RU2426791C2

RU2426791C2 - Method of producing steroid derivatives by oxasteroid reduction or hydroxysteroid oxidation with using hydroxysteroid dihydrogenase

Info

Publication number: RU2426791C2
Application number: RU2008144419/10A
Authority: RU
Inventors: Антье ГУПТА (DE); Антье ГУПТА; Анке ЧЕНЧЕР (DE); Анке ЧЕНЧЕР; Мария БОБКОВА (DE); Мария БОБКОВА
Original assignee: Иеп Гмбх
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2011-08-20
Also published as: AT503486A1; PT2004838E; US20090280525A1; TW200806798A; RU2008144419A; KR101344581B1; JP2009535017A; US8227208B2; PL2004838T3; CA2633736A1; AU2007237475B2; CN101421413A; AU2007237475A1; WO2007118644A1; EP2004838A1; KR20090004862A; ES2389383T3; CA2633736C; TWI374936B; JP5113832B2

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: there is offered a method of enantio-selective enzymic reduction of oxasteroid compounds of general formula I and formula II presented in the invention description. The oxasteroid compound in a reaction mixture in the concentration ≥50 g/l is reduced by hydroxysteroid dihydrogenase in the presence of a NADH or NADPH cofactor. The oxidised NAD or NADP cofactor produced by hydroxysteroid dihydrogenase is continuously reduced through secondary alcohol oxidation or through C₄-C₆-cycloalkanol oxidation. For secondary alcohol or cycloalkanol oxidation, complementary oxydoreductase/alcohol dehydrogenase is used. Also, there is offered a method of enantio-selective enzymic oxidation of hydroxysteroid compounds of general formula I or hydroxysteroid compounds which are derivatives of bile acid. The hydroxysteroid compound in a reaction mixture in the concentration ≥50 g/l is oxydated by hydroxysteroid dihydrogenase in the presence of NADH or NADPH cofactor. The reduced NADH or NADPH cofactor produced by hydroxysteroid dihydrogenase is continuously regenerated through keto compound reduction or through C₄-C₆-cycloalkanol reduction. For keto compound or cycloalkanol reduction, complementary oxydoreductase/alcohol dehydrogenase is used. The inventions enable oxidation/reduction of initial hydroxysteroid/oxasteroid compounds of yield exceeding 90 % and higher TTN cofactors > 10³.

EFFECT: improved results.

18 cl, 6 ex

Description

Настоящее изобретение относится к способу энантиоселективного ферментативного восстановления соединений, которые имеют стероидную структуру (ABCD), включая один или несколько гетероатомов, одну или несколько двойных связей и/или ароматическое звено в циклической структуре, и содержат по меньшей мере одну оксо-группу в положении 3, 7, 11, 12 или 17 стероидной циклической системы или в α-положении какого-либо углеродного остатка на стероидном скелете (= оксостероидное соединение), причем оксостероидное соединение восстанавливается гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NADH или NADPH.The present invention relates to a method for enantioselective enzymatic reduction of compounds that have a steroid structure (ABCD), including one or more heteroatoms, one or more double bonds and / or an aromatic unit in the cyclic structure, and contain at least one oxo group in position 3 , 7, 11, 12, or 17 of the steroidal cyclic system or at the α-position of any carbon residue on the steroid skeleton (= oxosteroid compound), wherein the oxosteroid compound is reduced by the hydroxyst oidnoy dehydrogenase in the presence of cofactor NADH or NADPH.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу окисления соединений, которые имеют стероидную структуру (ABCD), включая один или несколько гетероатомов, одну или несколько двойных связей и/или одно ароматическое звено в циклической структуре, и содержат по меньшей мере одну гидрокси-группу в положении 3, 7, 11, 12 или 17 стероидной циклической системы или в α-положении какого-либо углеродного остатка на стероидном скелете (= гидроксистероидное соединение), причем гидроксистероидное соединение окисляется гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NAD или NADP.In addition, the present invention relates to a method for oxidizing compounds that have a steroid structure (ABCD), including one or more heteroatoms, one or more double bonds and / or one aromatic unit in the cyclic structure, and contain at least one hydroxy group in position 3, 7, 11, 12 or 17 of the steroidal cyclic system or at the α-position of any carbon residue on the steroid skeleton (= hydroxysteroid compound), and the hydroxysteroid compound is oxidized by hydroxysteroid dehydrogenase in the presence of a cofactor NAD or NADP.

Стероиды представляют собой соединения, имеющие циклическую систему холестерина и различающиеся числом двойных связей, видом, числом и положением функциональных групп, числом метильных групп, алкильной боковой цепью и конфигурацией связей. Стероидные соединения встречаются как в животных организмах, так и в грибах и растениях и имеют разнообразную биологическую активность, например, как мужские и женские половые гормоны, как гормоны надпочечников, как витамины, как желчные кислоты, как стероидные сапогенины, как действующие на сердце вещества и как жабьи яды.Steroids are compounds having a cyclic cholesterol system and differing in the number of double bonds, the type, number and position of functional groups, the number of methyl groups, the alkyl side chain and the configuration of the bonds. Steroid compounds are found both in animal organisms and in fungi and plants and have a variety of biological activities, for example, male and female sex hormones, adrenal hormones, vitamins, bile acids, steroid sapogenins, substances that act on the heart and like toad poisons.

Далее под оксостероидными соединениями понимаются стероиды определенного в начале вида, то есть такие, которые содержат по меньшей мере одну кетогруппу, причем она может находиться на циклической системе или же на имеющейся на стероидном скелете боковой цепи.Further, oxosteroid compounds are understood to mean steroids of a species defined at the beginning, that is, those that contain at least one keto group, and it can be on the cyclic system or on the side chain on the steroid skeleton.

Под гидроксистероидными соединениями далее понимаются стероиды определенного в начале вида, то есть такие, которые содержат по меньшей мере одну гидрокси-группу, причем она может находиться на циклической системе или же на имеющейся на стероидном скелете боковой цепи.Hydroxysteroid compounds are hereinafter referred to as steroids of a species defined at the beginning, that is, those that contain at least one hydroxy group, and it can be on the cyclic system or on the side chain on the steroid skeleton.

Благодаря многостороннему физиологическому действию стероидов понятно, что стероидные соединения и производные применяются также в большом числе как терапевтические средства и лекарственные средства в медицине.Due to the many-sided physiological effect of steroids, it is clear that steroid compounds and derivatives are also used in large numbers as therapeutic agents and drugs in medicine.

Так, например, производные гестагена и эстрогена широко применяются во всем мире как контрацептивы; андрогены (тестостерон) применяются в лечении, например, рака предстательной железы как анаболики и антиандрогены. Глюкокортикоиды (кортизон, кортизол, преднизолон и преднизон) и их производные благодаря их противовоспалительному, противоаллергическому и иммунодепрессивному действию широко используются в терапевтическом лечении кожных заболеваний, ревматических заболеваний, аллергических реакций, заболеваний почек, желудочно-кишечных заболеваний и многих других нарушений.For example, derivatives of gestagen and estrogen are widely used worldwide as contraceptives; androgens (testosterone) are used in the treatment of, for example, prostate cancer like anabolics and antiandrogens. Glucocorticoids (cortisone, cortisol, prednisone and prednisone) and their derivatives due to their anti-inflammatory, anti-allergic and immunosuppressive effects are widely used in the therapeutic treatment of skin diseases, rheumatic diseases, allergic reactions, kidney diseases, gastrointestinal diseases and many other disorders.

Мировой рынок биологически активных стероидных соединений огромен. В производстве различных производных стероидов разного действия большую роль играют биотрансформации. При этом, в частности, важны реакции, которые катализируются гидроксилазами и дегидрогеназами. При этом особую роль играют дельта-1-дегидрирование, 11-бета-восстановление, 20-бета-восстановление, 17-бета-восстановление, стереоселективное восстановление в положении 3 и 7, а также окисление гидрокси-групп, в частности, в положениях 3, 7, 12 и 17.The global market for biologically active steroid compounds is huge. In the production of various derivatives of steroids with different effects, an important role is played by biotransformation. In this case, in particular, reactions that are catalyzed by hydroxylases and dehydrogenases are important. In this case, delta-1-dehydrogenation, 11-beta recovery, 20-beta recovery, 17-beta recovery, stereoselective reduction at positions 3 and 7, and oxidation of hydroxy groups, in particular at positions 3, play a special role , 7, 12, and 17.

