RU2545993C2 - Method for repairing long bone defects of critical size - Google Patents
Method for repairing long bone defects of critical size Download PDFInfo
- Publication number
- RU2545993C2 RU2545993C2 RU2013140871/15A RU2013140871A RU2545993C2 RU 2545993 C2 RU2545993 C2 RU 2545993C2 RU 2013140871/15 A RU2013140871/15 A RU 2013140871/15A RU 2013140871 A RU2013140871 A RU 2013140871A RU 2545993 C2 RU2545993 C2 RU 2545993C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- bone
- medium
- matrix
- bone tissue
- Prior art date
Links
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 113
- 230000007547 defect Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 51
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 38
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 24
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 claims abstract description 10
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 5
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 claims abstract description 4
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 3
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical group O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 claims abstract 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 5
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 5
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 5
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 abstract 1
- 244000309466 calf Species 0.000 abstract 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 23
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 17
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 12
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 9
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 7
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 7
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 7
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 5
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 5
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 4
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 4
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 4
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001872 metatarsal bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 3
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 description 2
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000899361 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 7 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- IUJDSEJGGMCXSG-UHFFFAOYSA-N Thiopental Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=S)NC1=O IUJDSEJGGMCXSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIPLYOUQVMMOHB-MXWBXKMOSA-L [Ca++].CN(C)[C@H]1[C@@H]2[C@@H](O)[C@H]3C(=C([O-])[C@]2(O)C(=O)C(C(N)=O)=C1O)C(=O)c1c(O)cccc1[C@@]3(C)O.CN(C)[C@H]1[C@@H]2[C@@H](O)[C@H]3C(=C([O-])[C@]2(O)C(=O)C(C(N)=O)=C1O)C(=O)c1c(O)cccc1[C@@]3(C)O Chemical compound [Ca++].CN(C)[C@H]1[C@@H]2[C@@H](O)[C@H]3C(=C([O-])[C@]2(O)C(=O)C(C(N)=O)=C1O)C(=O)c1c(O)cccc1[C@@]3(C)O.CN(C)[C@H]1[C@@H]2[C@@H](O)[C@H]3C(=C([O-])[C@]2(O)C(=O)C(C(N)=O)=C1O)C(=O)c1c(O)cccc1[C@@]3(C)O KIPLYOUQVMMOHB-MXWBXKMOSA-L 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004221 bone function Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 239000002241 glass-ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000046107 human BMP7 Human genes 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940063650 terramycin Drugs 0.000 description 1
- 229960003279 thiopental Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001928 zirconium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к области биомедицины, в частности к созданию in vitro специального биологического эквивалента костной ткани, на основе стволовых клеток взрослого организма, и способа восстановления дефектов длинных трубчатых костей при его имплантации, и может найти применение в ортопедии для восстановления целостности трубчатой кости при критически обширном дефекте костной ткани.The invention relates to the field of biomedicine, in particular, to the creation in vitro of a special biological equivalent of bone tissue, based on adult stem cells, and a method for repairing defects of long tubular bones during implantation, and can be used in orthopedics to restore the integrity of the tubular bone under critically extensive bone defect.
Уровень техники.The level of technology.
Одними из наиболее перспективных развивающихся направлений современной биомедицины является использование клеточных технологий и тканевой инженерии для разработки методов регенерации различных тканей. Основой такого успешного развития данных направлений стали успехи клеточной биологии, а именно выделение и характеристика стволовых клеток, которые обладают большим потенциалом к репарации различных органов и тканей.One of the most promising developing areas of modern biomedicine is the use of cell technology and tissue engineering to develop methods for the regeneration of various tissues. The basis for such a successful development of these areas was the success of cell biology, namely the isolation and characterization of stem cells, which have great potential for the repair of various organs and tissues.
Стволовые клетки во взрослом организме обычно находятся в состоянии покоя, активизируясь в случае необходимости восстановления клеточного состава ткани и органа, например, при повреждении или физиологической регенерации. Считается, что для выполнения своей биологической роли стволовые клетки обладают уникальной способностью к самообновлению и дифференцировке в различные клеточные типы. На сегодняшний день выделены и охарактеризованы практически все виды стволовых клеток из различных тканей организма человека: мезенхимные, эпидермальные, нейральные, мышечные стволовые клетки и другие. Благодаря своей способности к дифференцировке в различные клеточные линии и репарации тканевых дефектов использование стволовых клеток в методах клеточной терапии и тканевой инженерии стало наиболее развивающимся и перспективным направлением регенеративной медицины.Stem cells in the adult body are usually at rest, activating if necessary to restore the cellular composition of the tissue and organ, for example, during damage or physiological regeneration. To fulfill their biological role, stem cells are believed to have a unique ability to self-renew and differentiate into different cell types. To date, almost all types of stem cells from various tissues of the human body have been isolated and characterized: mesenchymal, epidermal, neural, muscle stem cells and others. Due to its ability to differentiate into different cell lines and repair tissue defects, the use of stem cells in cell therapy and tissue engineering methods has become the most developing and promising area of regenerative medicine.
Среди многочисленных случаев восстановления целостности костной ткани существуют значительные трудности в восстановлении обширных дефектов критической величины таких, где самостоятельное (спонтанное) восстановление костной ткани невозможно. Такие дефекты могут появиться в результате обширных травм, переломов, оперативных вмешательств при реконструкции костной ткани после удаления имплантов или крупных опухолей, кроме того, восстановление больших участков костной ткани необходимо для удлинения ног в эстетической хирургии.Among the numerous cases of restoration of the integrity of bone tissue, there are significant difficulties in restoring extensive defects of a critical magnitude such where independent (spontaneous) restoration of bone tissue is impossible. Such defects can appear as a result of extensive injuries, fractures, surgical interventions during bone tissue reconstruction after removal of implants or large tumors, in addition, restoration of large areas of bone tissue is necessary for lengthening the legs in aesthetic surgery.
Первым подходом к восстановлению таких дефектов было использование аутологичной (собственной) костной ткани. На сегодняшний день данный метод является одним из самых распространенных способов. Аутологичный материал содержит белки и остеогенные клетки, способные стимулировать рост новообразованной костной ткани. Использование аутотрансплантатов ограничено небольшим количеством забираемого материала, невозможностью проводить лечение обширных дефектов у детей, пожилых людей, а также у людей с врожденными заболеваниями и имеющих метастазирующие опухоли. Помимо перечисленных недостатков, существенным ограничением данного метода является сам процесс получения материала. Забор ткани представляет собой отдельную операцию, после которой пациенты могут испытывать болезненные ощущения в донорской области и другие послеоперационные осложнения.The first approach to repairing such defects was the use of autologous (own) bone tissue. Today, this method is one of the most common methods. Autologous material contains proteins and osteogenic cells that can stimulate the growth of newly formed bone tissue. The use of autografts is limited by the small amount of material taken, the inability to treat extensive defects in children, the elderly, as well as in people with congenital diseases and having metastatic tumors. In addition to these shortcomings, a significant limitation of this method is the process of obtaining the material. Tissue collection is a separate operation, after which patients may experience pain in the donor area and other postoperative complications.
