RU2546284C2

RU2546284C2 - Противоопухолевые эффекты комбинаций каннабиноидных соединений

Info

Publication number: RU2546284C2
Application number: RU2010153576/15A
Authority: RU
Inventors: ДИЕС Гильермо ВЕЛАСКО; ПАСТОР Мануэль ГУСМАН; Мар Лоренте; София Торрес; Фатима РОДРИГЕС
Original assignee: ДжиДаблЮ ФАРМА ЛИМИТЕД; Оцука Фармасьютикал Ко Лимитед
Priority date: 2008-06-04
Filing date: 2009-06-04
Publication date: 2015-04-10
Also published as: US20150313867A1; SG195650A1; EP3785710B1; AU2009254936B2; WO2009147439A1; SG191644A1; RU2010153576A; TW201002315A; GB2471987A; IL209738A0; CA2726258A1; NZ589228A; US20200138771A1; CO6382172A2; EP3785710A1; CN102083430B; AR072003A1; CN102083430A; US8632825B2; IL209738B

Abstract

Изобретение относится к медицине и описывает комбинацию каннабиноидов тетрагидроканнабинола (ТГК) и каннабидиола (КБД) в соотношении 1:5 для изготовления лекарственного средства для применения в лечении глиомы, где содержание каннабиноида находится в пределах от 5 до 100 мг от общего содержания каннабиноидов, где лечение глиомы заключается в снижении выживаемости клеток, подавлении клеточного роста или уменьшении объема опухоли. Изобретение обеспечивает повышение эффективности каннабиноидов в комбинации ТГК и КБД при лечении глиомы. 4 з.п. ф-лы, 5 пр., 2 табл., 6 ил.

Description

Настоящее изобретение относится к использованию комбинации каннабиноидов в производстве лекарственного препарата для применения в лечении рака. В частности, подлежащий лечению рак является опухолью головного мозга, более конкретно глиомой, еще более конкретно мультиморфной глиобластомой (ПГБ) и предпочтительная комбинация каннабиноидов содержит тетрагидроканнабинол (ТГК) и каннабидиол (КБД).

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Рак представляет собой заболевание, при котором группа клеток проявляет признаки неконтролируемого роста. Это означает, что клетки растут и делятся свыше уровней нормальных пределов. Клетки также способны проникать и разрушать окружающие ткани. Кроме того, раковые клетки также иногда метастазируют, т.е. распространяются в другие участки организма через кровь или лимфу.

Большинство злокачественных новообразований (рака) вызвано нарушениями в генетическом аппарате клеток. Эти нарушения могут являться следствием действия канцерогенов. Другие генетические нарушения, способствующие злокачественным новообразованиям, могут появляться вследствие ошибок при репликации ДНК или являются врожденными и таким образом присутствуют во всех клетках с рождения.

Генетические нарушения, обнаруженные при злокачественных новообразованиях, обычно затрагивают два основных класса генов. В злокачественных клетках часто активированы способствующие злокачественным новообразованиям онкогены, наделяющие эти клетки новыми способностями, такими как гиперактивный рост и деление, защита от программируемой гибели клеток, потеря связи с границами своей ткани и способность к развитию в различных тканевых окружениях.

Гены опухолевых супрессоров часто инактивированы в злокачественных клетках, что приводит к нарушению нормальных клеточных функций, таких как правильная репликация ДНК, контроль за клеточным циклом, ориентация и адгезия внутри тканей, и взаимодействие с защитными клетками иммунной системы.

Существуют различные типы злокачественных новообразований и обычно злокачественные новообразования классифицируют согласно типу ткани, из которой они развиваются.

Рак обычно лечат посредством одного или нескольких следующих способов: хирургическое лечение, химиотерапия, лучевая терапия, иммунотерапия и терапия моноклональными антителами. Способ лечения зависит от локализации и состояния опухоли и стадии заболевания.

Целью лечения является полное удаление злокачественного образования без повреждения остального организма. Иногда этого можно достичь посредством хирургического лечения, однако склонность злокачественных новообразований проникать в прилегающую или распространяться в отдаленные участки посредством микроскопических метастазов часто ограничивает его эффективность. Эффективность химиотерапии часто ограничивается токсичностью в отношении других тканей организма. Радиация также может повреждать нормальную ткань.

