RU2550252C1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pCLm4/hygro-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH LIGHT CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, AND RECOMBINANT PLASMID DNA pCHm2-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH HEAVY CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, CHIMERIC ANTIBODY PROVIDING ACUTE PREVENTION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS IN MICE - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID DNA pCLm4/hygro-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH LIGHT CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, AND RECOMBINANT PLASMID DNA pCHm2-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH HEAVY CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, CHIMERIC ANTIBODY PROVIDING ACUTE PREVENTION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS IN MICE Download PDFInfo
- Publication number
- RU2550252C1 RU2550252C1 RU2013151031/10A RU2013151031A RU2550252C1 RU 2550252 C1 RU2550252 C1 RU 2550252C1 RU 2013151031/10 A RU2013151031/10 A RU 2013151031/10A RU 2013151031 A RU2013151031 A RU 2013151031A RU 2550252 C1 RU2550252 C1 RU 2550252C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tick
- borne encephalitis
- chimeric antibody
- gene
- hygro
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 75
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 title claims abstract description 25
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 title claims description 28
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title abstract description 7
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 title abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 57
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 14
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 13
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 8
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 4
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims description 2
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 claims description 2
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 claims description 2
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 20
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- 101000961156 Homo sapiens Immunoglobulin heavy constant gamma 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000840257 Homo sapiens Immunoglobulin kappa constant Proteins 0.000 description 5
- 102100039345 Immunoglobulin heavy constant gamma 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100029572 Immunoglobulin kappa constant Human genes 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108010075717 Flavivirus glycoprotein E Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 101000807236 Human cytomegalovirus (strain AD169) Membrane glycoprotein US3 Proteins 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 206010014612 Encephalitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 108010033155 GGGCCC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 description 1
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012572 advanced medium Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108010015866 endodeoxyribonuclease NheI Proteins 0.000 description 1
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002064 post-exposure prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и предназначена для биосинтеза в клетках млекопитающих полноразмерного химерного антитела, обеспечивающего экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита.The group of inventions relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, and is intended for biosynthesis in mammalian cells of a full-sized chimeric antibody that provides emergency prevention of mice from tick-borne encephalitis.
Вирус клещевого энцефалита, представитель семейства Flaviviridae, является высокопатогенным для человека вирусным агентом, который способен вызывать заболевание, приводящее к серьезным поражениям нервной системы [1].Tick-borne encephalitis virus, a member of the Flaviviridae family, is a highly pathogenic viral agent for humans that can cause a disease leading to serious damage to the nervous system [1].
В настоящее время для этиотропной терапии клещевого энцефалита применяют в основном сывороточный иммуноглобулин, получаемый из плазмы крови доноров, проживающих в природных очагах заболевания [2]. Этот препарат обладает выраженным терапевтическим эффектом особенно при среднетяжелом и тяжелом течении заболевания, причем введение препарата в 1-2 день после укуса обеспечивает значительно больший лечебный эффект, чем введение в последующие дни. Вместе с тем, препарат обладает определенными недостатками, в частности, он дефицитен, что связанно с ограниченным источником исходного материала, и содержит относительно низкий уровень специфических вируснейтрализующих антител. Кроме того, использование препаратов человеческой крови сопровождается известным биологическим риском.Currently, for the etiotropic treatment of tick-borne encephalitis, mainly serum immunoglobulin is used, obtained from the blood plasma of donors living in natural foci of the disease [2]. This drug has a pronounced therapeutic effect, especially with moderate to severe disease, and the introduction of the drug 1-2 days after the bite provides a significantly greater therapeutic effect than the introduction on the following days. However, the drug has certain disadvantages, in particular, it is deficient, which is associated with a limited source of source material, and contains a relatively low level of specific virus-neutralizing antibodies. In addition, the use of human blood products is associated with a known biological risk.
В последние годы сывороточные антитела заменяют рекомбинантными антителами, получаемыми в культурах клеток. Среди рекомбинантных антител на фармацевтическом рынке преобладают химерные антитела - полноразмерные иммуноглобулины, в которых к константным доменам иммуноглобулинов человека присоединены вариабельные домены мышиных моноклональных антител (МКА) [3, 4]. При конструировании химерных антител против вируса клещевого энцефалита ключевым этапом является выбор МКА, вариабельные домены которого обладают высоким сродством к антигену и обепечивают высокиее противовирусные свойства.In recent years, serum antibodies have been replaced with recombinant antibodies obtained in cell cultures. Among the recombinant antibodies in the pharmaceutical market, chimeric antibodies predominate - full-sized immunoglobulins in which the variable domains of murine monoclonal antibodies (MCAs) are attached to the constant domains of human immunoglobulins [3, 4]. When constructing chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus, the key step is the choice of MCA, whose variable domains have high affinity for the antigen and provide high antiviral properties.
Известны аналоги векторных плазмид, используемых для экспрессии химерных антител и полностью человеческих антител. К таким аналогам относятся плазмидные ДНК рСН37 и pCL37 (патент RU 2317330 С2, оп. 20.02.2008), предназначенные для экспрессии человеческого антитела против вируса осповакцины; плазмидные ДНК рСН1 и pCL1 (патент RU 2285043 С2, оп. 10.10.2006), предназначенные для экспрессии человеческого антитела против вируса Эбола; плазмидные ДНК pH1-HD и pL-HD2 (патент US 4975369 A, оп. 04.12.1990 и SU 1780541 A3, оп. 07.12.1992), предназначенные для экспрессии химерного антитела KS1/4 против антигена Ер-САМ клеток аденокарциномы человека; плазмидные ДНК pSVgptHu2VHPLAP-HuIgG1 и pSVneoHuVkPLAP-HuCk, предназначенные для экспрессии гуманизированного антитела против плацентарной щелочной фосфатазы человека (патент WO 199107500 А1, оп. 30.05.1991 и патент RU 2102479 C1, оп. 20.01.1998). Сведения о плазмидных ДНК, предназначенных для продукции химерных или гуманизированных антител против вируса клещевого энцефалита, в общедоступных источниках информации отсутствуют.Known analogues of vector plasmids used for the expression of chimeric antibodies and fully human antibodies. Such analogs include plasmid DNA pCH37 and pCL37 (patent RU 2317330 C2, op. 20.02.2008) intended for expression of a human antibody against vaccinia virus; plasmid DNA pCH1 and pCL1 (patent RU 2285043 C2, op. 10.10.2006) intended for expression of a human antibody against Ebola virus; plasmid DNA pH1-HD and pL-HD2 (patent US 4975369 A, op. 04.12.1990 and SU 1780541 A3, op. 07.12.1992), designed for expression of the chimeric antibody KS1 / 4 against the antigen Ep-SAM cells of human adenocarcinoma; plasmid DNA pSVgptHu2VHPLAP-HuIgG1 and pSVneoHuVkPLAP-HuCk intended for expression of a humanized antibody against human placental alkaline phosphatase (patent WO 199107500 A1, op. 30.05.1991 and patent RU 2102479 C1, op. 20.01.1998). Information about plasmid DNA intended for the production of chimeric or humanized antibodies against tick-borne encephalitis virus is not available in publicly available sources of information.
Ранее были получены и охарактеризованы МКА против гликопротеина Е - основного иммуногенного белка вируса клещевого энцефалита, причем некоторые из них, в частности антитело 14D5, способны ингибировать инфекционность вируса на культуре эукариотических клеток [5].Previously, MCAs were obtained and characterized against glycoprotein E, the main immunogenic protein of the tick-borne encephalitis virus, and some of them, in particular the 14D5 antibody, are able to inhibit the infectivity of the virus in eukaryotic cell culture [5].
Наиболее близким аналогом к заявляемой группе изобретений -прототипом, является химерное антитело ch13D6, обладающее сродством к гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита с константой аффинности 1,4·10-8 М и способное нейтрализовать инфекционность вируса клещевого энцефалита на культуре клеток [6]. Антитело ch13D6 получают в системе экспрессии, основанной на эукариотической линии НЕК293Т и двух плазмидных ДНК pD6H и pD6L, содержащих гены тяжелой и легкой цепей химерного антитела человека/мыши класса IgG1-каппа. Однако полученное химерное антитело не способно защищать модельных животных от инфекции вирусом клещевого энцефалита.The closest analogue to the claimed group of inventions, the prototype, is the chimeric antibody ch13D6, which has an affinity for tick-borne encephalitis virus glycoprotein E with an affinity constant of 1.4 · 10 -8 M and can neutralize tick-borne encephalitis virus infectivity in cell culture [6]. The ch13D6 antibody is obtained in an expression system based on the HEK293T eukaryotic line and two plasmid DNAs pD6H and pD6L containing the heavy and light chain genes of the human / mouse chimeric IgG1-kappa antibody. However, the resulting chimeric antibody is not able to protect model animals from tick-borne encephalitis virus infection.
Задачей группы изобретений является получение двух полипептидов со свойствами полноразмерных легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина человека, образующих в клетках млекопитающих химерное антитело человека/мыши класса IgG1/каппа, обладающее более высоким сродством к гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита, а также обеспечивающее экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита в дозировке, не превышающей 1 мг на кг веса животного.The objective of the group of inventions is to obtain two polypeptides with the properties of full-sized light and heavy chains of human immunoglobulin, forming in mammalian cells a chimeric human / mouse IgG1 / kappa antibody, which has a higher affinity for tick-borne encephalitis virus glycoprotein E, and also provides emergency prevention of mice from viral tick-borne encephalitis in a dosage not exceeding 1 mg per kg of animal weight.
Технический результат: получение гликопротеина иммуноглобулинового типа, обеспечивающего экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита в дозировке, не превышающей 1 мг на кг веса животного.EFFECT: obtaining an immunoglobulin type glycoprotein that provides emergency prophylaxis of mice against tick-borne encephalitis in a dosage not exceeding 1 mg per kg of animal weight.