В качестве альтернативы аутологичному материалу для замещения костных дефектов стали использовать аллогенные (взятые у донора) трансплантаты. В настоящее время аллогенная костная ткань хранится в различных банках мира, что делает ее доступной в необходимом для каждого случая количестве. Кроме того, такой трансплантат может иметь различную форму и отличаться по минеральной плотности, поэтому можно подобрать материал для каждого конкретного клинического случая. Недостатками аллогенной костной ткани является хрупкость заготавливаемого материала и его чувствительность к инфекциям (Pelker R.R., Friedlaender G.E., Markham Т.С. Biomechanical properties of bone allografts // Clin Orthop Relat Res. 1983. №(174). P.54-57).As an alternative to autologous material, allogeneic (taken from a donor) grafts began to be used to replace bone defects. Currently, allogeneic bone tissue is stored in various banks of the world, which makes it available in the quantity necessary for each case. In addition, such a graft may have a different shape and differ in mineral density, so you can choose the material for each specific clinical case. The disadvantages of allogeneic bone tissue are the fragility of the harvested material and its sensitivity to infections (Pelker RR, Friedlaender GE, Markham T.S. Biomechanical properties of bone allografts // Clin Orthop Relat Res. 1983. No. (174). P.54-57) .
В настоящее время наиболее широкое распространение получили пористые матриксы, натуральной (коралл, деминерализованный костный матрикс (ДКМ)) или синтетической природы (биокерамика, стеклокерамика и другие).Currently, the most widely used are porous matrices of natural (coral, demineralized bone matrix (DCM)) or synthetic nature (bioceramics, glass ceramics and others).
Эти материалы обладают такими важными свойствами для матрикса, как остеокондуктивность (способность обеспечивать структурную поддержку костной ткани) и остеоинуктивность (способность активировать рост костной ткани), но у них отсутствует ключевая характеристика - остеогенность (способность трансплантата вызывать рост костной ткани за счет собственных остеогенных клеток). Для обеспечения трансплантатов остеогенными свойствами, исследователи обратили свое внимание на стволовые клетки, в частности мультипотентые мезенхимные стволовые клетки (ММСК), выделенные из костного мозга и других тканей (подкожно-жировая клетчатка, плацента). Отрабатываются подходы использования как цельного костного мозга, так и ММСК различных тканей.These materials have such important properties for the matrix as osteoconductivity (the ability to provide structural support for bone tissue) and osteoinductivity (the ability to activate bone growth), but they lack a key characteristic - osteogenicity (the ability of a transplant to cause bone growth due to its own osteogenic cells) . To provide grafts with osteogenic properties, the researchers turned their attention to stem cells, in particular multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) isolated from bone marrow and other tissues (subcutaneous fat, placenta). Approaches for using both whole bone marrow and MMSC of various tissues are being developed.
Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки характеризуются относительной простотой выделения, высокой способностью к пролиферации in vitro в течение достаточно длительного времени, с сохранением способности к дифференцировке в различные клеточные типы. Впервые ММСК были выделены из костного мозга отечественным ученым. А.Я. Фриденштейн и сотрудники его лаборатории показали, что костный мозг содержит особую популяцию клеток, не являющихся стволовыми клетками крови (Fridenshtein A.J., Deriglazova U.F., Kulagina N.N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. // Exp. Hematol. 1974. Vol.2. P.83-92). Они не только выделили эти клетки, но и охарактеризовали их. В дальнейшем, ММСК были выделены из различных тканей - подкожно-жировой клетчатки, тимуса, плаценты, мышечной ткани и др., и охарактеризованы.Multipotent mesenchymal stem cells are characterized by relative ease of isolation, high ability to proliferate in vitro for a sufficiently long time, while maintaining the ability to differentiate into various cell types. For the first time MMSCs were isolated from bone marrow by Russian scientists. AND I. Friedenshtein AJ, Deriglazova UF, Kulagina NN et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method // Exp. Hematol. 1974. Vol.2. P.83-92). They not only isolated these cells, but also characterized them. In the future, MMSCs were isolated from various tissues - subcutaneous fat, thymus, placenta, muscle tissue, etc., and characterized.
Помимо широких потенций к дифференцировке, ММСК обладают особыми иммунологическими свойствами, поэтому данный клеточный материал активно используется учеными для разработки способов восстановления целостности и функциональной активности различных тканей. Способность ММСК к направленной эффективной дифференцировке в клетки остеогенного ряда определили этот материал как наиболее перспективный и эффективный для использования с целью восстановления костной ткани.In addition to the wide potentials for differentiation, MMSCs have special immunological properties, therefore, this cellular material is actively used by scientists to develop ways to restore the integrity and functional activity of various tissues. The ability of MMSCs to direct effective differentiation into osteogenic cells has identified this material as the most promising and effective for use in bone repair.
Для заполнения дефектов критической величины используются матриксы достаточного большого размера и объема, поэтому важным этапом создания эффективного костного трансплантата in vitro, является получение равномерно заселенной стволовыми клетками конструкции. Существующие методы создания биологических эквивалентов костной ткани позволяют получить матриксы с неравномерным заполнением клеточным материалом, для изготовления которого используется большое число клеток, что значительно повышает себестоимость технологии и препятствует ее широкому внедрению в клиническую практику. Кроме того, при таких способах восстановления ткани наблюдается длительное (неэффективное) заживление костных дефектов, с образованием соединительной ткани (рубца) или незрелой грубоволокнистой костной ткани. Поэтому создание современного эквивалента костной ткани для максимально быстрого и эффективного заживления костных дефектов критической величины подразумевает разработку метода, который позволит использовать минимальное число клеток, равномерно заселенных в объемный пористый матрикс, с их последующей обработкой средой для дифференцировки.Matrices of a sufficiently large size and volume are used to fill in defects of a critical magnitude; therefore, an important step in creating an effective bone graft in vitro is to obtain a structure uniformly populated by stem cells. Existing methods for creating biological equivalents of bone tissue make it possible to obtain matrices with uneven filling with cellular material, for the manufacture of which a large number of cells are used, which significantly increases the cost of the technology and prevents its widespread adoption in clinical practice. In addition, with such methods of tissue repair, prolonged (ineffective) healing of bone defects is observed, with the formation of connective tissue (scar) or immature coarse fibrous bone tissue. Therefore, the creation of a modern bone tissue equivalent for the fastest and most effective healing of critical bone defects implies the development of a method that will allow the use of a minimum number of cells uniformly populated in a porous bulk matrix, followed by treatment with a medium for differentiation.
Известен способ восстановления костных дефектов с помощью аутологичного костного мозга или рекомбинантного остеогенного белка человека, загруженных в гидроксиапатиный носитель (den Boer FC, Wippermann BW, Blokhuis TJ et al. Healing of segmental bone defects with granular porous hydroxyapatite augmented with recombinant human osteogenic protein-1 or autologous bone marrow // J Orthop Res. 2003. Vol.21(3) P:521-8).A known method of repairing bone defects using autologous bone marrow or recombinant human osteogenic protein loaded into a hydroxyapatine carrier (den Boer FC, Wippermann BW, Blokhuis TJ et al. Healing of segmental bone defects with granular porous hydroxyapatite augmented with recombinant human osteogenic protein-1 or autologous bone marrow // J Orthop Res. 2003. Vol.21 (3) P: 521-8).
Такие конструкции помещали в 3-см дефект левой большеберцовой кости овец и фиксировали с помощью интрамедуллярного гвоздя. Через 12 недель после имплантации было показано, что в области дефекта формировалась соединительная ткань и грубоволокнистая костная ткань.Such constructs were placed in a 3 cm defect of the sheep’s left tibia and fixed with an intramedullary nail. 12 weeks after implantation, it was shown that in the area of the defect, connective tissue and coarse fibrous bone were formed.
Недостатком этого способа является то, что для создания костных трансплантатов необходимо большое количество рекомбинантного белка, что значительно повышает себестоимость метода. Кроме того, ограничения в использовании данного подхода связаны с трудностями манипуляции данным веществом.The disadvantage of this method is that to create bone grafts, a large amount of recombinant protein is required, which significantly increases the cost of the method. In addition, limitations in the use of this approach are associated with difficulties in manipulating this substance.