В промышленности биовосстановление на стероидах до сих пор проводилось исключительно с целыми, невредимыми клетками и при концентрациях субстрата намного ниже 10 г/л. Это объясняется, во-первых, тем, что ответственные за биотрансформации ферменты до сих пор не были охарактеризованы или не могли быть экспрессированы, а, во-вторых, также тем, что не предлагалось никакого удовлетворительного технологического решения, которое, с одной стороны, решало бы проблему низкой растворимости стероидов в водной среде, а с другой стороны - проблему регенерации кофакторов NADH и NADPH в достаточной степени.In industry, steroid bioremediation has so far been carried out exclusively with intact, intact cells and at substrate concentrations well below 10 g / L. This is due, firstly, to the fact that the enzymes responsible for biotransformation so far have not been characterized or could not be expressed, and, secondly, also to the fact that no satisfactory technological solution was proposed, which, on the one hand, solved would be the problem of low solubility of steroids in the aquatic environment, and on the other hand, the problem of regeneration of the cofactors NADH and NADPH to a sufficient degree.

Окисление на стероидах до настоящего времени в промышленности осуществлялось химически.Oxidation on steroids to date in the industry was carried out chemically.

Опыты по энантиоселективному восстановлению стероидов изолированными ферментами были описаны с 1975 по 1988 в основном G.Carrea (Eur. J. Biochemistry 44, 1974, p.401-405; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 17, 1975, p.1101-1108; Enzyme Microb. Technol. Vol. 6, July, 1984, p.307-311; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 26, 1984, p.560-563; J. Org. Chem. 51, 1986, p.2902-2906; J. Org. Chem. 58, 1993, p.499-501; J. Org. Chem., 53, 1988, p.88-92; Enzyme Microb. Technol., Vol. 10, June, p.333-339; Archives of Biochemistry and Biophysics, 159, 1973, p.7-10).Experiments on enantioselective recovery of steroids with isolated enzymes were described from 1975 to 1988 mainly by G. Carrea (Eur. J. Biochemistry 44, 1974, p.401-405; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 17, 1975, p.1101-1108; Enzyme Microb. Technol. Vol. 6, July, 1984, p.307-311; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 26, 1984, p.560-563; J. Org. Chem. 51, 1986, p.2902-2906 ; J. Org. Chem. 58, 1993, p. 499-501; J. Org. Chem., 53, 1988, p. 88-92; Enzyme Microb. Technol., Vol. 10, June, p. 333- 339; Archives of Biochemistry and Biophysics, 159, 1973, p. 7-10).

При этом использовались различные гидроксистероидные дегидрогеназы (HSHD), причем регенерация кофактора NADH достигалась в основном путем сочетания с ферментами лактатдегидрогеназа, формиатдегидрогеназа или же спиртовая дегидрогеназа из дрожжей. Регенерация NADP проводилась с помощью глюкозадегидрогеназы. Для решения проблемы растворимости проводились также опыты в двухфазной системе с этилацетатом и бутилацетатом в качестве органической фазы. При этом с изолированными ферментами в двухфазной системе также работали в диапазоне концентраций в основном намного ниже 10 г/л, причем достигаемые "total turn over numbers" (TTN = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль использованного кофактора) также лежали намного ниже 1000, из-за чего эти способы не давали существенного экономического преимущества по сравнению со способами с цельными клетками.In this case, various hydroxysteroid dehydrogenases (HSHD) were used, and the regeneration of the NADH cofactor was achieved mainly by combination with the enzymes lactate dehydrogenase, formate dehydrogenase, or alcohol dehydrogenase from yeast. NADP regeneration was carried out using glucose dehydrogenase. To solve the solubility problem, experiments were also carried out in a two-phase system with ethyl acetate and butyl acetate as the organic phase. At the same time, isolated enzymes in the two-phase system were also operated in the concentration range mainly much lower than 10 g / l, and the achieved “total turn over numbers” (TTN = moles of reduced oxosteroid compound per mole of cofactor used) also lay much lower than 1000, why these methods did not give a significant economic advantage compared with methods with whole cells.

Кроме того, имеются работы, в которых превращение гидрокси-групп из 7-альфа в 7-бета проводилось путем сочетания окисления и восстановления. Это достигалось сочетанием 7α HSDH и 7β HSDH (Pedrini et al., Steroid 71 (2006), p. 189-198). И в этом способе работали в диапазоне концентраций намного ниже 10 г/л, и получаемые "total turn over numbers" (TTN = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль используемого кофактора) были ниже 100, из-за чего эти способы также не имеют экономического значения.In addition, there are works in which the conversion of hydroxy groups from 7-alpha to 7-beta was carried out by a combination of oxidation and reduction. This was achieved by a combination of 7α HSDH and 7β HSDH (Pedrini et al., Steroid 71 (2006), p. 189-198). And in this method, they worked in a concentration range much lower than 10 g / l, and the resulting "total turn over numbers" (TTN = moles of reduced oxosteroid compound per mole of cofactor used) were below 100, which is why these methods also have no economic value .

Изобретение имеет целью устранение этих недостатков и трудностей и ставит задачу разработать способ, который позволяет энантиоселективное восстановление или окисление оксостероидных соединений или гидроксистероидных соединений с высокими выходами, в диапазоне высоких концентраций и с высокими TTN кофакторов и тем самым экономически выгодным образом.The invention seeks to eliminate these drawbacks and difficulties and sets the task to develop a method that allows enantioselective reduction or oxidation of oxosteroid compounds or hydroxysteroid compounds in high yields, in the range of high concentrations and with high TTN cofactors, and thus in an economically advantageous manner.

Эта задача решена способом указанного в начале вида тем, что:This problem is solved by the method indicated at the beginning of the form in that:

a) оксостероидное соединение находится в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,a) the oxosteroid compound is in the reaction mixture at a concentration of ≥50 g / l,

b) окисленный кофактор NAD или NADP, образуемый гидроксистероидной гидрогеназой, непрерывно регенерируется через окисление вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH, причем R_X, R_Y независимо друг от друга означают водород, разветвленный или неразветвленный C₁-C₈-алкил и С_общ≥3, или через окисление C₄-C₆-циклоалканола, иb) the oxidized cofactor NAD or NADP formed by hydroxysteroid hydrogenase is continuously regenerated through the oxidation of a secondary alcohol of the general formula R _X R _Y CHOH, wherein R _X , R _{Y are} independently hydrogen, branched or unbranched C ₁ -C ₈ -alkyl and With a _{total of} ≥3, or through oxidation of a C ₄ -C ₆ cycloalkanol, and

c) для окисления вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH или циклоалканола используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.c) additional oxidoreductase / alcohol dehydrogenase is used to oxidize the secondary alcohol of the general formula R _X R _Y CHOH or cycloalkanol.

Кроме того, вышеуказанная задача в соответствии со способом указанного в начале вида решается тем, что:In addition, the above task in accordance with the method specified at the beginning of the form is solved by the fact that:

a) гидроксистероидное соединение находится в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,a) the hydroxysteroid compound is in the reaction mixture at a concentration of ≥50 g / l,

b) восстановленный кофактор NADH или NADPH, образуемый гидроксистероидной гидрогеназой, непрерывно регенерируется через восстановление кетосоединения общей формулы R_XR_YCO, причем R_X, R_Y независимо друг от друга означают водород, разветвленный или неразветвленный C₁-C₈-алкил и С_общ≥3, или через восстановление C₄-C₆-циклоалканона, иb) the reduced NADH or NADPH cofactor formed by hydroxysteroid hydrogenase is continuously regenerated through the reduction of the keto compound of the general formula R _X R _Y CO, wherein R _X, R _{Y are} independently hydrogen, branched or unbranched C ₁ -C ₈ -alkyl and C _total ≥3, or through reduction of a C ₄ -C ₆ cycloalkanone, and

c) для восстановления кетосоединения общей формулы R_XR_YCO или циклоалканона используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.c) additional oxidoreductase / alcohol dehydrogenase is used to reduce the keto compound of the general formula R _X R _Y CO or cycloalkanone.

Настоящее изобретение представляет собой существенное улучшение реакции энантиоселективного ферментативного восстановления и окисления на стероидном скелете по сравнению с уровнем техники. Настоящее изобретение делает возможным восстановление или окисление оксостероидных соединений до соответствующих гидрокси- или оксостероидов свободными ферментами в диапазонах концентраций, которые намного превышают описанные в уровне техники.The present invention is a significant improvement in the reaction of enantioselective enzymatic reduction and oxidation on the steroid skeleton compared with the prior art. The present invention makes it possible to reduce or oxidize oxosteroid compounds to the corresponding hydroxy or oxosteroid free enzymes in concentration ranges that far exceed those described in the prior art.

В способе согласно изобретению в качестве кофактора применяется NADH или NADPH. Под термином "NADP" понимается никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат, под "NADPH" восстановленный никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат. Термин "NAD" означает никотинамид-аденин-динуклеотид, термин "NADH" - восстановленный никотинамид-аденин-динуклеотид.In the method according to the invention, NADH or NADPH is used as a cofactor. By the term "NADP" is meant nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphate, by "NADPH" is reduced nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphate. The term "NAD" means nicotinamide-adenine dinucleotide, the term "NADH" means reduced nicotinamide-adenine dinucleotide.

