RU2547426C1 - Method for cryopreservation of haemopoietic umbilical stem cells - Google Patents
Method for cryopreservation of haemopoietic umbilical stem cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2547426C1 RU2547426C1 RU2013155825/13A RU2013155825A RU2547426C1 RU 2547426 C1 RU2547426 C1 RU 2547426C1 RU 2013155825/13 A RU2013155825/13 A RU 2013155825/13A RU 2013155825 A RU2013155825 A RU 2013155825A RU 2547426 C1 RU2547426 C1 RU 2547426C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sample
- temperature
- stage
- stem cells
- rate
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 28
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 21
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims abstract description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 claims abstract description 5
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 28
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 22
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 claims description 7
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 abstract description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000035922 thirst Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKWHHTWSTXZKDW-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[2-[2-(2-butoxyethoxy)ethoxymethoxy]ethoxy]ethoxy]butane Chemical compound CCCCOCCOCCOCOCCOCCOCCCC DKWHHTWSTXZKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000005476 soldering Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к способам консервирования гемопоэтических стволовых клеток человека.The invention relates to medicine, namely to methods for preserving human hematopoietic stem cells.
Наиболее близким к предлагаемому является способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови [Патент РФ №2416197, МПК A01N 1/02, A61K 35/14, A61K 35/44, 2011], включающий введение ограждающего раствора криопротектора 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) в криопакете, механическое перемешивание, выпуск воздуха из криопакета и части взвеси, запайку и помещение его в термоусадочный пакет, программное многоэтапное замораживание, после чего образец помещается в карантинный дьюар с жидким азотом до определения результатов тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию, по истечении карантинного срока хранения образец переносится на длительное хранение при температуре, не превышающей -150°C, в дьюар с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в дьюар для инфекционного материала длительного хранения.Closest to the proposed is a method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells [RF Patent No. 2416197, IPC
Известной причиной, препятствующей достижению технического результата, обеспечиваемого предлагаемым изобретением, является защита образца от внешних воздействий не на всех этапах способа, длительность процесса подготовки ГСК к криоконсервации, сравнительно невысокая жизнеспособности ГСК после размораживания.A known reason preventing the achievement of the technical result provided by the invention is the protection of the sample from external influences not at all stages of the method, the duration of the preparation of HSCs for cryopreservation, and the relatively low viability of HSCs after thawing.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является снижение вероятности заражения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови инфекцией и бактериальной и/или грибковой контаминацией, сокращение продолжительности подготовки к длительному хранению криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и сохранение жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.The problem to which the present invention is directed is to reduce the likelihood of infection of hematopoietic cord blood stem cells with infection and bacterial and / or fungal contamination, reduce the duration of preparation for long-term storage of cryopreserved cord blood stem cells and preserve the viability of hematopoietic cord blood cells.
При осуществлении изобретения поставленная задача решается за счет достижения технического результата, который заключается в улучшении условий стерильности, уменьшении времени программного многоэтапного замораживания и повышении количества жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после периода хранения.In the implementation of the invention, the task is solved by achieving a technical result, which consists in improving the sterility conditions, reducing the time of multi-stage program freezing and increasing the number of viable hematopoietic cord blood stem cells after a storage period.
Указанный технический результат достигается способом криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, включающим в себя вскрытие флакона криопротектора в ламинарном боксе, заправку криопротектора в специальный шприц шприцевого насоса, введение с помощью шприцевого насоса ограждающего раствора криопротектора 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C со скоростью 0,8 мл/мин во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками в криопакет с одновременным механическим перемешиванием в аппарате для перемешивания при +4°C, прекращение механического перемешивания сразу после поступления требуемого количества криопротектора в криопакет с концентратом, перенос системы вместе с флаконом криопротектора в ламинарный бокс, выпуск воздуха из криопакета и части взвеси, запайку и помещение его в термоусадочный пакет, программное многоэтапное замораживание, на первом этапе которого смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания - выдерживают 10 мин при температуре +4°C, на втором этапе охлаждают со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, на третьем этапе охлаждают со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C, на четвертом этапе нагревают образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, на пятом этапе охлаждают образец со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C, после замораживания образец помещается в карантинный дьюар с жидким азотом, до определения результатов тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию, по истечению карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносится на длительное хранение при температуре, не превышающей -150°C в дьюар с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов на инфекции и бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в дьюар для инфекционного материала длительного хранения.The specified technical result is achieved by the method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells, which includes opening the cryoprotectant bottle in the laminar box, filling the cryoprotectant into a special syringe pump syringe, and introducing with the help of a syringe pump a cryoprotectant enclosing solution of 55%
Вскрытие флакона криопротектора и заправку криопротектора в специальный шприц шприцевого насоса осуществляют в ламинарном боксе для того, чтобы обеспечить стерильность процесса. Это позволяет снизить вероятность заражения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови инфекцией и бактериальной и/или грибковой контаминацией.Opening the cryoprotectant bottle and filling the cryoprotectant into a special syringe of the syringe pump is carried out in a laminar box in order to ensure the sterility of the process. This reduces the likelihood of infection of hematopoietic stem cells of cord blood with infection and bacterial and / or fungal contamination.