Кроме того, в результате, формируется не пластинчатая кость характерная для трубчатых костей, а грубоволокнистая, незрелая костная ткань наравне с соединительной тканью, которые не обеспечивают достаточной механической прочности.In addition, as a result, not a lamellar bone characteristic of tubular bones is formed, but a coarse-fibered, immature bone tissue along with connective tissue, which do not provide sufficient mechanical strength.
Известен способ применения мезенхимных стволовых клеток пуповинной крови собак для восстановления 1,5 см дефекта лучевой кости собак (порода - бигль) (Jang BJ, Byeon YE, Lim JH et al. Implantation of canine umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells mixed with beta-tricalcium phosphate enhances osteogenesis in bone defect model dogs // J Vet Sci. 2008.Vol.9(4). P:387-93). Через 12 недель после имплантации было показано, что в группе, где для создания импланта использовали мезенхимные стволовые клетки пуповинной крови, восстановление костной ткани происходило интенсивнее, по сравнению с контролем, где стволовые клетки не использовались. Костные импланты изготавливались путем смешивания мезенхимных стволовых клеток (число которых составило 1×106) с бета-трикальцийфосафтными гранулами, после чего происходила имплантация материала в 1,5 см дефект костной ткани. Для фиксации импланта, его окружали композитной мембраной и фиксировали пластиной с винтами.A known method of using mesenchymal stem cells of umbilical cord blood of dogs to restore 1.5 cm of the defect of the radial bone of a dog (Beagle breed) (Jang BJ, Byeon YE, Lim JH et al. Implantation of canine umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells mixed with beta -tricalcium phosphate enhances osteogenesis in bone defect model dogs // J Vet Sci. 2008. Vol. 9 (4). P: 387-93). 12 weeks after implantation, it was shown that in the group where mesenchymal cord blood stem cells were used to create the implant, bone tissue repair was more intensive compared to the control, where stem cells were not used. Bone implants were made by mixing mesenchymal stem cells (the number of which was 1 × 10 6 ) with beta-tricalcium phosphate granules, after which the implantation of the material into a 1.5 cm bone defect occurred. To fix the implant, it was surrounded by a composite membrane and fixed with a plate with screws.
Минусом данного подхода являются ограничения, связанные с использованием аутологичного материала для восстановления костной ткани. То есть при клиническом использовании данного подхода, костные импланты будут иметь в основном аллогенную природу. Кроме того, анализ радиографии (рентген) показал, что полное соединение кости с имплантом обнаруживалось только у 3-х из 6-ти собак к 12-ти неделям наблюдения. Гистоморфометрический анализ выявил, что формирование новой кости составило 4.08±2.08% в контрольной группе и 10.92±2.74% в группе, где дефект заполнялся костными имплантами на основе мезенхимных стволовых клеток пуповинной крови. Таким образом, данный метод характеризуется низкой эффективностью и длительным периодом образования костной ткани.The disadvantage of this approach is the limitations associated with the use of autologous material for bone restoration. That is, with the clinical use of this approach, bone implants will be mostly allogeneic in nature. In addition, an analysis of radiography (X-ray) showed that complete connection of the bone with the implant was detected only in 3 out of 6 dogs by 12 weeks of observation. Histomorphometric analysis revealed that the formation of a new bone was 4.08 ± 2.08% in the control group and 10.92 ± 2.74% in the group where the defect was filled with bone implants based on cord blood mesenchymal stem cells. Thus, this method is characterized by low efficiency and a long period of bone formation.
Известен способ восстановления костных дефектов у мышей с помощью применения стволовых клеток из стромы жировой ткани человека (Choi HJ, Kirn JM, Kwon E et.al. Establishment of efficacy and safety assessment of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hATMSCs) in a nude rat femoral segmental defect model // J Korean Med Sci. 2011. Vol.26(4). P:482-91). В сформированный дефект, размером 5 мм, помещали матрикс, заполненный мезенхимными стволовыми клетками жировой ткани человека в разной концентрации (7.5×105, 7.5×106, 7.5×107 клеток). Матриксы насыщали клетками с помощью вакуума, помещали их в инкубатор на 3 часа, для того, чтобы клетки прикрепились к поверхности матрикса, и на следующий день проводили операции. В качестве контроля в область дефекта помещали пустой матрикс или оставляли дефект пустым. Результаты данного исследования показали, что через 16 недель после имплантации, в опытных группах наблюдалось значительно формирование новообразованной костной ткани, по сравнению с контрольной группой животных. Кроме того, степень образования костной ткани была прямо пропорциональна числу клеток, заселенных в пористый матрикс.A known method of repairing bone defects in mice by using stem cells from stroma of human adipose tissue (Choi HJ, Kirn JM, Kwon E et.al. Establishment of efficacy and safety assessment of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hATMSCs) in a nude rat femoral segmental defect model // J Korean Med Sci. 2011. Vol. 26 (4). P: 482-91). A matrix filled with mesenchymal stem cells of human adipose tissue in different concentrations (7.5 × 10 5 , 7.5 × 10 6 , 7.5 × 10 7 cells) was placed in the formed defect, 5 mm in size. The matrices were saturated with cells using a vacuum, placed in an incubator for 3 hours, so that the cells would attach to the surface of the matrix, and operations were performed the next day. As a control, an empty matrix was placed in the defect area or the defect was left empty. The results of this study showed that 16 weeks after implantation, in the experimental groups, the formation of newly formed bone tissue was significantly observed, compared with the control group of animals. In addition, the degree of bone formation was directly proportional to the number of cells populated in the porous matrix.
Недостатком данного метода является длительное время заживления дефекта, а также его высокая себестоимость.The disadvantage of this method is the long healing time of the defect, as well as its high cost.
Известен способ применения мезенхимных стволовых клеток костного мозга, заселенных в пористый матрикс (коралл) без последующей дифференцировки клеток, для восстановления 2,5 см дефекта плюсневой кости овец (Petite H, Viateau V, Bensaïd W et al. Tissue-engineered bone regeneration // Nat Biotechnol. 2000. Vol.18(9). P:959-63). В данном случае пористый имплант помещали в клеточную суспензию (32,5×106 клеток) на два часа, затем добавляли культуральную среду и оставляли в инкубаторе на ночь. При применении данного метода получения костного импланта наблюдалось неравномерное заселение матрикса клетками, с большей концентрацией их по периферии. Заживление дефекта наблюдалось через 16 недель.A known method of using mesenchymal stem cells of bone marrow, populated in a porous matrix (coral) without subsequent differentiation of cells, to restore 2.5 cm of the defect of the metatarsal bone of sheep (Petite H, Viateau V, Bensaïd W et al. Tissue-engineered bone regeneration // Nat Biotechnol. 2000. Vol. 18 (9). P: 959-63). In this case, the porous implant was placed in a cell suspension (32.5 × 10 6 cells) for two hours, then the culture medium was added and left in the incubator overnight. When using this method of obtaining a bone implant, an uneven population of the matrix with cells was observed, with a higher concentration of them on the periphery. Defect healing was observed after 16 weeks.
Недостатком данного метода является применение большого числа клеток, и неравномерное распределение внутри матрикса и достаточно долгое время заживление дефекта.The disadvantage of this method is the use of a large number of cells, and the uneven distribution within the matrix and the healing of the defect for a sufficiently long time.
