RU2545783C9 - Средства и способы определения количества полипептида нейротоксина и его каталитической и протеолитической активностей - Google Patents
Средства и способы определения количества полипептида нейротоксина и его каталитической и протеолитической активностей Download PDFInfo
- Publication number
- RU2545783C9 RU2545783C9 RU2011147994/15A RU2011147994A RU2545783C9 RU 2545783 C9 RU2545783 C9 RU 2545783C9 RU 2011147994/15 A RU2011147994/15 A RU 2011147994/15A RU 2011147994 A RU2011147994 A RU 2011147994A RU 2545783 C9 RU2545783 C9 RU 2545783C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- neurotoxin polypeptide
- neurotoxin
- detection
- complex
- Prior art date
Links
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 206
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 206
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 title claims abstract description 189
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 173
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 158
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 158
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 90
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 title claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 title description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 93
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 4
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 18
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 18
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 101710101803 DNA-binding protein J Proteins 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 7
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 4
- 101100272852 Clostridium botulinum (strain Langeland / NCTC 10281 / Type F) F gene Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 4
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 4
- 241001075517 Abelmoschus Species 0.000 description 3
- 241000283323 Delphinapterus leucas Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 108010059642 isinglass Proteins 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 2
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 2
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010063006 Facial spasm Diseases 0.000 description 1
- 208000004095 Hemifacial Spasm Diseases 0.000 description 1
- 101000582320 Homo sapiens Neurogenic differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 102000004390 N-Ethylmaleimide-Sensitive Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081735 N-Ethylmaleimide-Sensitive Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100030589 Neurogenic differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100484930 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) VPS41 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical group [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 108010079650 abobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000002866 cervical dystonia Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 229940098753 dysport Drugs 0.000 description 1
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000002904 focal dystonia Diseases 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 108010024001 incobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 229940018272 xeomin Drugs 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы и устройства для определения количества процессированного полипептида нейротоксина в растворе путем вычитания количества частично процессированного и непроцессированного нейротоксина из количества общего нейротоксина. Предложены наборы, содержащие систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина и соответствующие инструкции. Предложенная группа изобретений позволяет эффективно определять количество процессированного нейротоксина в препарате. 6 н. и 18 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к области средств для обеспечения получения полипептидов и контроля качества. В особенности, это касается способа определения количества процессированного (активного) полипептида нейротоксина в растворе, содержащем процессированный полипептид нейротоксин и частично процессированный или непроцессированный полипептид нейротоксин. Кроме того, настоящее изобретение относится к устройству для определения вышеуказанного количества и набору, подходящему для выполнения способа в соответствии с настоящим изобретением.
Clostridium botulinum и Clostridium tetani продуцируют весьма мощные нейротоксины, то есть ботулинические токсины (BoNTs) и токсин столбняка (TeNT), соответственно. Эти клостридиальные нейротоксины (CNTs) специфически связываются с нейрональными клетками и нарушают высвобождение нейромедиатора. Каждый токсин синтезируется как неактивный, непроцессированный одноцепочечный белок с молекулярной массой около 150 кДа. Посттрансляционный процессинг включает образование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (одноцепочечный разрыв) посредством бактериальной протеаз(ы). Активный нейротоксин состоит из двух цепей, N-концевой легкой цепи массой около 50 кДа и тяжелой цепи массой около 100 кДа, связанных дисульфидной связью. CNTs структурно и функционально состоят из трех доменов, то есть каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, охватывающей транслокационный домен (N-концевая половина) и рецептор-связывающего домена (С-концевая половина), смотрите Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Ботулинические нейротоксины синтезируются как молекулярные комплексы, содержащие белок нейротоксин массой 150 кДа и ассоциированные нетоксичные белки. Размеры комплекса различаются в зависимости от штамма Clostridial и различных серотипов нейротоксина в пределах от 300 кДа, более чем 500 кДа и 900 кДа. Нетоксичные белки в этих комплексах стабилизируют нейротоксин и защищают его от деградации, смотрите Sil-berstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26.
Clostridium botulinum секретирует семь антигенно отличающихся серотипов, обозначаемые как ботулинические нейротоксины от А до G (BoNT). Все серотипы вместе с родственным столбнячным нейротоксином (TeNT), секретируемым Clostridium tetani, являются Zn2+-эндопротеазами, которые блокируют синаптический экзоцитоз путем расщепления SNARE белков, смотрите Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. CNTs cause the flaccid muscular paralysis seen in botulism and tetanus, see Fischer 2007, PNAS 104, 10447.
Несмотря на его токсические эффекты, комплекс ботулинического токсина применялся в качестве терапевтического агента для большого количества болезней. Серотип ботулинического токсина А был одобрен в Соединенных Штатах в 1989 г. для использования на людях для лечения косоглазия, блефароспазма и других расстройств. Он коммерчески доступен как белковый препарат Ботулинический токсин А, например, под торговым наименованием ВОТОХ (Allergan Inc) или под товарным знаком DYSPORT (Ipsen Ltd). Улучшенный, свободный от комплексов препарат Ботулинический токсин А, коммерчески доступен под товарным знаком XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH). Для терапевтических применений препарат вводится непосредственно в мышцу, которая подлежит лечению. При физиологических значениях рН токсин высвобождается из белкового комплекса и достигается желаемый фармакологический эффект. Эффект ботулинического токсина является только временным, что служит причиной того, что повторное введение ботулинического токсина необходимо для поддержания терапевтического эффекта.
Клостридиальные нейротоксины ослабляют силу произвольно сокращающихся мышц и являются эффективной терапией для косоглазия, фокусной дистонии, включая цервикальную дистонию и доброкачественный эссенциальный блефароспазм. Кроме того, для них было показано облегчение гемифациального спазма и фокальной спастичности, и, более того, была показана способность быть эффективными при широком диапазоне других показаний, таких как желудочно-кишечные расстройства, чрезмерное потоотделение и косметическая коррекция морщин, смотрите Jost 2007, Drugs 67, 669.
В ходе процесса получения клостридиальных нейротоксинов количественное определение также как и контроль качества активного полипептида нейротоксина имеет особенно важное значение. Доступные в настоящее время препараты нейротоксинов содержат в дополнение к требуемому активному (процессированному или зрелому) нейротоксину протеолитически непроцессированный предшественник или частично процессированный полипептид нейротоксин. Протеолитически непроцессированный предшественник или частично процессированный полипептид нейротоксин отличаются от зрелого (активного, процессированного) нейротоксического полипептида в последовательности только несколькими аминокислотами. Поэтому они с трудом могут быть количественно различимы на основании их химических и физических свойств. С другой стороны, часть протеолитически непроцессированного предшественника и/или частично процессированный полипептид нейротоксин полного белка все еще может иметь существенное значение в таких препаратах. Эта часть зависит от биологической системы, применяемой для получения, и следует из биосинтеза и условий процесса ферментации. Таким образом, количество требуемого зрелого, биологически активного полипептида нейротоксина в нейротоксических препаратах предопределено и в настоящее время довольно трудно для определения.
Средства и способы надежной качественной и количественной системы обнаружения зрелого (активного) полипептида нейротоксина весьма желательны, но еще недоступны.
Таким образом, техническая задача, лежащая в основе настоящего изобретения, может рассматриваться как предоставление средств и способов, обеспечивающих вышеупомянутые потребности. Техническая задача решается посредством примеров осуществления, охарактеризованных в формуле изобретения и приведенных ниже.
Настоящее изобретение относится к способу определения количества процессированного (активного) полипептида нейротоксина в растворе, содержащем процессированный полипептид нейротоксин и частично процессированный и/или непроцессированный полипептид нейротоксин, содержащему стадии:
a) контактирование первой части названного раствора с первым антителом захвата, которое специфически связывается с легкими цепями зрелого полипептида нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание упомянутого антитела с вышеназванным зрелым нейротоксином, частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, первого антитело-содержащего комплекса,
b) контактирование первого антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, которое специфически связывается с тяжелой цепью вышеназванного зрелого нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина в антитело-содержащем комплексе, сформированном на стадии а), посредством чего образуется первый комплекс обнаружения,
c) контактирование второй части вышеназванного раствора со вторым антителом захвата, которое специфически связывается с линкерами упомянутого частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые позволяют связывание упомянутого антитела с упомянутым частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, второго антитело-содержащего комплекса,
d) контактирование второго антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, посредством чего образуется второй комплекс обнаружения,
e) определение количества первого и второго комплексов обнаружения, сформированных на стадиях b) и d),
f) вычисление количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных на стадии е).