Указанный результат достигается путем конструирования двух рекомбинантных плазмидных ДНК, одна из которых, pCLm4/hygro-14D5, кодирует синтез полипептида со свойствами легкой цепи полноразмерного химерного антитела, другая, pCHm2-14D5, - кодирует синтез полипептида со свойствами тяжелой цепи химерного антитела. Совместная трансфекция плазмидами pCLm4/hygro-14D5 и pCHm2-14D5 эукариотических клеток линии СНО-K1, обеспечивает синтез полипептида со свойствами химерного антитела, обеспечивающее экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита. Транзиентный биосинтез целевых полипептидов обеспечивается наличием в плазмидных ДНК pCLm4/hygro-14D5 и pCHm2-14D5 цитомегаловирусного промотора и сайта полиаденилирования гена бычьего гормона роста.This result is achieved by constructing two recombinant plasmid DNAs, one of which pCLm4 / hygro-14D5 encodes the synthesis of a polypeptide with the properties of the light chain of a full-sized chimeric antibody, the other, pCHm2-14D5, encodes the synthesis of a polypeptide with the properties of the heavy chain of a chimeric antibody. Joint transfection with pCLm4 / hygro-14D5 and pCHm2-14D5 plasmids of eukaryotic CHO-K1 cells ensures the synthesis of a polypeptide with the properties of a chimeric antibody, which provides emergency prophylaxis of mice against tick-borne encephalitis. Transient biosynthesis of target polypeptides is provided by the presence of pCLm4 / hygro-14D5 and pCHm2-14D5 in the plasmid DNA of the cytomegalovirus promoter and the bovine growth hormone gene polyadenylation site.
Сущность заявляемой группы изобретений заключается в следующем.The essence of the claimed group of inventions is as follows.
Генно-инженерными методами получают плазмиды pCLm4/hygro-14D5 и pCHm2-14D5, которые содержат искусственные гены легкой и тяжелой цепей полноразмерного химерного антитела, созданные на основе вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей мышиного моноклонального антитела 14D5 против вируса клещевого энцефалита и генов, кодирующих константные домены иммуноглобулинов человека класса IgG1/каппа, а также содержат цитомегаловирусный промотор и сайт полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Сконструированные плазмидные ДНК при одновременном введении в эукариотические клетки обусловливают биосинтез полипептидов со свойствами легкой и тяжелой цепей антитела человека, которые объединяются в химерное антитело, направленное против вируса клещевого энцефалита и обеспечивающее экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита.Using genetic engineering methods, plasmids pCLm4 / hygro-14D5 and pCHm2-14D5 are obtained, which contain artificial light and heavy chain genes of a full-sized chimeric antibody based on variable fragments of light and heavy chains of mouse monoclonal antibody 14D5 against tick-borne encephalitis virus and constant coding genes domains of human immunoglobulins of the IgG1 / kappa class, and also contain the cytomegalovirus promoter and the bovine growth hormone gene polyadenylation site. Constructed plasmid DNAs simultaneously introduced into eukaryotic cells determine the biosynthesis of polypeptides with the properties of the light and heavy chains of a human antibody, which combine into a chimeric antibody directed against tick-borne encephalitis virus and provide emergency prevention of mice from tick-borne encephalitis.
Исходным генетическим материалом для конструирования целевых плазмид служат следующие генно-инженерные исходные конструкции:The following genetic engineering source constructs serve as the initial genetic material for constructing the target plasmids:
а) суммарная РНК, выделенная из гибридомных клеток, продуцирующих мышиное моноклональное антитело 14D5 [5];a) total RNA isolated from hybridoma cells producing 14D5 murine monoclonal antibody [5];
б) суммарная РНК, выделенная из суммарной клеточной фракции крови здорового донора;b) total RNA isolated from the total cell fraction of the blood of a healthy donor;
в) плазмидная ДНК pCL37, содержащая ген легкой цепи полноразмерного моноклонального антитела человека 1F4 против вируса осповакцины, включающая лидерную последовательность гена легкой цепи антител мыши, участок гена, кодирующего константный домен легких цепей человеческих антител класса каппа [7];c) plasmid DNA pCL37 containing the light chain gene of the full-size human monoclonal antibody 1F4 against vaccinia virus, including the leader sequence of the mouse antibody light chain gene, a portion of the gene encoding the constant domain of the light chains of human kappa class antibodies [7];
г) плазмидная ДНК рСН37, содержащая ген тяжелой цепи полноразмерного моноклонального антитела человека 1F4 против вируса осповакцины, включающая лидерную последовательность гена тяжелой цепи антитела мыши, участки генов, кодирующие константные CH1-CH2-CH3 - домены тяжелых цепей человеческих антител класса IgG1 [7];d) plasmid DNA pCH37 containing the heavy chain gene of the full-length human monoclonal antibody 1F4 against vaccinia virus, including the leader sequence of the mouse antibody heavy chain gene, regions of the genes encoding the constant C H 1-C H 2-C H 3 - domains of the heavy chains of human antibodies IgG1 class [7];
д) плазмидная ДНК pcDNA™3.1/Hygro(+) (Invitrogen);d) plasmid DNA pcDNA ™ 3.1 / Hygro (+) (Invitrogen);
е) олигонуклеотидные праймеры для конструирования плазмидныхe) oligonucleotide primers for the construction of plasmid
ДНК, содержащих гены легкой и тяжелой цепи антитела человека противDNA containing the light and heavy chain genes of human antibodies
вируса клещевого энцефалита (в направлении 5′-3′).tick-borne encephalitis virus (in the
1. 5' СТТ CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC1.5 'CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC
2. 5' GGA AGA TCT ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC2.5 'GGA AGA TCT ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC
3. 5' CC GAA TTC GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA3.5 'CC GAA TTC GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA
4. 5' GG GAA GCT TGA TAC AGT TGG TGC AGC АТС AGC4.5 'GG GAA GCT TGA TAC AGT TGG TGC AGC PBX AGC
5. 5' GGC TTA TCG AAA TTA ATA CG5.5 'GGC TTA TCG AAA TTA ATA CG
6. 5' TAG AAG GCA CAG TCG AGG6.5 'TAG AAG GCA CAG TCG AGG
7. 5' GAC AAA ACT CAC АСА TGC7.5 'GAC AAA ACT CAC ACA TGC
8. 5' CAT GAG GGT GTC СТТ GGG8.5 'CAT GAG GGT GTC CTT GGG
9. 5' GAA АТС AAA CGT ACT GTG GCT GCA9.5 'GAA PBX AAA CGT ACT GTG GCT GCA
10. 5' TGC AGC CAC AGT ACG TTT GAT TTC10.5 'TGC AGC CAC AGT ACG TTT GAT TTC
11. 5' GG GAT АТС GTG ATG ACC CAG TCC CC11.5 'GG GAT PBX GTG ATG ACC CAG TCC CC
12. 5' CCG TTT GAT CTC AAG СТТ GGT CCC12.5 'CCG TTT GAT CTC AAG CTT GGT CCC
13. 5' GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG13.5 'GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG
14. 5' GAC GGT GAC CAG GGT ACC CTG GCC14.5 'GAC GGT GAC CAG GGT ACC CTG GCC
15. 5' CGC TCT AGA TCA TTT ACC CGG GGA CAG GGA GAG15.5 'CGC TCT AGA TCA TTT ACC CGG GGA CAG GGA GAG
16. 5' A TGC AAG CTT GAG АТС AAA CGG ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC16.5 'A TGC AAG CTT GAG PBX AAA CGG ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC
17. 5' TCG AGG АТС CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC17.5 'TCG AGG PBX CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC
18. 5' С CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA Т18.5 'C CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA T
19. 5' A TGC TCT AGA TCA TTT ACC CGG GGA CAG GGA19.5 'A TGC TCT AGA TCA TTT ACC CGG GGA CAG GGA
Полученная в результате плазмида pCLm4/hygro-14D5, кодирующая синтез в клетках млекопитающих полипептида со свойствами легкой цепи полноразмерного химерного антитела, характеризуется следующими признаками:The resulting plasmid pCLm4 / hygro-14D5, encoding the synthesis in mammalian cells of a polypeptide with the light chain properties of a full-sized chimeric antibody, is characterized by the following features:
- имеет молекулярную массу 4,11 МДа и размер 6232 п.н.;- has a molecular weight of 4.11 MDa and a size of 6232 bp;
- кодирует гибридный белок, в котором вариабельный домен легкой цепи мышиного моноклонального антитела 14D5 соединен с константным доменом каппа-цепи иммуноглобулинов человека;- encodes a hybrid protein in which the variable domain of the light chain of the murine monoclonal antibody 14D5 is connected to the constant domain of the kappa chain of human immunoglobulins;
- состоит из следующих элементов:- consists of the following elements:
а) NheI / ApaI - векторного фрагмента плазмиды pcDNA™3.1/Hygro(+) (Invitrogen) размером 5491 п.н., содержащего промотор-энхансер цитомегаловируса, сайт полиаденилирования и участок терминации транскрипции гена бычьего гормона роста, ген β-лактамазы (bla), ген гигромицин фосфотрансферазы (hpt);a) NheI / ApaI, a vector fragment of the plasmid pcDNA ™ 3.1 / Hygro (+) (Invitrogen), 5491 bp in size, containing the cytomegalovirus promoter enhancer, polyadenylation site and bovine growth hormone gene transcription termination site, β-lactamase gene (bla ), hygromycin phosphotransferase (hpt) gene;
б) NheI / ApaI - фрагмента промежуточной плазмиды pCLm4-14D5 размером 741 п.н., включающего искусственный ген, кодирующий полипептид со свойствами легкой цепи полноразмерного химерного антитела, осуществляющего протекцию против вируса клещевого энцефалита.b) NheI / ApaI - fragment of the intermediate plasmid pCLm4-14D5 of 741 bp in size, including an artificial gene encoding a polypeptide with the properties of the light chain of a full-sized chimeric antibody that protects against tick-borne encephalitis virus.
