RU2437937C1 - СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ БАКТЕРИЙ Escherichia coli ПО ДЕТЕКТИРОВАНИЮ ИХ ФРАГМЕНТОВ С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ - Google Patents
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ БАКТЕРИЙ Escherichia coli ПО ДЕТЕКТИРОВАНИЮ ИХ ФРАГМЕНТОВ С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2437937C1 RU2437937C1 RU2010116544/10A RU2010116544A RU2437937C1 RU 2437937 C1 RU2437937 C1 RU 2437937C1 RU 2010116544/10 A RU2010116544/10 A RU 2010116544/10A RU 2010116544 A RU2010116544 A RU 2010116544A RU 2437937 C1 RU2437937 C1 RU 2437937C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fragments
- washing
- escherichia coli
- bound
- detecting
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 abstract description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 3
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 3
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 2
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000000572 ellipsometry Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000009774 resonance method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения наличия бактерий Escherichia coli. Способ включает специфическую иммобилизацию фрагментов указанных бактерий из раствора на аффинную поверхность, состоящую из слоя белка G с нанесенным на него слоем антител, специфичных к выявляемым бактериальным клеткам. Осуществляют двухэтапную промывку образца от неспецифически связавшегося материала, включающую в себя промывку в буфере со значением рН 8,5-9,5 и последующую промывку деионизованной водой. Используют атомно-силовую микроскопию как инструмент визуализации связавшихся бактериальных фрагментов с возможностью прямого подсчета объема связавшегося аналита на единицу поверхности. Предложенное изобретение позволяет определять наличие сверхмалых концентраций клеток в анализируемом растворе. 1 ил.
Description
Заявленный способ определения наличия бактерий Escherichia coli no детектированию их фрагментов относится к области сенсорных технологий, направленных на обнаружение и визуализацию бактериальных клеток, а также их фрагментов. Под фрагментом бактериальной клетки понимается любая ее часть, содержащая антигенную детерминанту.
Существует ряд технических решений, близких по смыслу к предлагаемому способу: диагностическая тест-система для выявления заболевания (патент RU 2361215 С1), нанобиочип, используемый для регистрации белков и белковых комплексов, способ его получения и способ регистрации белков и белковых комплексов с использованием зондовой микроскопии (патент RU 2007117787A), способ регистрации специфических макромолекул в биологической пробе и устройство для его осуществления (патент RU 2006129865A), способ регистрации макромолекул при проведении протеомных исследованний и биочип, используемый при их регистрации (патент RU 2004119864).
Однако методы, разработанные во всех перечисленных патентах, имеют один существенный недостаток: они не описывают регистрацию или визуализацию бактериальных клеток и их фрагментов, в том числе Escherichia coli, а относятся лишь к макромолекулам (в основном к белкам и белковым комплексам) и к вирусам.
Существуют способы регистрации специфически связавшихся с аффинной поверхностью бактерий, основанные на применении методов кварцевого микробаланса, эллипсометрии, поверхностного плазменного резонанса (Lazcka О., Del Campo F.J., Munoz F.X., Biosens. Bioelectron, 2007, 22, 1205-1217; Ivnitski D., Abdel-Hamid I., Atanasov P., Wilkins E., Biosens. Bioelectron, 1999, 14, 599-624). Недостатками данных методов являются (1) высокий уровень сигнала в контрольных экспериментах, т.е. при неспецифическом связывании, (2) отсутствие возможности визуализации связавшегося аналита, которая для бактериальных клеток (и их фрагментов) означает подтверждение физического события их связывания с аффинной поверхностью, (3) невозможность детектировать единичную бактериальную клетку или часть бактериальной клетки, (4) риск обсемененности помещения и возможности заражения персонала при детектировании патогенных бактерий.
Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является определение наличия бактериальных клеток Escherichia coli и их фрагментов в растворах с малыми концентрациями с помощью атомно-силовой микроскопии. Предложенный метод позволяет определять наличие сверхмалых концентраций клеток в анализируемом растворе, в том числе детектировать связавшиеся с аффинной поверхностью фрагменты единственной бактерии. Метод одинаково чувствителен как к бактериальным клеткам целиком, так и к их фрагментам, поскольку антитела связываются с антигенной детерминантой. Время детектирования от момента экспонирования аналита к аффинной поверхности до получения результата составляет от 20 минут. Данный метод подходит для контроля качества питьевой воды и любых других жидкостей на содержание в них бактерий Escherichia coli. Поскольку данным методом можно детектировать фрагменты бактерий Escherichia coli, то это позволяет использовать для анализа раствор разрушенных бактериальных клеток, что позволяет снизить риск заражения обслуживающего персонала.
Технический результат в предлагаемом изобретении достигают следующей последовательностью действий: подготовка аффинной поверхности на основе специфических антител, экспонирование аналита к этой поверхности, двухэтапная промывка подложки, получение топографии поверхности образца с помощью атомно-силовой микроскопии. При этом экспонирование аналита к аффинной поверхности проводят в окружении буферного раствора со значением рН, и при температурах, являющихся оптимальными для специфического связывания антитела с антигеном. Существенным признаком является также двухэтапность промывки: сначала в буфере, позволяющем наиболее эффективно отмыть не специфически связавшийся материал, а затем водой, позволяющей отмыть подложку от солей.