Известно, что злокачественные новообразования повреждают различные участки тела, и основные типы злокачественных новообразований включают: рак желчного протока, рак мочевого пузыря, рак кости, рак кишечника (включая рак толстой кишки и рак прямой кишки), рак головного мозга, рак молочной железы, рак нейроэндокринной системы (обычно известное как карциноид), рак шейки матки, рак глаза, рак пищевода, рак головы и шеи (эта группа включает карциномы, появляющиеся из клеток, образующих выстилку рта, носа, глотки, уха или поверхностного слоя языка), саркому Капоши, рак почки, рак гортани, лейкемию, рак печени, рак легких, рак в лимфоузлах, лимфому Ходжкина, неходжкинские лимфомы, меланому, мезотелиому, миелому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак полового члена, рак предстательной железы, рак кожи, саркомы мягких тканей, рак спинного мозга, рак желудка, рак яичек, рак щитовидной железы, рак влагалища, рак вульвы и рак матки.

Опухоли, которые развиваются головном мозге, способны разрушать или повреждать клетки головного мозга посредством стимуляции воспаления, сдавливания других участков головного мозга, индуцирования церебрального отека (набухания головного мозга) и могут вызывать повышение внутричерепного давления (давления внутри черепа).

В Великобритании опухоль головного мозга ежегодно диагностируют приблизительно у 4300 человек. Первичная опухоль головного мозга представляет собой образование, появившееся в результате роста или неконтролируемого деления клеток головного мозга. Первичные злокачественные опухоли головного мозга, по всей вероятности, вызывают проблемы за счет распространения в окружающую нормальную ткань головного мозга, и сдавливания и повреждения прилегающих областей головного мозга. Эти опухоли редко распространяются за пределы головного мозга в другие части тела. Однако вторичные опухоли головного мозга возникают в случаях, когда злокачественные клетки их других частей тела, таких как легкие или молочная железа, проникают в головной мозг.

Хирургическое лечение является способом выбора для многих опухолей мозга. Некоторые можно полностью вырезать, однако для тех опухолей, которые располагаются глубоко или инфильтрируют ткань головного мозга, более вероятно уменьшение их массы, чем удаление.

В зависимости от типа рассматриваемой опухоли можно рекомендовать лучевую терапию и химиотерапию.

Глиальные опухоли часто бывают летальными. Характерный распространенный инфильтративный опухолевый рост глиом часто делает невозможным хирургическое удаление, и это в значительной степени усложняет клиническое ведение таких пациентов.

Мультиморфная глиобластома (ПГБ) является наиболее распространенным и наиболее агрессивным типом первичной опухоли головного мозга и составляет 52% от всех случаев первичных опухолей головного мозга и 20% от всех внутричерепных опухолей.

Для снижения смертности пациентов с диагностированной глиомой предпринимаются различные подходы. Они включают способы терапии, направленные на клетки глиомы, но сохраняющие нормальные клетки неповрежденными, способы, ограничивающие распространение злокачественных клеток и лечение, блокирующее молекулы, поддерживающие жизнеспособность опухолей.

Одно из направлений исследования включает применение каннабиноидов в качестве противоопухолевых средств.

Каннабиноиды представляют собой активные компоненты растения конопли и было обнаружено, что они демонстрируют многочисленные фармакологические эффекты.

Например, EP1177790 (Guzman et al.) описывает лечение церебральных опухолей посредством введения естественных или синтетических каннабиноидов, в частности ТГК. Заявлено, что активация специфических рецепторов приводит к избирательной гибели трансформированных клеток.

Недавно было показано, что каннабиноид КБД обладает противоопухолевыми эффектами (Massi et al. 2004). В данной работе описано подавление пролиферации как in vitro, на клеточных линиях глиомы человека U87 и U373, так и in vivo, на подкожно имплантированных голым мышам клетках глиомы человека U87.