- содержит:- contains:
а) цитомегаловирусный (CMV) промотор и энхансер транскрипции;a) the cytomegalovirus (CMV) promoter and enhancer of transcription;
б) искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен легкой цепи мышиного моноклонального антитела 14D5 соединен с константным доменом каппа-цепи иммуноглобулинов человека;b) an artificial gene encoding a hybrid protein in which the variable domain of the light chain of the murine monoclonal antibody 14D5 is connected to the constant domain of the kappa chain of human immunoglobulins;
в) в качестве генетических маркеров ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pCLm4/hygro-14D5 клеток бактерий к ампициллину, и ген гигромицин фосфотрансферазы (hpt), обеспечивающий устойчивость к гигромицину В для селекции трансфицированных плазмидой pCLm4/hygro-14D5 клеток млекопитающих;c) as genetic markers, the β-lactamase gene (bla), which determines the resistance of bacterial cells transformed with plasmid pCLm4 / hygro-14D5 to ampicillin, and the hygromycin phosphotransferase (hpt) gene, which provides resistance to hygromycin B for selection of plasmids transfected with pCLm4 / hygro-14D5 mammalian cells;
г) уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: BglII - 13, NheI - 896, EcoRV - 980, HindIII - 1284, ApaI - 1637.d) unique recognition sites by restriction endonucleases having the following coordinates: BglII - 13, NheI - 896, EcoRV - 980, HindIII - 1284, ApaI - 1637.
Полученная в результате плазмида pCHm2-14D5, кодирующая синтез в клетках млекопитающих полипептида со свойствами тяжелой цепи полноразмерного химерного антитела, характеризуется следующими признаками:The resulting plasmid pCHm2-14D5, encoding the synthesis in mammalian cells of a polypeptide with the heavy chain properties of a full-sized chimeric antibody, is characterized by the following features:
- имеет молекулярную массу 4,47 МДа и размер 6765 п.н.;- has a molecular weight of 4.47 MDa and a size of 6765 bp;
- кодирует гибридный белок, в котором вариабельный домен тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14D5 соединен с константной частью тяжелой цепи иммуноглобулинов человека класса IgG1;- encodes a hybrid protein in which the variable domain of the heavy chain of the murine monoclonal antibody 14D5 is connected to the constant part of the heavy chain of human immunoglobulins of class IgG1;
- состоит из следующих элементов:- consists of the following elements:
а) NheI / XbaI - векторного фрагмента плазмиды pcDNA™3.1 (+) (Invitrogen) размером 5332 п.н., содержащего промотор-энхансер цитомегаловируса (CMV), сайт полиаденилирования и участок терминации транскрипции гена бычьего гормона роста (BGH), ген β-лактамазы (bla), ген устойчивости к неомицину (neo);a) NheI / XbaI, a 5332 bp vector fragment of plasmid pcDNA ™ 3.1 (+) (Invitrogen) containing the cytomegalovirus promoter enhancer (CMV), polyadenylation site and bovine growth hormone gene transcription termination site (BGH), β gene β-lactamases (bla), a gene for resistance to neomycin (neo);
б) NheI / XhoI - фрагмента промежуточной плазмиды pCHm2 размером 104 п.н., содержащего лидерную последовательность одного из VH-генов мыши;b) NheI / XhoI - fragment of the intermediate plasmid pCHm2 of 104 bp containing the leader sequence of one of the mouse VH genes;
в) XhoI / Acc65I - фрагмента размером 312 п.н., кодирующего вариабельный домен мышиного моноклонального антитела 14D5;c) XhoI / Acc65I - a fragment of 312 bp in size encoding the variable domain of the murine monoclonal antibody 14D5;
г) Acc65I / XbaI - фрагмента промежуточной плазмиды pCHm2, включающего участок, кодирующий CH1-, CH2-, CH3 - домены иммуноглобулинов человека класса IgG1.d) Acc65I / XbaI, a fragment of the intermediate plasmid pCHm2, including the region encoding C H 1 -, C H 2 -, C H 3 - domains of human immunoglobulins of the IgG1 class.
- содержит:- contains:
а) цитомегаловирусный (CMV) промотор и энхансер транскрипции;a) the cytomegalovirus (CMV) promoter and enhancer of transcription;
б) искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14D5 соединен с константной частью тяжелой цепи иммуноглобулинов IgGI человека;b) an artificial gene encoding a hybrid protein in which the variable domain of the heavy chain of the murine monoclonal antibody 14D5 is connected to the constant part of the heavy chain of human IgGI immunoglobulins;
в) в качестве генетических маркеров ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pCHm2-14D5 клеток бактерий к ампициллину и ген устойчивости к неомицину (neo) для селекции трансфецированных плазмидой pCHm2-14D5 клеток млекопитающих;c) as genetic markers, the β-lactamase gene (bla), which determines the resistance of bacterial cells transformed with plasmid pCHm2-14D5 to ampicillin and the neomycin resistance gene (neo) for selection of mammalian cells transfected with plasmid pCHm2-14D5;
г) уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: BglII - 14, NheI - 897, XhoI - 1001, Acc65I - 1313, XbaI - 2330.d) unique recognition sites by restriction endonucleases having the following coordinates: BglII - 14, NheI - 897, XhoI - 1001, Acc65I - 1313, XbaI - 2330.
Транзиентную экспрессию химерного антитела ch14D5 осуществляют в клетках млекопитающих линии СНО-K1, трансфицированных одновременно плазмидами pCLm4/hygro-14D5 и pCHm2-14D5, обеспечивающими синтез полипептидов со свойствами полноразмерных легкой и тяжелой цепей химерного антитела, обеспечивающее экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита.Transient expression of the ch14D5 chimeric antibody is carried out in mammalian cells of the CHO-K1 line, transfected simultaneously with the plasmids pCLm4 / hygro-14D5 and pCHm2-14D5, which provide the synthesis of polypeptides with the properties of full-size light and heavy chains of the chimeric antibody, which provides emergency prevention of mice from tick-borne encephalitis.
Целевое химерное антитело ch14D5 выделяют из культуральной жидкости аффинной хроматографией на сорбенте с ковалентно иммобилизованным белком A Staphylococcus aureus. Выделенное химерное антитело анализируют гель-электрофорезом в денатурирующих условиях в присутствии и в отсутствии 2-меркаптоэтанола.The target chimeric antibody ch14D5 is isolated from the culture fluid by affinity chromatography on a sorbent with covalently immobilized protein A of Staphylococcus aureus. The isolated chimeric antibody is analyzed by gel electrophoresis under denaturing conditions in the presence and absence of 2-mercaptoethanol.
Полученное химерное антитело ch14D5 обладает способностью связывать поверхностный белок Е вируса клещевого энцефалита [8] с константой аффинности 6,0·10-11 М, которую определяют методом поверхностного плазменного резонанса с использованием прибора ProteOn XPR36 (Bio-Rad).The resulting ch14D5 chimeric antibody has the ability to bind the surface protein E of tick-borne encephalitis virus [8] with an affinity constant of 6.0 · 10 -11 M, which is determined by surface plasma resonance using a ProteOn XPR36 (Bio-Rad) device.
Полученное химерное антитело ch14D5, введенное в дозировке, не превышающей 1 мг на кг веса животного, обеспечивает экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита, что подтверждается в экспериментах in vivo.The resulting ch14D5 chimeric antibody, administered at a dosage not exceeding 1 mg per kg of animal weight, provides emergency prophylaxis of mice against tick-borne tick-borne encephalitis, as confirmed in in vivo experiments.
Таким образом, впервые получены плазмидные ДНК pCLm4/hygro-14D5 и pCHm2-14D5, обеспечивающие синтез полипептидов со свойствами полноразмерных легкой и тяжелой цепей химерного антитела, способного связывать поверхностный белок Е вируса клещевого энцефалита с константой аффинности 6,0·10-11 М и обеспечивать экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита при введении химерного антитела ch14D5 в дозировке, не превышающей 1 мг на кг веса животного.Thus, pCLm4 / hygro-14D5 and pCHm2-14D5 plasmid DNAs were obtained for the first time, which provide the synthesis of polypeptides with the properties of full-size light and heavy chains of a chimeric antibody capable of binding tick-borne encephalitis virus surface protein E with an affinity constant of 6.0 · 10 -11 M and provide emergency prevention of mice from tick-borne encephalitis with the introduction of chimeric ch14D5 antibodies in a dosage not exceeding 1 mg per kg of animal weight.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:The invention is illustrated by the following figures:
Фиг. 1. Нуклеотидная и кодируемая ею аминокислотная последовательность NheI/ApaI-фрагмента плазмиды pCLm4/hygro-14D5, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи химерного антитела против вируса клещевого энцефалита. Подчеркнуты сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, жирным шрифтом выделены инициирующий и терминирующий кодоны.FIG. 1. The nucleotide and its encoded amino acid sequence of the NheI / ApaI fragment of plasmid pCLm4 / hygro-14D5, encoding a polypeptide with the properties of the light chain of a chimeric antibody against tick-borne encephalitis virus. Recognition sites of restriction endonucleases are underlined, initiating and terminating codons are in bold.
Фиг. 2. Нуклеотидная и кодируемая ею аминокислотная последовательность NheI/XbaI-фрагмента плазмиды pCHm2-14D5, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи химерного антитела против вируса клещевого энцефалита. Подчеркнуты сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, жирным шрифтом выделены инициирующий и терминирующий кодоны.FIG. 2. The nucleotide and its encoded amino acid sequence of the NheI / XbaI fragment of the plasmid pCHm2-14D5 encoding a polypeptide with the properties of the heavy chain of a chimeric antibody against tick-borne encephalitis virus. Recognition sites of restriction endonucleases are underlined, initiating and terminating codons are in bold.