Согласно одной предпочтительной форме реализации способ по изобретению отличается тем, что в качестве оксостероидного соединения используется соединение общей формулы IAccording to one preferred embodiment, the method according to the invention is characterized in that a compound of the general formula I is used as an oxosteroid compound

в которой означают:in which mean:

R₁ - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,R ₁ is hydrogen, methyl group, hydroxy group or oxo group,

R₂ - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,R ₂ is hydrogen, methyl group, hydroxy group or oxo group,

R₃ - водород, гидрокси-группа, оксо-группа или метильная группа,R ₃ is hydrogen, a hydroxy group, an oxo group or a methyl group,

R₄ - водород или гидрокси-группа,R ₄ is hydrogen or a hydroxy group,

R₅ - водород, остаток -COR₁₀, причем R₁₀ представляет собой незамещенную или замещенную гидрокси-группой C₁-C₄-алкильную группу или замещенную или незамещенную C₁-C₄-карбоксиалкильную группу,R ₅ is hydrogen, the residue is -COR ₁₀ , wherein R ₁₀ is an unsubstituted or substituted C ₁ -C ₄ alkyl group by a hydroxy group or a substituted or unsubstituted C ₁ -C ₄ carboxyalkyl group,

или R₄ и R₅ вместе означают оксо-группу,or R ₄ and R ₅ together mean an oxo group,

R₆ - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,R ₆ is hydrogen, methyl group, hydroxy group or oxo group,

R₇ - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,R ₇ is hydrogen, methyl group, hydroxy group or oxo group,

R₈ - водород, метильная группа или галогенид, иR ₈ is hydrogen, a methyl group or a halide, and

R₉ - водород, метильная группа, гидрокси-группа, оксо-группа или галогенид,R ₉ is hydrogen, methyl group, hydroxy group, oxo group or halide,

причем по меньшей мере одно из R₁, R₂, R₄+R₅, R₆, R₈ или R₉ означает оксо-группу или R₅ является остатком -COR₁₀, а структурный элементwherein at least one of R ₁ , R ₂ , R ₄ + R ₅ , R ₆ , R ₈ or R ₉ is an oxo group or R ₅ is a —COR ₁₀ residue, and the structural element

означает бензольное кольцо или C₆-кольцо с 0, 1 или 2 двойными связями C-C.means a benzene ring or a C ₆ ring with 0, 1 or 2 double bonds CC.

Согласно одной предпочтительной форме реализации способ по изобретению отличается тем, что в качестве гидроксистероидного соединения используется соединение общей формулы IAccording to one preferred embodiment, the method according to the invention is characterized in that a compound of the general formula I is used as a hydroxysteroid compound

в которой означают:in which mean:

R₂ - водород, метильная группа, оксо-группа или гидрокси-группа,R ₂ is hydrogen, methyl group, oxo group or hydroxy group,

R₆ - водород, метильная группа, оксо-группа или гидрокси-группа,R ₆ is hydrogen, methyl group, oxo group or hydroxy group,

R₇ - водород, метильная группа, оксо-группа или гидрокси-группа,R ₇ is hydrogen, methyl group, oxo group or hydroxy group,

причем по меньшей мере одно из R₁, R₂, R₄, R₆, R₇, R₈ или R₉ означает гидрокси-группу, а структурный элементand at least one of R ₁ , R ₂ , R ₄ , R ₆ , R ₇ , R ₈ or R ₉ means a hydroxy group, and a structural element

Предпочтительно, в качестве вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH используется 2-пропанол, 2-бутанол, 2-пентанол, 4-метил-2-пентанол, 2-гексанол, 2-гептанол, 5-метил-2-гексанол или 2-октанол, а в качестве циклического спирта - циклогексанол.Preferably, as a secondary alcohol of general formula R _X R _Y CHOH uses 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 4-methyl-2-pentanol, 2-hexanol, 2-heptanol, 5-methyl-2-hexanol, or 2-octanol, and cyclohexanol as cyclic alcohol.

Предпочтительно, в качестве кетона общей формулы R_XR_YCO используется ацетон, 2-бутанон, 2-пентанон, 4-метил-2-пентанон, 2-гексанон, 2-гептанон, 5-метил-2-гексанон или 2-октанон, а в качестве циклоалканона - циклогексанон.Preferably, acetone, 2-butanone, 2-pentanone, 4-methyl-2-pentanone, 2-hexanone, 2-heptanone, 5-methyl-2-hexanone or 2-octanone are used as the ketone of the general formula R _X R _Y CO , and as cycloalkanone - cyclohexanone.

В дальнейшем для кетона общей формулы R_XR_YCO, соответственно C₄-C₆-циклоалканона и вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH или C₄-C₆-циклоалканола используется обобщенное обозначение косубстрат.Subsequently, for the ketone of the general formula R _X R _Y CO, respectively, C ₄ -C ₆ cycloalkanone and the secondary alcohol of the general formula R _X R _Y CHOH or C ₄ -C ₆ cycloalkanol, the generic term cosubstrates is used.

Предпочтительно, способ по изобретению осуществляется в водно-органической двухфазной системе. При этом целесообразно, чтобы используемый для образования коферментов косубстрат не смешивался с водой и тем самым образовывал органическую фазу водно-органической двухфазной системы.Preferably, the method according to the invention is carried out in an aqueous-organic two-phase system. At the same time, it is advisable that the cosubstrate used for the formation of coenzymes is not mixed with water and thereby forms the organic phase of the aqueous-organic two-phase system.

Согласно следующей форме реализации в способе дополнительно используется органический растворитель, который не участвует в регенерации кофактора, такой как, например, диэтиловый эфир, трет-бутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, этилацетат, бутилацетат, гептан, гексан или циклогексан.According to a further embodiment, the method further uses an organic solvent that is not involved in the regeneration of the cofactor, such as, for example, diethyl ether, tert-butyl methyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, ethyl acetate, butyl acetate, heptane, hexane or cyclohexane.

Далее, предпочтительно, чтобы TTN в способе по изобретению составляло ≥10³.Further, it is preferable that the TTN in the method according to the invention was ≥10 ³ .

Кроме того, предпочтительно, чтобы по меньшей мере 50% используемого оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения окислялось в течение 2-96 часов до соответствующего гидроксистероидного соединения или восстанавливалось до оксостероидного соединения.In addition, it is preferred that at least 50% of the oxosteroid compound or hydroxysteroid compound used is oxidized within 2-96 hours to the corresponding hydroxysteroid compound or reduced to the oxosteroid compound.

Предпочтительные формы реализации способа по изобретению отличаются тем, что в качестве оксостероидного соединения используются, например, кетолитохолевая кислота (формула II), дексаметазон (формула III), 4-андростен-3,17-дион (формула IV), 1,4-андростадиен-3,17-дион (формула V), эстрон (формула VI), прегненолон (формула VII) и кортизон (формула VIII).Preferred embodiments of the method according to the invention are characterized in that, for example, ketolitocholic acid (formula II), dexamethasone (formula III), 4-androsten-3,17-dione (formula IV), 1,4-androstadiene are used as the oxosteroid compound -3.17-dione (formula V), estrone (formula VI), pregnenolone (formula VII) and cortisone (formula VIII).

Предпочтительные формы реализации способа по изобретению отличаются, кроме того, тем, что в качестве гидроксистероидного соединения используются, например, различные производные желчной кислоты, такие как холевая кислота, хенодеоксохолевая кислота, 12-оксохолевая кислота, 3-гидрокси-12-оксохолевая кислота, кетолитохолевая кислота, литохолевая кислота или же гидрокортизон.Preferred embodiments of the method according to the invention are further characterized in that, for example, various bile acid derivatives such as cholic acid, chenodeoxocholic acid, 12-oxocholic acid, 3-hydroxy-12-oxocholic acid, ketolitocholic are used as the hydroxysteroid compound acid, lithocholic acid or hydrocortisone.

Под гидроксистероидными дегидрогеназами понимаются обычно такие ферменты, которые способны катализировать восстановление кетогрупп до гидрокси-групп или окисление гидрокси-групп в соответствующие кетогруппы на стероидном скелете. При этом окисление или восстановление может происходить на циклической системе самого стероида (например, 7-α гидроксистероидные дегидрогеназы) или же на углеродных остатках стероидного скелета (например, 20-β гидроксистероидные дегидрогеназы).Under the hydroxysteroid dehydrogenases are usually understood such enzymes that are capable of catalyzing the reduction of keto groups to hydroxy groups or the oxidation of hydroxy groups to the corresponding keto groups on the steroid skeleton. In this case, oxidation or reduction can occur on the cyclic system of the steroid itself (for example, 7-α hydroxysteroid dehydrogenases) or on the carbon residues of the steroid skeleton (for example, 20-β hydroxysteroid dehydrogenases).