Злокачественные глиомы являются интенсивно делящимися и инфильтративными опухолями, которые развиваются согласно характерным особенностям роста. Клетки глиомы проникают в прилегающие нормальные структуры головного мозга и окружающие крупные кровеносные сосуды.

Кроме того, патент EP1802274 описывает использование каннабиноида КБД для торможения развития злокачественные клеток, мигрирующих из своего первичного опухолевого очага во вторичный участок.

Кроме того, в Medical hypothesis (2006), том 66, стр. 234-246 обсуждаются физиологические и клинические эффекты ТГК и КБД и представлено логическое обоснование для их соединения. Признано, что ТГК проявляет цитотоксические воздействия в отношении "неопластического заболевания" (страница 242) и что КБД также обладает доказанным цитостатическим/ цитотоксическим эффектом. Принимая во внимание обезболивающий эффект соединения КБД:ТГК при лечении злокачественных опухолей, дополнительное полезное воздействие ТГК и КБД на вызванную химиотерапией тошноту и описанные первичные эффекты на рост и распространение опухоли, дополнительные клинические испытания считаются крайне целесообразными. Однако применимость данной идеи не может предсказать полезные свойства, которые можно получить от соединения компонентов, которые в противном случае по отдельности должны считаться недостаточными (или неэффективными количествами).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

По настоящему изобретению обеспечивается использование соединения каннабиноидов в производстве лекарственного препарата для применения в лечении рака.

Предпочтительно каннабиноиды содержат, по меньшей мере, тетрагидроканнабинол (ТГК) и каннабидиол (КБД).

Предпочтительно ТГК и КБД находятся в соотношении от 20:1 до 1:20 (ТГК:КБД).

Более предпочтительно ТГК и КБД находятся в соотношении от 5:1 до 1:5 (ТГК:КБД).

Еще более предпочтительно ТГК и КБД находятся в соотношении от 2:1 до 1:2, еще более предпочтительно приблизительно 1:1.

Каждый каннабиноид содержится в терапевтически эффективном количестве. Диапазоны доз ТГК и КБД относительно содержания каннабиноидов можно установить исходя из содержания каннабиноида, которое предпочтительно находится в диапазоне от 5 до 100 мг.

Подлежащий лечению рак может представлять собой опухоль головного мозга.

Опухоли головного мозга обычно классифицируют согласно локализации опухоли и типу клеток, из которых развивается рак.

Например, различные типы опухолей головного мозга включают: неврому слухового нерва, астроцитому, лимфому ЦНС, эпендимому, гемангиобластому, медуллобластому, менингиому, глиому, смешанную глиома, олигодендроглиому, эпифизарные опухоли и опухоли гипофиза.

Глиомы являются опухолями из глиальных клеток; эти клетки поддерживают и защищают нервные клетки мозга. Глиомы составляют приблизительно половину от всех первичных опухолей головного мозга и пятую часть всех первичных опухолей спинного мозга.

Комбинация каннабиноидов по изобретению особенно полезна в случае, когда опухоль головного мозга является глиомой, более конкретно мультиморфной глиобластомой (ПГБ).

Один или несколько каннабиноидов могут быть представлены в виде растительных экстрактов, в виде чистых соединений или их комбинации.

Растительный экстракт определяют в качестве экстракта из растительного материала, как описано в «Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance, August 2000, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration Centre for Drug Evaluation and Research».

В качестве растительного материала определяют растения или части растения (например, кора, древесина, листья, почки, корни, цветки, плоды, семена, ягоды или их фрагменты), а также вытяжки растения.

Более предпочтительно растительный экстракт находится в форме растительного лекарственного вещества.

Растительные лекарственные вещества, которые получают из растений конопли, включают первичные экстракты, получаемые посредством таких процессов, как например: вымачивание, процеживание, экстракция растворителями, такими как C1-C5 спирты (например, этанол), Norflurane (HFA134a), HFA227, жидкий диоксид углерода под давлением, и экстракция с использованием горячего газа. В дальнейшем можно получить первичный экстракт посредством сверхкритической или субкритической экстракции, выпаривания и хроматографии. Если используют перечисленные выше растворители, то конечный экстракт может содержать неспецифические жирорастворимые компоненты. Их можно удалить посредством различных процессов, включающих фракционирование охлаждением, которое предусматривает охлаждение до -20°C с последующей фильтрацией для удаления воскового балласта, экстракцию с жидким диоксидом углерода и посредством дистилляции.

