RU2439156C2 - Method of obtaining ribonucleic acid - Google Patents
Method of obtaining ribonucleic acid Download PDFInfo
- Publication number
- RU2439156C2 RU2439156C2 RU2009143035/10A RU2009143035A RU2439156C2 RU 2439156 C2 RU2439156 C2 RU 2439156C2 RU 2009143035/10 A RU2009143035/10 A RU 2009143035/10A RU 2009143035 A RU2009143035 A RU 2009143035A RU 2439156 C2 RU2439156 C2 RU 2439156C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- rna
- parts
- solution containing
- units
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title claims description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 12
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 6
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- -1 ribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 11
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 11
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N iron oxide Inorganic materials [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной генетике, и может найти применение в диагностике и терапии бактериальных и вирусных инфекций.The invention relates to medicine, namely to molecular genetics, and may find application in the diagnosis and treatment of bacterial and viral infections.
В клетках живых организмов рибонуклеиновая кислота (РНК) выполняет исключительно важную роль посредника в передаче генетической информации от ДНК к белку. На матрице геномной ДНК клеточные РНК-полимеразы синтезируют информационную РНК, которая в свою очередь является матрицей для синтеза молекулы белка на рибосомах. Так осуществляется синтез РНК in vivo. Большим достижением молекулярной генетики является разработка системы синтеза РНК in vitro, которая позволяет получать в препаративных количествах информационную РНК индивидуальных генов. В основе получения РНК in vitro лежит способность очищенных РНК-полимераз бактериофагов Т3, Т7 и SP6 синтезировать индивидуальную РНК на матрице рекомбинантной ДНК, содержащей промотор полимеразы и клонированный ген [Anal. Biochem., 1991, v.195, 207-213]. Метод получения РНК in vitro лег в основу создания высокочувствительных способов диагностики бактериальных и вирусных инфекции, таких как NASBA (nucleic acid-based amplification) [Anal. Biochem., 1991, v.195, 207-213] и ТМА (transcription-mediated amplification) [Hepatology, 2006, v.44, 360-367].In the cells of living organisms, ribonucleic acid (RNA) plays an extremely important role as a mediator in the transfer of genetic information from DNA to protein. On a genomic DNA matrix, cellular RNA polymerases synthesize messenger RNA, which in turn is a matrix for the synthesis of a protein molecule on ribosomes. So is the synthesis of RNA in vivo. A great achievement of molecular genetics is the development of an in vitro RNA synthesis system that allows the preparation of informational RNA of individual genes in preparative quantities. In vitro RNA production is based on the ability of purified RNA polymerases of bacteriophages T3, T7 and SP6 to synthesize individual RNA on a recombinant DNA matrix containing the polymerase promoter and the cloned gene [Anal. Biochem., 1991, v. 195, 207-213]. The in vitro method of obtaining RNA formed the basis for the creation of highly sensitive methods for the diagnosis of bacterial and viral infections, such as NASBA (nucleic acid-based amplification) [Anal. Biochem., 1991, v. 195, 207-213] and TMA (transcription-mediated amplification) [Hepatology, 2006, v. 44, 360-367].