Гидроксистероидными дегидрогеназами, подходящими для восстановления оксостероидных соединений, являются, например, 3-α гидроксистероидная дегидрогеназа (HSDH), 3β HSDH, 12α HSDH, 20β HSDH, 7α HSDH, 7β HSDH, 17β HSDH и 11β HSDH.Hydroxysteroid dehydrogenases suitable for the reduction of oxosteroid compounds are, for example, 3-α hydroxysteroid dehydrogenase (HSDH), 3β HSDH, 12α HSDH, 20β HSDH, 7α HSDH, 7β HSDH, 17β HSDH and 11β HSDH.

Подходящая 3-α гидроксистероидная дегидрогеназа может быть получена, например, из Pseudomonas testosteroni (J. Biol. Chem. 276 (13), 9961-9970 (2001)) и может применяться для окисления 3-α-гидроксистероидов или для восстановления 3-кетостероидов, например 3-кетожелчных кислот, прогестерона, 4-андростен-3,17-диона, 5-α-андростан-3,17-диона и т.д.Suitable 3-α hydroxysteroid dehydrogenase can be obtained, for example, from Pseudomonas testosteroni (J. Biol. Chem. 276 (13), 9961-9970 (2001)) and can be used to oxidize 3-α-hydroxysteroids or to restore 3-ketosteroids e.g. 3-keto-bile acids, progesterone, 4-androsten-3,17-dione, 5-α-androstan-3,17-dione, etc.

Подходящие ферменты с активностью к 3-β гидроксистероидной дегидрогеназе могут быть получены, например, из Clostridium innocuum (Applied and Environmental Microbiology, June 1989, p.1656-1659) или из Pseudomonas testosteroni, и их можно использовать для окисления 3-β-гидроксистероидов или для восстановления 3-кетостероидов, например 3-кетожелчных кислот, прогестерона, 4-андростен-3,17-диона, 5-α-андростан-3,17-диона и т.д.Suitable enzymes with activity for 3-β hydroxysteroid dehydrogenase can be obtained, for example, from Clostridium innocuum (Applied and Environmental Microbiology, June 1989, p.1656-1659) or from Pseudomonas testosteroni, and can be used to oxidize 3-β-hydroxysteroids or for the reduction of 3-ketosteroids, for example 3-ketogel acids, progesterone, 4-androsten-3,17-dione, 5-α-androstan-3,17-dione, etc.

Например, 12α HSDH может быть получена из клостридий (Eur. J. Biochem. 196 (1991) 439-450), ее можно использовать для окисления 12α-гидроксистероидов (например, холевой кислоты) или для восстановления 12-кетостероидов, например 12-кетожелчных кислот (12-кетохенодеоксихолевая кислота, дегидрохолевая кислота). Описаны также ферменты из клостридий с активностью к 12-β гидроксистероидной дегидрогеназе (Biochim. Biophys. Acta 1988 Oct. 14; 962(3): 362-370).For example, 12α HSDH can be obtained from clostridia (Eur. J. Biochem. 196 (1991) 439-450), it can be used to oxidize 12α-hydroxysteroids (e.g. cholic acid) or to restore 12-ketosteroids, e.g. 12-keto-bile acids (12-ketochenodeoxycholic acid, dehydrocholic acid). Enzymes from clostridia with activity to 12-β hydroxysteroid dehydrogenase are also described (Biochim. Biophys. Acta 1988 Oct. 14; 962 (3): 362-370).

Ферменты с активностью к 20-β гидроксистероидной дегидрогеназе могут быть получены, например, из организмов группы Streptomyces (The Journal of Biological Chemistry, 1977, Vol. 252 № 1, Jan 10, 205-211) и могут применяться для восстановления кортизона и производных кортизола (кортизон, кортизол, кортексолон, прогестерон) до соответствующих 20-β-гидроксистероидов (например, 20-β-гидроксипрогестерон).Enzymes with activity to 20-β hydroxysteroid dehydrogenase can be obtained, for example, from organisms of the Streptomyces group (The Journal of Biological Chemistry, 1977, Vol. 252 No. 1, Jan 10, 205-211) and can be used to restore cortisone and cortisol derivatives (cortisone, cortisol, cortexolone, progesterone) to the corresponding 20-β-hydroxysteroids (e.g. 20-β-hydroxyprogesterone).

Соответствующие ферменты с активностью к 20-α гидроксистероидной дегидрогеназе могут быть получены, например, из клостридий, в частности из Clostridium scindens (Journal of Bacteriology, June 1989, p.2925-2932), и из Tetrahymena pyriformis (Biochem J. (1994) 297, 195-200).Corresponding enzymes with activity to 20-α hydroxysteroid dehydrogenase can be obtained, for example, from clostridia, in particular from Clostridium scindens (Journal of Bacteriology, June 1989, p.2925-2932), and from Tetrahymena pyriformis (Biochem J. (1994) 297, 195-200).

Подходящие 7-α гидроксистероидные дегидрогеназы могут быть получены, кроме того, из организмов кишечной флоры, например из клостридий (Clostridium absonum, Clostridium sordellii) (Journal of Bacteriology, Aug. 1994, p.4865-4874), из Escherichia coli (Journal of Bacteriology Apr., 1991, p.2173-2179), из Bacteroides fragilis (Current Microbiology, Vol. 47 (2003), 475-484), Brucella, Eubacterium, они могут применяться для окисления 7-α-гидроксистероидов (хенолитохолевая кислота) или для восстановления 7-кетостероидов, например 7-кетожелчных кислот (кетолитохолевая кислота).Suitable 7-α hydroxysteroid dehydrogenases can also be obtained from organisms of the intestinal flora, for example from clostridium (Clostridium absonum, Clostridium sordellii) (Journal of Bacteriology, Aug. 1994, p. 4865-4874), from Escherichia coli (Journal of Bacteriology Apr., 1991, p.2173-2179), from Bacteroides fragilis (Current Microbiology, Vol. 47 (2003), 475-484), Brucella, Eubacterium, they can be used for the oxidation of 7-α-hydroxysteroids (henolithocholic acid) or to restore 7-ketosteroids, for example 7-keto-bile acids (ketolitocholic acid).

Описаны также соответствующие ферменты с активностью к 7-β гидроксистероидной дегидрогеназе из клостридий, из микроорганизмов семейства Ruminococcen (J. Biochemistry 102, 1987, p.613-619) или пептострептококков (Biochimica and Biophysica Acta 1004, 1989, p.230-238), из Eubacterium aerofaciens (Applied and Environmental Microbiology, May 1982, p.1057-1063) и из Xanthomonas maltophila (Pedrini et al., Steroids 71 (2006), p. 189-198). С помощью 7-β HSDH можно получить, например, урсодезоксихолевую кислоту из кетолитохолевой кислоты.The corresponding enzymes with activity to 7-β hydroxysteroid dehydrogenase from clostridia, from microorganisms of the Ruminococcen family (J. Biochemistry 102, 1987, p.613-619) or peptostreptococci (Biochimica and Biophysica Acta 1004, 1989, p.230-238) are also described. , from Eubacterium aerofaciens (Applied and Environmental Microbiology, May 1982, p. 1057-1063) and from Xanthomonas maltophila (Pedrini et al., Steroids 71 (2006), p. 189-198). Using 7-β HSDH, for example, ursodeoxycholic acid can be obtained from ketolitocholic acid.

Известны 17-β гидроксистероидные дегидрогеназы из грибов, как Cylindrocarpon radicola (J. Biochemistry 103, 1988, 1039-1044) и Cochliobolus lunatus (J. Steroid Biochem. Molec. Biol. Vol. 59, 1996, № 2, p.205-214), из бактерий семейства Streptomyces (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem, Bd. 356, 1975, 1843-1852), Pseudomonas (The Journal of Biological Chemistry, Vol.252, № 11, June 10, 1977, p.3775-3783) и Alcaligenes (The Journal of Biological Chemistry, Vol.260, № 25, Nov 5, 1985, p.13648-13655).Known 17-β hydroxysteroid dehydrogenases from fungi are Cylindrocarpon radicola (J. Biochemistry 103, 1988, 1039-1044) and Cochliobolus lunatus (J. Steroid Biochem. Molec. Biol. Vol. 59, 1996, No. 2, p.205- 214), from bacteria of the Streptomyces family (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem, Bd. 356, 1975, 1843-1852), Pseudomonas (The Journal of Biological Chemistry, Vol. 252, No. 11, June 10, 1977, p. 3775-3783) and Alcaligenes (The Journal of Biological Chemistry, Vol. 260, No. 25, Nov 5, 1985, p. 13648-13655).

17-β-гидроксистероидные дегидрогеназы могут применяться, например, для окисления 17-β-гидроксистероидов или для восстановления 17-кетостероидов, например 4-андростен-3,17-диона, андростерона, эстрона.17-β-hydroxysteroid dehydrogenases can be used, for example, for the oxidation of 17-β-hydroxysteroids or for the reduction of 17-ketosteroids, for example 4-androsten-3,17-dione, androsterone, estrone.