Вышеупомянутый способ может, в общем, содержать дополнительные стадии, включающие стадии для приготовления раствора, или стадии, касающиеся дополнительной оценки результатов, полученных на стадии f). Кроме того, стадии а) и b), также как и стадии с) и d), могут быть выполнены одновременно или последовательно. В последнем случае стадии а) и b) могут быть выполнены до или после стадий с) и d). Дальнейшее определение, упомянутое для стадии е), может быть проведено в названном случае после того, как обе серии стадий были проведены, или определение на стадии е), поскольку будет затронут первый комплекс обнаружения, проводится после стадий а) и b), в то время как определение, касающееся второго комплекса обнаружения, проводится после стадий с) и d). Способ может быть частично или полностью автоматизирован. Инкубация и стадии измерений могут быть выполнены, например, роботом. Анализ данных и интерпретация могут быть выполнены на компьютере, снабженным вычислительным алгоритмом.
Термин "полипептид нейротоксин", применяемый в настоящем изобретении, относится к семи отдельным серотипам ботулинических нейротоксинов, то есть BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, и к столбнячному нейротоксину (TeNT), смотрите Таблицу 1, и вариантам вышеупомянутого.
| Таблица 1 | |||
| Ботулинические и столбнячные нейротоксины | |||
| SEQ ID NO: | Ссылка | Номер доступа: | Нейротоксин (полной длины)/бактериальный штамм |
| 17 | Beecher 1997, J Protein Chem 16, 701-712; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49-57. | ABD65472.1 GI:89258592 | BoNT/A (Hall/62A) |
| 18 | Antharavally 1998, J Protein Chem 17, 417-428 | BAE48264.1 GI:81230332 | BoNT/B (Okra) |
| 19 | Sagane 1999, J Protein Chem 18,885-892 | BAA89713.1 GI:6729213 | BoNT/CI (C-6814) |
| 20 | Sagane 1999, J Protein Chem 18,885-892 | BAA90661.1 GI:6939795 | BoNT/D (CB16) |
| 21 | Antharavally 1997, J Protein Chem 16, 787-799 | CAA43999.1 GI:40394 | BoNT/E (Beluga) |
| 22 | Sagane 1999, J Protein Chem 18,885-892 | CAA73972.1 GI:3805790 | BoNT/F (NCTC10281) |
| 23 | Campbell 1993, Biochim. Biophys. Acta 1216 (3), 487-491 | CAA52275.1 GI:441276 | BoNT/G |
| 24 | Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202,41-51; Krieglstein et al. 1990, Eur J Biochem 188, 39-45 | P04958.2 GI:135624 | TeNT |
Нейротоксины, упомянутые в настоящем изобретении, в принципе, содержат N-концевую легкую цепь и С-концевую тяжелую цепь. Нейротоксины продуцируются в виде одноцепочечных молекул-предшественников, называемых в настоящем изобретении как «непроцессированные полипептиды нейротоксины». Последовательности N-концевой легкой цепи и С-концевой тяжелой цепи разделены в непроцессированных нейротоксинах по меньшей мере одним сайтом протеолитического расщепления. Эти нейротоксины содержат линкерную последовательность между последовательностями легкой и тяжелой цепи, где легкая цепь локализована у N-конца, начиная от первого сайта расщепления, и тяжелая цепь локализована у С-конца, начиная от второго сайта расщепления. В аспекте настоящего изобретения названный линкер имеет аминокислотную последовательность, как показано любой из последовательностей SEQ ID NOs:1-16. Во время процессинга нейротоксинов последовательность линкера будет вырезана. Эти нейротоксины содержат два сайта протеолитического расщепления, один на N-концевом и один на С-концевом краях линкерной последовательности. В ходе процессинга таких нейротоксинов могут возникнуть интермедиаты, которые расщепляются по тому или другому сайту расщепления, то есть линкерная последовательность еще не вырезана, но остается либо на N-концевой легкой цепи, либо на С-концевой тяжелой цепи. Такие интермедиаты упоминаются в настоящем описании как "частично процессированные полипептиды нейротоксины". Другие нейротоксины содержат только один сайт расщепления. Понятно, что для таких нейротоксинов не может быть вырезана никакая линкерная последовательность. Тем не менее, непроцессированный нейротоксин может быть распознан иммунологически благодаря присутствию интактного сайта протеолитического расщепления и фланкирующих последовательностей. Эти фланкирующие последовательности и сайт расщепления также рассматриваются как линкер в целях настоящего изобретения. Таким образом, термин "линкер", применяемый в настоящем изобретении и определенный выше, относится либо к последовательности между последовательностями легких и тяжелых цепей полипептидов нейротоксинов, имеющих два сайта расщепления, либо к сайту расщепления и фланкирующим последовательностей для полипептидов нейротоксинов, имеющих только единственный сайт расщепления. В результате процессинга получается "процессированный полипептид нейротоксин". Названный нейротоксический полипептид нейротоксин показывает биологические свойства, характерные для нейротоксина, а именно, (а) связывание с рецептором, (b) интернализация, (с) транслокация через эндосомальную мембрану в цитозоль, и/или (d) эндопротеолитическое расщепление белков, вовлеченных в слияние мембраны синаптического пузырька. Поэтому процессированный полипептид нейротоксин иногда упоминается в настоящем изобретении как активный или зрелый нейротоксический полипептид. Биологическая активность полипептидов нейротоксинов, в некотором аспекте, является результатом всех вышеупомянутых биологических свойств. Исследования in vivo для оценки биологической активности включают определение LD50 для мышей и анализ ех vivo одного из куполов диафрагмы мыши, как описано Реагсе et al. и Dressier et al. (Pearce 1994, Toxicol AppI Pharmacol 128:69-77 and Dressier 2005, Mov Disord 20:1617-1619). Биологическая активность обычно выражается в мышиных единицах (ME). При использовании в настоящем изобретении, 1 ME - количество нейротоксического компонента, который убивает 50% обработанной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции, то есть LD50 для мышей при внутрибрюшинном введении.
В аспекте способа настоящего изобретения названый полипептид нейротоксин выбирается из группы, состоящей из: а) полипептида нейротоксина, имеющего аминокислотную последовательность, как показано любой из последовательностей SEQ:17-24, и b) полипептида нейротоксина, имеющего аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 40% идентичной аминокислотной последовательности полипептида нейротоксина, как показано любой из последовательностей SEQ:17-24. Вышеупомянутые аминокислотные последовательности показывают непроцессированные полипептиды нейротоксины. Последовательности соответствующих частично процессированных или процессированных полипептидов нейротоксинов могут быть выведены из названных последовательностей с помощью информации о сайтах расщепления, представленных ниже в Таблице 3. В другом варианте выполнения настоящего изобретения, полипептид нейротоксин имеет аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 40%, на 50%, на 60%, на 70%, на 75%, на 80%, на 85%, на 90%, на 95%, на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной аминокислотной последовательности, как показано SEQ:17-24. Термин «идентичная», при использовании в настоящем изобретении, относится к идентичности последовательностей аминокислотных последовательностей, где последовательности выровнены таким образом, что достигается наиболее высокая степень соответствия. Это может быть достигнуто при использовании опубликованных методик или способов, кодифицируемых в компьютерных программах, таких как, например, BLASTP, BLASTN, FASTA, Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403. Величины процента идентичности, в одном варианте, вычисляются относительно полной аминокислотной последовательности. Ряд программ, основанных на различных алгоритмах, доступен квалифицированному специалисту в данной области техники для того, чтобы сравнивать различные последовательности. В этом контексте алгоритмы Нидлмана и Вунша или Смита и Ватермана дают особенно надежные результаты. Для проведения выравнивания последовательностей следует использовать программу PileUp (1987, J Mol Evolution 25, 351; Higgins 1989 CABIOS 5, 151) или программы Gap и BestFit (Needleman and Wunsch 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith and Waterman 1981, Adv AppI Math 2, 482), которые являются частью пакета программного обеспечения GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Величины идентичности последовательностей, приведенные выше в процентах, должны быть определены, в одном варианте настоящего изобретения, с помощью программы GAP в районе полной последовательности со следующими параметрами настройки: вес гэпа: 50, вес длины: 3, среднее совпадение: 10.000 и среднее несовпадение: 0.000, которые, если иначе не определено, должны всегда использоваться в качестве стандартных параметров настройки для выравниваний последовательностей. Следует иметь ввиду, что вышеупомянутые варианты, в аспекте настоящего изобретения, должны сохранить по меньшей мере одно из биологических свойств нейротоксинов и, в некотором варианте настоящего изобретения, все биологические свойства полипептида нейротоксина, рассматриваемого в настоящем изобретении. В следующем варианте выполнения настоящего изобретения, варианты могут быть нейротоксинами, имеющими улучшенные или измененные биологические свойства, например, они могут содержать сайты расщепления, которые улучшены для узнавания ферментом или для связывания с рецептором, или любое другое свойство, указанное выше. Понятно, что концепция настоящего изобретения основывается на присутствии двух или более сайтов расщепления между легкой и тяжелой цепями полипептида нейротоксина, в то время как природа сайтов расщепления и особенности аминокислотной последовательности между ними не имеет значения, пока агент является специфичным для частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина. Соответственно, другим вариантом является замена сайтов узнавания протеазы и пептидного линкера между тяжелой и легкой цепью полипептида нейротоксина.