Фиг. 3. Карта плазмиды pCLm4/hygro-14D5. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Pcmv - цитомегаловирусный промотор; S - сигнальная последовательность; VL, kappa_const - вариабельный и константный участки гена легкой цепи рекомбинантного антитела; BGHpA - сайт полиаденилирования гена бычьего гормона роста.FIG. 3. Plasmid map of pCLm4 / hygro-14D5. Restriction endonucleases sites are indicated. Pcmv - cytomegalovirus promoter; S is the signal sequence; VL, kappa_const — variable and constant regions of the recombinant antibody light chain gene; BGHpA is a bovine growth hormone gene polyadenylation site.
Фиг. 4. Карта плазмиды pCHm2-14D5. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Pcmv - цитомегаловирусный промотор; S - сигнальная последовательность; VH, IgG1_const. - вариабельный и константный участки гена тяжелой цепи рекомбинантного антитела; BGHpA - сайт полиаденилирования бычьего гормона роста.FIG. 4. Map of the plasmid pCHm2-14D5. Restriction endonucleases sites are indicated. Pcmv - cytomegalovirus promoter; S is the signal sequence; VH, IgG1_const. - variable and constant regions of the recombinant antibody heavy chain gene; BGHpA is a bovine growth hormone polyadenylation site.
Фиг. 5. Электрофореграмма очищенного химерного антитела в денатурирующем 15% полиакриламидном геле. Дорожки: 1 - маркер молекулярных масс, 2 - целевой белок, не обработанный 2-меркаптоэтанолом, 3 - целевой белок, обработанный 2-меркаптоэтанолом.FIG. 5. Electrophoregram of the purified chimeric antibody in a denaturing 15% polyacrylamide gel. Lanes: 1 — molecular weight marker, 2 — target protein not treated with 2-mercaptoethanol, 3 — target protein treated with 2-mercaptoethanol.
Фиг. 6. График, иллюстрирующий кинетику связывания химерного антитела ch14D5 в различных концентрациях с рекомбинантным белком Е [8]. Фрагмент 1-600 сек - фаза связывания антитела, 600-2500 сек - фаза диссоциации антитела.FIG. 6. A graph illustrating the kinetics of binding of the chimeric ch14D5 antibody at various concentrations with recombinant protein E [8]. Fragment 1-600 sec - antibody binding phase, 600-2500 sec - antibody dissociation phase.
Фиг. 7. График, иллюстрирующий выживаемость мышей, инфицированных вирусом клещевого энцефалита, штамм «Абсеттаров», в дозировке 240 ЛД5о, в зависимости от введения химерного антитела ch14D5. По горизонтальной оси указаны дни после инфекции, по вертикальной - число живых мышей.FIG. 7. Graph illustrating the survival of mice infected with tick-borne encephalitis virus, strain "Absettarov", at a dosage of 240 LD5o, depending on the introduction of the chimeric antibody ch14D5. The horizontal axis shows the days after infection, the vertical axis shows the number of live mice.
Для лучшего понимания сущности предлагаемых изобретений, они иллюстрируются следующими примерами конкретного осуществления.For a better understanding of the essence of the proposed invention, they are illustrated by the following examples of specific implementation.
Пример 1. Получение фрагментов ДНК, кодирующих вариабельные домены мышиного моноклонального антитела 14D5, и определение их нуклеотидных последовательностей.Example 1. Obtaining DNA fragments encoding the variable domains of the murine monoclonal antibody 14D5, and determining their nucleotide sequences.
Из гибридомных клеток, продуцирующих моноклональное антитело 14D5, выделяют суммарную РНК любым доступным способом, например, с использованием набора "RNeasy Mini Kit" (Qiagen).From hybridoma cells producing the 14D5 monoclonal antibody, total RNA is isolated by any available means, for example, using the RNeasy Mini Kit (Qiagen).
На основе выделенной РНК в реакции обратной транскрипции (ОТ) -полимеразной цепной реакции (ГЩР) с использованием олигонуклеотидных праймеров 1 и 2 и набора "One step RT-PCR Kit" (Qiagen) получают фрагмент ДНК VH-14D5, кодирующий вариабельный домен тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14D5, и аналогично с использованием олигонуклеотидных праймеров 3 и 4 получают фрагмент ДНК VL-14D5, кодирующий вариабельный домен легкой цепи мышиного моноклонального антитела 14D5. Продукты ОТ-ПЦР разделяют электрофоретически с использованием агарозного геля, и элюируют из геля любым доступным образом, например, с использованием набора "GeneJET™ Gel Extraction Kit" (Fermentas).Based on the isolated RNA in the reverse transcription (RT) polymerase chain reaction (GPR) reaction using
Нуклеотидные последовательности полученных фрагментов ДНК VH-14D5 и VL-14D5 определяют любым доступным способом, например, с использованием набора "BigDye® Terminator v3.1" (Applied Biosystems) и автоматического капиллярного секвенатора ABI 3730XL Genetic Analyser (Applied Biosystems). Нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК VH-14D5 и VL-14D5, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 14D5 представлены на фиг. 1 и фиг. 2.The nucleotide sequences of the obtained VH-14D5 and VL-14D5 DNA fragments are determined by any available method, for example, using the BigDye® Terminator v3.1 kit (Applied Biosystems) and ABI 3730XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) automatic capillary sequencer. The nucleotide sequences of the VH-14D5 and VL-14D5 DNA fragments encoding the variable domains of the heavy and light chains of the murine monoclonal antibody 14D5 are shown in FIG. 1 and FIG. 2.
Пример 2. Получение фрагментов ДНК, кодирующих константный домен тяжелой цепи иммуноглобулинов человека класса IgG1 и константный домен легкой цепи иммуноглобулинов человека класса каппа.Example 2. Obtaining DNA fragments encoding the constant domain of the heavy chain of human immunoglobulins of the IgG1 class and the constant domain of the light chain of human immunoglobulins of the Kappa class.
Из 1 мл крови здорового донора выделяют суммарную РНК любым доступным способом, например, с использованием набора "RNeasy Mini Kit" (Qiagen).Total RNA is isolated from 1 ml of blood from a healthy donor by any available means, for example, using the RNeasy Mini Kit (Qiagen).
На основе выделенной РНК в реакции ОТ-ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров 16 и 17 и набора "One step RT-PCR Kit" (Qiagen) получают фрагмент ДНК IGKC, кодирующий константный домен легкой цепи класса каппа иммуноглобулинов человека. Процедуру проводят согласно инструкции производителя, отжиг праймеров осуществляют при 55°C. Аналогично с использованием олигонуклеотидных праймеров 18 и 19 получают фрагмент ДНК IGHG1, кодирующий константный домен тяжелой цепи иммуноглобулинов человека класса IgG1. Продукты ОТ-ПЦР разделяют электрофоретически с использованием 1% агарозного геля и вырезают фрагмент геля с ДНК, соответствующей по подвижности 1000 п.н. в случае IGHG1 и 340 п.н. в случае IGKC. Элюируют ДНК из геля любым доступным образом, например, с использованием набора "GeneJET™ Gel Extraction Kit" (Fermentas).Based on the isolated RNA in the RT-PCR reaction using
Нуклеотидные последовательности полученных фрагментов ДНК IGHG1 и IGKC определяют любым доступным способом, например, с использованием набора "BigDye® Terminator v3.1" (Applied Biosystems) и автоматического капиллярного секвенатора ABI 3730XL Genetic Analyser (Applied Biosystems). Нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК IGHG1 и IGKC, кодирующих константные домены тяжелой цепи иммуноглобулинов человека класса IgG1 и легкой цепи иммуноглобулинов человека класса каппа представлены на фиг. 1 и фиг. 2.The nucleotide sequences of the obtained IGHG1 and IGKC DNA fragments are determined by any available method, for example, using the BigDye® Terminator v3.1 kit (Applied Biosystems) and ABI 3730XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) automatic capillary sequencer. The nucleotide sequences of the IGHG1 and IGKC DNA fragments encoding the constant domains of the IgG1 human immunoglobulin heavy chain and Kappa human immunoglobulin light chain constant domains are shown in FIG. 1 and FIG. 2.
Пример 3. Конструирование плазмидной ДНК pCLm4/hygro-14D5, содержащей ген, который кодирует легкую цепь химерного антитела ch14D5.Example 3. Construction of plasmid DNA pCLm4 / hygro-14D5 containing a gene that encodes the light chain of the chimeric antibody ch14D5.