Описан соответствующий фермент с активностью к 17-α гидроксистероидной дегидрогеназе из Eubacterium sp. (Journal of Lipid Research, Vol.35, 1994, p.922-929).The corresponding enzyme with activity to 17-α hydroxysteroid dehydrogenase from Eubacterium sp. (Journal of Lipid Research, Vol. 35, 1994, p. 922-929).

Известны 11-β гидроксистероидные дегидрогеназы из высших млекопитающих, которые могут применяться, например, для окисления кортизола в кортизон.Known 11-β hydroxysteroid dehydrogenases from higher mammals, which can be used, for example, for the oxidation of cortisol to cortisone.

Однако в качестве гидроксистероидной дегидрогеназы могут применяться также любые другие оксидоредуктазы, которые катализируют окисление или восстановление на стероидном скелете.However, any other oxidoreductases that catalyze oxidation or reduction on the steroid skeleton may also be used as hydroxysteroid dehydrogenase.

Дегидрогеназами вторичных спиртов, подходящими для регенерации NADH или NAD, например, при использовании 17-β гидроксистероидных дегидрогеназ из Pseudomonas testosteroni, 3-β гидроксистероидных дегидрогеназ из Clostridium innocuum или 7-α гидроксистероидной дегидрогеназы из Bacteroides fragilis, являются, например, вышеописанные дегидрогеназы, которые выделяют из дрожжей рода Candida и Pichia, такие как, например, карбонилредуктаза из Candida parapsilosis (CPCR) (US 5523223 и US 5763236; Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov; 15(11):950-8), Pichia capsulata (DE 10327454.4), Pichia farinosa (A 1261/2005, кл. C12N), Pichia finlandica (EP 1179595 Al), Candida nemodendra (A 1261/2005, кл. C12N), Pichia trehalophila (A 1261/2005, кл. C12N), Rhodotorula mucilaginosa (A 1261/2005, кл. C12N), Lodderomyces elongisporus (A 1261/2005, кл. C12N) и Pichia stipidis (A 1261/2005, кл. C12N).Secondary alcohol dehydrogenases suitable for the regeneration of NADH or NAD, for example, using 17-β hydroxysteroid dehydrogenases from Pseudomonas testosteroni, 3-β hydroxysteroid dehydrogenases from Clostridium innocuum, or 7-α hydroxysteroid dehydrogenases from Bacteroides, for example, the above, isolated from yeast of the genus Candida and Pichia, such as, for example, carbonyl reductase from Candida parapsilosis (CPCR) (US 5523223 and US 5763236; Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov; 15 (11): 950-8), Pichia capsulata (DE 10327454.4 ), Pichia farinosa (A 1261/2005, class C12N), Pichia finlandica (EP 1179595 Al), Candida nemodendra (A 1261/2005, class C12N), Pichia trehalophila (A 1261/2005, class C12N), Rhodotorula mucilaginosa (A 1261/2005, class C12N), Lodderomyces elongisporus (A 1261/2005, class C12N) and Pichia stipidis (A 1261/2005, class C12N) .

Кроме того, регенерация NADH может осуществляться также вторичными спиртовыми дегидрогеназами/оксидоредуктазами, какие описаны и выделены из бактерий класса Actinobacteria, например, из Rhodococcus erythropolis (US 5523223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999), p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sep; 62(4):380-6, Epub 2003 Apr 26), Rhodococcus ruber (J. Org. Chem. 2003 Jan 24; 8(2):402-6) или Microbacterium spec. (A 1261/2005, кл. C12N).In addition, NADH can also be regenerated by secondary alcohol dehydrogenases / oxidoreductases, which are described and isolated from bacteria of the class Actinobacteria, for example, from Rhodococcus erythropolis (US 5523223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999) , p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sep; 62 (4): 380-6, Epub 2003 Apr 26), Rhodococcus ruber (J. Org. Chem. 2003 Jan 24; 8 (2): 402 -6) or Microbacterium spec. (A 1261/2005, CL C12N).

Вторичными спиртовыми дегидрогеназами/оксидоредуктазами, подходящими для регенерации NADPH или NADP, например, при использовании 12-α гидроксистероидных дегидрогеназ из Clostridium paraputrificum, 17-α гидроксистероидных дегидрогеназ из Eubacterium sp. или 7-α гидроксистероидных дегидрогеназ из Clostridium sordelli, являются, например, такие, какие описаны и выделены из организмов отряда лактобацилл (Lactobacillus kefir (US 5200335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 Al; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), Lactobacillus minor (DE 10119274), Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, кл. C12N)), или такие, какие описаны из Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus или Clostridium beijerinckii.Secondary alcohol dehydrogenases / oxidoreductases suitable for the regeneration of NADPH or NADP, for example, using 12-α hydroxysteroid dehydrogenases from Clostridium paraputrificum, 17-α hydroxysteroid dehydrogenases from Eubacterium sp. or 7-α hydroxysteroid dehydrogenases from Clostridium sordelli are, for example, those described and isolated from organisms of the order Lactobacillus (Lactobacillus kefir (US 5,200,335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 Al; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. D. Biol. ; 56 Pt 12: 1696-8), Lactobacillus minor (DE 10119274), Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, CL C12N)), or those described in Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus or Clostridium beijerinckii.

Оба фермента: гидроксистероидная дегидрогеназа и оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа - предпочтительно используются рекомбинатно сверхэкспрессированными в Escherichia coli. В способе по изобретению оба фермента: гидроксистероидная дегидрогеназа и спиртовая дегидрогеназа/оксидоредуктаза - могут применяться полностью очищенными, частично очищенными или находящимися в клетках. При этом используемые клетки могут присутствовать как естественные, как клетки с нарушенной проницаемостью мембраны или растворенными.Both enzymes: hydroxysteroid dehydrogenase and oxidoreductase / alcohol dehydrogenase are preferably used recombinantly overexpressed in Escherichia coli. In the method according to the invention, both enzymes: hydroxysteroid dehydrogenase and alcohol dehydrogenase / oxidoreductase can be used completely purified, partially purified or present in the cells. In this case, the cells used can be present as natural, as cells with impaired membrane permeability or dissolved.

На 1 кг реагирующего оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения используется от 50000 до 10 млн ед. гидроксистероидной дегидрогеназы и от 50000 до 10 млн ед. спиртовой дегидрогеназы (с открытой верхней границей).Per 1 kg of reactive oxosteroid compound or hydroxysteroid compound, 50,000 to 10 million units are used. hydroxysteroid dehydrogenase and from 50,000 to 10 million units. alcohol dehydrogenase (with an open upper boundary).

При этом единице ферментов 1 ед. соответствует такое количество ферментов в гидроксистероидной дегидрогеназе, которое необходимо, чтобы реагировал 1 мкмоль оксостероидного соединения в минуту (мин), или такое количество ферментов в спиртовой дегидрогеназе, которое необходимо для окисления 1 мкмоль вторичного спирта в минуту (мин).With this unit of enzymes 1 unit. corresponds to such an amount of enzymes in hydroxysteroid dehydrogenase that it is necessary that 1 μmol of an oxosteroid compound per minute (min) reacts, or such an amount of enzymes in alcohol dehydrogenase that is necessary to oxidize 1 μmol of secondary alcohol per minute (min).

Аналогично, на каждый кг реагирующего оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения может использоваться примерно от 10 г до 500 г влажной биомассы E.coli, содержащей гидроксистероидную дегидрогеназу, и от 10 г до 500 г влажной биомассы E.coli, содержащей спиртовую дегидрогеназу/оксидоредуктазу (верхняя граница открыта).Similarly, for each kg of reactive oxosteroid compound or hydroxysteroid compound, about 10 g to 500 g of wet E. coli biomass containing hydroxysteroid dehydrogenase and 10 g to 500 g of wet E. coli biomass containing alcohol dehydrogenase / oxidoreductase can be used (top the border is open).

Регенерация NAD(P)H осуществляется в описанном способе в сочетании с ферментами.The regeneration of NAD (P) H is carried out in the described method in combination with enzymes.

В способе по изобретению реакция превращения оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения протекает предпочтительно в двухфазной системе, содержащей вторичный спирт или кетосоединение для регенерации кофактора, гидроксистероидную дегидрогеназу, спиртовую дегидрогеназу, воду, кофактор и оксостероидное соединение или гидроксистероидное соединение. Кроме того, могут содержаться также дополнительные органические растворители, которые не участвуют в регенерации кофактора, то есть ни один из которых не содержит окисляемых спиртовой дегидрогеназой гидрокси-групп или восстанавливаемых кетогрупп.In the method according to the invention, the conversion reaction of the oxosteroid compound or hydroxysteroid compound proceeds preferably in a two-phase system containing a secondary alcohol or keto compound for regenerating a cofactor, hydroxysteroid dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, water, cofactor and an oxosteroid compound or hydroxysteroid compound. In addition, additional organic solvents may also be present that do not participate in the regeneration of the cofactor, that is, none of them contains hydroxy groups or reducible keto groups oxidizable by alcohol dehydrogenase.

