно вводили 10 мл среды для выделения клеток из брюшной полости (среда 199+2% лошадиной сыворотки + 100 ед. гепарина + 100 ед. пенициллина) и выдерживали 1 мин, массируя брюшко. Затем крысу вскрывали и собирали введенную среду со смытыми макрофагами. После клетки осаждали при 2500 об/мин в течение 30 мин и отмывали 3 раза средой для отмывания клеток (среда 199+2% лошадиной сыворотки + 100 ед. пенициллина). Далее клетки ресуспендировали в среде для культивирования (среда 199+10% лошадиной сыворотки + 100 ед., пенициллина). Содержание и лейкограмму выделенных клеток определяли на геманализаторе «Arkus» (Австрия).
Получение лимфоцитов
Лимфоидные клетки получали из периферической крови телят. Периферическую кровь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин, после чего отбирали плазму. Полученную плазму разводили раствором Хенкса 3:1. Разбавленную плазму наслаивали на фикол-верографин, не нарушая границу раздела плазма/фикол и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин.
После центрифугирования собирали образовавшееся кольцо мононуклеарных клеток в отдельную пробирку, разбавляли раствором Хенкса 1:1 и осаждали клеточную фракцию при 3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок отмывали раствором Хенкса 1:7 от фикол-верографина, осаждая клеточную фракцию так же. Осадок с остатком супернатанта в суммарном объеме 1 мл разводили средой для получения лимфоцитов (среда 199+5% лошадиной сыворотки + 0,1% желатина) 1:1, осаждали при 2000 об/мин в течение 10 мин и полученный осадок ресуспендировали в той же среде. Содержание и лейкограмму выделенных клеток определяли на геманализаторе «Arkus» (Австрия).
Инкубация частиц коллоидного селена конъюгированного с метионином с перитонеальными макрофагами и лимфоцитами
Исследуемый коллоидные частицы инкубировали с перитонеальными макрофагами и лимфоцитами в течение 3 часов в термостате при 37°C.
После окончания инкубации клетки трижды отмывали холодным физиологическим раствором для удаления непоглощенных частиц. После отмывки клетки суспендировали в 200 мкл физиологического раствора. В полученной клеточной суспензии замеряли количество накопившегося в клетках метионина методом ВЭЖХ, а также готовили мазки.
В результате проведенных экспериментов были получены следующие данные. При культивировании метионина, конъюгированного с коллоидным селеном как носителем, наибольшая концентрация препарата определялась при использовании в качестве объекта исследования перитонеальных макрофагов крыс. При использовании лимфоцитов цельной крови телят в качестве объекта проникновения нами наблюдалось снижение количества метионина в 2 раза в клеточной популяции (табл. 1). Полученные данные указывают на способность коллоидного селена переносить метионин во внутриклеточное пространство.
| Таблица 1 | ||
| Концентрация метионина внутри клеток при использовании коллоидного селена как носителя | ||
| Вид конъюгата/вид клеток | Внесено метионина, мкг | Найдено метионина, мкг ×108/Li |
| конъюгат метионин/селен/перитонеальные макрофаги | 30,45 | 29,13 |
| конъюгат метионин/селен/лимфоциты цельной крови | 30,45 | 15,63 |
| метионин/лимфоциты цельной крови | 30,4 | 0,06 |
| метионин/перитонеальные макрофаги | 30,4 | 2,4 |
Аналогичные результаты получены и при использовании других низкомолекулярных веществ - гентамицина, гексаметилентетрамина, цефалексина, индол-3 карбинола.
Изучали биодинамику средства внутриклеточной доставки биологически активных веществ путем оценки проникающей способности коллоидных частиц селена внутрь клетки.
В качестве средства внутриклеточной доставки использовали средство, полученное в соответствии с примером 1 или 2.
Осуществляли маркирование препарата флуоресцентным красителем (ФИТЦ) по методике, описанной, например, в книге: Иммунологическаие методы / Под редакцией Г. Фримель, Перевод с немецкого А.П. Тарасова. - М.: Медицина, 1987, с. 130.
Объектом исследований служили белые мыши массой 20 грамм.
Все животные были разбиты на группы: первой группе мышей (n=3) препарат, меченый ФИТЦ, вводили внутримышечно в дозе 0,1 мл; второй - внутрибрюшинно в дозе 0,2 мл, третьей - орально в дозе 0,2 мл. Одна мышь была контрольной.
Через 2, 6 и 24 часа постмортально были получены отпечатки печени, почек, селезенки, костного мозга и мазок цельной крови.