Введение с помощью шприцевого насоса ограждающего раствора криопротектора 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C со скоростью 0,8 мл/мин во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками с одновременным механическим перемешиванием позволяет равномерно распределить криопротектор по объему лейкоцитарной клеточной фракции. Благодаря этому, раствор криопротектора проникает практически во все клетки, содержащиеся в данной фракции, и увеличивается количество жизнеспособных ГСК после размораживания. Скорость введения криопротектора 0,8 мл/мин является оптимальной для данного способа и выбрана исходя из скорости диффузии раствора криопротектора через клеточную мембрану. Механическое перемешивание при +4°C в аппарате для перемешивания прекращают сразу после поступления требуемого количества криопротектора в криопакет с концентратом. Если перемешивание будет длиться дольше по времени, то есть вероятность образования гемолиза.The introduction of a cryoprotectant enclosing solution of 55% dimethyl sulfoxide with 5
После механического перемешивания систему вместе с флаконом криопротектора переносят в ламинарный бокс, выпускают воздух из криопакета и часть взвеси, запаивают и помещают его в термоусадочный пакет. Проведение этих операций в ламинарном боксе позволяет снизить вероятность заражения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови инфекцией и бактериальной и/или грибковой контаминацией.After mechanical stirring, the system, together with the cryoprotectant bottle, is transferred to the laminar box, air is released from the cryopackage and part of the suspension, sealed and placed in a heat-shrink bag. Carrying out these operations in a laminar box reduces the likelihood of infection of hematopoietic stem cells of cord blood with infection and bacterial and / or fungal contamination.
На третьем этапе программного многоэтапного замораживания образец охлаждают со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C. За счет увеличения скорости охлаждения достигается равномерное охлаждение образца во всем объеме до нужной температуры.In the third stage of the multi-stage program freezing, the sample is cooled at a rate of 20 ° C / min to a temperature of -60 ° C. By increasing the cooling rate, uniform cooling of the sample in the entire volume to the desired temperature is achieved.
На четвертом этапе программного многоэтапного замораживания нагревают образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C. Благодаря более медленному повышению температуры происходит плавный процесс оттаивания за счет выброса латентного тепла, что дает возможность обойти точку перекристаллизации и погасить термоудар.In the fourth stage of the program multi-stage freezing, the sample is heated at a rate of 10 ° C / min to a temperature of -18 ° C. Due to the slower increase in temperature, a smooth thawing process occurs due to the release of latent heat, which makes it possible to bypass the recrystallization point and quench the thermal shock.
Таким образом, более быстрое охлаждение на третьем этапе и более медленный нагрев на четвертом этапе, по сравнению с прототипом, позволяют избежать резкого скачка температуры, тем самым сохраняя жизнеспособность клеток в образце.Thus, faster cooling in the third stage and slower heating in the fourth stage, compared with the prototype, can avoid a sharp jump in temperature, thereby maintaining the viability of the cells in the sample.
Примеры осуществления предлагаемого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови приведены ниже.Examples of the proposed method for the cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells are given below.