Конструирование плазмидной ДНК pCLm4/hygro-14D5 состоит из нескольких этапов:The construction of plasmid DNA pCLm4 / hygro-14D5 consists of several stages:
1. Модификация исходной плазмиды pCL37 с целью введения уникальных сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции. Для этого плазмидную ДНК гидролизуют эндонуклеазами BamHI и XbaI, достраивают 5′-выступающие концы векторного фрагмента до тупых при помощи Pfu-полимеразы и объединяют полученные концы с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4. Полученную промежуточную плазмиду pCL37deltal используют в качестве матрицы в ПЦР, которую проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 ед.акт. Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), 0,5 ед.акт. Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas), 12,5 пмоль каждого олигонуклеотида, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 75 мМ Трис-HCl (рН 8,8 при 25°C), 20 мМ (NH4)2SO4, 0,01% детергента tween-20, 2,5 мМ MgSO4. Проводят 30 циклов по схеме: 95°C/30 сек, 52°C/30 сек, 72°C/50 сек. При этом с использованием пары праймеров 5 и 10, а также пары праймеров 6 и 9 получают два перекрывающихся фрагмента ДНК, которые после выделения используют в реакции совместной объединяющей ПЦР с образованием единого фрагмента ДНК light_delta2, представляющего собой фрагмент плазмиды pCL37, из которого удалены сайты HindIII, XhoI и XmaJI. Далее методом мегапраймера [9, 10] в ДНК-фрагмент light_delta2 вводят сайты узнавания эндонуклеаз EcoRV и HindIII в области, соответствующие концам VL-участка, кодирующего вариабельный домен легкой цепи антитела. Для этого методом ПЦР с праймеров 5 и 12 по матрице light_delta2 получают фрагмент ДНК, который после очистки достраивают по матрице light_delta2 и амплифицируют в присутствии олигонуклеотидов 5 и 6 с образованием фрагмента light_mod3. Методом ПЦР с праймеров 6 и 11 по матрице light_mod3 получают фрагмент ДНК, который после очистки достраивают по матрице light_mod3 и амплифицируют в присутствии олигонуклеотидов 5 и 6 с образованием фрагмента light_mod4. Этот фрагмент объединяют с исходной плазмидой pCL37, гидролизованной по сайтам NheI и ApaI, в реакции лигирования с образованием плазмиды pCLm4.1. Modification of the original plasmid pCL37 to introduce unique recognition sites of restriction endonucleases. To do this, plasmid DNA is hydrolyzed with BamHI and XbaI endonucleases, the 5 ′ protruding ends of the vector fragment are extruded to blunt using Pfu polymerase, and the obtained ends are combined using T4 bacteriophage DNA ligase. The obtained intermediate plasmid pCL37deltal is used as a template in PCR, which is carried out in 50 μl of the reaction mixture containing 0.5 unit act. Taq DNA polymerase (Fermentas), 0.5 unit Pfu DNA polymerase (Fermentas), 12.5 pmol of each oligonucleotide, 0.2 mm of each deoxynucleoside triphosphate, 75 mm Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 20 mm (NH 4 ) 2 SO 4 , 0, 01% tween-20 detergent, 2.5 mM MgSO 4 . Spend 30 cycles according to the scheme: 95 ° C / 30 sec, 52 ° C / 30 sec, 72 ° C / 50 sec. In this case, using a pair of
2. ДНК-фрагмент IGKC, полученный ранее, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции HindIII и BamHI и лигируют с векторным фрагментом, полученным в результате гидролиза плазмиды pCLm4 этими же эндонуклеазами. В результате получают плазмидную ДНК pCLm4-IGKC.2. The previously obtained IGKC DNA fragment is treated with restriction endonucleases HindIII and BamHI and ligated with the vector fragment obtained by hydrolysis of the plasmid pCLm4 with the same endonucleases. The result is plasmid DNA pCLm4-IGKC.
3. Встраивание в плазмиду pCLm4 фрагмента ДНК VL-14D5, кодирующего вариабельный домен мышиного моноклонального антитела 14D5. Фрагмент VL-14D5, полученный ранее, амплифицируют методом ПНР в присутствии праймеров 11 и 12. Полученный фрагмент обрабатывают эндонуклеазами рестрикции EcoRV и HindIII и лигируют с векторным фрагментом, полученным в результате гидролиза плазмиды pCLm4-IGKC этими же эндонуклеазами. В результате получают плазмидную ДНК pCLm4-14D5.3. Insertion into the plasmid pCLm4 of the VL-14D5 DNA fragment encoding the variable domain of the murine monoclonal antibody 14D5. The VL-14D5 fragment obtained earlier is amplified by the NDP method in the presence of
4. Клонирование гена, кодирующего легкую цепь химерного антитела ch14D5, в плазмидную ДНК pcDNA™3.1/Hygro(+). Плазмидную ДНК pCLm4-14D5 обрабатывают эндонуклеазами NheI и ApaI, в результате чего образуется фрагмент размером 741 п.н. Этот фрагмент лигируют с векторным фрагментом ДНК, образующимся при гидролизе плазмиды pcDNA™3.1/Hygro(+) этими же эндонуклеазами. Правильность встраивания подтверждают секвенированием с использованием любого доступного метода, например, с помощью набора "BigDye® Terminator v3.1" (Applied Biosystems) и автоматического капиллярного секвенатора ABI 3730XL Genetic Analyser (Applied Biosystems). В результате получают плазмидную ДНК pCLm4/hygro-14D5, карта которой представлена на фиг. 3.4. Cloning of the gene encoding the light chain of the ch14D5 chimeric antibody into pcDNA ™ 3.1 / Hygro plasmid DNA (+). The plasmid DNA pCLm4-14D5 is treated with NheI and ApaI endonucleases, resulting in the formation of a fragment of 741 bp in size. This fragment is ligated with a vector DNA fragment resulting from the hydrolysis of the plasmid pcDNA ™ 3.1 / Hygro (+) with the same endonucleases. The correct insertion was confirmed by sequencing using any available method, for example, using the kit "BigDye® Terminator v3.1" (Applied Biosystems) and automatic capillary sequencer ABI 3730XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems). As a result, plasmid DNA pCLm4 / hygro-14D5 is obtained, the map of which is shown in FIG. 3.
Пример 4. Конструирование плазмиды pCHm2-14D5, содержащей ген, кодирующий тяжелую цепь химерного антитела ch14D5.Example 4. Construction of the plasmid pCHm2-14D5 containing the gene encoding the heavy chain of the chimeric antibody ch14D5.
Конструирование плазмиды pCHm2-14D5 проводят в несколько этапов:The construction of the plasmid pCHm2-14D5 is carried out in several stages:
1. В векторную плазмиду рСН37 вводят сайты эндонуклеаз рестрикции XhoI и Асс651. Для этого в ПЦР по матрице рСН37 с праймеров 5 и 14 получают фрагмент ДНК sigVH. Далее методом ПЦР с использованием праймеров 13 и 14 на основе матрицы sigVH получают фрагмент ДНК, который после очистки достраивают и амплифицируют в присутствии олигонуклеотидов 5 и 14 с образованием фрагмента sigVHmod. Методом ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК плазмиды рСН37 в присутствии праймеров 5 и 15 получают фрагмент h-pA. Затем на основе матрицы h-pA методом мегапраймера в присутствии праймеров 5 и 15 достраивают фрагмент sigVHmod до фрагмента hm2a, который содержит ген тяжелой цепи антитела с введенными по концам VH-участка сайтами эндонуклеаз XhoI и Асс651. Фрагмент hm2a объединяют с исходной плазмидой рСН37, гидролизованной по сайтам эндонуклеаз NheI и XbaI, в реакции лигирования с образованием плазмиды pCHm2.1. XhoI and Ass651 restriction endonucleases sites are introduced into the vector plasmid pCH37. For this, a sigVH DNA fragment is obtained from the
2. ДНК-фрагмент IGHG1, полученный ранее, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Acc65I и XbaI и лигируют с векторным фрагментом, полученным в результате гидролиза плазмиды pCHm2 этими же эндонуклеазами. В результате получают плазмидную ДНК pCHm2-IGHG1.2. The previously obtained IGHG1 DNA fragment is treated with Acc65I and XbaI restriction endonucleases and ligated with the vector fragment obtained by hydrolysis of the pCHm2 plasmid with the same endonucleases. The result is plasmid DNA pCHm2-IGHG1.
3. Фрагмент VH-14D5, полученный ранее, амплифицируют методом ПЦР в присутствии праймеров 13 и 14. Полученный ПНР-фрагмент обрабатывают эндонуклеазами рестрикции XhoI и Acc65I и лигируют с векторным фрагментом, полученным в результате гидролиза плазмиды pCHm2-IGHG1 этими же эндонуклеазами. Правильность встраивания подтверждают секвенированием с использованием любого доступного метода, например, с помощью набора "BigDye® Terminator v3.1" (Applied Biosystems) и автоматического капиллярного секвенатора ABI 3730XL Genetic Analyser (Applied Biosystems). В результате получают плазмидную ДНК pCHm2-14D5, карта которой представлена на фиг. 4.3. The VH-14D5 fragment obtained previously is amplified by PCR in the presence of
Пример 5. Получение полноразмерного химерного антитела ch14D5 в эукариотических клетках млекопитающих.Example 5. Obtaining a full-sized chimeric antibody ch14D5 in eukaryotic mammalian cells.
Транзиентную экспрессию полноразмерного химерного антитела против вируса клещевого энцефалита осуществляют в результате ко-трансфекции клеток яичников китайского хомячка линии СНО-К1 полученными экспрессионными плазмидами pCLm4/hygro-14D5 и pCHm2-14D5, содержащими гены легкой и тяжелой цепей антитела. Перед трансфекцией клетки СНО-К1 культивируют при 37°C в атмосфере 5% CO2 в среде DMEM (Gibco), содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки. Клетки высевают на 6-луночные планшеты и выращивают до плотности 90-95%. Трансфекцию осуществляют с использованием реагента ″Lipofectamine 2000″ (Invitrogen) согласно инструкции производителя. Для этого в 4,5 мл среды DMEM добавляют 36 мкг ДНК pCLm4/hygro-14D5 и 36 мкг ДНК pCHm2-14D5. Одновременно смешивают 180 мкл реагента ″Lipofectamine 2000″ с 4,5 мл среды DMEM. После пятиминутной инкубации оба полученных раствора объединяют и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. После инкубации по 0,5 мл суспензии вносят в каждую лунку планшета, содержащего клетки СНО-К1. Через 4 ч после трансфекции культуральную среду в лунках заменяют на 0,5 мл среды "DMEM F12 advanced" (Gibco) с добавлением 2% сыворотки с пониженным содержанием иммуноглобулинов (Invitrogen). Через 72 ч культуральную среду собирают и центрифугируют 15 мин при 15000 g. Супернатант отделяют, добавляют к нему азид натрия до концентрации 0,05% и используют для выделения антител.Transient expression of a full-sized chimeric antibody against tick-borne encephalitis virus is carried out as a result of co-transfection of Chinese hamster ovary cells of the CHO-K1 line with the obtained expression plasmids pCLm4 / hygro-14D5 and pCHm2-14D5 containing the light and heavy chain genes of the antibody. Before transfection, CHO-K1 cells were cultured at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in DMEM (Gibco) containing 10% bovine fetal serum. Cells are seeded on 6-well plates and grown to a density of 90-95%. Transfection is carried out using reagent ″
Пример 6. Выделение рекомбинантных антител с помощью аффинной хроматографии.Example 6. Isolation of recombinant antibodies using affinity chromatography.