Известен способ восстановления 2,1 см дефекта бедренной кости собак, с помощью полого пористого матрикса, заселенного аллогенными мезенхимными стволовыми клетками костного мозга (Arinzeh TL, Peter SJ, Archambault MP et al. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect // J Bone Joint Surg Am. 2003. Vol.85-A(10). P:1927-35). В качестве контроля использовались матриксы, не заселенные клеточным материалом, и пустые дефекты. Для заселения матриксов клетками использовали метод вакуумной загрузки клеточного материала. С этой целью пустой матрикс помещали в шприц, с помощью которого набирали культуральную среду с клеточным материалом. На один матрикс наслаивали 37,5 млн клеток. Через 16 недель на месте дефекта наблюдалось формирование костной ткани. Процент образования костной ткани был выше в имплантах, содержащих клеточный материал, по сравнению с имплантированными пустыми матриксами. Тем не менее, содержание небиодеградировавшей керамики было сравнительно одинаковым в трех группах и составляло около 35%.A known method of repairing 2.1 cm of a femoral defect in dogs using a hollow porous matrix populated by allogeneic mesenchymal stem cells of the bone marrow (Arinzeh TL, Peter SJ, Archambault MP et al. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect // J Bone Joint Surg Am. 2003. Vol. 85-A (10). P: 1927-35). As a control, matrices not populated by cellular material and empty defects were used. To populate the matrices with cells, the method of vacuum loading of cellular material was used. For this purpose, an empty matrix was placed in a syringe, with which a culture medium with cellular material was collected. 37.5 million cells were layered on one matrix. After 16 weeks, bone formation was observed at the site of the defect. The bone formation rate was higher in implants containing cellular material compared to implanted empty matrices. Nevertheless, the content of non-biodegraded ceramics was relatively the same in the three groups and amounted to about 35%.
Недостатком данного метода является то, что для формирования костной ткани требуется большое число клеточного материала, кроме того, не весь матрикс замещается костной тканью, и через 16 недель он детектируется в достаточно большом количестве.The disadvantage of this method is that a large number of cellular material is required for the formation of bone tissue, in addition, not all of the matrix is replaced by bone tissue, and after 16 weeks it is detected in a sufficiently large amount.
Известен способ использования мезенхимных стволовых клеток костного мозга, заселенных на коралловые матриксы для восстановления 2,5 см дефектов плюсневой кости овец. Клетки после культивирования в остеогенной среде (18×106) наносили за день до имплантации непосредственно на матрикс, обернутый с трех сторон фольгой. Кроме того, в эксперименте использовали костные трансплантаты, которые были подготовлены таким же образом, но после нанесения клеток, импланты снова выдерживали в культуральной среде с индукторами остеогенной дифференцировки в течение двух недель. Через 16 недель после операции было показано, что при имплантации костных имплантов, созданных с применением первой методики, на месте дефекта формировалась соединительная ткань, которая характерна для образующегося рубца на месте повреждения. Образование костной ткани на месте таких дефектов было минимальным. При использовании имплантов с двухнедельным этапом культивирования, на месте дефекта наблюдалось формирование грубоволокнистой, то есть незрелой, костной ткани. Этими же авторами было показано, что при нанесении клеток на коралловый матрикс, обработанный гидроксиапатитом, сформированный дефект через 4 месяца заполнялся костной тканью, но только у пяти овец из семи (BensaTd W, Oudina К, Viateau V et al. De novo reconstruction of functional bone by tissue engineering in the metatarsal sheep model // Tissue Eng. 2005. Vol.11(5-6). P:814-24).A known method of using mesenchymal stem cells of bone marrow, settled on coral matrices to restore 2.5 cm of the defects of the metatarsal bone of sheep. Cells after cultivation in an osteogenic medium (18 × 10 6 ) were applied the day before implantation directly on a matrix wrapped on three sides with foil. In addition, bone grafts were used in the experiment, which were prepared in the same way, but after the application of the cells, the implants were again kept in a culture medium with osteogenic differentiation inducers for two weeks. 16 weeks after the operation, it was shown that during implantation of bone implants created using the first technique, connective tissue was formed at the site of the defect, which is characteristic of the scar that forms at the site of damage. The formation of bone tissue at the site of such defects was minimal. When using implants with a two-week cultivation stage, coarse-fibrous, that is, immature, bone tissue was observed at the site of the defect. The same authors showed that when cells were applied to a coral matrix treated with hydroxyapatite, the defect formed was filled with bone tissue after 4 months, but only in five out of seven sheep (BensaTd W, Oudina K, Viateau V et al. De novo reconstruction of functional bone by tissue engineering in the metatarsal sheep model // Tissue Eng. 2005. Vol. 11 (5-6). P: 814-24).
Недостатком этого метода является большое число клеток, необходимое для создания костного импланта, его высокая себестоимость, а также низкая эффективность созданных имплантов для восстановления дефекта костной ткани.The disadvantage of this method is the large number of cells needed to create a bone implant, its high cost, as well as the low efficiency of the created implants to repair a bone tissue defect.
Из патента RU 2386453 известен биотрансплантат на основе пенокерамических носителей системы оксид циркония - оксид алюминия и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека для восстановления дефектов костной ткани. Для изготовления этого биотрансплантата используют в качестве носителя образцы из биокерамики в виде трехмерных блоков размером 0,5×0,5×0,2 см с диаметром пор от 50 до 100 нм. При изготовлении биотрансплантата проводят термообработку порошков системы оксид алюминия - оксид циркония в температурном интервале (100-1000)°С.From patent RU 2386453 a biograft based on ceramic foam carriers of the zirconium oxide-alumina system and multipotent mesenchymal stromal cells of a human bone marrow for repairing bone tissue defects is known. For the manufacture of this biograft, bioceramics in the form of three-dimensional blocks of 0.5 × 0.5 × 0.2 cm in size with a pore diameter of 50 to 100 nm are used as a carrier. In the manufacture of a biograft, the powders of the alumina - zirconium oxide system are heat treated in the temperature range (100-1000) ° С.
При получении биотрансплантата на основе пенокерамических носителей полученный аспират костного мозга наслаивают на разделяющий градиент раствора фикола и центрифугируют при 1300 об/мин в течение 20 мин при +4°С, полученное таким образом интерфазное кольцо с ядросодержащими клетками отбирают и центрифугируют при 1100 об/мин в течение 10 мин при +4°С, при этом супернатант удаляют, а клеточный осадок суспендируют в культуральной среде (DMEM/F12 1:1, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки или аутологичной сыворотки, 2 mM L-глутамина и 0,5 мг/мл амикацина, суспензию клеток рассевают на пластиковые чашки Петри в концентрации 104 клеток на 1 мл и инкубируют при стандартных условиях, затем неприкрепленные клетки удаляют, а прикрепившиеся клетки промывают культуральной средой и инкубируют до достижения 75-85% конфлюентности, в дальнейшем смену среды проводят каждые 2-3 суток в зависимости от ростовых характеристик культуры, при этом культивирование проводят до 3-4 пассажа до получения необходимого количества клеточной массы, при этом пенокерамические носители подвергают стерилизации методом облучения в дозе 2,5 Мрад, затем носители промывают физиологическим раствором и высушивают в потоке воздуха, подготовленные образцы носителя вместе с полученной клеточной суспензией с концентрацией клеток от 1 до 2 млн в 1 мл среды наносят на образцы из расчета 100 мкл суспензии на 100 мг образца.When receiving a biograft based on ceramic foam carriers, the obtained bone marrow aspirate is layered on a ficol solution separating gradient and centrifuged at 1300 rpm for 20 min at + 4 ° С, the thus obtained interphase ring with nucleated cells is selected and centrifuged at 1100 rpm for 10 min at + 4 ° C, while the supernatant is removed, and the cell pellet is suspended in the culture medium (DMEM / F12 1: 1, with the addition of 10% fetal calf serum or autologous serum, 2 mM L-glutamine and 0.5 mg / ml a ikatsina, the cell suspension was seeded on plastic Petri dishes at a concentration of 10 4 cells per 1 ml and incubated under standard conditions, then nonadherent cells were removed and adherent cells were washed with culture medium and incubated until reaching 75-85% confluence, subsequently changed every 2-3 days, depending on the growth characteristics of the culture, while cultivation is carried out up to 3-4 passages until the required amount of cell mass is obtained, while ceramic foam carriers are sterilized radiation dose of 2.5 Mrad, then the carriers are washed with physiological saline and dried in an air stream, prepared carrier samples together with the obtained cell suspension with a cell concentration of 1 to 2 million in 1 ml of medium are applied to the samples at the rate of 100 μl of suspension per 100 mg sample.