В настоящее время получение РНК in vitro осуществляют как с помощью стандартных лабораторных методик [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3d Edition. 2001. CSHL Press], так и с помощью коммерческих наборов, таких как MEGAscript (Ambion), Riboprobe (Promega), MiniV (Epicentre), HiScrine (New England Biolabs) и других, в состав которых входит стандартный набор реагентов: реакционный буфер, смесь четырех рибонуклеотидтрифосфатов, РНК-полимераза фага Т3, или Т7, или SP6, контрольная плазмидная ДНК, а также фермент ДНКаза 1 для удаления плазмидной ДНК из конечной реакционной смеси, содержащей синтезированную in vitro РНК. Общим недостатком всех известных на сегодняшний день способов получения РНК in vitro является необходимость удаления ДНК по окончании реакции, поскольку ДНК мешает последующему использованию полученной РНК. Для удаления ДНК применяют ферментативную обработку смеси ДНКазой 1 с последующей термической инактивацией ДНКазы 1 при +60°С или удалением ДНКазы 1 из реакционной смеси экстракцией ее смесью фенола и хлороформа 1:1. Оба способа инактивации ДНКазы 1 усложняют процедуру получения РНК и делают ее достаточно продолжительной. Кроме того, любая термическая обработка крайне нежелательна РНК, так как она является термолабильным веществом. Экстракция ДНКазы 1 смесью фенола и хлороформа приводит к уменьшению выхода РНК из-за ее потерь в органическом и промежуточном слоях. При этом даже малейшие примеси фермента РНКазы в препаратах в коммерческих препаратах ДНКазы 1, используемых для этой цели, приводят к частичной деградации полученной РНК, что существенно снижает ее качество.Currently, in vitro RNA production is carried out using standard laboratory techniques [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3 d Edition. 2001. CSHL Press], and using commercial kits such as MEGAscript (Ambion), Riboprobe (Promega), MiniV (Epicentre), HiScrine (New England Biolabs) and others, which include a standard set of reagents: reaction buffer, a mixture of four ribonucleotide triphosphates, RNA polymerase of phage T3, or T7, or SP6, a control plasmid DNA, and a
В качестве прототипа нами выбран способ получения РНК с помощью лабораторной методики [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3d Edition. 2001. CSHL Press]. Способ заключается в том, что к 1 мкл водного раствора, содержащего 1 мг/мл плазмидной ДНК, добавляют 10 мкл воды, 1 мкл буферного раствора с рН 7,5, 2 мкл 0,005 М раствора рибонуклеотидтрифосфатов, 2 мкл 0,1 М раствора дитиотреитола, 1 мкл раствора, содержащего 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1 мкл раствора, содержащего 10 единиц ингибитора РНКазы и 1 мкл раствора, содержащего 10 единиц РНК-полимеразы бактериофага Т3, или Т7, или SP6, после чего инкубируют полученную смесь 1 час при температуре +37°С. По окончании инкубации в смесь добавляют 1 мкл раствора, содержащего 10 мг/мл ДНКазы 1, инкубируют 15 мин при температуре +37°С, затем добавляют 100 мкл воды и 120 мкл смеси фенола и хлороформа 1:1 и полученную суспензию экстрагируют, после чего водную и органическую фазы разделяют центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин. Водную фазу декантируют и РНК из водной фазы осаждают добавлением 30 мкл 10 М раствора ацетата аммония и 250 мкл этанола и последующей инкубацией смеси во льду в течение 30 минут, после чего осадок РНК собирают центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин. Осадок РНК растворяют в 100 мкл воды и таким образом получат раствор искомой РНК в очищенном виде.As a prototype, we have chosen a method for producing RNA using a laboratory technique [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3 d Edition. 2001. CSHL Press]. The method consists in the fact that to 1 μl of an aqueous solution containing 1 mg / ml of plasmid DNA, add 10 μl of water, 1 μl of a buffer solution with a pH of 7.5, 2 μl of a 0.005 M solution of ribonucleotide triphosphates, 2 μl of a 0.1 M solution of dithiothreitol , 1 μl of a solution containing 2 mg / ml bovine serum albumin, 1 μl of a solution containing 10 units of an RNase inhibitor and 1 μl of a solution containing 10 units of RNA polymerase of the bacteriophage T3, or T7, or SP6, after which the resulting mixture is incubated for 1 hour at a temperature of + 37 ° C. At the end of the incubation, 1 μl of a solution containing 10 mg /
Прототип представляет, таким образом, сложный и длительный процесс получения РНК, пригодной для молекулярно-биологических целей. В частности, для очистки РНК используют обработку реакционной смеси ферментом ДНКазой 1 для удаления плазмидной ДНК с последующим удалением этого фермента из реакционной смеси экстракцией смесью фенола и хлороформа, осаждением полученной РНК, центрифугированием и растворением ее в воде. Все это значительно усложняет способ получения РНК и удлиняет его.The prototype is, therefore, a complex and lengthy process for producing RNA suitable for molecular biological purposes. In particular, RNA purification uses the treatment of the reaction mixture with
Технический результат настоящего изобретения состоит в упрощении и ускорении получения РНК за счет иммобилизации плазмидной ДНК на суперпарамагнитных частицах магнетита и последующего удаления связанной ДНК посредством воздействия магнитного поля.The technical result of the present invention is to simplify and accelerate the production of RNA by immobilizing plasmid DNA on superparamagnetic particles of magnetite and subsequent removal of the bound DNA by means of a magnetic field.