В другом варианте полипептид нейротоксин в соответствии со способом по настоящему изобретению может быть химерной молекулой. Так называемая химерная молекула в одном варианте может иметь одиночные замещенные домены. Соответственно, в другом варианте, часть тяжелой цепи нейротоксина замещается FC-фрагментом антитела.
Термин "количество", при применении в способе по настоящему изобретению, охватывает абсолютное количество полипептида, относительное количество или концентрацию названного полипептида, так же, как и любое значение или параметр, который коррелирует с ними или может быть выведен их них.
Термин "раствор", при применении в настоящем изобретении, относится к любой растворяющей системе, содержащей зрелый полипептид нейротоксин и его частично процессированные и/или непроцессированные предшественники полипептида нейротоксина. Растворяющая система, кроме того, содержит растворитель. Возможными растворителями в различных вариантах изобретения являются вода, водные буферные системы, органические растворители и ионные жидкости. В одном варианте настоящего изобретения растворяющей системой является система водного растворителя. Кроме того, растворяющая система в дополнение к зрелому полипептиду нейротоксину и частично процессированному или непроцессированному предшественнику полипептида нейротоксина и растворителю может также содержать дополнительно молекулы, включая дополнительные бактериальные полипептиды. В некотором варианте, раствором, который должен применяться в способе в соответствии с настоящим изобретением, будет культура бактериальных клеток или частично очищенный или очищенный препарат, полученный из такой бактериальной клеточной культуры.
Термин «порция», используемый в соответствии со способом по настоящему изобретению, относится к образцу или к аликвоте раствора. В варианте способа настоящего изобретения первая порция и вторая порция, упоминаемые в настоящем изобретении, полностью эквиваленты по их объемам и содержанию. Это может быть достигнуто, например, измерением содержания общего белка первой и второй порции, в соответствии с чем, практически полная идентичность содержания общего белка показательна для первой и второй порции, имеющих практически идентичное содержание. Однако в следующем варианте, порция, которая будет применяться в качестве первой или второй порции, может быть разбавлением образца или аликвоты раствора. Следует понимать, что в зависимости от количества подлежащего определению полипептида нейротоксина (то есть частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина или общего нейротоксина) разбавление может быть необходимым, чтобы обеспечить оптимальное качественное и количественное определение. Как делать такие разбавления, хорошо известно специалистам в данной области техники.
Термин "контактирование", использующийся в соответствии со способом по настоящему изобретению, относится к (i) обеспечению вышеупомянутых антител захвата и раствора, содержащего нейротоксины, или (ii) обеспечению антитело-содержащих комплексов и антител обнаружения в физической близости, чтобы позволить физическое и/или химическое взаимодействие. Подходящие условия, которые обеспечивают специфическое взаимодействие, известны квалифицированному специалисту в данной области техники. Названные условия будут зависеть от антител и раствора, которые будут применяться в способе по настоящему изобретению, и могут быть адаптированы специалистом в данной области техники. Помимо этого, время, достаточное для осуществления взаимодействия, также может быть определено квалифицированным специалистом в данной области техники. Кроме того, нужно понимать, что между отдельными стадиями контактирования, изложенными в способе по настоящему изобретению, могут выполняться стадии промывки для обеспечения подходящих условий для контактирования. Например, после формирования первого антитело-содержащего комплекса на стадии а), оставшийся раствор должен быть удален до применения антитела обнаружения к указанному антитело-содержащему комплексу. Кроме того, после того как первый комплекс обнаружения сформирован на стадии b), возможно будет необходимо удалить оставшееся (несвязавшееся) антитело обнаружения до определения количества первого комплекса обнаружения на стадии с). То же самое применяется, конечно, для стадий от а) до f), соответственно.
Термин "антитело", используемый в настоящем изобретении, охватывает моноклональное антитело, поликлональное антитело, одноцепочечное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, синтетическое антитело или фрагмент любого из перечисленных антител. Фрагменты названных антител включают Fab, Fv или scFv фрагменты, или химически модифицированные производные любого из этих фрагментов. Антитела могут быть изготовлены с использованием способов, которые описаны, например, в Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью методик, первоначально описанными в Kóhler 1975, Nature 256, 495, и Galfre 1981, Meth Enzymol 73, 3. Названные методики содержат слияние клеток миеломы мыши с клетками селезенки, полученными из иммунизированных млекопитающих. Антитела могут быть далее улучшены с помощью методик, известных специалистам этой области техники. Например, поверхностный плазменный резонанс, использующийся в системе в BIACORE(R), может быть использован для повышения эффективности фаговых антител, которые связываются с эпитопом, смотрите Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J. Immunol Methods 183, 7. Антитела, используемые в настоящем изобретении, также содержат функциональные эквиваленты антител, то есть агентов, которые способны к специфическому связыванию с желательными эпитопами или частями полипептидов нейротоксинов. В некотором варианте такие функциональные эквиваленты содержат рецептор или связывающие белки, упомянутые в других указанны как специфическое связывание.
Согласно способу в соответствии с настоящим изобретением, "первое антитело захвата" специфически связывается с эпитопами, содержащимися в легкой цепи зрелого полипептида нейротоксина и содержащимися в частично процессированном и/или непроцессированном полипептиде нейротоксине. Термин «специфическое связывание», при использовании в настоящем изобретении, в общем, означает, что антитело не реагирует перекрестно в существенной степени с другими эпитопами на тяжелой цепи или линкере нейротоксического полипептида, подлежащего определению, или на других полипептидах. Специфическое связывание, как упоминается в настоящем изобретении, может быть исследовано различными хорошо известными методиками, включая, например, эксперименты по конкуренции и Вестерн-блоты. Термин «эпитоп», при использовании в соответствии с настоящим изобретением, касается антигенной детерминанты, которая узнается антителом.
В другом варианте, различные антитела захвата могут использоваться, чтобы заменить первое антитело захвата. С этой целью может применяться по меньшей мере одно антитело захвата, которое специфически связывается с эпитопами легкой цепи непроцессированного полипептида нейротоксина, по меньшей мере еще одно антитело захвата, которое специфически связывается с эпитопами легкой цепи частично процессированного полипептида нейротоксина, и еще по меньшей мере одно антитело захвата, которое специфично связывается с эпитопами легкой цепи процессированного полипептида нейротоксина. Следует иметь в виду, что эти три типа антител имеют функциональное сходство с первым антителом захвата в целях способа по настоящему изобретению. Похожим образом, антитело захвата, которое специфически связывается с эпитопами легкой цепи частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, может применяться в комбинации с антителом захвата, которое специфически связывается с эпитопами легкой цепи процессированного полипептида нейротоксина.