Недостатком этого трансплантата является неравномерность распределения клеток по его поверхности и в глубине, недостаточная прикрепленность клеток к субстрату. Вследствие этого регенерация костной ткани может происходить неравномерно, сроки замещения костных дефектов могут быть слишком длительными, кроме того, возможен риск вторичных переломов, в том числе и в отдаленном периоде. Кроме того, биотрансплантат, полученный этим способом, может быть неэффективен при замещении дефектов кости значительной протяженности.The disadvantage of this transplant is the uneven distribution of cells on its surface and in depth, insufficient attachment of cells to the substrate. As a result of this, bone tissue regeneration can occur unevenly, the timing of replacement of bone defects can be too long, in addition, the risk of secondary fractures, including in the long term, is possible. In addition, the biograft obtained by this method may be ineffective in replacing bone defects of considerable length.
Автором разработаны способы получения трансплантатов для замещения костных дефектов критической величины, позволяющие устранить недостатки, присущие трансплантатам, полученным с помощью ранее известных способов.The author has developed methods for producing grafts to replace bone defects of critical magnitude, allowing to eliminate the disadvantages inherent in grafts obtained using previously known methods.
Соблюдение всей последовательности действий по способам получения трансплантатов, предложенных автором, соблюдение всех разработанных условий при получении трансплантатов позволяет обеспечить равномерность распределения клеток в трансплантате, их хорошую прикрепленность к субстрату, позволяет обеспечить равномерность регенерации костной ткани, сокращение сроков замещения костных дефектов, в том числе костных дефектов, имеющих значительный объем, значительную протяженность. Способ замещения костных дефектов критической величины с помощью трансплантатов, полученных предлагаемыми способами, позволит свести к минимуму риск вторичных переломов в отдаленном периоде.Observance of the entire sequence of actions on the methods for producing transplants proposed by the author, compliance with all the developed conditions for obtaining transplants allows for uniform distribution of cells in the transplant, their good attachment to the substrate, allows for uniform regeneration of bone tissue, reduction of the time for replacement of bone defects, including bone defects having a significant volume, a significant extent. A method for replacing critical bone defects with transplants obtained by the proposed methods will minimize the risk of secondary fractures in the long term.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, заключается в создании специального биологического эквивалента костной ткани на основе стволовых клеток взрослого организма, и способа восстановлении дефектов длинных трубчатых костей при его имплантации.The problem to which the claimed invention is directed, is to create a special biological equivalent of bone tissue based on stem cells of an adult body, and a method for repairing defects of long tubular bones during implantation.
Техническим результатом изобретения является эффективное и быстрое восстановление костной ткани трубчатых костей, которое достигается благодаря оптимальному подбору способа загрузки клеточного материала внутрь носителя и последующей обработке данной конструкции, что приводит к уменьшению количества используемой популяции соматических клеток, высокой скорости репарации дефекта, низкой себестоимости метода и простоте его воспроизведения. В результате дефектная область заполняется вновь образованной зрелой пластинчатой костной тканью, что подтверждается данными морфологического и гистологического анализа.The technical result of the invention is the effective and rapid restoration of bone tissue of the tubular bones, which is achieved due to the optimal selection of the method of loading cellular material into the carrier and subsequent processing of this design, which leads to a decrease in the number of somatic cells used, high repair rate of the defect, low cost of the method and simplicity its reproduction. As a result, the defective area is filled with newly formed mature lamellar bone tissue, which is confirmed by morphological and histological analysis.
Согласно данному изобретению, было обнаружено, что мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) обладают выраженными потенциями к репарации костной ткани. При имплантации в область дефекта импланта, созданного специальным образом с применением ММСК, происходит зарастание дефекта кости новообразованной пластинчатой костной тканью, при этом эффективность восстановления зависит от происхождения клеточного материала (ауто- или аллогенные ММСК). Следовательно, целью данного изобретения, являлась разработка способа восстановления костной ткани трубчатых костей для его дальнейшего применения в ортопедии при лечении дефектов костной ткани критической величины, отличающегося тем, что в качестве клеточного материала использовались аутологичные мультипотентные мезенхимные стволовые клетки костного мозга, заселенные на носитель методом наслоения с последующим вращением при скорости 25 об./мин и дальнейшей обработкой средой с индукторами остеогенной дифференцировки, для достижения максимально эффективной репарации костной ткани.According to this invention, it was found that multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) have pronounced potentials for bone repair. When implanted in the area of an implant defect created in a special way using MMSCs, a bone defect overgrows with newly formed lamellar bone tissue, and the recovery efficiency depends on the origin of cellular material (auto- or allogeneic MMSCs). Therefore, the aim of this invention was to develop a method for restoring bone tissue of tubular bones for further use in orthopedics in the treatment of critical bone defects, characterized in that autologous multipotent mesenchymal bone marrow stem cells colonized on a carrier by layering were used as cellular material followed by rotation at a speed of 25 rpm./min and further processing by a medium with inductors of osteogenic differentiation, for which I have the most effective repair of bone tissue.
Теоретический результат изобретения достигается за счет того, что используемые мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) выделяются из костного мозга. Известно, что для восстановления костной ткани ММСК, выделенные из костного мозга, являются наиболее перспективным материалом по сравнению с ММСК, выделенными из других источников, например жировой ткани (Savchenkova I.P., Rostovskaya M.S., Chupikova N.I. et al. Osteogenic Differentiation of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Isolated from Human Bone Marrow and Subcutaneous Adipose Tissue // Cell and Tissue Biology. 2008. Vol.2(6). P:566-571.) Данные клетки имеют в культуре уникальные характеристики: способны к пролиферации в течение длительного времени и, при индукции к дифференцировке, формируют клетки тканей мезенхимного происхождения.The theoretical result of the invention is achieved due to the fact that used multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) are secreted from the bone marrow. MMSCs isolated from bone marrow are known to be the most promising materials for bone tissue restoration compared to MMSCs isolated from other sources, e.g. adipose tissue (Savchenkova IP, Rostovskaya MS, Chupikova NI et al. Osteogenic Differentiation of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Isolated from Human Bone Marrow and Subcutaneous Adipose Tissue // Cell and Tissue Biology. 2008. Vol.2 (6). P: 566-571.) These cells have unique characteristics in culture: they are capable of proliferation for a long time and, when induction to differentiation, form cells of tissues of mesenchymal origin.
Выделенные и культивированные ММСК вводят в носитель и подвергают обработке средой с индукторами остеогенной дифференцировки.Isolated and cultured MMSCs are introduced into the carrier and subjected to treatment with a medium with osteogenic differentiation inducers.