В ламинарном боксе «Тепло Scientific» Hera Safe KS 12 (Heraeus, США) вскрывали флакон криопротектора CryoSur-DEX 40, содержащий раствор 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, и заправляли в специальный шприц 20 мл для шприцевого насоса Pilot (Fresenius Vial, Франция).In a laminar box “Heat Scientific” Hera Safe KS 12 (Heraeus, USA), a bottle of CryoSur-DEX 40 cryoprotectant containing a solution of 55% dimethyl sulfoxide with 5%
Криопакет с концентратом лейкоцитов помещали в аппарат предподготовки CoolMix AS-210 (Biosafe, Швейцария), с помощью системы полимерных магистралей присоединяли к шприцевому насосу. На шприцевом насосе Pilot выставляли скорость введения раствора криопротектора, равную 0,8 мл/мин. Когда 5 мл криопротектора поступили в криопакет с концентратом, насос Pilot давал сигнал, сразу прекращали перемешивание и переносили систему вместе с флаконом в ламинарный бокс.A cryopackage with leukocyte concentrate was placed in a CoolMix AS-210 pre-preparation apparatus (Biosafe, Switzerland), and connected to a syringe pump using a polymer line system. A cryoprotectant solution injection rate of 0.8 ml / min was set on the Pilot syringe pump. When 5 ml of the cryoprotectant was delivered to the cryopackage with concentrate, the Pilot pump gave a signal, the stirring was stopped immediately and the system and the bottle were transferred to the laminar box.
Выпускали воздух из криопакета, выдавливали небольшое количество крови из пакета, чтобы она заполнила трубку на расстоянии 5 см от пакета; отпаивали трубку на этом расстоянии и делали перепайки на расстоянии 1 см друг от друга. Перепаивали участки, ведущие к пробирке-спутнику.Air was released from the cryopackage, a small amount of blood was squeezed out of the packet so that it filled the tube at a distance of 5 cm from the packet; soldered the tube at this distance and made soldering at a distance of 1 cm from each other. Soldered areas leading to a test tube satellite.
Криопакет концентрата упаковывали в термоусадочный пакет, удаляли воздух из пакета и запаивали с помощью аппарата Shop Sealer FS-315 (Fuji Impulse Co. Ltd, EC) для запаивания термоусадочного пакета «CryoFlex», помещали на хладагент и передавали для программного замораживания.The cryopackage of the concentrate was packaged in a shrink bag, the air was removed from the bag and sealed using a Shop Sealer FS-315 apparatus (Fuji Impulse Co. Ltd, EC) to seal the CryoFlex shrink bag, placed on the refrigerant and transferred for program freezing.
Упакованный в термоусадочный пакет концентрат помещали в кассету для программного замораживания; устанавливали в камеру на штатив.The concentrate packed in a heat-shrink bag was placed in a cassette for program freezing; mounted in a camera on a tripod.
Контрольный датчик температуры Sample программного замораживателя Planer Kryo 560-16 (Planer pis, Великобритания) размещали в непосредственной близости к образцу. Контроль температуры в камере осуществляли дополнительным датчиком Chamber программного замораживателя Planer Cryo 560/16 (Planer pis, Великобритания). При составлении криопротокола заданный график выстраивали по уставке температуры камеры.The Sample temperature control probe of the Planer Kryo 560-16 software freezer (Planer pis, UK) was placed in close proximity to the sample. The temperature in the chamber was controlled by an additional Chamber sensor of the Planer Cryo 560/16 software freezer (Planer pis, Great Britain). When compiling a cryoprotocol, a given schedule was built according to the temperature setting of the chamber.
Также использовали дополнительный выносной датчик системы мониторинга Master Scada, для контроля температуры и своевременной калибровки камеры.We also used an additional remote sensor of the Master Scada monitoring system to monitor the temperature and timely calibration of the camera.
Замораживание концентрата осуществляли в программном замораживателе Planer Cryo 560/16 по следующим этапам: на первом этапе смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания выдерживали 10 мин при температуре +4°C, на втором этапе охлаждали со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, на третьем этапе охлаждали со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C, на четвертом этапе нагревали образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, на пятом этапе охлаждали образец со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждали со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C.Данные по процедуре замораживания регистрировали в протоколе программного замораживания концентрата стволовых клеток, который представлен на фиг.1. Протокол программного замораживания концентрата стволовых клеток по прототипу представлен на фиг.2.Concentrate was frozen in the Planer Cryo 560/16 program freezer according to the following steps: at the first stage, the suspension mixture with stem cells and cryoprotectant — the freezing sample was held for 10 min at + 4 ° C, and at the second stage it was cooled at a rate of 1 ° C / min to temperature -12 ° C, in the third stage it was cooled at a speed of 20 ° C / min to a temperature of -60 ° C, in the fourth stage the sample was heated at a speed of 10 ° C / min to a temperature of -18 ° C, in the fifth stage the sample was cooled at a
Протокол криоконсервации ГСК по предлагаемому способу по длительности выполнения составляет 86 мин (+1…3 мин), а в прототипе 114 мин (+1…2 мин). Следовательно, сокращается продолжительности подготовки к длительному хранению криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови по предлагаемому способу.The HSC cryopreservation protocol according to the proposed method for the execution time is 86 minutes (+ 1 ... 3 minutes), and in the prototype 114 minutes (+ 1 ... 2 minutes). Therefore, the duration of preparation for long-term storage of cryopreserved hematopoietic cord blood stem cells is reduced by the proposed method.