Указанное первое антитело захвата в некотором варианте должно быть иммобилизовано. Названная иммобилизация антитела, в принципе, может достигаться, в некотором варианте, обратимым или необратимым, прямым или непрямым (через линкерные молекулы) связыванием антитела с твердой подложкой. В некотором варианте изобретения, первое антитело захвата иммобилизуется до выполнения способа. В другом варианте, первое антитело захвата иммобилизуется после того, как был сформирован первый антитело-содержащий комплекс, но до контактирования комплекса с антителом обнаружения. Материалы для твердых подложек известны специалистам в данной области техники и включают, среди прочего, коммерчески доступные полисахаридные матрицы, выбранные из группы, состоящей из: сефарозы, сефадекса; агарозы, сефацела, микроцеллюлозы и альгинатных гранул, полипептидных матриц, гранул полистирола, латексных гранул, магнитных гранул, коллоидных металлических частиц, стеклянных, пластмассовых и/или кремниевых крошек и поверхностей, нитроцеллюлозных полосок, мембран, листов, стабилизированных эритроцитов, лунки и стенки реакционных плашек, пластиковых пробирок. В некотором варианте настоящего изобретения, названная твердая подложка изготовлена из полистирола, подвергнутого гамма-облучению.
Термин "первый антитело-содержащий комплекс" относится к комплексу, содержащему первое антитело захвата, специфически связанное с процессированными, частично процессированными, или формируется в результате контактирования первого антитела захвата с раствором, содержащим названные процессированные, частично процессированные или непроцессированные полипептиды нейротоксины, как указано выше.
Согласно способу по настоящему изобретению, "второе антитело захвата" специфически связывается с эпитопом, который содержит линкер непроцессированного и/или частично процессированного полипептида нейротоксина или его частей. В случаях, где линкерная последовательность отсутствует, предусматривается, что названное второе антитело захвата специфически связывается с эпитопом, содержащим нерасщепленный сайт протеолитического расщепления или его части. В некотором аспекте изобретения, второе антитело захвата не реагирует перекрестно с процессированным полипептидом нейротоксином в существенной степени. В некотором варианте настоящего изобретения, названное второе иммобилизованное антитело захвата специфически связывается с эпитопом, по существу состоящим из аминокислотной последовательности, как показано SEQ ID NO:1-16, содержащим ее или содержащимся ей, смотрите Таблицы 2 или 3, приведенные ниже.
| Таблица 2 | ||
| Аминокислотная последовательность сайтов расщепления различных полипептидов нейротоксинов и фланкирующих последовательностей | ||
| SEQ | Последовательность эпитопа, включающая сайты расщепления (выделено) | Нейротоксин (бактериальный штамм) |
| 1 | KLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALN…DLCIKV | BoNT/A (Hall/62A) |
| 2 | IQMCKSVKAPG…ICIDV | BoNT/B (Okra) |
| 3 | TKFCHKAIDGRSL…YNKTL…DCRELLV | BoNT/CI (C-6814) |
| 4 | TKVCLRLTK…NSRD…DSTCIKV | BoNT/D |
| 5 | IRFCKNIVSVKG…IRK…SICIEI | BoNT/E (Beluga) |
| 6 | VKFCKSVIPRKG…TKAP…PRLCIRV | BoNT/F(NCTC10281) |
| 7 | IAMCKPVMYKNT…GKS…EQCIIV | BoNT/G |
| 8 | IGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKI | TeNT |
| Таблица 3 | |||
| Аминокислотные последовательности линкерных участков | |||
| SEQ ID NO: | Последовательность эпитопов | Сайты расщепления | Нейротоксин/бактериальный штамм |
| 9 | TKSLDKGYNK | K438/Т439 K448/А449 | BoNT/A (Hall/62A) |
| 10 | CKSVKAPGIC | K441/А442 | BoNT/B (Okra) |
| 11 | SLYNK | R444/S445 K449/Т450 | BoNT/CI (C-6814) |
| 12 | NSR | K442/N443 | BoNT/D (CB16) |
| R445/D446 | |||
| 13 | GIR | K419/G420 R422/K423 | BoNT/E (Beluga) |
| 14 | KGTK | R435/K436 K439/А440 | BoNT/F(NCTC 10281) |
| 15 | NGTK | BoNT/G | |
| 16 | ENLYNR | R449 (альтернативно R455) | TeNT |
Благодаря присутствию вышеупомянутого эпитопа, непроцессированные или частично процессированные полипептиды нейротоксины могут специфически связываться вторым антителом захвата и, таким образом, формировать второй антитело-содержащий комплекс. Названное второе антитело захвата является иммобилизованным, как подробно объяснено выше.
Соответственно, термин "второй антитело-содержащий комплекс" относится к комплексу, содержащему второе антитело захвата, специфически связанное с частично процессированным или непроцессированным полипептидом нейротоксином. Названный второй антитело-содержащий комплекс, однако, не должен содержать процессированный полипептид нейротоксин.
Согласно способу по настоящему изобретению "антитело обнаружения" специфически связывается с первым и/или вторым антитело-содержащим комплексом. В некотором варианте изобретения, антитело обнаружения идентично для первого и второго антитело-содержащего комплекса. Однако в другом варианте, для первого и второго антитело-содержащего комплекса могут использоваться различные антитела обнаружения. В некотором варианте, антитело обнаружения специфически связывается с эпитопами на тяжелой цепи процессированного, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина. Вследствие присутствия одного и того же эпитопа в обоих комплексах, первый антитело-содержащий комплекс или второй антитело-содержащий комплекс могут быть специфически связаны и, таким образом, обнаружены с помощью антитела обнаружения в указанном варианте настоящего изобретения.
В результате специфического связывания антитела обнаружения, формируются первый комплекс обнаружения или второй комплекс обнаружения, соответственно.
Поэтому термин "первый комплекс обнаружения" относится к комплексу, содержащему первый антитело-содержащий комплекс и антитело обнаружения. Аналогично, термин "второй комплекс обнаружения" относится к комплексу, содержащему второй антитело-содержащий комплекс и антитело обнаружения.
В аспекте способа по настоящему изобретению, указанное антитело обнаружения, содержащееся в первом или втором комплексе обнаружения, соединено с детектируемой меткой, позволяющей измерять количество антитела обнаружения, которое связано с комплексом обнаружения. С помощью измерения количества названного связанного антитела обнаружения может быть определено количество первых или вторых антитело-содержащих комплексов, так как количество связанного антитела обнаружения в комплексе обнаружения коррелирует с количеством антитело-содержащего комплекса, содержащимся в комплексе обнаружения. Мечение может быть проведено прямыми или непрямыми методами. Прямое мечение включает в себя непосредственное присоединение метки (ковалентно или нековалентно) к первому антителу обнаружения. Косвенное мечение включает в себя связывание (ковалентно или нековалентно) агента, который специфически связывается с антителом обнаружения и который несет детектируемую метку. Таким агентом может быть, например, вторичное (более высокого порядка) антитело, которое специфически связывается с антителом обнаружения. Вторичное антитело в таком случае будет соединено с детектируемой меткой. Следует иметь в виду, что дополнительные антитела более высокого порядка часто используются также для детектирования комплекса обнаружения. Антитела более высокого порядка часто используются для усиления сигнала. Подходящие антитела более высокого порядка могут также включать хорошо известную систему стрептавидин-биотин (Vector Laboratories, Inc.) и хорошо известный Dako LSAB™2 и LSAB™+ (меченый стрептавидин-биотин), или Dako PAP (пероксидаза антипероксидаза). В следующем варианте указанная метка первого антитела обнаружения выбирается из группы, состоящей из: флуоресцентных красителей, хемолюминесцентных молекул, радиоактивных меток и ферментов, способных генерировать детектируемый сигнал. Типичные флуоресцентные метки включают флуоресцентные белки (такие как GFP и его производные), Cy3, Cy5, Texas Red, флуоресцеин и Texas Red (например, Alexa 568). Типичные радиоактивные метки включают 35S, 125I, 32P, 33P и т.п. Альтернативно, детектируемая метка, соединенная с названным первым антителом обнаружения, может также быть ферментом, который способен к генерированию детектируемого сигнала, например, путем конверсии субстрата. В некотором варианте, такой фермент может быть пероксидазой (например, пероксидазой хрена) или щелочной фосфатазой.