Теоретическим основанием для использования нового метода нанесения клеток и их последующей обработки является то, что с помощью существующих методов нанесения клеток на матрикс (вакуум, наслоение) клетки распределяются не равномерно внутри матрикса, а по градиенту нанесения раствора с клетками. Последующая дифференцировка клеток в остеогенном направлении способствует формированию биологического эквивалента костной ткани, тем самым активизируя процессы остеогенеза как внутри импланта, так и способствует активации роста новообразованной костной ткани из опилов кости.The theoretical basis for using the new method of applying cells and their subsequent processing is that, using the existing methods of applying cells to the matrix (vacuum, layering), the cells are distributed not uniformly inside the matrix, but along the gradient of applying the solution with the cells. Subsequent differentiation of cells in the osteogenic direction contributes to the formation of the biological equivalent of bone tissue, thereby activating the processes of osteogenesis both inside the implant and also helps to activate the growth of newly formed bone tissue from bone filings.
Носитель с загруженными в него клетками трансплантируется непосредственно в область дефекта кости.A carrier with cells loaded into it is transplanted directly into the area of the bone defect.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Оценка эффективности способа регенерации костной ткани критической величины была проведена в рамках предклинического испытания. Исследование проводилось поэтапно и включало стадии выделения мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из костного мозга овец и человека и культивирования их in vitro до наращивания необходимой клеточной массы; подготовку различных комбинаций трансплантата; дифференцировку клеток в остеогенном направлении; моделирования дефекта костной ткани критической величины у мелких сельскохозяйственных животных (овцы); введения в область дефекта подготовленных трансплантатов; морфологического и гистологического анализа костных композитов исследуемых трубчатых костей.Evaluation of the effectiveness of the critical tissue bone regeneration method was carried out as part of a preclinical trial. The study was carried out in stages and included the stages of isolation of multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) from the bone marrow of sheep and humans and culturing them in vitro to build up the necessary cell mass; preparation of various graft combinations; differentiation of cells in the osteogenic direction; modeling a critical bone defect in small farm animals (sheep); introducing prepared grafts into the defect area; morphological and histological analysis of bone composites of the studied tubular bones.
Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничение объема данного изобретения.The invention is illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting the scope of this invention.
Пример 1. Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из костного мозга овцы.Example 1. Isolation and cultivation of multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) from sheep’s bone marrow.
Аспират костного мозга получали от половозрелых баранов романовской породы методом пунктирования гребня подвздошной кости. Полученные пробы костного мозга собирали в пробирки с литий-гепарином, затем разбавляли ФСБ. После фильтрования через 70 µм фильтр клетки центрифугировали при 400 g в течение 10 мин для получения осадка. Основной средой для культивирования была среда ДМЕМ, дополненная 10% СПК, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками пенициллин и стрептомицин, в конечной концентрации 100 Ед/мл и 100 мкг/мл соответственно.A bone marrow aspirate was obtained from sexually mature Romanov rams by puncturing the iliac crest. The obtained bone marrow samples were collected in lithium heparin tubes, then diluted with FSB. After filtering through 70 μm, the cells were centrifuged at 400 g for 10 min to obtain a pellet. The main culture medium was DMEM supplemented with 10% SEC, a single solution of essential amino acids and antibiotics penicillin and streptomycin, at a final concentration of 100 U / ml and 100 μg / ml, respectively.
Полученную клеточную суспензию высевали во флаконы площадью 150 см2 из расчета 1×106 клеток/см2. Доля прикрепившихся клеток составляла приблизительно 1-1,5%. Культивировали мезенхимные стволовые клетки в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% эмбриональной сыворотки теленка, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками (100 ед/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина) при 37°С и 5% CO2 в воздухе. Среду меняли каждые 3 суток и по достижении конфлуэнтного монослоя осуществляли субкультивирование: клетки снимали с субстрата раствором 0,05% трипсин-ЭДТА и высевали на культуральные флаконы из расчета 1×10 клеток/см2 в ростовой среде. Непосредственно перед процедурой подготовки трансплантата клетки снимали с субстрата, отмывали средой ДМЕМ, ресуспендировали в небольшом количестве физиологического раствора и подсчитывали в камере Горяева. Результаты иммунофенотипирования показали, что популяция полученных клеток соответствует по экспрессии поверхностных антигенов мезенхимным стволовым клеткам. Митотический индекс и время цитогенерации составили 60‰ и 38-42 час соответственно.The resulting cell suspension was sown in vials with an area of 150 cm 2 at the rate of 1 × 10 6 cells / cm 2 . The proportion of adherent cells was approximately 1-1.5%. Mesenchymal stem cells were cultured in low glucose DMEM supplemented with 10% fetal calf serum, a single solution of essential amino acids and antibiotics (100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) at 37 ° C and 5% CO 2 in air. The medium was changed every 3 days and, upon reaching a confluent monolayer, subculture was performed: the cells were removed from the substrate with a solution of 0.05% trypsin-EDTA and plated on culture vials at a rate of 1 × 10 cells / cm 2 in growth medium. Immediately prior to the graft preparation procedure, cells were removed from the substrate, washed with DMEM medium, resuspended in a small amount of physiological saline, and counted in a Goryaev chamber. The results of immunophenotyping showed that the population of the obtained cells corresponds to the expression of surface antigens to mesenchymal stem cells. The mitotic index and cytogenesis time were 60 ‰ and 38-42 hours, respectively.
Пример 2. Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из костного мозга человекаExample 2. Isolation and cultivation of multipotent mesenchymal stem cells (MMSC) from human bone marrow
ММСК выделяли из костного мозга человека, полученного во время проведения плановой операции с информированного согласия пациента. Аспират помещали в одноразовые стерильные пробирки с напылением LiHe и разбавляли физиологическим раствором, забуференным фосфатами (ФСБ), без ионов Са2+ и Mg2+, содержащим антибиотик/антимикотик (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В). Полученную из аспирата суспензию клеток центрифугировали в градиенте плотности фиколла в течение 30 мин, затем полученную фракцию клеток последовательно промывали ФБС с антибиотиком/антимикотиком и проводили лизирование в специальном буфере. Выделенную популяцию клеток переносили в культуральный матрас из расчета 1 млн клеток на 1 см2. Основной средой для культивирования клеток была среда ДМЕМ с низким (1 г/л и менее) содержанием глюкозы, дополненная СПК (10%), стократным раствором заменимых аминокислот, и антибиотиками пенициллин и стрептомицин. Конечная концентрация стрептомицина составляла 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 Ед/мл. Периодическое культивирование осуществляли по мере формирования полного монослоя, снятие клеток с субстрата проводили, используя 0,05%-ный раствор трипсина-ЭДТА в течение 5-6 мин.MMSCs were isolated from the bone marrow of a person obtained during a planned operation with the informed consent of the patient. The aspirate was placed in disposable sterile LiHe-sprayed tubes and diluted with physiological phosphate buffered saline (PBS) without Ca2 + and Mg2 + ions containing antibiotic / antimycotics (100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0.25 μg / ml amphotericin ) The cell suspension obtained from the aspirate was centrifuged in a ficoll density gradient for 30 min, then the obtained cell fraction was washed sequentially with PBS with antibiotic / antimycotic and lysed in a special buffer. The selected population of cells was transferred to the culture mattress at the rate of 1 million cells per 1 cm 2 . The main medium for cell cultivation was DMEM medium with a low (1 g / L or less) glucose content, supplemented with SEC (10%), a hundred-fold solution of essential amino acids, and antibiotics penicillin and streptomycin. The final concentration of streptomycin was 100 μg / ml, and penicillin was 100 U / ml. Periodic cultivation was carried out as a complete monolayer was formed, cells were removed from the substrate using a 0.05% trypsin-EDTA solution for 5-6 minutes.