Этот результат достигается тем, что в известном способе получения РНК, включающем добавление к 1 части водного раствора, содержащего 1 мг/мл плазмидной ДНК, 10 частей воды и 1 части буферного раствора с рН 7,5, 2 частей 0,005 М раствора рибонуклеотидтрифосфатов, 2 частей 0,1 М раствора дитиотреитола, 1 части раствора, содержащего 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1 части раствора, содержащего 10 единиц ингибитора РНКазы, 1 части раствора, содержащего 10 единиц РНК-полимеразы бактериофага Т3, или Т7, или SP6, и последующую инкубацию реакционной смеси не менее 1 часа при температуре +37°С, согласно изобретению перед добавление буферного раствора с рН 7,5 к водному раствору плазмидной ДНК добавляют 1 часть суспензии, содержащей 4 г/мл суперпарамагнитных частиц магнетита, а после инкубации реакционную смесь помещают в магнитное поле напряженностью не менее 0,2 Тл на 1-3 минуты, после чего декантируют водную фазу, которая содержит искомую РНК.This result is achieved by the fact that in the known method of producing RNA, comprising adding to 1 part of an aqueous solution containing 1 mg / ml plasmid DNA, 10 parts of water and 1 part of a buffer solution with a pH of 7.5, 2 parts of a 0.005 M solution of ribonucleotide triphosphates, 2 parts of a 0.1 M solution of dithiothreitol, 1 part of a solution containing 2 mg / ml bovine serum albumin, 1 part of a solution containing 10 units of an RNase inhibitor, 1 part of a solution containing 10 units of RNA polymerase of the bacteriophage T3, or T7, or SP6, and subsequent incubation of the reaction mixture n less than 1 hour at a temperature of + 37 ° C, according to the invention, before adding a buffer solution with a pH of 7.5 to the aqueous solution of plasmid DNA add 1 part of a suspension containing 4 g / ml of superparamagnetic magnetite particles, and after incubation, the reaction mixture is placed in a magnetic field of intensity not less than 0.2 T for 1-3 minutes, after which the aqueous phase that contains the desired RNA is decanted.
Целесообразно в качестве буферного раствора с рН 7,5 использовать раствор, содержащий 0,4 М Трис (2-Амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол), 0,06 М хлористого магния, 0,05 М хлористого натрия, 0,02 М спермидина.It is advisable as a buffer solution with a pH of 7.5 to use a solution containing 0.4 M Tris (2-amino-2- (hydroxymethyl) -1,3-propanediol), 0.06 M magnesium chloride, 0.05 M sodium chloride , 0.02 M spermidine.
Добавление суперпарамагнитных частиц магнетита к водному раствору плазмидной ДНК обеспечивает быстрое и эффективное связывание ее суперпарамагнитными частицами, в результате чего она сохраняет свои функциональные свойства, а именно - способность синтеза РНК. Поскольку плазмидная ДНК оказывается в связанном с суперпарамагнитными частицами состоянии, это дает возможность при последующем подведении к реакционной смеси магнитного поля быстро и полностью удалить ее из смеси. Это в свою очередь позволяет исключить из схемы получения РНК стадию ферментативной обработки смеси ДНКазной 1 с последующим ее удалением из реакционной смеси экстракцией смесью фенола и хлороформа. Все это значительно упрощает и сокращает процедуру получения РНК.Adding superparamagnetic particles of magnetite to an aqueous solution of plasmid DNA provides fast and efficient binding of its superparamagnetic particles, as a result of which it retains its functional properties, namely, the ability of RNA synthesis. Since plasmid DNA is in a state bound to superparamagnetic particles, this makes it possible to quickly and completely remove it from the mixture upon subsequent addition of a magnetic field to the reaction mixture. This, in turn, makes it possible to exclude from the RNA preparation scheme the stage of enzymatic treatment of the
Полученная таким образом РНК обладает высоким качеством и пригодна, как нами показано, для молекулярно-биологических исследований структуры и функций генов, а также в медицинской практике для диагностических и терапевтических целей.The RNA thus obtained is of high quality and is suitable, as we have shown, for molecular biological studies of the structure and functions of genes, as well as in medical practice for diagnostic and therapeutic purposes.
Сущность способа поясняется примеромThe essence of the method is illustrated by example.