При этом доля не смешиваемых с водой органических компонентов двухфазной системы может составлять от 10 до 90%, предпочтительно от 20 до 80%, в расчете на полный объем реакционной смеси. Содержание воды может составлять от 90 до 10%, предпочтительно от 80 до 20%, от полного объема реакционной смеси.Moreover, the proportion of organic components of a two-phase system not miscible with water can be from 10 to 90%, preferably from 20 to 80%, based on the total volume of the reaction mixture. The water content may be from 90 to 10%, preferably from 80 to 20%, of the total volume of the reaction mixture.

К воде можно добавлять буфер, например калийфосфатный, Tris/HCl, глициновый или триэтаноламиновый буфер со значением pH от 5 до 10, предпочтительно от 6 до 9. Дополнительно буфер может содержать ионы для стабилизации или активирования обоих ферментов, например ионы магния или ионы цинка.A buffer, for example potassium phosphate, Tris / HCl, glycine or triethanolamine buffer, with a pH value of 5 to 10, preferably 6 to 9, can be added to the water. Additionally, the buffer may contain ions to stabilize or activate both enzymes, for example magnesium ions or zinc ions.

Кроме того, в способе по изобретению могут использоваться дополнительные добавки для стабилизации ферментов гидроксистероидная дегидрогеназа и спиртовая дегидрогеназа, такие как, например, глицерин, сорбитол, 1,4-DL-дитиотреит (DTT) или диметилсульфоксид (ДМСО).In addition, the method according to the invention can use additional additives to stabilize the enzymes hydroxysteroid dehydrogenase and alcohol dehydrogenase, such as, for example, glycerin, sorbitol, 1,4-DL-dithiothreitol (DTT) or dimethyl sulfoxide (DMSO).

Концентрация кофактора NAD(P)H в расчете на водную фазу составляет от 0,001 мМ до 10 мМ, в частности от 0,01 мМ до 1,0 мМ. Температура в зависимости от конкретных свойств использующихся ферментов может составлять от 10°C до 70°C, предпочтительно от 20°C до 35°C.The concentration of the cofactor NAD (P) H calculated on the aqueous phase is from 0.001 mm to 10 mm, in particular from 0.01 mm to 1.0 mm. The temperature, depending on the specific properties of the enzymes used, can range from 10 ° C to 70 ° C, preferably from 20 ° C to 35 ° C.

При этом достигаемое в способе по изобретению TTN (total turn over number = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль используемого кофактора) может находиться в интервале от 10² до 10⁵, как правило, предпочтительно TTN ≥10³.Moreover, the TTN achieved in the method according to the invention (total turn over number = moles of reduced oxosteroid compound per mole of cofactor used) can be in the range from 10 ² to 10 ⁵ , usually preferably TTN ≥10 ³ .

Восстанавливаемые оксостероидные соединения или гидроксистероидные соединения, как правило, плохо растворяются в воде. Субстрат во время реакции может находиться полностью, а также частично растворенным. Если субстрат в реакционной смеси растворим не полностью, то часть субстрата находится в твердой форме и, таким образом, может образовывать третью твердую фазу. Реакционная смесь может также во время превращения периодически образовывать эмульсию.Reducible oxosteroid compounds or hydroxysteroid compounds are generally poorly soluble in water. The substrate during the reaction can be completely, as well as partially dissolved. If the substrate in the reaction mixture is not completely soluble, then part of the substrate is in solid form and, thus, can form a third solid phase. The reaction mixture may also periodically form an emulsion during the conversion.

Восстанавливаемое оксостероидное соединение или окисляемое гидроксистероидное соединение в способе по изобретению используется в количествах ≥50 г/л в расчете на полный объем реакционной смеси. Предпочтительно используется от 50 г/л до 400 г/л оксостероидного соединения/гидроксистероидного соединения, особенно предпочтительно от 50 г/л до 200 г/л.The reducible oxosteroid compound or oxidizable hydroxysteroid compound in the method of the invention is used in amounts of ≥50 g / l, based on the total volume of the reaction mixture. Preferably, from 50 g / l to 400 g / l of the oxosteroid compound / hydroxysteroid compound is used, particularly preferably from 50 g / l to 200 g / l.

Предпочтительными дополнительными органическими растворителями, которые не участвуют в регенерации кофактора, являются, например, этилацетат, бутилацетат, трет-бутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, гептан, гексан, толуол, дихлорметан или циклогексан или их смеси разного состава.Preferred additional organic solvents that are not involved in the regeneration of the cofactor are, for example, ethyl acetate, butyl acetate, tert-butyl methyl ether, diisopropyl ether, heptane, hexane, toluene, dichloromethane or cyclohexane or mixtures thereof of different compositions.

Регенерация NAD(P)H достигается окислением вторичных спиртов общей формулы R_XR_YCHOH или C₄-C₆-циклоалканолов. При этом в качестве продуктов реакции образуются кетоны общей формулы R_XR_YC=O или C₄-C₆-циклоалканоны. Предпочтительными вторичными спиртами являются при этом алифатические вторичные спирты, такие как, например, изопропанол, 2-бутанол, 2-пентанол, 2-гексанол, 2-гептанол, 2-октанол, 4-метил-2-пентанол, 5 метил-2-гексанол, и циклические вторичные спирты, такие как циклогексанол, циклопентанол. В принципе допустимо также применение диолов, таких как, например, 1,4-циклогександиол.The regeneration of NAD (P) H is achieved by the oxidation of secondary alcohols of the general formula R _X R _Y CHOH or C ₄ -C ₆ cycloalkanols. Moreover, ketones of the general formula R _X R _Y C = O or C ₄ -C ₆ cycloalkanones are formed as reaction products. Preferred secondary alcohols are aliphatic secondary alcohols, such as, for example, isopropanol, 2-butanol, 2-pentanol, 2-hexanol, 2-heptanol, 2-octanol, 4-methyl-2-pentanol, 5 methyl-2- hexanol; and cyclic secondary alcohols, such as cyclohexanol, cyclopentanol. In principle, the use of diols is also permissible, such as, for example, 1,4-cyclohexanediol.

Регенерация NAD(P) достигается восстановлением кетосоединений общей формулы R_XR_YC=O или C₄-C₆-циклоалканонов. При этом как продукты реакции образуются вторичные спирты общей формулы R_XR_YCHOH или C₄-C₆-циклоалканолы. Предпочтительными кетосоединениями при этом являются кетоны, такие как, например, ацетон, 2-бутанон, 2-пентанон, 2-гексанон, 2-гептанон, 2-октанон, 4-метил-2-пентанон, 5-метил-2-гексанон и циклические кетоны, такие как циклогексанон, циклопентанон. В принципе допустимо также применение дионов, например 1,4-циклогександиона.Regeneration of NAD (P) is achieved by reduction of keto compounds of the general formula R _X R _Y C = O or C ₄ -C ₆ cycloalkanones. At the same time, secondary alcohols of the general formula R _X R _Y CHOH or C ₄ -C ₆ cycloalkanols are formed as reaction products. Preferred keto compounds are ketones, such as, for example, acetone, 2-butanone, 2-pentanone, 2-hexanone, 2-heptanone, 2-octanone, 4-methyl-2-pentanone, 5-methyl-2-hexanone and cyclic ketones such as cyclohexanone, cyclopentanone. In principle, the use of dyons, for example 1,4-cyclohexanedione, is also permissible.

Способ по изобретению проводится, например, в реакционном сосуде из стекла или металла. Для этого компоненты помещают в реакционный сосуд по отдельности и перемешивают в атмосфере, например, азота или воздуха. В зависимости от используемого оксостероидного соединения продолжительность реакции составляет от 1 часа до 96 часов, в частности от 2 часов до 48 часов. За это время по меньшей мере 50% оксостероидного соединения восстановится до соответствующего гидроксистероида или гидроксистероид окислится до оксостероидного соединения.The method according to the invention is carried out, for example, in a reaction vessel of glass or metal. For this, the components are placed separately in the reaction vessel and mixed in an atmosphere of, for example, nitrogen or air. Depending on the oxosteroid compound used, the reaction time is from 1 hour to 96 hours, in particular from 2 hours to 48 hours. During this time, at least 50% of the oxosteroid compound will be reduced to the corresponding hydroxysteroid or the hydroxysteroid will be oxidized to the oxosteroid compound.

Далее настоящее изобретение подробнее поясняется на примерах.Further, the present invention is explained in more detail with examples.