Культуральную жидкость в объеме около 500 мл наносят при 4°C со скоростью 0,5 мл/мин на колонку, содержащую 5 мл сорбента "Protein A Sepharose CL-4B″ (GE Healthcare) и уравновешенную фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР), представляющем собой раствор 100 мМ Nad, 50 мМ Na2HPO4 (pH 7,4 при 25°C). Элюцию осуществляют при 25°C и скорости 1 мл/мин с использованием хроматографа "BioLogic LP System" (Bio-Rad). Колонку промывают 25 мл ФСБР, после чего элюируют иммуноглобулины быка, исходно присутствующие в сыворотке, 25 мл 0,1 М цитратного буфера (pH 5,0 при 25°C). Далее 15 мл 0,1 М цитратного буфера (pH 3,0 при 25°C) элюируют химерное антитело в пробирку, содержащую 1,5 мл 1 М буфера Трис-HCl (pH 8,0 при 25°C). Фракцию, содержащую химерное антитело, концентрируют с помощью концентраторов ″Amicon ultra-4″ 30 кДа (Millipore) согласно инструкции производителя, одновременно заменяя буферный раствор на ФСБР с добавлением 0,05% азида натрия. Концентрацию антитела в образце определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм, учитывая, что раствор иммуноглобулинов IgG в концентрации 1 мг/мл при длине оптического пути 1 см характеризуется оптической плотностью около 1,41 [11]. Очищенные рекомбинантные антитела анализируют в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях фракционированием в 12% полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия (фиг. 5).A culture fluid in a volume of about 500 ml was applied at 4 ° C at a rate of 0.5 ml / min on a column containing 5 ml of Protein A Sepharose CL-4B sorbent (GE Healthcare) and balanced with phosphate-buffered saline (PBS). which is a solution of 100 mm Nad, 50 mm Na 2 HPO 4 (pH 7.4 at 25 ° C.) The elution is carried out at 25 ° C and a speed of 1 ml / min using a BioLogic LP System chromatograph (Bio-Rad). The column is washed with 25 ml of PBS, after which the bovine immunoglobulins originally present in serum are eluted with 25 ml of 0.1 M citrate buffer (pH 5.0 at 25 ° C), followed by 15 ml of 0.1 M citrate buffer (pH 3.0 at 25 ° C) elute the chimeric antibody in a test tube containing 1.5 ml of 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0 at 25 ° C). The fraction containing the chimeric antibody is concentrated using 30 ″ Amicon ultra-4 ″ concentrators (Millipore) according to the manufacturer’s instructions, while replacing the buffer solution with PBS with the addition of 0.05% sodium azide The concentration of antibodies in the sample is determined spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm, given that the IgG immunoglobulin solution is at a concentration of 1 mg / ml at the
Пример 7. Определение сродства химерного антитела ch14D5 к рекомбинантому аналогу гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита.Example 7. Determination of the affinity of the chimeric antibody ch14D5 to the recombinant analog of tick-borne encephalitis virus glycoprotein E.
Кинетику связывания химерного антитела ch14D5 с рекомбинантным белком Е [8] и кинетику диссоциации комплексов, а также термодинамическую константу аффинности между этими соединениями определяли методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Для этого активируют поверхность одного из вертикальных каналов биосенсорного чипа GLC (Bio-Rad) с помощью набора "ProteOn Amine Coupling Kit" (Bio-Rad) согласно методике производителя. На активированную поверхность иммобилизуют рекомбинантный белок Е из расчета 250 мкл раствора с концентрацией 30 мкг/мл белка в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4,5 при 25°C). Оставшиеся активированные группы блокируют 1М раствором этаноламин-HCl. В качестве аналита используют последовательные двухкратные разведения химерного антитела ch14D5 в ФСБР с добавлением 0,005% детергента tween-20, максимальная концентрация антитела составляет 7,5 мкг/мл. Ассоциацию проводят в течение 600 сек при скорости потока 25 мкл/мин, затем следует диссоциация в течение 1800 сек с той же скоростью. На основе полученной сенсограммы вычисляют кинетические константы связывания компонентов и диссоциации комплексов, которые используют для вычисления равновесных константы диссоциации и константы аффинности. Полученное в эксперименте значение константы аффинности химерного антитела ch14D5 к белку Е составило 6,0·10-11 М. (фиг. 6).The kinetics of binding of the chimeric ch14D5 antibody to recombinant protein E [8] and the kinetics of dissociation of complexes, as well as the thermodynamic affinity constant between these compounds, were determined by surface plasmon resonance using a ProteOn XPR36 instrument (Bio-Rad). To do this, activate the surface of one of the vertical channels of the GLC biosensor chip (Bio-Rad) using the ProteOn Amine Coupling Kit (Bio-Rad) according to the manufacturer's method. Recombinant protein E is immobilized onto the activated surface at the rate of 250 μl of a solution with a concentration of 30 μg / ml protein in 10 mM acetate buffer (pH 4.5 at 25 ° C). The remaining activated groups are blocked with a 1M solution of ethanolamine-HCl. As an analyte, serial two-fold dilutions of chimeric ch14D5 antibody in PBS were added with the addition of 0.005% tween-20 detergent; the maximum concentration of the antibody was 7.5 μg / ml. The association is carried out for 600 sec at a flow rate of 25 μl / min, followed by dissociation for 1800 sec at the same rate. Based on the obtained sensogram, kinetic constants of component binding and complex dissociation are calculated, which are used to calculate the equilibrium dissociation constants and affinity constants. The experimentally obtained value of the affinity constant of the chimeric antibody ch14D5 for protein E was 6.0 · 10 -11 M. (Fig. 6).
Пример 8. Определение способности химерного антитела ch14D5 обеспечивать экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита.Example 8. The determination of the ability of the chimeric antibody ch14D5 to provide emergency prophylaxis of mice against tick-borne encephalitis.
Для подтверждения способности химерного антитела ch14D5 обеспечивать экстренную профилактику модельных животных от вирусного клещевого энцефалита используют мышей линии Balb/C весом 10 г. Каждая группа содержит 10 животных. Для изучения дозозависимого эффекта препарат химерного антитела ch14D5 вводят в двух дозировках, 8 мг/кг веса животного и 1 мг/кг веса животного. В качестве препаратов сравнения используют иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита для внутримышечного введения 10% с титром специфических антител в РТГА 1:160 (НПО «Микроген», г.Томск). В качестве контроля летальности вируса используют группу инфицированных мышей, в которых после инфицирования вирусом клещевого энцефалита не вводят ни химерное антитело, ни препараты сравнения. В качестве контроля используют группу интактных мышей.To confirm the ability of the ch14D5 chimeric antibody to provide emergency prophylaxis of model animals against tick-borne encephalitis, 10 g Balb / C mice were used. Each group contains 10 animals. To study the dose-dependent effect, the ch14D5 chimeric antibody preparation is administered in two dosages, 8 mg / kg animal weight and 1 mg / kg animal weight. As comparison preparations, a human immunoglobulin against tick-borne encephalitis is used for intramuscular administration of 10% with a titer of specific antibodies in RTGA 1: 160 (NPO Mikrogen, Tomsk). As a control of the lethality of the virus, a group of infected mice is used, in which, after infection with tick-borne encephalitis virus, neither a chimeric antibody nor comparison preparations are administered. A group of intact mice was used as a control.
Для приготовления вируса используют суспензию головного мозга мышей-сосунков, зараженных вирусом клещевого энцефалита, штамм «Абсеттаров», хранящуюся при -30°C. После размораживания суспензию путем последовательных десятикратных разведении разводят в 107 раз в 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2-7,4 при 25°C) с добавлением 2% сыворотки крупного рогатого скота. Мышам внутрибрюшинно водят по 0,2 мл суспензии в рабочем разведении. Реальную летальную дозу препарата рассчитывают по методу Рида-Менча [12]. Для этого готовят последовательные десятикратные разведения мозговой суспензии вируса от 10-7 до 10-10 и вводят мышам внутрибрюшинно по 0,2 мл (по 6 голов на каждое разведение). Реальная доза введенного вируса в эксперименте составляет 240 ЛД5о.To prepare the virus, use the suspension of the brain of sucker mice infected with tick-borne encephalitis virus, strain Absettarov, stored at -30 ° C. After thawing, the suspension is diluted 107 times in successive ten-fold dilutions in a 0.9% sodium chloride solution (pH 7.2-7.4 at 25 ° C) with the addition of 2% cattle serum. Mice were intraperitoneally administered with 0.2 ml of suspension in working dilution. The real lethal dose of the drug is calculated according to the Reed-Mench method [12]. To do this, prepare sequential ten-fold dilutions of the brain suspension of the virus from 10 -7 to 10 -10 and inject the mice intraperitoneally with 0.2 ml (6 goals for each dilution). The real dose of the introduced virus in the experiment is 240 LD5o.
Определение способности химерного антитела обеспечивать экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита осуществляют следующим образом. Через сутки после заражения вирусом мышам внутривенно в хвостовую вену однократно вводят заранее приготовленные рабочие растворы исследуемых антител в 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2-7,4 при 25°C) в дозах 8 мг/кг веса (80 мкг/мышь) и 1 мг/кг веса (10 мкг/мышь). В качестве препарата сравнения однократно внутримышечно вводят препарат иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита для внутримышечного введения в дозировке 10 мг/кг веса (100 мкг/мышь). Мышей наблюдают в течение 21 суток после заражения вирусом клещевого энцефалита, подсчитывая смертность животных. Результаты эксперимента показывают, что однократное введение химерного антитела в дозировке 8 мг/кг веса и 1 мг/кг веса мышам, зараженным 240 ЛД50 вируса клещевого энцефалита, обеспечило 100% выживаемость животных (летальность 0%). Результаты эксперимента представлены на фиг. 7.The ability of a chimeric antibody to provide emergency prophylaxis of mice against tick-borne tick-borne encephalitis is determined as follows. A day after infection with the virus, mice are intravenously injected into the tail vein with pre-prepared working solutions of the studied antibodies in a 0.9% sodium chloride solution (pH 7.2-7.4 at 25 ° C) at doses of 8 mg / kg body weight (80 μg / mouse) and 1 mg / kg of body weight (10 μg / mouse). As a comparison drug, a human immunoglobulin preparation against tick-borne encephalitis is administered intramuscularly once for intramuscular administration at a dose of 10 mg / kg body weight (100 μg / mouse). Mice are observed for 21 days after infection with tick-borne encephalitis virus, counting the mortality of animals. The experimental results show that a single dose of the chimeric antibody at a dosage of 8 mg / kg bodyweight and 1 mg / kg in mice infected with 240 LD 50 of tick-borne encephalitis virus, provided 100% survival of the animals (0% mortality). The experimental results are shown in FIG. 7.