Результаты всех исследований, характеризующие образец пуповинной крови и полученный концентрат стволовых клеток пуповинной крови, вносили в базу данных ООО НПО «Тюменькриобанк» под единым идентификационным номером образца.The results of all studies characterizing the cord blood sample and the obtained cord blood stem cell concentrate were entered into the database of Tyumenkriobank NGO under a single identification number of the sample.
Концентрат стволовых клеток пуповинной крови хранили в карантинном дьюаре до тех пор, пока не известны результаты тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию (согласно приказу Минздрава РФ №325 от 25 июля 2003 г.). По истечении карантинного срока хранения концентрат лейкоцитов пуповинной крови переносили на длительное хранение при температуре, не превышающей -150°C, в дьюар с жидким азотом при отрицательных результатах тестирования (Анти-fflV-l и -2, HIV-lAg, Анти-HTLV-I и -II, Анти-HbcorAg, HBs-Ag, Анти-HCV). Данные по изъятию образца заносили в протокол изъятия образца концентрата стволовых клеток, информацию по изменению локализации образца регистрировали в протоколе переноса концентрата стволовых клеток, а также в базе данных ООО НПО «Тюменькриобанк» и в «Журнале учета и регистрации замороженных образцов стволовых клеток пуповинной крови».Cord blood stem cell concentrate was stored in quarantine dewar until the results of tests for infectious agents and bacteriological fungal contamination were known (according to the order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 325 of July 25, 2003). After the expiration of the quarantine shelf life, the cord blood leukocyte concentrate was transferred to long-term storage at a temperature not exceeding -150 ° C in a dewar with liquid nitrogen with negative test results (Anti-fflV-l and -2, HIV-lAg, Anti-HTLV- I and -II, Anti-HbcorAg, HBs-Ag, Anti-HCV). The data on the withdrawal of the sample was recorded in the protocol for the withdrawal of the sample of stem cell concentrate, information on the change in the localization of the sample was recorded in the protocol for the transfer of stem cell concentrate, as well as in the database of Tyumenkriobank LLC and in the Journal of Registration and Registration of Frozen Cord Blood Stem Cells .
Размораживание криоконсервированного образца и отмывку концентрата стволовых клеток пуповинной крови от криопротектора проводили по общепринятой методике следующим образом.Thawing of the cryopreserved sample and washing of the cord blood stem cell concentrate from the cryoprotectant were carried out according to the generally accepted method as follows.
Сперва подготавливали помещение, в котором производили процедуру размораживания и отмывки образца пуповинной крови: включали УФ-лампы на 15 мин.First, a room was prepared in which the procedure of thawing and washing of a cord blood sample was performed: UV lamps were turned on for 15 minutes.
Включали водяную баню в сеть, устанавливали 37°C. Подогревали физиологический раствор в термостате при 37°C в течение 15 мин. В ламинарном боксе приготавливали отмывочный буфер: физиологический раствор, содержащий 2,5% альбумина человеческого рекомбинантного. Отобирали из пакета для конечного продукта весь антикоагулянт.Turned on the water bath in the network, set 37 ° C. Saline was heated in a thermostat at 37 ° C for 15 minutes. Wash buffer was prepared in a laminar box: physiological saline containing 2.5% human recombinant albumin. All anticoagulant was taken from the bag for the final product.