Результаты исследований представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| №п/п | Органы | Внутриклеточная флуоресценция | ||
| 2 часа | 6 часов | 24 часа | ||
| ОРАЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ | ||||
| 1. | Кровь | + | ||
| 2. | Печень | + | + | |
| 3. | Почка | + | ||
| 4. | Селезенка | + | + | + |
| 5. | Костный мозг | + | + | |
| ВНУТРИБРЮШИННОЕ ВВЕДЕНИЕ | ||||
| 1. | Кровь | + | + | |
| 2. | Печень | + | + | |
| 3. | Почка | + | ||
| 4. | Селезенка | + | + | |
| 5. | Костный мозг | + | + | |
| ВНУТРИМЫШЕЧНОЕ В ВЕДЕНИЕ | ||||
| 1. | Кровь | + | + | |
| 2. | Печень | + | + | |
| 3. | Почка | + | ||
| 4. | Селезенка | + | + | |
| 5. | Костный мозг | + | + | |
Как видно из таблицы 2, комплекс на основе коллоидного селена с метионином или гентамицином в организме животных находится внутри структурных элементов, имеющих оболочку, т.е. внутри иммунокомпетентных клеток. При этом средство чаще всего проникает в клетки селезенки. Препарат достаточно быстро всасывается в желудочно-кишечном тракте.
Однако при оральном введении препарата в клеточные элементы крови он попадает значительно позднее, чем при парентеральном введении. Вместе с этим при парентеральном введении препарат достигает печени и селезенки позднее чем, при оральном.
Представленные данные свидетельствуют о проникновении препарата в клеточные элементы иммунокомпетентных органов, где и происходит его метаболизация. Отсутствие препарата в межклеточном пространстве указывает на его полную биодеградацию клеточными элементами.
Таким образом, средство не подвергается ферментной деградации и нейтрализации печенью, т.е. оно полностью проникает во внутриклеточное пространство.
Сам коллоидный селен, являясь частью метаболической цепочки организма, усваивается во внутриклеточном пространстве, т.е. в данном изобретении решена задача «утилизации» в организме самого носителя.
Определяли острую токсичность препарата методом Кербера.
Для этого использовали белых беспородных мышей в количестве 10 голов живой массой 20-25 г.
Средство на основе метионина или гентамицина вводили мышам внутрибрюшинно в максимально возможной дозе - 0,5 мл. Средство вводили в течение суток через каждые 3-4 часа.
В течение первых суток за мышами вели тщательное наблюдение, отмечая поведение, потребление пищи, воды, а также общее состояние.
Всего наблюдения вели в течение 2-х недель, гибели мышей не наблюдали. Таким образом, можно констатировать, что препарат относится к группе нетоксичных соединений.
Аналогичные результаты получены и при использовании других низкомолекулярных веществ - гексаметилентетрамина, цефалексина, индол-3-карбинола.
Вышеизложенные эксперименты доказывают, что средство, полученное разработанным способом обладает низкой токсичностью и высокой биодоступностью.
Кроме того, биодинамика биологически активных низкомолекулярных соединений, конъюгированных с коллоидным селеном, происходит лимфогенным путем и в меньшей степени подвергается ферментной деградации и нейтрализации печенью, при этом биологически активные низкомолекулярные вещества проявляют свое действие непосредственно в патологическом очаге.
Claims (1)
- Способ получения средства внутриклеточной доставки биологически активного низкомолекулярного соединения, заключающийся в том, что готовят смесь 1 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора селенистой кислоты в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 7,55, далее готовят смесь 2 путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора солянокислого гидразина в 8 мл ПЭГ 400, интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 0,68, при интенсивном перемешивании вносится в смесь 1 смесь 2 по каплям, полученный раствор ставят на диализ против дистиллированной воды, удаляя ПЭГ 400 и солянокислый гидразин, избыток воды отгоняют на роторном испарителе при 60 об/мин и 70°C, в полученный раствор вносится низкомолекулярное соединение, выбранное из группы гентамицин, гексаметилентетрамин, метионин, цефалексин, индол-3-карбинол, доводят pH до 7,2-7,4, при этом компоненты смешивают в количестве, обеспечивающем содержание их в средстве, в масс. %:
Биологически активное низкомолекулярное соединение 0,001-5,0 Селен 0,0001-1,0 Вода до 100
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014126130/15A RU2557987C1 (ru) | 2014-06-27 | 2014-06-27 | Способ получения средства внутриклеточной доставки биологически активных низкомолекулярных соединений, на основе наночастиц |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014126130/15A RU2557987C1 (ru) | 2014-06-27 | 2014-06-27 | Способ получения средства внутриклеточной доставки биологически активных низкомолекулярных соединений, на основе наночастиц |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2557987C1 true RU2557987C1 (ru) | 2015-07-27 |
Family
ID=53762621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014126130/15A RU2557987C1 (ru) | 2014-06-27 | 2014-06-27 | Способ получения средства внутриклеточной доставки биологически активных низкомолекулярных соединений, на основе наночастиц |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2557987C1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2322998C1 (ru) * | 2006-11-16 | 2008-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Березовый мир" | Носитель лекарственных и диагностических средств |