ПримерыExamples

1. Восстановление андростен-3,17-диона до 17-β-гидрокси-4-андростен-3-она (тестостерон)1. Recovery of androsten-3,17-dione to 17-β-hydroxy-4-androsten-3-one (testosterone)

A) Двухфазная система с 4-метил-2-пентанолом для регенерации коферментаA) Two-phase system with 4-methyl-2-pentanol for coenzyme regeneration

Для синтеза 17β-гидрокси-4-андростен-3-она (тестостерона) к 0,5 мл буфера (100 мМ триэтаноламина, pH 7, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NAD, 30 единиц рекомбинантной 17-β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) и 50 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Pichia capsulata (DE-A 10327454), добавляют 100 мг андростен-3,17-диона, растворенного в 0,4 мл 4-метил-2-пентанола. Смесь выдерживают 24 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Концентрация андростен-3,17-диона во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.For the synthesis of 17β-hydroxy-4-androsten-3-one (testosterone) to 0.5 ml of buffer (100 mM triethanolamine, pH 7, 1 mM MgCl ₂ , 10% glycerol) containing 0.1 mg NAD, 30 units of recombinant 17-β-hydroxysteroid dehydrogenase from Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) and 50 units of recombinant alcohol dehydrogenase from Pichia capsulata (DE-A 10327454), 100 mg of androsten-3,17-dione dissolved in 0.4 ml of 4-methyl-2-pentanol are added. The mixture was incubated for 24 hours at room temperature with constant stirring. The concentration of androsten-3,17-dione in the entire reaction volume is about 100 g / l.

По окончании реакции реакционную смесь можно переработать, например, экстрагируя реакционную смесь органическим растворителем и затем удаляя растворитель перегонкой.At the end of the reaction, the reaction mixture can be processed, for example, by extracting the reaction mixture with an organic solvent and then removing the solvent by distillation.

Через 24 часа около 94% использованного андростен-3,17-диона превращается в 17-β-гидрокси-4-андростен-3-он (тестостерон).After 24 hours, about 94% of the androsten-3,17-dione used is converted to 17-β-hydroxy-4-androsten-3-one (testosterone).

За превращением андростен-3,17-диона в 17-β-гидрокси-4-андростен-3-он (тестостерон) наблюдали с помощью газовой хроматографии. Для этого применялся газовый хроматограф GC-17A фирмы Shimadzu с хиральной разделительной колонкой Lipodex E, 12m (Machery-Nagel, Düren, Германия), пламенно-ионизационный газоанализатор и гелий в качестве газа-носителя.The conversion of androsten-3,17-dione to 17-β-hydroxy-4-androsten-3-one (testosterone) was monitored by gas chromatography. For this, we used a Shimadzu GC-17A gas chromatograph with a Lipodex E, 12m chiral separation column (Machery-Nagel, Düren, Germany), a flame ionization gas analyzer, and helium as a carrier gas.

B) Двухфазная система с бутилацетатом и 2-пропанолом для регенерации коферментаB) Two-phase system with butyl acetate and 2-propanol for regeneration of coenzyme

Для синтеза 17-β-гидрокси-4-андростен-3-она (тестостерона) к 0,5 мл буфера (100 мМ триэтаноламина, pH 7, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NAD, 30 единиц рекомбинантной 17-β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) и 50 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Pichia capsulata (DE-A 10327454), добавляют 100 мг андростен-3,17-диона, растворенного в 0,3 мл бутилацетата и 0,1 мл 2-пропанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация андростен-3,17-диона во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.For the synthesis of 17-β-hydroxy-4-androsten-3-one (testosterone) to 0.5 ml of buffer (100 mM triethanolamine, pH 7, 1 mM MgCl ₂ , 10% glycerol) containing 0.1 mg NAD, 30 units of recombinant 17-β-hydroxysteroid dehydrogenase from Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) and 50 units of recombinant alcohol dehydrogenase from Pichia capsulata (DE-A 10327454 ), 100 mg of androsten-3,17-dione dissolved in 0.3 ml of butyl acetate and 0.1 ml of 2-propanol are added. The mixture was incubated for 24 hours at room temperature and with constant stirring. The concentration of androsten-3,17-dione in the entire reaction volume is about 100 g / l.

Через 24 часа около 90-95% использованного андростен-3,17-диона превращается в 17-β-гидрокси-4-андростен-3-он (тестостерон).After 24 hours, about 90-95% of the androsten-3,17-dione used is converted to 17-β-hydroxy-4-androsten-3-one (testosterone).

2. Восстановление кетолитохолевой кислоты до хенолитохолевой кислоты2. Reduction of ketolitocholic acid to henolitocholic acid

A) Регенерация коферментов посредством ADH из Thermoanerobium brockii/двухфазная системаA) Coenzyme regeneration by ADH from Thermoanerobium brockii / biphasic system

Для синтеза 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) к 0,2 мл буфера (100 мМ калийфосфатного буфера, pH 8,5, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NADP, 10 единиц рекомбинантной 7-α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151) и 10 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Thermoanerobium brockii, добавляют 100 мг 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) в 0,5 мл метилпентанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.For the synthesis of 3α-7α-dihydroxy-5-β-cholanic acid (chenodeoxycholic acid) to 0.2 ml of buffer (100 mM potassium phosphate buffer, pH 8.5, 1 mM MgCl ₂ , 10% glycerol) containing 0.1 mg NADP, 10 units of recombinant 7-α-hydroxysteroid dehydrogenase from Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151) and 10 units of recombinant alcohol dehydrogenase from Thermoanerobium brockii, add 100 mg of 3α-hydroxy-7-oxo-5-β-cholanoic acid (ketolitochol 0.5 ml methylpentanol. The mixture was incubated for 24 hours at room temperature and with constant stirring. The concentration of ketolitocholic acid in the entire reaction volume is about 100 g / l.

Через 24 часа примерно 90-98% использованной кетолитохолевой кислоты превращается в хенодеоксихолевую кислоту.After 24 hours, approximately 90-98% of the ketolitocholic acid used is converted to chenodeoxycholic acid.

За превращением кетолитохолевой кислоты в хенодеоксихолевую кислоту наблюдают с помощью ВЭЖХ. Для этого применяется разделительная колонка EC125/4 Nucleodur 100-5 C18ec (Machery-Nagel, Düren, Германия) изократического разделения со смесью MeOH/вода (80:20).The conversion of ketolitocholic acid to chenodeoxycholic acid is monitored by HPLC. For this, a separation column EC125 / 4 Nucleodur 100-5 C18ec (Machery-Nagel, Düren, Germany) of isocratic separation with a mixture of MeOH / water (80:20) is used.

B) Регенерация кофермента посредством ADH из лактобацилл (DE 10119274)/двухфазная системаB) Coenzyme regeneration by ADH from lactobacilli (DE 10119274) / two-phase system

Для синтеза 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) к, например, 0,3 мл буфера (100 мМ триэтаноламинового буфера, pH 7, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NADP, 10 единиц рекомбинантной 7-α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Clostridium scindens (Pubmed AAB61151) и 10 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из лактобацилл (DE 10119274), добавляют 100 мг 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) в 0,5 мл октанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.For the synthesis of 3α-7α-dihydroxy-5-β-cholanoic acid (chenodeoxycholic acid), for example, 0.3 ml of a buffer (100 mM triethanolamine buffer, pH 7, 1 mM MgCl ₂ , 10% glycerol) containing 0.1 mg NADP, 10 units of recombinant 7-α-hydroxysteroid dehydrogenase from Clostridium scindens (Pubmed AAB61151) and 10 units of recombinant alcohol dehydrogenase from lactobacilli (DE 10119274), add 100 mg of 3α-hydroxy-7-oxo-5-β-cholanoic acid ( ketolitocholic acid) in 0.5 ml of octanol. The mixture was incubated for 24 hours at room temperature and with constant stirring. The concentration of ketolitocholic acid in the entire reaction volume is about 100 g / l.

Через 24 часа примерно 70-80% использованной кетолитохолевой кислоты превращается в хенодеоксихолевую кислоту.After 24 hours, approximately 70-80% of the ketolitocholic acid used is converted to chenodeoxycholic acid.

3. Восстановление 1,4-андростадиен-3,17-диона в 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-он3. Reduction of 1,4-androstadien-3,17-dione to 17-β-hydroxy-1,4-androstadien-3-one

Для синтеза 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-она к 0,5 мл буфера (100 мМ триэтаноламина, pH 7, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NAD, 30 единиц рекомбинантной 17-β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) и 5 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Pichia capsulata (DE-A 10327454), добавляют 100 мг 1,4-андростадиен-3,17-диона, растворенного в 0,4 мл 4-метил-2-пентанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация 1,4-андростадиен-3,17-диона во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.For the synthesis of 17-β-hydroxy-1,4-androstadien-3-one to 0.5 ml of buffer (100 mM triethanolamine, pH 7, 1 mM MgCl ₂ , 10% glycerol) containing 0.1 mg NAD, 30 units recombinant 17-β-hydroxysteroid dehydrogenase from Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) and 5 units of recombinant alcohol dehydrogenase from Pichia capsulata (DE-A 10327454) 100 mg of 1,4-androstadien-3,17-dione dissolved in 0.4 ml of 4-methyl-2-pentanol are added. The mixture was incubated for 24 hours at room temperature and with constant stirring. The concentration of 1,4-androstadien-3,17-dione in the entire reaction volume is about 100 g / l.