Количество полученных клеток оценивали подсчетом в камере Горяева, после чего клетки сеяли во флаконы площадью 150 см2 из расчета 1×106 клеток/см2.The number of obtained cells was estimated by counting in a Goryaev chamber, after which the cells were seeded in vials with an area of 150 cm 2 at the rate of 1 × 10 6 cells / cm 2 .
Непосредственно перед процедурой подготовки трансплантата клетки снимали с субстрата, отмывали средой ДМЕМ, ресуспендировали в небольшом количестве физиологического раствора и подсчитывали в камере Горяева. Результаты иммунофенотипирования показали, что популяция полученных клеток соответствует по экспрессии поверхностных антигенов мезенхимным стволовым клеткам. Митотический индекс и время цитогенерации составили 31‰ и 56-60 час соответственно.Immediately prior to the graft preparation procedure, cells were removed from the substrate, washed with DMEM medium, resuspended in a small amount of physiological saline, and counted in a Goryaev chamber. The results of immunophenotyping showed that the population of the obtained cells corresponds to the expression of surface antigens to mesenchymal stem cells. The mitotic index and cytogenesis time were 31 ‰ and 56-60 hours, respectively.
Пример 3. Получение трансплантатовExample 3. Obtaining transplants
Суспензию клеток медленно наносили на матрикс, инкубировали 3 часа при температуре 37°С при покачивании на орбитальном шейкере со скоростью 25 об/мин После этого матрикс заливали рабочей средой, а через сутки меняли среду на остеогенную. Средой для дифференцировки в клетки остеогенного ряда была ДМЕМ, дополненная СПК (10%), дексаметазоном (10-7 М), β-глицерофосфатом (10 мМ), аскорбат-2-фосфатом (0,05 мМ) и 1% антибиотиком (конечная концентрация стрептомицина - 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 Ед/мл). Каждые 3-й сутки среду меняли на свежую, культивирование проводили в течение 28 дней.The cell suspension was slowly applied to the matrix, incubated for 3 hours at 37 ° C with shaking on an orbital shaker at a speed of 25 rpm. After this, the matrix was poured with a working medium, and after a day the medium was changed to osteogenic. The medium for differentiation into osteogenic cells was DMEM supplemented with SEC (10%), dexamethasone (10 -7 M), β-glycerophosphate (10 mM), ascorbate-2-phosphate (0.05 mM) and 1% antibiotic (final the concentration of streptomycin is 100 μg / ml, and penicillin is 100 U / ml). Every 3 days the medium was changed to fresh, cultivation was carried out for 28 days.
В эксперименте использовали различные варианты трансплантатов с целью изучения влияния различных факторов на процессы регенерации костной ткани.In the experiment, various variants of transplants were used to study the influence of various factors on bone tissue regeneration processes.
1. Пустой матрикс без клеточного материала.1. Empty matrix without cellular material.
2. ММСК костного мозга человека, заселенные в пористый матрикс.2. MMSCs of human bone marrow populated in a porous matrix.
3. ММСК костного мозга овцы, заселенные в пористый матрикс.3. MMSC bone marrow of sheep, populated in a porous matrix.
Пример 4. Моделирование дефекта костной ткани трубчатой кости критической величины у овецExample 4. Modeling a bone defect of a bone tissue of a critical bone in sheep
Хирургическое вмешательство проводилось под общей анестезией с применением правил асептики и антисептики в стерильной операционной. Перед проведением операций животных выдерживали 12 часов на голодной диете. В качестве наркотического вещества применялся 5%-ный раствор тиопентал (пентотал) - натрия из расчета 15 мг/кг массы животного. Животное фиксировалось на специальном столике. Место оперативного вмешательства - правая большеберцовая кость.Surgical intervention was performed under general anesthesia using the rules of asepsis and antiseptics in a sterile operating room. Before operations, animals were kept for 12 hours on a starvation diet. As a narcotic substance, a 5% solution of thiopental (pentotal) sodium was used at the rate of 15 mg / kg of the animal's weight. The animal was fixed on a special table. The place of surgical intervention is the right tibia.
Доступ. Выбривали участок большеберцовой кости. Операционное поле обрабатывали спиртовым раствором йода 3%. Проводили рассечение кожи с медиальной стороны средней трети большеберцовой кости. Также рассекали подкожную фасцию и межфасциальную жировую ткань. Рассекали надкостницу, обнажая участок кости.Access. A tibial site was shaved. The surgical field was treated with an alcoholic solution of iodine 3%. The skin was dissected from the medial side of the middle third of the tibia. Subcutaneous fascia and interfascial adipose tissue were also dissected. The periosteum was dissected, exposing a portion of the bone.
Моделирование дефекта. На поверхности кости отмерялся участок размером в 2,5 см, по краям выпиливался пилой с возвратно-поступательным движением полотна, с помощью физиологического раствора происходило охлаждение костной ткани.Defect modeling. On the surface of the bone, a 2.5-cm-sized site was measured, sawn along the edges with a saw with reciprocating movement of the blade, and bone tissue was cooled using physiological saline.
Пример 5. Введение трансплантатов в сформированный дефектExample 5. The introduction of grafts into the formed defect
Из прооперированных животных было сформировано 3 опытные группы по 7 животных в каждой (таблица 1).From the operated animals, 3 experimental groups of 7 animals each were formed (table 1).
Группа №1 являлась контрольной, заживление дефекта проводилось без применения ММСК, в область дефекта имплантировался пустой матрикс. Группы №2 и 3 являлись опытными, в область дефекта помещали трансплантаты, созданные на основе синтетического матрикса и ММСК, выделенных из костного мозга овцы (Группа №2) или человека (Группа №3).Group No. 1 was the control, the healing of the defect was carried out without the use of MMSC, an empty matrix was implanted in the area of the defect. Groups No. 2 and 3 were experimental; grafts created on the basis of a synthetic matrix and MMSC isolated from the bone marrow of a sheep (Group No. 2) or human (Group No. 3) were placed in the defect area.
Техника введения трансплантатов. После помещения трансплантатов в сформированные дефекты, на кость накладывали металлическую пластину, которую фиксировали 8-ю винтами.Technique for the introduction of transplants. After the transplants were placed in the formed defects, a metal plate was placed on the bone, which was fixed with 8 screws.
Затем рана закрывалась в обратном порядке. Накладывали кожные швы шелком №4. Швы обрабатывали Террамицином-спреем. Швы снимали на 10-е сутки после проведения операции. Все операции (21 шт) были проведены успешно, без осложнений.Then the wound closed in the reverse order. Skin sutures were applied with silk No. 4. The sutures were treated with Terramycin Spray. Sutures were removed on the 10th day after the operation. All operations (21 pcs) were performed successfully, without complications.
Пример 6. Морфологический и гистологический анализ костных композитов исследуемых костей.Example 6. Morphological and histological analysis of bone composites of the studied bones.
Для изучения в динамике процесса регенерации костной ткани в зависимости от состава трансплантата забой животных (по одному животному из каждой группы) производили через 3 и 6 месяцев после операции. Изолировали костный композит большеберцовой кости и проводили визуальный и гистологический анализ (Таблица 2).To study the dynamics of the bone tissue regeneration process, depending on the graft composition, animals were killed (one animal from each group) 3 and 6 months after the operation. A bone composite of the tibia was isolated and visual and histological analysis was performed (Table 2).