| RU2348666C2 (ru) * | 2007-03-16 | 2009-03-10 | Вера Матвеевна Елинсон | Способ получения нанокомпозитных полимерных материалов с биологической активностью и нанокомпозитные полимерные материалы, полученные этим способом |
| RU2372890C2 (ru) * | 2007-10-03 | 2009-11-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации - Федеральное государственное учреждение "27 Научный центр Министерства обороны Российской Федерации" | Способ получения наноразмерной системы доставки лекарственных средств на основе диоксида кремния |
| RU2012130202A (ru) * | 2012-07-16 | 2014-01-27 | Общество с ограниченной ответственностью "НаноФарм-про" (ООО "НаноФарм-про") | Средство внутриклеточной доставки биологически активных веществ на основе наноразмерных носителй и способ его получения (варианты) |
-
2014
- 2014-06-27 RU RU2014126130/15A patent/RU2557987C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2322998C1 (ru) * | 2006-11-16 | 2008-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Березовый мир" | Носитель лекарственных и диагностических средств |
| RU2348666C2 (ru) * | 2007-03-16 | 2009-03-10 | Вера Матвеевна Елинсон | Способ получения нанокомпозитных полимерных материалов с биологической активностью и нанокомпозитные полимерные материалы, полученные этим способом |
| RU2372890C2 (ru) * | 2007-10-03 | 2009-11-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации - Федеральное государственное учреждение "27 Научный центр Министерства обороны Российской Федерации" | Способ получения наноразмерной системы доставки лекарственных средств на основе диоксида кремния |
| RU2012130202A (ru) * | 2012-07-16 | 2014-01-27 | Общество с ограниченной ответственностью "НаноФарм-про" (ООО "НаноФарм-про") | Средство внутриклеточной доставки биологически активных веществ на основе наноразмерных носителй и способ его получения (варианты) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zavareh et al. | Chitosan/carbon quantum dot/aptamer complex as a potential anticancer drug delivery system towards the release of 5-fluorouracil | |
| Yang et al. | Chitosan mediated solid lipid nanoparticles for enhanced liver delivery of zedoary turmeric oil in vivo | |
| Ahmad et al. | Brain targeted delivery of carmustine using chitosan coated nanoparticles via nasal route for glioblastoma treatment | |
| Shen et al. | Microfluidics‐assisted engineering of pH/enzyme dual‐activatable ZIF@ polymer nanosystem for Co‐delivery of proteins and chemotherapeutics with enhanced deep‐tumor penetration | |
| Wang et al. | Mitoxantrone-preloaded water-responsive phospholipid-amorphous calcium carbonate hybrid nanoparticles for targeted and effective cancer therapy | |
| Wilson et al. | Nanoparticles based on albumin: preparation, characterization and the use for 5-flurouracil delivery | |
| Wang et al. | Integration of cascade delivery and tumor hypoxia modulating capacities in core-releasable satellite nanovehicles to enhance tumor chemotherapy | |
| Akhtar et al. | Pharmacokinetic profile of chitosan modified poly lactic co-glycolic acid biodegradable nanoparticles following oral delivery of gentamicin in rabbits | |
| Guo et al. | Enhanced drug release from a pH-responsive nanocarrier can augment colon cancer treatment by blocking PD-L1 checkpoint and consuming tumor glucose | |
| CN112826808B (zh) | 一种环二核苷酸或其类似物的中性/阳离子混合脂材纳米制剂及其应用 | |
| Rani et al. | Surface-engineered liposomes for dual-drug delivery targeting strategy against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) | |
| Li et al. | Size-transformable gelatin/nanochitosan/doxorubicin nanoparticles with sequentially triggered drug release for anticancer therapy | |
| van Vlerken et al. | Augmentation of therapeutic efficacy in drug-resistant tumor models using ceramide coadministration in temporal-controlled polymer-blend nanoparticle delivery systems | |
| CN117138042A (zh) | 一种二价无机金属离子/光敏剂蛋白纳米粒及制备和应用 | |
| Xu et al. | Anti-osteosarcoma trimodal synergistic therapy using NiFe-LDH and MXene nanocomposite for enhanced biocompatibility and efficacy | |
| Chen et al. | M1 macrophage-derived sonoresponsive nanoparticles for sonodynamic anticancer therapy | |
| Fan et al. | Polysialic acid self-assembled nanocomplexes for neutrophil-based immunotherapy to suppress lung metastasis of breast cancer | |
| Sengar | Liposomal Drug Delivery Systems: An Intro as a Primer for Advanced Therapeutics | |
| Baviskar et al. | Development and evaluation of N-acetyl glucosamine-decorated vitamin-E-based micelles incorporating resveratrol for cancer therapy | |
| US20170049701A1 (en) | Clustoidal multilamellar soy lecithin phospholipid structures for transdermal, transmucosal, or oral delivery, improved intestinal absorption, and improved bioavailability of nutrients | |
| Abdellatif et al. | MCT4 knockdown by tumor microenvironment-responsive nanoparticles remodels the cytokine profile and eradicates aggressive breast cancer cells | |
| Pourmadadi et al. | The smart nanocarrier containing zein/starch co-biopolymers enhanced by graphitic carbon nitride; exploring opportunities in brain cancer treatment | |
| CN116251062B (zh) | 一种细菌膜-脂质体载药系统的制备方法及其应用 | |
| Jin et al. | Glutamate affects self-assembly, protein corona, and anti-4 T1 tumor effects of melittin/vitamin E-succinic acid-(glutamate) n nanoparticles | |
| Liu et al. | Multidimensional Applications and Challenges of Metal–Organic Frameworks (MOFs) in Biomedicine: From Drug Safety Evaluation to Drug Delivery |