Термин "определение количества", используемый в настоящем изобретении, касается измерения абсолютного количества, относительного количества или концентрации количественным или полуколичественным способом. Измерение будет осуществляться на основе химических, физических или биологических свойств детектируемой метки, соединенной с первым антителом обнаружения. Подходящие единицы измерения для обнаружения хорошо известны специалистам в данной области техники и зависят от природы детектируемой метки, как указывалось выше. Однако необходимо понимать, что количество детектируемой метки, которое может быть измерено, прямо коррелирует с количеством комплекса обнаружения, которое в свою очередь коррелирует с количеством антитело-содержащего комплекса и, таким образом, с количеством подлежащих определению видов нейротоксина, которые должны быть определены, то есть либо общего (процессированного, непроцессированного и частично процессированного нейротоксина), либо непроцессированного и частично процессированного нейротоксина. Следует понимать, что определение количества полипептидов нейротоксинов, в некотором варианте, также требует калибровки способа путем применения стандартных растворов с предопределенным количеством полипептидов нейротоксинов. То, как выполнять такую калибровку, хорошо известно специалистам в данной области техники.
Термин «вычисление», используемый в соответствии со способом по настоящему изобретению, касается математических операций, которые позволяют определить количество процессированного нейротоксина на основании количеств общего нейротоксина (то есть процессированного, непроцессированного и частично процессированного нейротоксина) и количества частично процессированного и непроцессированного нейротоксина. В отношении способа по настоящему изобретению, вышеуказанные вычисления включают вычитание количества частично процессированного и непроцессированного нейротоксина из количества общего нейротоксина.
Способ в соответствии с настоящим изобретением преимущественно позволяет надежно определять количество процессированного нейротоксина в данном препарате. Соответственно, качество препаратов на основе нейротоксина может быть повышено, так как препараты могут быть проверены на постоянное содержание требующегося процессированного полипептида нейротоксина.
В принципе, способ по настоящему изобретению может быть выполнен присоединением первого антитела захвата к твердой подложке, такой как реакционная пробирка. Точно так же, второе антитело захвата должно быть соединено с другой физически отдельной твердой подложкой (например, с дополнительной реакционной пробиркой). Оба антитела захвата, присоединенные к твердыми подложкам, будут последовательно вовлечены в контакт с названными порциями раствора, содержащими процессированный, непроцессированный и/или частично процессированный нейротоксин, подлежащий определению. Таким раствором может быть, например, очищенная бактериальная клеточная культура Clostridum sp. Следует иметь в виду, что первая порция будет вовлечена в контакт с первым антителом захвата на первой твердой подложке, а вторая порция будет вовлечена в контакт со вторым антителом захвата на второй твердой подложке. Порции обычно имеют равный объем и нормализованы относительно их содержимого, например, содержания общего белка. Контактирование будет выполнено в течение времени, достаточного для специфического связывания первых и вторых антител захвата с их соответствующими антигенами. Например, контактирование может быть выполнено при комнатной температуре в течение около одного часа. Впоследствии первая и вторая порции раствора удаляются, и твердые подложки (например, реакционные пробирки) будут промыты один или два раза буфером, при условиях, которые не влияют на первый и второй антитело-содержащие комплексы, которые были к тому времени сформированы с антителами захвата на твердых подложках. После того как стадии промывки были выполнены, (первое) антитело обнаружения должно быть добавлено к твердым подложкам, при условиях, которые позволяют специфическое связывание антитела обнаружения. Избыток антитела обнаружения должен быть удален дальнейшими стадиями промывки с использованием подходящего буфера. Впоследствии, количество первого и второго комплексов обнаружения может быть определено определением количества специфически связанного антитела обнаружения. Это достигается в зависимости от природы метки антитела обнаружения, например, измерением оптической плотности или интенсивности флюоресценции. Измеренное количество для детектируемой метки может сравниваться со стандартами калибровки, чтобы определить количество видов нейротоксина, то есть либо общий (процессированный, непроцессированный и частично процессированный нейротоксин), либо непроцессированный и частично процессированный нейротоксин в первом или во втором комплексе обнаружения. Следует иметь в виду, что первый комплекс обнаружения представляет количество общего нейротоксина, в то время как второй комплекс обнаружения представляет количество только частично процессированных и непроцессированных полипептидов нейротоксина. Соответственно, количество процессированного полипептида нейротоксина может быть вычислено вышеупомянутым способом, вычитанием количества частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина из общего количества полипептида нейротоксина.
Следует понимать, что вышеприведенные определения и объяснения терминов применяются с изменениями и оговорками в отношении всех вариантов, описанных в этом описании, если не указано иное.
Настоящее изобретение также касается способа определения количества процессированного (активного) полипептида нейротоксина в растворе, содержащем процессированный полипептид нейротоксин и частично процессированный и/или непроцессированный полипептид нейротоксин, содержащего стадии:
a) контактирование первой порции указанного раствора с первым антителом захвата, которое специфически связывается с тяжелыми цепями зрелого полипептида нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание названного антитела с указанным зрелым нейротоксином, частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, первого антитело-содержащего комплекса,
b) контактирование первого антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, которое специфически связывается с легкой цепью указанного зрелого нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина в антитело-содержащем комплексе, сформированном на стадии а), посредством чего формируется первый комплекс обнаружения,
c) контактирование второй порции указанного раствора со вторым антителом захвата, которое специфически связывается с линкерами указанных частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание указанного антитела с названным частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, второго антитело-содержащего комплекса,
d) контактирование второго антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, посредством чего формируется второй комплекс обнаружения,
e) определение количества первого и второго комплексов обнаружения, сформированных на стадии b) и стадии d), и
f) вычисление количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных на стадии е).
В другом варианте способов в соответствии с настоящим изобретением, названные способы дополнительно содержат определение связывающей активности полипептида нейротоксина.
Термин "связывающая активность", применяющийся в соответствии со способом по настоящему изобретению, относится к способности процессированного полипептида нейротоксина связываться с поверхностным рецепторным белком, который присутствует, например, на периферийных холинергических нервных окончаниях. Рецепторные белки включают SV2 для BoNT/A, синап-тотагмины I и II для ВоNТ/В и BoNT/G, и ганглиозидный (GT1B) корецептор. В отношении способа в соответствии с настоящим изобретением, названная связывающая активность может быть определена методом ex vivo с использованием модельного субстрата, который заменяет поверхностный белковый рецептор путем имитации его связывающего домена. Названный модельный субстрат является, в некотором варианте, меченым пептидом, полученным из вышеупомянутых рецепторных белков. В другом варианте, подходящие метки включают те, которые упомянуты в другой части описания настоящего изобретения, и, в частности, биотин.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу определения связывающей активности полипептида нейротоксина, содержащему стадии
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с меченым пептидом, посредством чего формируется комплекс, и
b) определение указанного комплекса, сформированного на стадии (а), основанное на метке, посредством которой присутствие или отсутствие комплекса, или его количество свидетельствуют о связывающей активности полипептида нейротоксина в указанном растворе.
Комплекс может быть определен на основе природы метки, которая использовалась для мечения пептида. В некотором варианте, например, биотинилированный пептид, содержащийся в комплексе, может быть определен с помощью стрептавидинового конъюгата, способного генерировать детектируемый сигнал. Присутствие, отсутствие или интенсивность будут свидетельствовать о связывающей активности полипептидов нейротоксинов в растворе или их силы.
В другом варианте способа в соответствии с настоящим изобретением, указанный способ дополнительно содержит определение протеолитической активности полипептида нейротоксина.
Термин "протеолитическая активность", применяющийся в соответствии со способом по настоящему изобретению, касается способности процессированного нейротоксина протеолитически расщеплять чувствительный к N-этилмалеимиду фактор, обеспечивающий прикрепление белков (SNARE), вовлеченных в слияние мембраны синаптического пузырька. В некотором варианте указанное расщепление является цинк-независимым. Названная протеолитическая активность может быть определена с использованием модельного субстрата, который заменяет природный SNARE-белок. Более того, при расщеплении детектируемая метка, такая как краситель, должна высвобождаться из названного модельного субстрата. В одном варианте, модельным субстратом является соединение, имеющее общую формулу Х-пара-нитроанилид, где Х - это аргинин или пептид, имеющий последовательность аргинин-Y, в которой Y представляет собой одну или более аминокислот, и в другом варианте, соединением является аргинин-пара-нитроанилид.