Изымали образец из криохранилища, регистрировали надлежащим образом. Размораживание криоконсервированного образца проводили на программном замораживателе Planer Kryo 560-16 следующим образом: выдерживали 5 мин при температуре -160°C, нагревали образец со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C, выдерживали образец 5 мин при температуре -100°C, нагревали образец со скоростью 1°C/мин до температуры -60°C, нагревали образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, нагревали образец со скоростью 3°C/мин до температуры -4°C, выдерживали образец 5 мин при температуре -4°C, нагревали образец со скоростью 1°C/мин до температуры 0°C, выдерживали образец 5 мин при температуре 0°C. Последующее оттаивание проводили на водяной бане - термостат медицинский TW-2.02.A sample was taken from the cryostorage, recorded appropriately. The cryopreserved sample was thawed on a Planer Kryo 560-16 program freezer as follows: it was held for 5 min at a temperature of -160 ° C, the sample was heated at a rate of 3 ° C / min to a temperature of -100 ° C, and the sample was kept for 5 min at a temperature of -100 ° C, heated the sample at a speed of 1 ° C / min to a temperature of -60 ° C, heated the sample at a speed of 10 ° C / min to a temperature of -18 ° C, heated the sample at a speed of 3 ° C / min to a temperature of -4 ° C, kept the sample for 5 min at a temperature of -4 ° C, heated the sample at a rate of 1 ° C / min to a temperature of 0 ° C,
После того как кровь становилась жидкой, в воздушном потоке ламинарного бокса салфеткой, смоченной 70%-ным раствором этилового спирта, тщательно обрабатывали пакет с кровью, после чего через оба порта пакета отбирали шприцами (объемом 10 мл) весь концентрат клеток. Распределяли концентрат поровну в две конические центрифужные пробирки (объемом 50 мл) и заливали равным объемом отмывочного буфера. Проводили центрифугирование 400 g 10 мин при комнатной температуре.After the blood became liquid, in the air flow of the laminar box with a napkin moistened with a 70% solution of ethyl alcohol, the blood bag was thoroughly treated, after which the whole cell concentrate was taken through both ports of the bag with syringes (10 ml). The concentrate was distributed equally in two conical centrifuge tubes (50 ml) and poured with an equal volume of washing buffer. Centrifuged at 400 g for 10 min at room temperature.
В ламинарном боксе удаляли супернатант и резуспендировали осадок с клетками в промывочном буфере. Помещали конечный продукт в пустой пакет, в который через стерильный порт добавляли шприцом необходимое количество гепарина для предотвращения свертывания крови.In the laminar box, the supernatant was removed and the pellet resuspended with the cells in the wash buffer. The final product was placed in an empty bag into which the required amount of heparin was added via a sterile port with a syringe to prevent blood coagulation.
Из пакета с конечным продуктом отбирали 0,5 мл концентрата для анализа на жизнеспособность и количество клеток методом проточной цитофлюориметрии.0.5 ml of the concentrate was taken from the package with the final product for analysis of cell viability and cell count by flow cytometry.
Жизнеспособность клеток определяли с помощью витального красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Coulter, США), анализируя на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Идентификацию клеток выполняли путем регистрации двух параметров: объема и светорассеяния в боковом направлении (SS) и интенсивность флуоресценции (7-AAD).Cell viability was determined using the vital dye 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Coulter, USA), analyzed on a Cytomics FC500 flow cytometer (Beckman Coulter, USA). Cell identification was performed by recording two parameters: lateral volume and light scattering (SS) and fluorescence intensity (7-AAD).
На фиг.3 представлена гистограмма количества жизнеспособных клеток в размороженном образце в результате предлагаемого способа.Figure 3 presents a histogram of the number of viable cells in a thawed sample as a result of the proposed method.
На фиг.4 представлена гистограмма количества жизнеспособных клеток в размороженном образце в результате способа-прототипа.Figure 4 presents a histogram of the number of viable cells in a thawed sample as a result of the prototype method.