Наиболее эффективным оказался трансплантат, состоящий из матрикса, заселенного ММСК овцы. Введение в костный дефект мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга способствовало ускорению резорбции синтетического гидроксиапатита, активизировало процессы остеогенеза, ремоделирования и созревания новообразованной кости. Наиболее активно эти процессы происходили при использовании ММСК костного мозга овцы, то есть аутологичного материала. Через 6 месяцев дефект полностью восстанавливался.The most effective was a transplant consisting of a matrix populated with MMSC sheep. The introduction of multipotent mesenchymal stromal bone marrow cells into the bone defect accelerated the resorption of synthetic hydroxyapatite, activated the processes of osteogenesis, remodeling and maturation of the newly formed bone. Most actively, these processes occurred when using MMSC sheep bone marrow, that is, autologous material. After 6 months, the defect was fully restored.
Таким образом, использование заявленного изобретения позволяет улучшить восстановление функций костей при обширных повреждениях костной ткани за счет увеличения скорости регенерации костной ткани, малоинвазивным, легко воспроизводимым и недорогим способом.Thus, the use of the claimed invention allows to improve the restoration of bone functions with extensive damage to bone tissue by increasing the rate of regeneration of bone tissue, minimally invasive, easily reproducible and inexpensive way.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013140871/15A RU2545993C2 (en) | 2013-09-05 | 2013-09-05 | Method for repairing long bone defects of critical size |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013140871/15A RU2545993C2 (en) | 2013-09-05 | 2013-09-05 | Method for repairing long bone defects of critical size |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013140871A RU2013140871A (en) | 2015-03-10 |
| RU2545993C2 true RU2545993C2 (en) | 2015-04-10 |
Family
ID=53279721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013140871/15A RU2545993C2 (en) | 2013-09-05 | 2013-09-05 | Method for repairing long bone defects of critical size |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2545993C2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2685687C1 (en) * | 2017-12-11 | 2019-04-22 | Государственное бюджетное учреждение Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе Российской Федерации | Method of treating osteoarthritis of knee joint |
| RU2716594C1 (en) * | 2019-06-27 | 2020-03-13 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России) | Method for recovering resorbed alveolar bone tissue with a bioengineered structure of decellularized human dental tissues |
| RU2744756C1 (en) * | 2020-06-01 | 2021-03-15 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method of transplanting biocomposite spheroids to ensure the possibility of restoring the integrity of the bone in case of defects that exceed the critical size |
| RU2778615C1 (en) * | 2021-10-08 | 2022-08-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Graft, a method for bone marrow autotransplantation to stimulate reparative bone regeneration and a device for carrying out transplantation |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2280462C2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-07-27 | Александр Сергеевич Тепляшин | Method for detaching mesenchyma trunk cells |
| WO2010062297A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-03 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Regenerative tissue grafts and methods of making same |
-
2013
- 2013-09-05 RU RU2013140871/15A patent/RU2545993C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2280462C2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-07-27 | Александр Сергеевич Тепляшин | Method for detaching mesenchyma trunk cells |
| WO2010062297A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-03 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Regenerative tissue grafts and methods of making same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КУЛЬНЕВА Е.И. Получение in vitro трехмерных трансплантатов косной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и их использование при повреждении костной ткани, автореф. дис. к.б.н., Москва, 2011, С.7-8,10,15,рис.1.Найдено из Интернета [он-лайн] 10.11.2014 на сайте http://www.lib.znate.ru./docs/index-188428.html. КАМПОС Л., Определение минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии при остром миелолейкозе, Иммунология гемопоэза, 2013, N1-2, Т. 11, С.20, Подписано впечать 31.12.2012. Найдено из Интернета [он-лайн] 10.11.2014 на сайте www.ronc.ru/attachments/article/1815/ig-1-2-2013_for_NN.pdf * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2685687C1 (en) * | 2017-12-11 | 2019-04-22 | Государственное бюджетное учреждение Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе Российской Федерации | Method of treating osteoarthritis of knee joint |
| RU2716594C1 (en) * | 2019-06-27 | 2020-03-13 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России) | Method for recovering resorbed alveolar bone tissue with a bioengineered structure of decellularized human dental tissues |
| RU2744756C1 (en) * | 2020-06-01 | 2021-03-15 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method of transplanting biocomposite spheroids to ensure the possibility of restoring the integrity of the bone in case of defects that exceed the critical size |
| RU2778615C1 (en) * | 2021-10-08 | 2022-08-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Graft, a method for bone marrow autotransplantation to stimulate reparative bone regeneration and a device for carrying out transplantation |
| RU2805231C1 (en) * | 2022-12-28 | 2023-10-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Р.Р. Вредена" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for assessing effectiveness of using cell-engineered construct based on polymer carrier and cell culture in experiment when replacing hyaline cartilage defects |
| RU2845121C1 (en) * | 2024-11-17 | 2025-08-13 | ООО "Инновационно-Технологическая Компания Эндопринт" | Method for replacing a diaphyseal bone defect of a long bone with an individual double-loop liner |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013140871A (en) | 2015-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Song et al. | The homing of bone marrow MSCs to non-osseous sites for ectopic bone formation induced by osteoinductive calcium phosphate | |
| Borrelli et al. | Tissue engineering and regenerative medicine in craniofacial reconstruction and facial aesthetics | |
| Petite et al. | Tissue-engineered bone regeneration | |
| Yoshimi et al. | Self-assembling peptide nanofiber scaffolds, platelet-rich plasma, and mesenchymal stem cells for injectable bone regeneration with tissue engineering | |
| ES2775977T3 (en) | Prosthetic bone-like implants | |
| RU2447878C2 (en) | Osteogenesis and chondrogenesis activation | |
| S Shekkeris et al. | Clinical applications of mesenchymal stem cells in the treatment of fracture non-union and bone defects | |
| Griffin et al. | The use of adipose stem cells in cranial facial surgery | |
| CN110478528B (en) | Preparation method and application of novel tissue repair promoting material | |
| Maiti et al. | Mesenchymal stem cells of different origin-seeded bioceramic construct in regeneration of bone defect in rabbit | |
| ES2400282T3 (en) | New stem cell line and its application | |
| AU2004230980B2 (en) | Process for producing cartilage cells for transplantation | |
| Zhao et al. | The study of the feasibility of segmental bone defect repair with tissue-engineered bone membrane: a qualitative observation | |
| Shirakata et al. | An exploratory study on the efficacy of rat dedifferentiated fat cells (rDFATs) with a poly lactic-co-glycolic acid/hydroxylapatite (PLGA/HA) composite for bone formation in a rat calvarial defect model | |
| CN101564555A (en) | Tissue engineering bone implant and method for constructing the same | |
| Alabdulkarim et al. | Recent advances in bone regeneration: The role of adipose tissue-derived stromal vascular fraction and mesenchymal stem cells | |
| RU2545993C2 (en) | Method for repairing long bone defects of critical size | |
| Fattahian et al. | Biomaterials, substitutes, and tissue engineering in bone repair: Current and future concepts | |
| CN102172337B (en) | Tissue-engineered skin with sebaceous gland-like structure and preparation method thereof | |
| US9434923B2 (en) | Preparation of parental cell bank from foetal tissue | |
| RU2240135C1 (en) | Cell culture comprising precursor cells of osteogenesis, implant based on thereof and its applying for recovery bone integrity | |
| Borrelli et al. | Macrophage transplantation fails to improve repair of critical-sized calvarial defects | |
| RU86455U1 (en) | BIO ENGINEERING DESIGN | |
| CN1846793B (en) | A kind of tissue engineering bone and its construction and application | |
| CN115845138A (en) | Preparation method and application of high osteogenic activity bone repair material for promoting angiogenesis |