Растительные лекарственные вещества определены в «Botanical Drug Products which are defined in the Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance, August 2000, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration Centre for Drug Evaluation and Research» как: "растительный продукт, предназначенный для применения в качестве лекарственного средства; лекарственный продукт, приготовленный из растительного лекарственного вещества".

Один или несколько каннабиноидов можно применять раздельно, последовательно или одновременно друг с другом.

Некоторые аспекты данного изобретения дополнительно описаны только в качестве примера со ссылкой на сопровождающие чертежи, на которых:

Фиг. 1 представляет собой гистограмму, показывающую выживаемость клеток астроцитомы человека U87MG после лечения ТГК, КБД или соединения ТГК и КБД в сравнении с контролем;

Фиг. 2a и 2b представляют собой гистограммы, показывающие данные выживаемости in vivo клеток двух клеточных линий - U87MG (Фиг. 2a) и T98G (фиг. 2b) при различных концентрациях; и

Фиг. 3a, 3b и 3c представляют сведения о предположительном механизме действия соединения на клетки U87MG.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ

Следующие примеры описывают эксперименты, проведенные с целью выявления эффекта соединений каннабиноидов в качестве противоопухолевых средств.

Пример 1: Эффект ТГК и КБД при подавлении роста злокачественных клеток in vitro

Тетрагидроканнабинол (ТГК) и каннабидиол (КБД) в форме растительных экстрактов конопли растворяли в этаноле до концентрации 100 мМ и хранили до востребования при -20°C.

Перед использованием растительные экстракты конопли дополнительно разводили до требуемой концентрации с тем, чтобы концентрация этанола была менее 0,001%.

На всем протяжении данного эксперимента использовали клетки глиомы человека U87. Клетки культивировали при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂ и 95% воздуха.

Клетки культивировали в 75 см² культуральном флаконе в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), которую дополняли 4 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 1% пирувата натрия, 1% незаменимых аминокислот и 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки.

Выживаемость клеток астроцитомы человека U87MG изучали при различных концентрациях каннабиноидов. Сравнивали экстракты ТГК и КБД с чистыми ТГК и КБД.

Результаты:

Таблица 1 Выживаемость клеток астроцитомы человека U87MG в культуре
	ИК50 мкМ (чистые каннабиноиды)	ИК50 мкМ (растительный экстракт конопли)	ИК50 мкМ (чистый эквивалент в растительном экстракте конопли)
ТГК	0,37	0,64	0,43
КБД	0,47	0,72	0,47

Как можно видеть из таблицы 1 выше, экстракты ТГК и КБД обладают большей активностью по сравнению с соответствующими чистыми компонентами при условии, что количество каннабиноида в экстракте соответствует эквивалентному количеству чистого компонента.

Это показывает, что ТГК и КБД и их экстракты эффективны в отношении подавления роста клеток глиом.

Пример 2: Эффект соединения экстрактов ТГК и КБД при подавлении роста злокачественных клеток in vitro

Этот эксперимент проводился с целью проверки того, являлись ли соединения экстрактов ТГК и КБД настолько же эффективными в отношении подавлении клеточного роста как экстракты по отдельности.

Использовали способы, описанные в примере 1 выше.

Результаты:

Фиг. 1 содержит гистограмму, показывающую сравнительную выживаемость клеток астроцитомы человека U87MG в ответ на экстракты ТГК и КБД по отдельности и в сочетании друг с другом.

Как можно видеть, если используют соединение ТГК и КБД, то выживаемость клеток значительно снижена по сравнению с выживаемостью клеток после обработки отдельными ТГК или КБД.

Эти данные позволяют предположить, что каннабиноиды ТГК и КБД будут более эффективными при лечении опухолей, если используются в соединении.