Таким образом, впервые сконструированы плазмиды pCLm4/hygro-14D5 и pCHm2-14D5, содержащие искусственные гены легкой и тяжелой цепей полноразмерного химерного антитела, созданные на основе вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей мышиного моноклонального антитела 14D5, константных генов иммуноглобулинов IgG1/каппа человека, цитомегаловирусного промотора и сайта полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Транзиентная экспрессия в эукариотических клетках линии СНО-К1 обусловливает биосинтез полипептидов со свойствами легкой и тяжелой цепей химерного антитела, которые объединяются в антитело класса IgG1/каппа, специфически взаимодействующее поверхностным гликопротеином Е вируса клещевого энцефалита. Константа аффинности химерного антитела к рекомбинантному гликопротеину Е составляет около 6,0·10-11 М. Полученное химерное антитело ch14D5, введенное в дозировке 1 мг на кг веса животного, обеспечивает экстренную профилактику мышей от вирусного клещевого энцефалита, что делает возможным использование химерного антитела ch14D5 в качестве основы для создания лекарственных препаратов для лечения вирусного клещевого энцефалита.Thus, pCLm4 / hygro-14D5 and pCHm2-14D5 plasmids were constructed for the first time, containing artificial genes for the light and heavy chains of a full-sized chimeric antibody, created on the basis of variable fragments of the light and heavy chains of mouse monoclonal antibody 14D5, constant immunoglobulin genes of human IgG1 / kappa human cytomega the promoter and polyadenylation site of the bovine growth hormone gene. Transient expression in eukaryotic cells of the CHO-K1 line determines the biosynthesis of polypeptides with the properties of the light and heavy chains of a chimeric antibody, which combine into an IgG1 / kappa class antibody that specifically interacts with tick-borne encephalitis virus surface glycoprotein E. The affinity constant of the chimeric antibody for recombinant glycoprotein E is about 6.0 · 10 -11 M. The resulting ch14D5 chimeric antibody, administered at a dose of 1 mg per kg of animal weight, provides emergency prophylaxis of mice against tick-borne encephalitis, which makes it possible to use chimeric ch14D5 antibody as a basis for creating drugs for the treatment of tick-borne viral encephalitis.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИINFORMATION SOURCES
1. Аммосов А.Д. Клещевой энцефалит: Информационно-методическое пособие / А.Д. Аммосов. - Кольцове: Ин-т средств мед. диагностики ЗАО «Вектор-Бест», 2006. - 115 с.1. Ammosov A.D. Tick-borne encephalitis: Information-methodical manual / A.D. Ammosov. - Koltsovo: Institute of honey. Diagnostics CJSC Vector-Best, 2006. - 115 p.
2. Пеньевская Н.А., Рудаков Н.В. Эффективность применения препаратов иммуноглобулина для постэкспозиционной профилактики клещевого энцефалита в России (Обзор полувекового опыта) // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. -2010. -N1. - С. 53-592. Penyevskaya N.A., Rudakov N.V. The effectiveness of the use of immunoglobulin preparations for post-exposure prophylaxis of tick-borne encephalitis in Russia (Review of half a century of experience) // Medical parasitology and parasitic diseases. 2010. -N1. - S. 53-59
3. Morrison, S.L., Johnson, M.J., Herzenberg, L.A., Oi V.T. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1984. - V. 81(21). - P. 6851-6855.3. Morrison, S.L., Johnson, M.J., Herzenberg, L.A., Oi V.T. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1984.- V. 81 (21). - P. 6851-6855.
4. Boulianne G.L., Hozumi N, Shulman MJ. Production of functional chimaeric mouse/human antibody. // Nature. - 1984. - V. 312(5995). - P. 643-646.4. Boulianne G. L., Hozumi N, Shulman MJ. Production of functional chimaeric mouse / human antibody. // Nature. - 1984.- V. 312 (5995). - P. 643-646.
5. Tsekhanovskaya N.A., Matveev L.E., Rubin S.G., Karavanov A.S., Pressman E.K. Epitope analysis of tick-bome encephalitis (TBE) complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype). // Virus Res. - 1993. - V. 30(1). - P. 1-16.5. Tsekhanovskaya N.A., Matveev L.E., Rubin S.G., Karavanov A.S., Pressman E.K. Epitope analysis of tick-bome encephalitis (TBE) complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype). // Virus Res. - 1993 .-- V. 30 (1). - P. 1-16.
6. Levanov L.N., Matveev L.E., Goncharova E.P., Lebedev L.R., Ryzhikov A.B., Yun Т.Е., Batanova T.A., Shvalov A.N., Baykov I.K., Shingarova L.N., Kirpichnikov M.P., Tikunova N.V. Chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus // Vaccine. - 2010. - V. 28. - P. 5265-5271.6. Levanov L.N., Matveev L.E., Goncharova E.P., Lebedev L.R., Ryzhikov A.B., Yun T.E., Batanova T.A., Shvalov A.N., Baykov I.K., Shingarova L.N., Kirpichnikov M.P., Tikunova N.V. Chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus // Vaccine. - 2010. - V. 28. - P. 5265-5271.
7. Тикунова Н.В., Шингарова Л.Н., Юн Т.Э. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК pcL37, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи антитела человека против вируса осповакцины, рекомбинантная плазмидная ДНК рсН37, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи указанного антитела, и их применение. Патент РФ №2317330 С2, оп.20.02.20087. Tikunova N.V., Shingarova L.N., Yun T.E. and others. Recombinant plasmid DNA pcL37 encoding a polypeptide with the properties of the light chain of a human antibody against vaccinia virus, recombinant plasmid DNA pcH37 encoding a polypeptide with the properties of the heavy chain of the specified antibodies, and their use. RF patent №2317330 C2, op.20.02.2008
8. Нетесова Н.А., Белавин П.А., Малыгин Э.Г., Рукавишников М.Ю. Рекомбинантная плазмидная ДНК PGSDEI, кодирующая белок Е вируса клещевого энцефалита, и штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка Е вируса клещевого энцефалита. Патент РФ 2136754,19998. Netesova N.A., Belavin P.A., Malygin E.G., Rukavishnikov M.Yu. Recombinant plasmid DNA PGSDEI encoding tick-borne encephalitis virus E protein and Escherichia coli strain producing recombinant tick-borne encephalitis virus E protein. RF patent 2136754,1999
9. Giebel L.B., Spritz R.A. Site-directed mutagenesis using a double-stranded DNA fragment as a PCR primer. // Nucleic Acids Res. - 1990. - V. 18(16). -P. 4947.9. Giebel L.B., Spritz R.A. Site-directed mutagenesis using a double-stranded DNA fragment as a PCR primer. // Nucleic Acids Res. - 1990. - V. 18 (16). -P. 4947.
10. Ke S.H., Madison E.L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube ′megaprimer′ PCR method. // Nucleic Acids Res. - 1997. -V. 25(16). -P. 3371-3372.10. Ke S.H., Madison E.L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube ′ megaprimer ′ PCR method. // Nucleic Acids Res. - 1997. -V. 25 (16). -P. 3371-3372.
11. Hale G. Isolation and purification of monoclonal antibodies from tissue culture supernatant // Monoclonal antibodies. A practical approach. Shepherd P and Dean C. (ed). Oxford University Press. 2000. P. 149-180.11. Hale G. Isolation and purification of monoclonal antibodies from tissue culture supernatant // Monoclonal antibodies. A practical approach. Shepherd P and Dean C. (ed). Oxford University Press. 2000.P. 149-180.
12. Reed L.J., Muench, H.A simple method of estimating fifty percent endpoints. // The American Journal of Hygiene. - 1938. - V. 27. - P. 493-497.12. Reed L.J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. // The American Journal of Hygiene. - 1938. - V. 27. - P. 493-497.
Claims (3)
- NheI/ApaI - векторный фрагмент плазмиды pcDNA™3.1/Hygro(+) (Invitrogen) размером 5491 п.н., содержащий промотор-энхансер цитомегаловируса, сайт полиаденилирования и участок терминации транскрипции гена бычьего гормона роста, ген β-лактамазы (bla), ген гигромицин фосфотрансферазы (hpt);
- NheI/ApaI - фрагмент размером 741 п.н., содержащий искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен легкой цепи мышиного моноклонального антитела 14D5, осуществляющего протекцию против вируса клещевого энцефалита, соединен с константным доменом каппа-цепи антител человека, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, приведенную на фиг. 1;
- генетические маркеры: ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pCLm4/hygro-14D5 клеток бактерий к ампициллину, ген гигромицин фосфотрансферазы (hpt), определяющий устойчивость к гигромицину В для селекции трансфицированных плазмидой pCLm4/hygro-14D5 клеток млекопитающих;
- уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: BglII-13, NheI-896, EcoRV-980, HindIII-1284, ApaI-1637.1. Recombinant plasmid DNA pCLm4 / hygro-14D5 encoding a polypeptide with the properties of the light chain of a chimeric antibody against tick-borne encephalitis virus, size 6232 bp and a molecular weight of 4.11 MDa, containing in accordance with the physical map shown in figure 3:
- NheI / ApaI — 5491 bp pcDNA ™ 3.1 / Hygro (+) plasmid vector fragment containing the cytomegalovirus promoter enhancer, polyadenylation site and bovine growth hormone gene transcription termination site, β-lactamase gene (bla) hygromycin phosphotransferase (hpt) gene;
- NheI / ApaI - fragment of 741 bp containing an artificial gene encoding a hybrid protein in which the variable domain of the light chain of mouse monoclonal antibody 14D5, which protects against tick-borne encephalitis virus, is connected to the constant domain of the kappa chain of human antibodies, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG. one;
- genetic markers: β-lactamase (bla) gene, which determines the resistance of bacterial cells transformed with plasmid pCLm4 / hygro-14D5 to ampicillin, the hygromycin phosphotransferase (hpt) gene, which determines resistance to hygromycin B for selection of mammalian cells transfected with plasmid pCLm4 / hygro-14D5;
- unique recognition sites of restriction endonucleases, having the following coordinates: BglII-13, NheI-896, EcoRV-980, HindIII-1284, ApaI-1637.