Рассмотрим осуществление предлагаемого изобретения на примере детектирования фрагментов бактерии Escherichia coli из суспензии с концентрацией по целым клеткам 107 КОЕ/мл. В качестве контрольного эксперимента берется аналитический раствор (аналит), содержащий фрагменты бактерии Bacillus subtilis той же концентрации.
Для подготовки аффинной поверхности используется распространенный метод нанесения на поверхность слюды слоя из белка G, на который в свою очередь наносятся специфические антитела к Escherichia coli. Для увеличения адгезивных свойств слюды перед нанесением на нее белка G ее обрабатывают в тлеющем разряде в течение 60 секунд при силе тока 0,4 мА (напряжение 1,5 кВ, расстояние между электродами 5 мм, площадь электродов 0,5 см2). После нанесения слоя антител на поверхность слоя белка G подложку промывают в деионизованной воде и просушивают. Экспозицию аналита к биофункциональной поверхности проводят ее помещением сверху на небольшую каплю (20 мкл) анализируемой суспензии в буфере рН 8,5-9,5 при 37°С в течение 10 минут, после чего промывают погружением подложки в буферный раствор и ее раскачиванием на шейкере, при этом подложку жестко закрепляют в раскачиваемой системе. После этого подложку промывают деионизованной водой от солей, высушивают в струе сжатого азота и исследуют с помощью атомно-силовой микроскопии. Анализируя АСМ-изображения, производят подсчет количества связавшихся бактериальных клеток или суммарного объема связавшихся клеточных фрагментов на единицу поверхности.
На фиг.1 представлен трехмерный вид АСМ-изображений фрагментов клеток Escherichia coli, связавшихся с аффинной к ним поверхностью из суспензии концентрацией 107 КОЕ/мл (слева), а также такой же поверхности, к которой экспонировалась суспензия фрагментов клеток Bacillus subtilis той же концентрацией (справа). Размер области сканирования приведенных изображений составляет 10×10 мкм2. Анализ АСМ-изображений демонстрирует, что суммарный объем связавшихся фрагментов Escherichia coli высотой более 50 нм составляет на наблюдаемом поле 2,47×1014 нм3, тогда как эта величина для Bacillus subtilis равна нулю, т.е. в случае неспецифической пары «анитело-антиген» связывание объектов высотой более 50 нм не наблюдается вовсе.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет проводить диагностику жидкостей, в том числе пищевых, на содержание микроорганизмов, причем в случае возможно предварительно осуществлять намеренное разрушение клеток для снижения риска обсемененности помещения и заражения обслуживающего персонала. При этом чувствительность детектирования не понизится.
Claims (1)
- Способ определения наличия бактерий Escherichia coli по детектированию их фрагментов в растворе, включающий в себя специфическую иммобилизацию фрагментов указанных бактерий из раствора на аффинную поверхность, состоящую из слоя белка G с нанесенным на него слоем антител, специфичных к выявляемым бактериальным клеткам, предусматривающий двухэтапную промывку образца от неспецифически связавшегося материала, включающую в себя промывку в буфере со значением рН 8,5-9,5 и последующую промывку деионизованной водой, использование атомно-силовой микроскопии как инструмента визуализации связавшихся бактериальных фрагментов и возможностью прямого подсчета объема связавшегося аналита на единицу поверхности.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010116544/10A RU2437937C1 (ru) | 2010-04-27 | 2010-04-27 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ БАКТЕРИЙ Escherichia coli ПО ДЕТЕКТИРОВАНИЮ ИХ ФРАГМЕНТОВ С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010116544/10A RU2437937C1 (ru) | 2010-04-27 | 2010-04-27 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ БАКТЕРИЙ Escherichia coli ПО ДЕТЕКТИРОВАНИЮ ИХ ФРАГМЕНТОВ С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010116544A RU2010116544A (ru) | 2011-11-10 |
| RU2437937C1 true RU2437937C1 (ru) | 2011-12-27 |
Family
ID=44996622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010116544/10A RU2437937C1 (ru) | 2010-04-27 | 2010-04-27 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ БАКТЕРИЙ Escherichia coli ПО ДЕТЕКТИРОВАНИЮ ИХ ФРАГМЕНТОВ С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2437937C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2649763C1 (ru) * | 2017-04-10 | 2018-04-04 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ визуализации вируса гриппа |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2283496C2 (ru) * | 2004-06-30 | 2006-09-10 | Александр Иванович Арчаков | Способ регистрации макромолекул при проведении протеомных исследований и биочип, используемый при их регистрации |
| RU2351932C2 (ru) * | 2006-08-18 | 2009-04-10 | Александр Иванович Арчаков | Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии |
| RU2361215C1 (ru) * | 2007-11-14 | 2009-07-10 | Александр Иванович Арчаков | Диагностическая тест-система для выявления заболевания |
| RU2362169C2 (ru) * | 2007-05-14 | 2009-07-20 | Александр Иванович Арчаков | Нанобиочип, используемый для регистрации белков и белковых комплексов, способ его получения и способ регистрации белков и белковых комплексов с использованием зондовой микроскопии |
-
2010
- 2010-04-27 RU RU2010116544/10A patent/RU2437937C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2283496C2 (ru) * | 2004-06-30 | 2006-09-10 | Александр Иванович Арчаков | Способ регистрации макромолекул при проведении протеомных исследований и биочип, используемый при их регистрации |
| RU2351932C2 (ru) * | 2006-08-18 | 2009-04-10 | Александр Иванович Арчаков | Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии |
| RU2362169C2 (ru) * | 2007-05-14 | 2009-07-20 | Александр Иванович Арчаков | Нанобиочип, используемый для регистрации белков и белковых комплексов, способ его получения и способ регистрации белков и белковых комплексов с использованием зондовой микроскопии |
| RU2361215C1 (ru) * | 2007-11-14 | 2009-07-10 | Александр Иванович Арчаков | Диагностическая тест-система для выявления заболевания |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LAZCKA О. ЕТ AL. Pathogen detection: a perspective of traditional methods and biosensors, Biosens Bioelectron, 2007, v.22, no.7, p.1205-17. ABDEL-HAMID I. ET AL. Flow-through immunofiltration assay system for rapid detection of E. coli 0157:H7, Biosens Bioelectron. 1999, v.14, no.3, p.309-16. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2649763C1 (ru) * | 2017-04-10 | 2018-04-04 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ визуализации вируса гриппа |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010116544A (ru) | 2011-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cui et al. | An AC electrokinetic impedance immunosensor for rapid detection of tuberculosis | |
| Li et al. | AC electrokinetics-enhanced capacitive immunosensor for point-of-care serodiagnosis of infectious diseases | |
| RU2530718C2 (ru) | Устройство и способы детектирования аналитов в слюне | |
| US9568444B2 (en) | Method and apparatus for detection of a biomarker by alternating current electrokinetics | |
| JP5670423B2 (ja) | 抗凝固処理血液薄膜試料における特定の貪食作用の測定によるヒト又は動物の感染症の検出 | |
| Meyer et al. | Magnetic biosensor for the detection of Yersinia pestis | |
| JP5200003B2 (ja) | 磁場を用いた試料中の標的分子の検出 | |
| Zordan et al. | Detection of pathogenic E. coli O157: H7 by a hybrid microfluidic SPR and molecular imaging cytometry device | |
| Pulikkathodi et al. | Enumeration of circulating tumor cells and investigation of cellular responses using aptamer-immobilized AlGaN/GaN high electron mobility transistor sensor array | |
| CN105579849B (zh) | 在用于检测多聚靶分子的基于颗粒的测试中防止聚集的试剂、方法和设备 | |
| Lu et al. | A time-resolved fluorescence lateral flow immunoassay for rapid and quantitative serodiagnosis of Brucella infection in humans | |
| CN113791212B (zh) | 新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法 | |
| Cui et al. | Reagent free detection of SARS-CoV-2 using an antibody-based microwave sensor in a microfluidic platform | |
| KR101612095B1 (ko) | 바이오마커의 조기 검출 및 정밀 정량화가 가능한 바이오마커 탐지용 프로브 및 이의 용도 | |
| EP3243076B1 (en) | Methods for detecting a marker for active tuberculosis | |
| CN101528942A (zh) | 用于检测污染物的方法及系统 | |
| Neyama et al. | Batteryless wireless magnetostrictive Fe30Co70/Ni clad plate for human coronavirus 229E detection | |
| Qi et al. | Phage M13KO7 detection with biosensor based on imaging ellipsometry and AFM microscopic confirmation | |
| Bahrami et al. | Antibody functionalized capacitance sensor for label-free and real-time detection of bacteria and antibiotic susceptibility | |
| Beisenova et al. | Machine-learning-aided multiplexed nanoplasmonic biosensor for COVID-19 population immunity profiling | |
| Zhang et al. | Rapid detection of SARS-CoV-2 spike RBD protein in body fluid: based on special calcium ion-mediated gold nanoparticles modified by bromide ions | |
| Kwatra et al. | Correlation of dried blood spots and plasma for quantification of Immunoglobulin (IgG) against Receptor binding domain and full length spike protein of SARS-CoV-2 | |
| RU2437937C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ БАКТЕРИЙ Escherichia coli ПО ДЕТЕКТИРОВАНИЮ ИХ ФРАГМЕНТОВ С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ | |
| Basso et al. | A immunosensor for the diagnosis of canine distemper virus infection using SPR and EIS | |
| Wu et al. | Simple, fast and highly sensitive detection of gram-negative bacteria by A novel electrical biosensor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20131017 |
|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -PC4A- IN JOURNAL: 5-2014 |