Пример 3: Эффект комбинации ТГК и КБД при подавлении роста злокачественных клеток in vivo

Этот эксперимент проводился с целью проверки того, были ли эффективны соединения экстрактов ТГК и КБД также и in vivo.

Клетки астроцитомы человека U87MG ксенотрансплантировали голым мышам и вокруг опухоли с помощью инъекций вводили тестируемые соединения с концентрацией 15 мг/кг в сутки.

Результаты:

Таблица 2 Объем опухоли через 15 суток лечения относительно начального момента времени
	Объем опухоли
Наполнитель	9,2±0,6
Чистый ТГК	5,1±0,4
Экстракт ТГК	6,6±0,3
Экстракт ТГК:КБД (1:1)	4,8±0,3

Как можно видеть в таблице 2 выше, объем опухоли после лечения соединением 1:1 экстрактов ТГК и КБД значительно благоприятнее, чем в случае лечения отдельными чистыми экстрактами ТГК или ТГК.

Пример 4: Эффект концентрации каннабиноида на выживаемость клеток двух различных клеточных линий

Изучали действие различных концентраций ТГК, КБД и смеси ТГК и КБД в соотношении 1:1 на две клеточные линии: U87MG и T98G. Результаты выживаемости клеток показаны на рис. 2a и 2b.

Из фиг. 2a будет видно, что неэффективные/недостаточные для ТГК и КБД дозы 0,1 мкг/мл и 0,25 мкг/мл (выживаемость клеток более 90%) позволяли приводить к статистически достоверному снижению выживаемости клеток в случае их соединения (SAT), результаты которого демонстрировали дозозависимый эффект при повышении концентрации (большая цитотоксичность при 0,25 мкг/мл).

Похожие результаты получали на клеточной линии T98G (альтернативная клеточная линия глиомы человека), как показано на фиг. 2b.

Пример 5: Изучение механизма действия

Известно, что ТГК вызывает гибель клеток с помощью сигнального каскада, включающего ген ATG1 и общую каспазу. Результаты изучения с учетом S6 фосфорилирования, LC3 липидизации и эффекта ATG1 и ингибитора общей каспазы показаны на фиг. 3a, 3b и 3c соответственно.

Как можно видеть из фиг.3a, соединение ТГК:КБД (в сравнение с контролем C):

• подавляет активность mTORC1 (установлено по уровням S6 фосфорилирования);

• стимулирует накопление липидной формы LC3 (признак аутофагии).

Фиг. 3b показывает, что выключение существенного гена аутофагии ATGl посредством избирательного ингибитора (siATG10) siRNA снижает уровень индуцированной клеточной гибели по сравнению с клетками, трансфицированными контрольной siC.

Наконец, фиг. 3c демонстрирует, что клетки, обработанные ингибитором общей каспазы Z-VAD, также избегают индуцированной клеточной гибели.

Claims

1. Комбинация каннабиноидов тетрагидроканнабинола (ТГК) и каннабидиола (КБД) в соотношении 1:5 для изготовления лекарственного средства для применения в лечении глиомы, где содержание каннабиноида находится в пределах от 5 до 100 мг от общего содержания каннабиноидов, где лечение глиомы заключается в снижении выживаемости клеток, подавлении клеточного роста или уменьшении объема опухоли.

2. Комбинация каннабиноидов тетрагидроканнабинола (ТГК) и каннабидиола (КБД) по п. 1, где глиома представляет собой полиморфную глиобластому (ПГБ).

3. Комбинация каннабиноидов тетрагидроканнабинола (ТГК) и каннабидиола (КБД) по п. 1, где ТГК и КБД присутствуют в качестве растительных экстрактов, в качестве чистых соединений или их комбинации.

4. Комбинация каннабиноидов тетрагидроканнабинола (ТГК) и каннабидиола (КБД) по п. 3, где растительный экстракт находится в форме растительного лекарственного вещества.

5. Комбинация каннабиноидов тетрагидроканнабинола (ТГК) и каннабидиола (КБД) по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько каннабиноидов вводят раздельно, последовательно или одновременно друг с другом.