- NheI/XbaI - векторный фрагмент плазмиды pcDNA™3.1(+) (Invitrogen) размером 5332 п.н., содержащий промотор-энхансер цитомегаловируса CMV, сайт полиаденилирования и участок терминации транскрипции гена бычьего гормона роста BGH, ген β-лактамазы (bla), ген устойчивости к неомицину (neo);
- NheI/XbaI - фрагмент размером 1433 п.н., содержащий искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 14D5, осуществляющего протекцию против вируса клещевого энцефалита, соединен с константными СН1-СН2-СН3-доменами IgG1 человека, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, приведенную на фиг. 2;
- генетические маркеры: ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pCHm2-14D5 клеток бактерий к ампициллину, ген устойчивости к неомицину (neo) для селекции трансфицированных плазмидой pCHm2-14D5 клеток млекопитающих;
- уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: BglII-14, NheI-897, XhoI-1001, Acc65I-1313, XbaI-2330.2. Recombinant plasmid DNA pCHm2-14D5 encoding a polypeptide with the properties of the heavy chain of a chimeric antibody against tick-borne encephalitis virus, size 6765 bp and a molecular weight of 4.47 MDa, including:
- NheI / XbaI — 5332 bp pcDNA ™ 3.1 (+) plasmid vector fragment containing the CMV cytomegalovirus promoter enhancer, polyadenylation site and bovine growth hormone gene transcription termination site BGH, β-lactamase gene (bla) the neomycin resistance gene (neo);
- NheI / XbaI — a 1433 bp fragment containing an artificial gene encoding a fusion protein in which the variable domain of the heavy chain of the murine monoclonal antibody 14D5, which protects against tick-borne encephalitis virus, is connected with constant C H 1-C H 2- With the H 3 domains of human IgG1 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG. 2;
- genetic markers: the β-lactamase gene (bla), which determines the resistance of bacterial cells transformed with plasmid pCHm2-14D5 to ampicillin, the neomycin resistance gene (neo) for selection of mammalian cells transfected with plasmid pCHm2-14D5;
- unique recognition sites of restriction endonucleases, having the following coordinates: BglII-14, NheI-897, XhoI-1001, Acc65I-1313, XbaI-2330.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013151031/10A RU2550252C1 (en) | 2013-11-15 | 2013-11-15 | RECOMBINANT PLASMID DNA pCLm4/hygro-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH LIGHT CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, AND RECOMBINANT PLASMID DNA pCHm2-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH HEAVY CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, CHIMERIC ANTIBODY PROVIDING ACUTE PREVENTION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS IN MICE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013151031/10A RU2550252C1 (en) | 2013-11-15 | 2013-11-15 | RECOMBINANT PLASMID DNA pCLm4/hygro-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH LIGHT CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, AND RECOMBINANT PLASMID DNA pCHm2-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH HEAVY CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, CHIMERIC ANTIBODY PROVIDING ACUTE PREVENTION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS IN MICE |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2550252C1 true RU2550252C1 (en) | 2015-05-10 |
| RU2013151031A RU2013151031A (en) | 2015-05-20 |
Family
ID=53283917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013151031/10A RU2550252C1 (en) | 2013-11-15 | 2013-11-15 | RECOMBINANT PLASMID DNA pCLm4/hygro-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH LIGHT CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, AND RECOMBINANT PLASMID DNA pCHm2-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH HEAVY CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, CHIMERIC ANTIBODY PROVIDING ACUTE PREVENTION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS IN MICE |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2550252C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2800471C1 (en) * | 2022-10-13 | 2023-07-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Pveal3-10h10ch plasmid genetic construct, strain of cho-k1-10h10ch recombinant cell line and 10h10ch chimeric antibody against tick-borne encephalitis virus produced by the indicated strain of cho-k1-10h10ch cell line |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2158309C2 (en) * | 1998-06-25 | 2000-10-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Recombinant plasmid dna ptls containing gene of single-stranded antibody against tick-borne encephalitis virus and strain of bacterium escherichia coli as producer of single-stranded antibodies against tick-borne encephalitis virus |
| RU2317330C2 (en) * | 2006-01-16 | 2008-02-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | RECOMBINANT PLASMID DNA pcL37 ENCODING POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF HUMAN LIGHT CHAIN OF ANTIBODY AGAINST SMALLPOX VIRUS VACCINE, RECOMBINANT PLASMID DNA pcH37 ENCODING POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF HEAVY CHAIN OF INDICATED ANTIBODY AND THEIR USING |
-
2013
- 2013-11-15 RU RU2013151031/10A patent/RU2550252C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2158309C2 (en) * | 1998-06-25 | 2000-10-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Recombinant plasmid dna ptls containing gene of single-stranded antibody against tick-borne encephalitis virus and strain of bacterium escherichia coli as producer of single-stranded antibodies against tick-borne encephalitis virus |
| RU2317330C2 (en) * | 2006-01-16 | 2008-02-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | RECOMBINANT PLASMID DNA pcL37 ENCODING POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF HUMAN LIGHT CHAIN OF ANTIBODY AGAINST SMALLPOX VIRUS VACCINE, RECOMBINANT PLASMID DNA pcH37 ENCODING POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF HEAVY CHAIN OF INDICATED ANTIBODY AND THEIR USING |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LEVANOV L.N. et al., "Chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus", Vaccine. 2010 Jul 19;28(32):5265-71. doi: 10.1016/j.vaccine.2010.05.060. Epub 2010 Jun 9. TSEKHANOVSKAYA N.A. et al., "Epitope analysis of tick-borne encephalitis (TBE) complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype)", Virus Res. 1993 Oct;30(1):1-16. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2800471C1 (en) * | 2022-10-13 | 2023-07-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Pveal3-10h10ch plasmid genetic construct, strain of cho-k1-10h10ch recombinant cell line and 10h10ch chimeric antibody against tick-borne encephalitis virus produced by the indicated strain of cho-k1-10h10ch cell line |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013151031A (en) | 2015-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114401997B (en) | Cytokine prodrugs and dual prodrugs | |
| JP7236562B2 (en) | Interleukin-4 receptor antibody and use thereof | |
| ES2718399T3 (en) | Molecules that attach to human bispecific EGFRVIII antibodies | |
| TW202206097A (en) | Coronavirus antigen compositions and their uses | |
| CN109081868B (en) | Monoclonal antibodies targeting conserved epitopes of Zika virus envelope protein and their applications | |
| JP2013520181A (en) | Fully human anti-TNF-α monoclonal antibody, its preparation method and use | |
| WO1998022616A1 (en) | ANTI-HUMAN VEGF RECEPTOR F1t-1 MONOCLONAL ANTIBODY | |
| JP2022106951A (en) | Chimeric protein composed of NGF antagonist domain and TNFα antagonist domain | |
| WO2020028479A1 (en) | Anti-cxcr2 antibodies and uses thereof | |
| CA2971491A1 (en) | Human endothelin receptor antibody and use thereof | |
| BR112020020637A2 (en) | anti-pd-l1 antibody, antigen-binding fragment or variant thereof, bispecific antibody, pharmaceutical composition and use to relieve or treat tumors | |
| CN110551214A (en) | Humanized anti-Periostin monoclonal antibody, and preparation method and application thereof | |
| WO2022143816A1 (en) | Full-human broad-spectrum cross-neutralizing antibody for sars-cov-2 and sars-cov and application thereof | |
| BR112021004686A2 (en) | improved anti-flt3 antigen binding proteins | |
| KR20220167331A (en) | Anti-FLT3 Antibodies and Compositions | |
| CN115160433B (en) | Humanized HBV B and C genotype pre-S1 protein antibody and application thereof | |
| CN114014929B (en) | Preparation method of anti-human interleukin-33 monoclonal antibody concentrated solution | |
| EP4660205A1 (en) | Multiple antibodies against human il-36r and/or human il-1r3, and uses thereof | |
| CN110563841A (en) | Humanized anti-Grb 2 monoclonal antibody, and preparation method and application thereof | |
| CN112961250A (en) | Antibody fusion protein and application thereof | |
| KR20120051733A (en) | Beta cell marker antibody | |
| RU2550252C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pCLm4/hygro-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH LIGHT CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, AND RECOMBINANT PLASMID DNA pCHm2-14D5 CODING POLYPEPTIDE WITH HEAVY CHAIN PROPERTIES OF CHIMERIC ANTIBODY TO TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS, CHIMERIC ANTIBODY PROVIDING ACUTE PREVENTION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS IN MICE | |
| WO2014052713A2 (en) | Her2-and vegf-a-binding proteins with enhanced stability | |
| CN114456274A (en) | anti-Her-2 antibody-chemokine fusion protein and preparation method and application thereof | |
| JP4263951B2 (en) | Methods for making and using caninized antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200826 Effective date: 20200826 |