Таким образом, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу определения протеолитической активности нейротоксина, включающему стадии
а) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с соединением, имеющим общую формулу: Х-пара-нитроанилид, где Х является аргинином или пептидом, имеющим последовательность аргинин-Y, где Y представляет собой одну или более аминокислот, и
b) определение протеолитической активности полипептида нейротоксина в указанном растворе на основе количества высвободившегося пара-нитроанилина на стадии b), которое коррелирует с количеством полипептида нейротоксина.
В этом варианте Y представляет остаток пептида, имеющего аминокислотную последовательность, как показано любой из последовательностей SEQ ID NOs:25 или 26.
Процессированный полипептид нейротоксин, содержащийся указанной порцией раствора, может расщепляться и, таким образом, высвобождать пара-нитроанилин из оставшегося пептида. Пара-нитроанилин является красителем, хорошо известным специалистам в данной области техники. Определение протеолитической активности полипептида нейротоксина в указанном растворе основано на количестве высвобождающегося пара-нитроанилина, которое коррелирует с количеством полипептида нейротоксина.
Настоящее изобретение также относится к устройству для определения количества процессированного полипептида нейротоксина в растворе, содержащему:
а) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет проводить стадии a)-е) вышеупомянутых способов; и
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы в соответствии с а).
Термин "устройство", применяющийся в настоящем изобретении, касается системы, содержащей по меньшей мере вышеуказанную установку и средства, операционно связанные друг с другом, чтобы делать возможным определение. В некотором варианте, система может представлять собой твердую подложку с иммобилизованными антителами захвата, как упомянуто выше, которые могут находиться в физически разделенных пробирках, чтобы позволить отдельное контактирование с первой и второй порцией раствора. Более того, устройство может содержать, в некотором варианте, блок для определения количества комплексов обнаружения. В зависимости от вида используемых антител обнаружения, такой блок будет содержать детектор для сигналов, генерируемых антителом обнаружения. Кроме того, блок может также содержать, в некотором варианте, средства для калибровки, например, алгоритм, основанный на компьютере, для сравнения измеряемых сигналов с калибровочными стандартами, чтобы определять количество полипептидов нейротоксинов, присутствующих в растворе или в его порциях. Устройство будет также содержать средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количества первого и второго комплексов обнаружения, например, компьютерный алгоритм для проведения вычисления.
Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, подходящему для проведения вышеуказанных способов, причем указанный набор содержит:
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет проведение стадий от а) до е) вышеупомянутых способов;
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы в соответствии с а); и
с) инструкции для проведения указанного способа.
Термин "набор", используемый в настоящем изобретении, относится к набору вышеупомянутых средств или реактивов в соответствии с настоящим изобретением, которые могут быть упакованы вместе или по отдельности. Компоненты набора могут содержать отдельные ампулы (то есть как набор отдельных частей) или поставляться в виде единственной ампулы. Кроме того, следует понимать, что набор в соответствии с настоящим изобретением предназначен для осуществления способов, упомянутых в описании настоящего изобретения, приведенном выше. В одном варианте предусматривается, что все компоненты поставляются в состоянии, готовом для осуществления вышеупомянутых способов. В другом варианте, набор содержит инструкции для того, чтобы выполнить указанные способы. Инструкции могут быть представлены в виде руководства для пользователя в бумажной или электронной форме. Например, руководство может содержать инструкции для интерпретации результатов, полученных при выполнении вышеупомянутых способов с использованием набора в соответствии с настоящим изобретением.
Все ссылки, процитированные в настоящем описании, таким образом включены посредством как в отношении их полного содержания, так и в отношении их конкретно упомянутой части.
Чертежи
Фиг.1: Схема связывания по меньшей мере одного (или более) антитела обнаружения.
Фиг.2: Схема специфического связывания второго антитела захвата с частично процессированным или непроцессированным предшественником полипептида нейротоксина и последующего связывания по меньшей мере одного (или более) антитела обнаружения.
Фиг.3: Схема определения связывающей активности полипептида нейротоксина.
Фиг.4: Схема определения протеолитической активности полипептида нейротоксина.
Claims (24)
1. Способ определения количества процессированного полипептида нейротоксина в растворе, содержащем процессированный полипептид нейротоксин и частично процессированный и/или непроцессированный полипептид нейротоксин, содержащий стадии:
a) контактирование первой порции указанного раствора с первым антителом захвата, которое специфически связывается с легкими цепями процессированных, частично процессированных и непроцессированных полипептидов нейротоксинов, при условиях, обеспечивающих связывание указанного антитела с указанным нейротоксином, с формированием, таким образом, первого антитело-содержащего комплекса,
b) контактирование первого антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, которое специфически связывается с тяжелыми цепями указанных процессированных, непроцессированных и частично процессированных полипептидов нейротоксинов в антитело-содержащем комплексе, сформированном на стадии a), посредством чего формируется первый комплекс обнаружения,
c) контактирование второй порции указанного раствора со вторым антителом захвата, которое специфически связывается с линкером указанного частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, обеспечивающих связывание указанного антитела с указанным частично процессированным или непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, второго антитело-содержащего комплекса,
d) контактирование второго антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, посредством чего формируется второй комплекс обнаружения,
e) определение количества первого и второго комплексов обнаружения, сформированных на стадии b) и стадии d), и
f) вычисление количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных на стадии e).
a) контактирование первой порции указанного раствора с первым антителом захвата, которое специфически связывается с легкими цепями процессированных, частично процессированных и непроцессированных полипептидов нейротоксинов, при условиях, обеспечивающих связывание указанного антитела с указанным нейротоксином, с формированием, таким образом, первого антитело-содержащего комплекса,
b) контактирование первого антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, которое специфически связывается с тяжелыми цепями указанных процессированных, непроцессированных и частично процессированных полипептидов нейротоксинов в антитело-содержащем комплексе, сформированном на стадии a), посредством чего формируется первый комплекс обнаружения,
c) контактирование второй порции указанного раствора со вторым антителом захвата, которое специфически связывается с линкером указанного частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, обеспечивающих связывание указанного антитела с указанным частично процессированным или непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, второго антитело-содержащего комплекса,
d) контактирование второго антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, посредством чего формируется второй комплекс обнаружения,
e) определение количества первого и второго комплексов обнаружения, сформированных на стадии b) и стадии d), и
f) вычисление количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных на стадии e).
2. Способ по п.1, в котором указанное первое антитело захвата иммобилизовано.
3. Способ по п.1, в котором указанное второе антитело захвата иммобилизовано.
4. Способ по п.1, в котором вычисление на стадии f) содержит вычитание определенного количества второго комплекса обнаружения из определенного количества первого комплекса обнаружения.
5. Способ по п.1, в котором указанное второе антитело захвата специфически связывается с пептидным эпитопом, имеющим аминокислотную последовательность, как показано любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-16.
6. Способ по п.1, в котором указанный полипептид нейротоксин выбирается из группы, состоящей из:
a) полипептида нейротоксина, как показано любой из SEQ ID NO: 17-24; и
b) полипептида нейротоксина, имеющего аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 40% идентичной аминокислотной последовательности полипептида нейротоксина согласно a).
a) полипептида нейротоксина, как показано любой из SEQ ID NO: 17-24; и
b) полипептида нейротоксина, имеющего аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 40% идентичной аминокислотной последовательности полипептида нейротоксина согласно a).
7. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно содержит определение связывающей активности полипептида нейротоксина.
8. Способ по п.7, содержащий стадии:
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с меченым пептидом, посредством чего формируется комплекс, и
b) определение указанного комплекса, сформированного на стадии (a), основанное на метке, где присутствие или отсутствие комплекса, или его количество свидетельствуют о связывающей активности полипептида нейротоксина в указанном растворе.
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с меченым пептидом, посредством чего формируется комплекс, и
b) определение указанного комплекса, сформированного на стадии (a), основанное на метке, где присутствие или отсутствие комплекса, или его количество свидетельствуют о связывающей активности полипептида нейротоксина в указанном растворе.
9. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно содержит определение протеолитической активности полипептида нейротоксина.
10. Способ по п.9, содержащий стадии:
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с соединением, имеющим общую формулу: X-пара-нитроанилид, где X является аргинином или пептидом, имеющим последовательность аргинин-Y, где Y представляет собой одну или более аминокислот, и
b) определение протеолитической активности полипептида нейротоксина в указанном растворе на основании количества высвободившегося пара-нитроанилина на стадии b), которое коррелирует с количеством полипептида нейротоксина.