ПримерExample
К 1 мкл водного раствора, содержащего 1 мкг плазмидной ДНК pTRI-Xef (Ambion), содержащей вставку кДНК фактора элонгации 1 из X. leavis размером 1700 пар оснований, добавляют 10 мкл воды и 1 мкл суспензии (4 г/мл) суперпарамагнитных частиц магнетита Fе3O4 [Fе2О3*FeO] размером 10-300 нм и встряхивают в течение 1-2 минут при температуре +20°С, после чего к смеси добавляют 1 мкл буферного раствора с рН 7,5 состава 0,4 М Трис (2-Амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол), 0,06 М хлористого магния, 0,05 М хлористого натрия, 0,02 М спермидина, 2 мкл 0,005 М раствора рибонуклеотидтрифосфатов, 2 мкл 0,1 М раствора дитиотреитола, 1 мкл раствора, содержащего 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1 мкл раствора, содержащего 10 единиц ингибитора РНКазы, 1 мкл раствора, содержащего 10 единиц РНК-полимеразы бактериофага Т3, или Т7, или SP6, и инкубируют 1 час при температуре +37°С. По окончании инкубации смесь помещают в магнитное поле напряженностью 0,4 Тл на 3 минуты, после чего водную фазу декантируют и определяют качество полученной РНК. Для этого проводят электрофорез аликвоты раствора в 1% агарозном геле (NuSieve GTG, FMC), содержащем стандартный трис-боратный буфер и 0,03 мг/мл бромистого этидия. Электрофорез проводят в течение 1 часа при постоянном напряжении 10 В/см. Затем осуществляют фотодокументацию и анализ геля в проходящем ультафиолетовом свете с длиной волны 312 нм (трансиллюминатор ЕСХ-15.М, Vibler Lourmat) с помощью цифровой системы EDAS 290 и программы 1D Image Analysis version 3.5 (Kodak Digital Science). Результаты представлены на чертеже, из которого видно, что количество и электрофоретический профиль РНК, полученной с использованием контрольной плазмидной ДНК pTRI-Xef (Ambion) в растворе (дорожка 1), и профиль РНК, полученной предлагаемым нами способом (дорожка 2), не отличаются, что свидетельствует о высоком качестве полученной РНК. Таким образом, полученная нами РНК пригодна для молекулярно-биологических исследований структуры и функций генов, а также в медицинской практике для диагностических и терапевтических целей.To 1 μl of an aqueous solution containing 1 μg of pTRI-Xef plasmid DNA (Ambion) containing an insertion of the
Предлагаемый способ получения РНК по сравнению с известными имеет ряд существенных преимуществ.The proposed method for producing RNA in comparison with the known has several significant advantages.
1. Упрощает и ускоряет процедуру за счет иммобилизации плазмидной ДНК на суперпарамагнитных частицах магнетита и последующего удаления связанной ДНК посредством воздействия магнитного поля и таким образом исключения при очистке стадии РНК обработки реакционной смеси ферментом ДНКазной 1 и последующего удаления этого фермента из реакционной смеси экстракцией смесью фенола и хлороформа.1. Simplifies and accelerates the procedure by immobilizing plasmid DNA on superparamagnetic magnetite particles and subsequent removal of the bound DNA by means of a magnetic field and thus eliminating the purification of the RNA stage by treatment of the reaction mixture with
2. Обеспечивает высокое качество получаемой РНК.2. Provides high quality RNA obtained.