На гистограммах слева от вертикальной линии (у значения 10°) зарегистрированы живые клетки крови, а справа - мертвые. Полученные данные показали, что в результате применения предлагаемого способа количество жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после периода хранения в рассмотренном образце составило 87,24%, а по способу-прототипу 79,01%.On the histograms to the left of the vertical line (at a value of 10 °), living blood cells are registered, and on the right - dead. The data obtained showed that as a result of the application of the proposed method, the number of viable hematopoietic cord blood stem cells after the storage period in the sample was 87.24%, and by the prototype method 79.01%.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет снизить вероятность заражения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови инфекцией и бактериальной и/или грибковой контаминацией, сократить продолжительность подготовки к длительному хранению криоконсервированных ГСК пуповинной крови и повысить количество жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после периода хранения.Thus, the proposed method allows to reduce the likelihood of infection of hematopoietic cord blood stem cells with infection and bacterial and / or fungal contamination, shorten the preparation time for long-term storage of cryopreserved HSC cord blood and increase the number of viable hematopoietic cord blood stem cells after the storage period.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013155825/13A RU2547426C1 (en) | 2013-12-16 | 2013-12-16 | Method for cryopreservation of haemopoietic umbilical stem cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013155825/13A RU2547426C1 (en) | 2013-12-16 | 2013-12-16 | Method for cryopreservation of haemopoietic umbilical stem cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2547426C1 true RU2547426C1 (en) | 2015-04-10 |
Family
ID=53296341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013155825/13A RU2547426C1 (en) | 2013-12-16 | 2013-12-16 | Method for cryopreservation of haemopoietic umbilical stem cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2547426C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2821586C1 (en) * | 2023-08-25 | 2024-06-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for preserving viability of hematopoietic stem cells of umbilical blood after washing from cryoprotectant |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2416197C1 (en) * | 2009-12-11 | 2011-04-20 | Александр Борисович Смолянинов | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood |
| US20130059286A1 (en) * | 2011-09-01 | 2013-03-07 | Healthbanks Biotech Co., Ltd. | Cryopreservation of umbilical cord tissue for cord tissue-derived stem cells |
| RU2012111734A (en) * | 2012-03-22 | 2013-09-27 | Борис Лаврович Макеев | METHOD FOR CRYOPreservation of HEMOPOETIC STEM BLOOD CELLS |
-
2013
- 2013-12-16 RU RU2013155825/13A patent/RU2547426C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2416197C1 (en) * | 2009-12-11 | 2011-04-20 | Александр Борисович Смолянинов | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood |
| US20130059286A1 (en) * | 2011-09-01 | 2013-03-07 | Healthbanks Biotech Co., Ltd. | Cryopreservation of umbilical cord tissue for cord tissue-derived stem cells |
| RU2012111734A (en) * | 2012-03-22 | 2013-09-27 | Борис Лаврович Макеев | METHOD FOR CRYOPreservation of HEMOPOETIC STEM BLOOD CELLS |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2821586C1 (en) * | 2023-08-25 | 2024-06-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for preserving viability of hematopoietic stem cells of umbilical blood after washing from cryoprotectant |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10271543B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| Pidcoke et al. | Primary hemostatic capacity of whole blood: a comprehensive analysis of pathogen reduction and refrigeration effects over time | |
| AU2009228056B2 (en) | Materials and methods for hypothermic collection of whole blood | |
| US8936905B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| ES2910948T3 (en) | Anaerobic blood storage and pathogen inactivation procedure | |
| Jahan et al. | Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells | |
| EP2038402B1 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| RU2416197C1 (en) | Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells of umbilical blood | |
| JP6531256B2 (en) | Method for cryopreservation of cord blood and peripheral blood and solution for cryopreservation | |
| Lagerberg | Cryopreservation of red blood cells | |
| US8157774B1 (en) | Apparatus for stem cell collection and methods thereof | |
| CA3015457A1 (en) | Methods to reduce clot formation in cold-stored platelet products | |
| Zolla et al. | An efficient apparatus for rapid deoxygenation of erythrocyte concentrates for alternative banking strategies | |
| Sputtek | Cryopreservation of red blood cells and platelets | |
| Kilbride et al. | Recovery and post-thaw assessment of human umbilical cord blood cryopreserved as quality control segments and bulk samples | |
| RU2624214C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells | |
| Lagerberg | Frozen blood reserves | |
| RU2547426C1 (en) | Method for cryopreservation of haemopoietic umbilical stem cells | |
| Melaragno et al. | Cryopreservation of platelets isolated with the IBM 2997 blood cell separator: a rapid and simplified approach | |
| Rathbun et al. | Posttransfusion survival of red cells frozen for 8 weeks after 42‐day liquid storage in AS‐3 | |
| Thirumala et al. | A cryopreservation system for direct clinical use of MSC | |
| Abbruzzese et al. | A new freezing and storage procedure improves safety and viability of haematopoietic stem cells and neutrophil engraftment: a single institution experience | |
| Tynngård et al. | In vitro quality of platelets during prolonged storage after washing with three platelet additive solutions | |
| de Vries et al. | Bulk droplet vitrification for primary hepatocyte preservation | |
| CN111374123B (en) | The use method and application of neutral amino acid as cell cryoprotectant |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20161018 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191217 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20201222 |