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с соединением, имеющим общую формулу: X-пара-нитроанилид, где X является аргинином или пептидом, имеющим последовательность аргинин-Y, где Y представляет собой одну или более аминокислот, и
b) определение протеолитической активности полипептида нейротоксина в указанном растворе на основании количества высвободившегося пара-нитроанилина на стадии b), которое коррелирует с количеством полипептида нейротоксина.
11. Способ определения количества процессированного (активного) полипептида нейротоксина в растворе, содержащем процессированный полипептид нейротоксин и частично процессированный и/или непроцессированный полипептид нейротоксин, содержащий стадии:
a) контактирование первой порции указанного раствора с первым антителом захвата, которое специфически связывается с тяжелыми цепями зрелого полипептида нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание указанного антитела с указанным зрелым нейротоксином, частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, первого антитело-содержащего комплекса,
b) контактирование первого антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, которое специфически связывается с легкой цепью указанного зрелого нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина в антитело-содержащем комплексе, сформированном на стадии a), посредством чего формируется первый комплекс обнаружения,
c) контактирование второй порции указанного раствора со вторым антителом захвата, которое специфически связывается с линкерами указанного частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание указанного антитела с указанным частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, второго антитело-содержащего комплекса,
d) контактирование второго антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, посредством чего формируется второй комплекс обнаружения,
e) определение количества первого и второго комплексов обнаружения, сформированных на стадии b) и стадии d), и
f) вычисление количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных на стадии e).
a) контактирование первой порции указанного раствора с первым антителом захвата, которое специфически связывается с тяжелыми цепями зрелого полипептида нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание указанного антитела с указанным зрелым нейротоксином, частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, первого антитело-содержащего комплекса,
b) контактирование первого антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, которое специфически связывается с легкой цепью указанного зрелого нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина в антитело-содержащем комплексе, сформированном на стадии a), посредством чего формируется первый комплекс обнаружения,
c) контактирование второй порции указанного раствора со вторым антителом захвата, которое специфически связывается с линкерами указанного частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание указанного антитела с указанным частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, второго антитело-содержащего комплекса,
d) контактирование второго антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, посредством чего формируется второй комплекс обнаружения,
e) определение количества первого и второго комплексов обнаружения, сформированных на стадии b) и стадии d), и
f) вычисление количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных на стадии e).
12. Способ по п.11, в котором указанное первое антитело захвата иммобилизовано.
13. Способ по п.11, в котором указанное второе антитело захвата иммобилизовано.
14. Способ по п.11, в котором вычисление на стадии f) содержит вычитание определенного количества второго комплекса обнаружения из определенного количества первого комплекса обнаружения.
15. Способ по п.11, в котором указанное второе антитело захвата специфически связывается с пептидным эпитопом, имеющим аминокислотную последовательность, как показано любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-16.
16. Способ по п.11, в котором указанный полипептид нейротоксин выбирается из группы, состоящей из:
a) полипептида нейротоксина, как показано любой из SEQ ID NO: 17-24; и
b) полипептида нейротоксина, имеющего аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 40% идентичной аминокислотной последовательности полипептида нейротоксина согласно a).
a) полипептида нейротоксина, как показано любой из SEQ ID NO: 17-24; и
b) полипептида нейротоксина, имеющего аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 40% идентичной аминокислотной последовательности полипептида нейротоксина согласно a).
17. Способ по п.11, где указанный способ дополнительно содержит определение связывающей активности полипептида нейротоксина.
18. Способ по п.17, содержащий стадии:
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с меченым пептидом, посредством чего формируется комплекс, и
b) определение указанного комплекса, сформированного на стадии (a), основанное на метке, где присутствие или отсутствие комплекса, или его количество свидетельствуют о связывающей активности полипептида нейротоксина в указанном растворе.
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с меченым пептидом, посредством чего формируется комплекс, и
b) определение указанного комплекса, сформированного на стадии (a), основанное на метке, где присутствие или отсутствие комплекса, или его количество свидетельствуют о связывающей активности полипептида нейротоксина в указанном растворе.
19. Способ по п.11, где указанный способ дополнительно содержит определение протеолитической активности полипептида нейротоксина.
20. Способ по п.19, содержащий стадии:
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с соединением, имеющим общую формулу: X-пара-нитроанилид, где X является аргинином или пептидом, имеющим последовательность аргинин-Y, где Y представляет собой одну или более аминокислот, и
b) определение протеолитической активности полипептида нейротоксина в указанном растворе на основании количества высвободившегося пара-нитроанилина на стадии b), которое коррелирует с количеством полипептида нейротоксина.
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с соединением, имеющим общую формулу: X-пара-нитроанилид, где X является аргинином или пептидом, имеющим последовательность аргинин-Y, где Y представляет собой одну или более аминокислот, и
b) определение протеолитической активности полипептида нейротоксина в указанном растворе на основании количества высвободившегося пара-нитроанилина на стадии b), которое коррелирует с количеством полипептида нейротоксина.
21. Устройство для определения количества процессированного полипептида нейротоксина в растворе, содержащее:
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет проводить стадии a)-e) способов по любому из пп.1-10; и
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы согласно a).
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет проводить стадии a)-e) способов по любому из пп.1-10; и
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы согласно a).
22. Устройство для определения количества процессированного полипептида нейротоксина в растворе, содержащее:
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет проводить стадии a)-e) способов по любому из пп.11-20; и
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы согласно a).
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет проводить стадии a)-e) способов по любому из пп.11-20; и
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы согласно a).
23. Набор, подходящий для осуществления способа по любому из пп.1-10, где указанный набор содержит:
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет осуществление стадий a)-e) способов по любому из пп.1-10;
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы в соответствии с a); и
c) инструкции для осуществления указанного способа.
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет осуществление стадий a)-e) способов по любому из пп.1-10;
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы в соответствии с a); и
c) инструкции для осуществления указанного способа.
24. Набор, подходящий для осуществления способа по любому из пп.11-20, где указанный набор содержит:
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет осуществление стадий a)-e) способов по любому из пп.11-20;
b) средства для расчета количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы в соответствии с a); и
c) инструкции для осуществления указанного способа.