Способ разработан в лаборатории генной инженерии ФГУ «РНЦРХТ». Получаемая РНК используется в дальнейшем для наработки РНК-стандарта при молекулярной диагностике гепатита С методом полимеразной цепной реакции с положительным результатом.The method was developed in the laboratory of genetic engineering of FGU "RSCRHT". The resulting RNA is used in the future to produce the RNA standard for the molecular diagnosis of hepatitis C by polymerase chain reaction with a positive result.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009143035/10A RU2439156C2 (en) | 2009-11-24 | 2009-11-24 | Method of obtaining ribonucleic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009143035/10A RU2439156C2 (en) | 2009-11-24 | 2009-11-24 | Method of obtaining ribonucleic acid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009143035A RU2009143035A (en) | 2011-05-27 |
| RU2439156C2 true RU2439156C2 (en) | 2012-01-10 |
Family
ID=44734507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009143035/10A RU2439156C2 (en) | 2009-11-24 | 2009-11-24 | Method of obtaining ribonucleic acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2439156C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2555551C2 (en) * | 2013-03-18 | 2015-07-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" | Method of extracting dna from blood cells |
| RU2777282C2 (en) * | 2017-10-11 | 2022-08-02 | Гринлайт Байосайенсис, Инк. | Methods and compositions for the production of nucleoside triphosphate and ribonucleic acid |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070148651A1 (en) * | 2003-12-12 | 2007-06-28 | Uwe Michelsen | Method and kit for the isolation of rna |
-
2009
- 2009-11-24 RU RU2009143035/10A patent/RU2439156C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070148651A1 (en) * | 2003-12-12 | 2007-06-28 | Uwe Michelsen | Method and kit for the isolation of rna |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SAMBROOK J. ет al. Molecular Cloning // A Laboratory Manual (Third Edition)", 2001, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory press. BERENSMEIER S. ет al. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids // Appi Microbiol Biotechnol, 2006, v. 73, p.495-504. PALADICHUK A. et al. Isolating RNA: Pure and simple", 1999, The scientist 13[16]:20, найдено в интернете по адресу <URL: http://mcbl.iisc.ernet.in/Welcome%20to%20MCBL/Facultv/Parag/microarray%20workshop%20details/RNA%20isolation%20Kits.html. 21.07.2010. * |
| ПЕРШИНА А.Г. и др. Наноразмерный оксид олова - эффективный сорбент нуклеиновых кислот // Инновации РАН-2009. Материалы ежегодной научно-практической конференции. - 2009, стр.431-437. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2555551C2 (en) * | 2013-03-18 | 2015-07-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" | Method of extracting dna from blood cells |
| RU2777282C2 (en) * | 2017-10-11 | 2022-08-02 | Гринлайт Байосайенсис, Инк. | Methods and compositions for the production of nucleoside triphosphate and ribonucleic acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009143035A (en) | 2011-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10858647B2 (en) | Removal of DNA fragments in mRNA production process | |
| Henderson et al. | Cap 1 messenger RNA synthesis with co‐transcriptional cleancap® analog by in vitro transcription | |
| US10711315B2 (en) | Method for producing RNA | |
| Wang et al. | A synthetic molecular system capable of mirror-image genetic replication and transcription | |
| ES2470621T3 (en) | Procedure to obtain short RNA as well as kit for it | |
| DK2588609T3 (en) | METHOD AND KIT FOR SEQUENTIAL ISOLATION OF NUCLEOTIDE SPECIES FROM A SAMPLE | |
| US20160032273A1 (en) | Characterization of mrna molecules | |
| CN120082614A (en) | Enzymatic RNA capping method | |
| US20030022230A1 (en) | Molecule assigning genotype to phenotype and use thereof | |
| CN112888794A (en) | Compositions, methods and systems for processing or analyzing a multi-species nucleic acid sample | |
| JP2002539801A (en) | Detection of mutations in genes by specific LNA primers | |
| WO2013118878A1 (en) | Cyclic rna and protein production method | |
| Hertler et al. | Synthesis of point-modified mRNA | |
| CA3114892A1 (en) | Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed rna | |
| US4401759A (en) | Detection and isolation of glucagon mRNA using a synthetic oligodeoxynucleotide | |
| JP5733784B2 (en) | Efficient synthesis of cDNA / mRNA-protein conjugates | |
| RU2439156C2 (en) | Method of obtaining ribonucleic acid | |
| CN119677859A (en) | Capped RNA and method for producing the same, device for producing protein, and method for producing protein | |
| CN116375781A (en) | A kind of cap analogue modified by TNA and its preparation method and application | |
| CN103293314A (en) | Method for separating and identifying nucleotidyl modified protein | |
| JP6781883B2 (en) | Aptamer selection method | |
| RU2422532C2 (en) | Method of recovery low-molecular nuclear ribonucleoproteids (rnp) from tissues and organs of mammals | |
| Gaston et al. | OXOPAP assay: for selective amplification of aminoacylated tRNAs from total cellular fractions | |
| WO2024116901A1 (en) | Gene analysis method | |
| Jagga | Structural and Mechanistic Basis for Nucleocytoplasmic Shuttling of SOX Transcription Factors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151125 |