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет осуществление стадий a)-e) способов по любому из пп.11-20;
b) средства для расчета количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы в соответствии с a); и
c) инструкции для осуществления указанного способа.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21465009P | 2009-04-27 | 2009-04-27 | |
| EP09158788 | 2009-04-27 | ||
| EP09158788.1 | 2009-04-27 | ||
| US61/214,650 | 2009-04-27 | ||
| PCT/EP2010/055432 WO2010124998A1 (en) | 2009-04-27 | 2010-04-23 | Means and methods for the determination of the amount of neurotoxin polypeptide and of its catalytic and proteolytic activities |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011147994A RU2011147994A (ru) | 2013-06-10 |
| RU2545783C2 RU2545783C2 (ru) | 2015-04-10 |
| RU2545783C9 true RU2545783C9 (ru) | 2016-02-27 |
Family
ID=41066304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011147994/15A RU2545783C9 (ru) | 2009-04-27 | 2010-04-23 | Средства и способы определения количества полипептида нейротоксина и его каталитической и протеолитической активностей |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8663942B2 (ru) |
| EP (1) | EP2425251B1 (ru) |
| JP (1) | JP5689113B2 (ru) |
| KR (1) | KR101818777B1 (ru) |
| CN (1) | CN102414564B (ru) |
| AU (1) | AU2010243692B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI1015311B1 (ru) |
| CA (1) | CA2757637C (ru) |
| ES (1) | ES2647243T3 (ru) |
| IL (1) | IL215441A (ru) |
| MX (1) | MX2011011045A (ru) |
| PT (1) | PT2425251T (ru) |
| RU (1) | RU2545783C9 (ru) |
| WO (1) | WO2010124998A1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2694964C2 (ru) * | 2017-12-19 | 2019-07-19 | ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ (Росстандарт) | Способ измерений каталитической активности (каталитической концентрации) ферментов с использованием методов масс-спектрометрии и спектрофотометрии с предварительной идентификацией целевого аналита и определением чистоты веществ |
| RU2788039C2 (ru) * | 2017-07-27 | 2023-01-16 | Ипсен Биофарм Лимитед | Лечение спастичности нижних конечностей |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2603518B1 (en) * | 2010-08-11 | 2015-06-17 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Selective manufacture of recombinant neurotoxin polypeptides |
| RU2673910C2 (ru) | 2012-11-21 | 2018-12-03 | Ипсен Байоинновейшн Лимитед | Способ производства протеолитически процессированного полипептида |
| ES2699432T3 (es) * | 2013-06-28 | 2019-02-11 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Medios y métodos para la determinación de la actividad biológica de polipéptidos de neurotoxinas en células |
| WO2016079310A1 (en) | 2014-11-21 | 2016-05-26 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Methods for the determination of the biological activities of neurotoxin polypeptides |
| JP7394767B2 (ja) | 2018-01-12 | 2023-12-08 | ジェンザイム・コーポレーション | ポリペプチドの定量化方法 |
| EP4134133A1 (en) * | 2018-07-31 | 2023-02-15 | Snoretox Pty Ltd | Pegylated tetanus neurotoxins and treatment of hypotonia |
| US20220160874A1 (en) * | 2019-04-03 | 2022-05-26 | Technical University Of Denmark | Neurotrophic factor protein conjugates and related embodiments |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002023195A2 (en) * | 2000-09-15 | 2002-03-21 | U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases | Method for detecting clostridium botulinum neurotoxin serotypes a, b, e and f in a sample |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4208479A (en) * | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
| WO1991002756A1 (en) * | 1989-08-16 | 1991-03-07 | Cetus Corporation | Prohormone cleavage site blocking antibody |
| GB9411138D0 (en) * | 1994-06-03 | 1994-07-27 | Microbiological Res Authority | Toxin assay |
| KR100876060B1 (ko) * | 1999-08-25 | 2008-12-26 | 알러간, 인코포레이티드 | 활성화가능한 재조합 신경독 |
| US20060063221A1 (en) * | 2004-09-21 | 2006-03-23 | Williams Dudley J | Lanthanide-based substrates and methods for determining clostridial toxin activity |
| US7332567B2 (en) * | 2001-08-28 | 2008-02-19 | Allergan, Inc. | Fret protease assays for clostridial toxins |
| WO2005076785A2 (en) * | 2003-12-19 | 2005-08-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method and compositions for detecting botulinum neurotoxin |
| FR2869908B1 (fr) * | 2004-05-05 | 2006-07-28 | Pharmaleads | Substrat peptidique reconnu par la toxine botulique de type a, bont/a et son utilisation pour detecter et/ou doser ladite toxine ou des inhibiteurs de son activite |
| EP2164861A1 (en) * | 2007-06-01 | 2010-03-24 | Merz Pharma GmbH & Co.KGaA | Process for providing a temperature - stable muscle relaxant on the basis of the neurotoxic component of botulinum toxin |
| WO2008157374A1 (en) * | 2007-06-13 | 2008-12-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretrary Of Agriculture | High-affinity monoclonal antibodies for botulinum toxin type a |
| US8486422B2 (en) * | 2007-07-26 | 2013-07-16 | Allergan, Inc. | Methods of activating clostridial toxins |
| CN101386648B (zh) * | 2008-09-25 | 2012-05-30 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 抗b型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体、其制备方法及用途 |
| BRPI1008885B1 (pt) * | 2009-02-19 | 2021-09-28 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Método para obter uma solução purificada de polipeptídeos de neurotoxina processados e composição |
-
2010
- 2010-04-23 CA CA2757637A patent/CA2757637C/en active Active
- 2010-04-23 CN CN201080018544.0A patent/CN102414564B/zh active Active
- 2010-04-23 RU RU2011147994/15A patent/RU2545783C9/ru active
- 2010-04-23 US US13/138,948 patent/US8663942B2/en active Active
- 2010-04-23 KR KR1020117028244A patent/KR101818777B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2010-04-23 EP EP10714037.8A patent/EP2425251B1/en active Active
- 2010-04-23 MX MX2011011045A patent/MX2011011045A/es active IP Right Grant
- 2010-04-23 BR BRPI1015311-0A patent/BRPI1015311B1/pt active IP Right Grant
- 2010-04-23 WO PCT/EP2010/055432 patent/WO2010124998A1/en not_active Ceased
- 2010-04-23 AU AU2010243692A patent/AU2010243692B2/en not_active Ceased
- 2010-04-23 ES ES10714037.8T patent/ES2647243T3/es active Active
- 2010-04-23 JP JP2012506517A patent/JP5689113B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-04-23 PT PT107140378T patent/PT2425251T/pt unknown
-
2011
- 2011-09-27 IL IL215441A patent/IL215441A/en active IP Right Grant
-
2014
- 2014-01-16 US US14/157,046 patent/US20140134643A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002023195A2 (en) * | 2000-09-15 | 2002-03-21 | U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases | Method for detecting clostridium botulinum neurotoxin serotypes a, b, e and f in a sample |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JONES R.G.A. et al. Development of improved SNAP25 endopeptidase immunо-assays for botulinum type A and E toxins. Journal of Immunological Methods. 2008 Jan 1; 329 (1-2): 92-101. ВЕРТИЕВ Ю.В. и др. Эффективная экспрессия в клетках Е. Coli фрагментов гена ботулинического нейротоксина типа А, кодирующих L-цепь и Н-цепь, с образованием продуктов, вызывающих протективный иммунитет к введению токсина. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2000; 4: 3-6. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2788039C2 (ru) * | 2017-07-27 | 2023-01-16 | Ипсен Биофарм Лимитед | Лечение спастичности нижних конечностей |
| RU2694964C2 (ru) * | 2017-12-19 | 2019-07-19 | ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ (Росстандарт) | Способ измерений каталитической активности (каталитической концентрации) ферментов с использованием методов масс-спектрометрии и спектрофотометрии с предварительной идентификацией целевого аналита и определением чистоты веществ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2647243T3 (es) | 2017-12-20 |
| PT2425251T (pt) | 2017-11-27 |
| EP2425251A1 (en) | 2012-03-07 |
| IL215441A0 (en) | 2011-12-29 |
| BRPI1015311B1 (pt) | 2024-01-09 |
| WO2010124998A1 (en) | 2010-11-04 |
| JP2012525563A (ja) | 2012-10-22 |
| US20120142024A1 (en) | 2012-06-07 |
| RU2011147994A (ru) | 2013-06-10 |
| CN102414564B (zh) | 2015-01-21 |
| MX2011011045A (es) | 2011-11-04 |
| BRPI1015311A2 (pt) | 2016-04-19 |
| KR101818777B1 (ko) | 2018-01-15 |
| IL215441A (en) | 2015-04-30 |
| AU2010243692A1 (en) | 2011-10-27 |
| HK1169171A1 (en) | 2013-01-18 |
| CA2757637C (en) | 2017-10-24 |
| JP5689113B2 (ja) | 2015-03-25 |
| US20140134643A1 (en) | 2014-05-15 |
| US8663942B2 (en) | 2014-03-04 |
| KR20120005041A (ko) | 2012-01-13 |
| CA2757637A1 (en) | 2010-11-04 |
| RU2545783C2 (ru) | 2015-04-10 |
| CN102414564A (zh) | 2012-04-11 |
| EP2425251B1 (en) | 2017-10-25 |
| AU2010243692B2 (en) | 2015-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2545783C9 (ru) | Средства и способы определения количества полипептида нейротоксина и его каталитической и протеолитической активностей | |
| JP7656571B2 (ja) | 細胞性ｖａｍｐ切断アッセイ | |
| US6337386B1 (en) | Toxin Assay | |
| von Berg et al. | Functional detection of botulinum neurotoxin serotypes A to F by monoclonal neoepitope-specific antibodies and suspension array technology | |
| US9213026B2 (en) | System for determining unprocessed and partially processed neurotoxin type A | |
| US8936915B2 (en) | Cleavage sensitive antibodies and methods of use thereof | |
| HK1169171B (en) | Means and methods for the determination of the amount of neurotoxin polypeptide and of its catalytic and proteolytic activities | |
| RU2807994C2 (ru) | Анализ расщепления клеточного vamp | |
| HK1173493B (en) | System for determining unprocessed and partially processed neurotoxin a polypeptide | |
| HK40008973B (zh) | 细胞vamp切割测定 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Reissue of patent specification |