Через 24 часа примерно 90-98% использованного андростен-3,17-диона превращается в 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-он.After 24 hours, approximately 90-98% of the androsten-3,17-dione used is converted to 17-β-hydroxy-1,4-androstadien-3-one.

За превращением 1,4-андростадиен-3,17-диона в 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-он наблюдают с помощью газовой хроматографии. Для этого применяется газовый хроматограф Autosystem XL от Perkin Elmer, оборудованный масс-спектрометром с FS-капиллярной колонкой Optima-5-MS (Machery-Nagel, Düren, Германия), и гелий в качестве газа-носителя.The conversion of 1,4-androstadien-3,17-dione to 17-β-hydroxy-1,4-androstadien-3-one was observed by gas chromatography. For this, an Autosystem XL gas chromatograph from Perkin Elmer, equipped with an Optima-5-MS mass capillary column mass spectrometer (Machery-Nagel, Düren, Germany), and helium as a carrier gas are used.

4. Окисление хенолитохолевой кислоты до кетолитохолевой кислоты4. Oxidation of henolitocholic acid to ketolitocholic acid

A) Регенерация кофермента посредством ADH из Thermoanerobium brockii/двухфазная системаA) Coenzyme regeneration by ADH from Thermoanerobium brockii / biphasic system

Для синтеза 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) к 0,4 мл буфера (100 мМ калийфосфатного буфера, pH 8,5, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NADP, 10 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспрессированную 7-α-гидроксистероидную дегидрогеназу из Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151), и 5 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспрессированную спиртовую дегидрогеназу из Thermoanerobium brockii, добавляют 100 мг 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) в 0,5 мл метилизобутилкетона. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.For the synthesis of 3α-hydroxy-7-oxo-5-β-cholanoic acid (ketolitocholic acid) to 0.4 ml of buffer (100 mM potassium phosphate buffer, pH 8.5, 1 mM MgCl ₂ , 10% glycerol) containing 0, 1 mg NADP, 10 mg wet E. coli biomass containing overexpressed 7-α-hydroxysteroid dehydrogenase from Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151), and 5 mg wet E. coli biomass containing overexpressed alcohol dehydrogenase from Thermoanerobium brocci 100 mg 3 7α-dihydroxy-5-β-cholanoic acid (chenodeoxycholic acid) in 0.5 ml of methyl isobutyl ketone. The mixture was incubated for 24 hours at room temperature and with constant stirring. The concentration of ketolitocholic acid in the entire reaction volume is about 100 g / l.

Через 24 часа более 80% использованной хенодеоксихолевой кислоты превратилось в кетолитохолевую кислоту.After 24 hours, more than 80% of the used chenodeoxycholic acid turned into ketolitocholic acid.

За реакцией кетолитохолевой кислоты в хенодеоксихолевую кислоту наблюдают с помощью тонкослойной хроматографии.The reaction of ketolitocholic acid into chenodeoxycholic acid is monitored by thin layer chromatography.

Для синтеза 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) к 0,15 мл буфера (100 мМ калийфосфатный буфер, pH 7,5, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащему 0,1 мг NADP, 10 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспессированную 7-α-гидроксистероидную дегидрогеназу из Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151), и 5 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспрессированную спиртовую дегидрогеназу из лактобацилл (DE 10119274), добавляют 100 мг 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) в 0,7 мл метилизобутилкетона. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.For the synthesis of 3α-hydroxy-7-oxo-5-β-cholanoic acid (ketolitocholic acid) to 0.15 ml of buffer (100 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, 1 mM MgCl ₂ , 10% glycerol) containing 0, 1 mg of NADP, 10 mg of wet E. coli biomass containing overexpressed 7-α-hydroxysteroid dehydrogenase from Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151), and 5 mg of wet E. coli biomass containing overexpressed alcohol dehydrogenase from lactobacilli 27, 101 add 100 DE (101) DE ( mg 3α-7α-dihydroxy-5-β-cholanoic acid (chenodeoxycholic acid) in 0.7 ml of methyl isobutyl ketone. The mixture was incubated for 24 hours at room temperature and with constant stirring. The concentration of ketolitocholic acid in the entire reaction volume is about 100 g / l.

Через 24 часа более 90% использованной хенодеоксихолевой кислоты превращается в кетолитохолевую кислоту.After 24 hours, more than 90% of the used chenodeoxycholic acid is converted to ketolitocholic acid.

Claims

1. The method of enantioselective enzymatic recovery of oxosteroid compounds of General formula I

Where
R _{1 is} hydrogen, methyl group, hydroxy group or oxo group,
R _{2 is} hydrogen, methyl group, hydroxy group or oxo group,
R _{3 is} hydrogen, a hydroxy group, an oxo group or a methyl group,
R ₄ hydrogen or hydroxy-group,
R _{5 is} hydrogen, the residue is —COR ₁₀ , where R ₁₀ is an unsubstituted or substituted hydroxy group of a C1-C4 alkyl group, or a substituted or unsubstituted C1-C4 carboxyalkyl group,
or R ₄ and R ₅ together mean an oxo group,
R _{6 is} hydrogen, methyl group, hydroxy group or oxo group,
R _{7 is} hydrogen, methyl group, hydroxy group or oxo group,
R _{8 is} hydrogen, a methyl group or a halide, and
R _{9 is} hydrogen, methyl group, hydroxy group, oxo group or halide,
wherein at least one of R ₁ , R ₂ , R ₄ + R ₅ , R ₆ , R ₈ or R ₉ is an oxo group, or R ₅ is a —COR ₁₀ residue, and the structural element

means a benzene ring or a C6 ring with 0, 1 or 2 double bonds CC, or of formula II (ketolitocholic acid)

moreover, the oxosteroid compound is reduced with hydroxysteroid dehydrogenase in the presence of the cofactor NADH or NADPH, characterized in that
a) an oxosteroid compound is present in the reaction mixture at a concentration of ≥50 g / l,
b) the oxidized cofactor NAD or NADP formed by hydroxysteroid dehydrogenase is continuously regenerated through the oxidation of a secondary alcohol of the general formula R _X R _Y CHOH, where R _X , R _Y independently are branched or unbranched C ₁ -C ₈ alkyl and C _total ≥3, or through oxidation of C ₄ -C ₆ cycloalkanol, and
c) additional oxidoreductase / alcohol dehydrogenase is used to oxidize the secondary alcohol of the general formula R _X R _Y CHOH or cycloalkanol.

2. The method according to claim 1, characterized in that 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 4-methyl-2-pentanol, 2-hexanol, 2- are used as the secondary alcohol of the general formula R _X R _Y CHOH heptanol, 5-methyl-2-hexanol or 2-octanol, and cyclohexanol as a cyclic alcohol.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that it is carried out in an aqueous-organic two-phase system.

4. The method according to claim 3, characterized in that it additionally uses an organic solvent, such as diethyl ether, tert-butyl methyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, ethyl acetate, butyl acetate, heptane, hexane or cyclohexane.

5. The method according to claim 1, characterized in that the TTN (total turn over number = moles of the reduced oxosteroid compound per mole of cofactor used) is ≥10 ³ .

6. The method according to claim 1, characterized in that within 2-96 hours at least 50% of the oxosteroid compound used is reduced to a hydroxysteroid compound.

7. The method according to claim 1, characterized in that dexamethasone is used as the oxosteroid compound (formula III)

8. The method according to claim 1, characterized in that 4-androsten-3,17-dione (formula IV) is used as the oxosteroid compound

9. The method according to claim 1, characterized in that 1,4-androstadiene-3,17-dione (formula V) is used as the oxosteroid compound

10. The method according to claim 1, characterized in that estrone (formula VI) is used as the oxosteroid compound

11. The method according to claim 1, characterized in that pregnenolone is used as the oxosteroid compound (formula VII)

12. The method according to claim 1, characterized in that cortisone is used as the oxosteroid compound (formula VIII)

13. The method of enantioselective enzymatic oxidation of hydroxysteroid compounds of General formula I

Where
R _{1 is} hydrogen, methyl group, hydroxy group or oxo group,
R _{2 is} hydrogen, a methyl group, an oxo group or a hydroxy group,
R _{3 is} hydrogen, a hydroxy group, an oxo group or a methyl group,
R ₄ hydrogen or hydroxy-group,
R _{5 is} hydrogen, the residue is COR ₁₀ , wherein R ₁₀ is unsubstituted or
hydroxy-substituted C1-C4-alkyl group or substituted or unsubstituted C1-C4-carboxyalkyl group,
or R ₄ and R ₅ together mean an oxo group,
R _{6 is} hydrogen, methyl group, oxo group or hydroxy group,
R _{7 is} hydrogen, methyl group, oxo group or hydroxy group,
R _{8 is} hydrogen, a methyl group or a halide, and
R _{9 is} hydrogen, methyl group, hydroxy group, oxo group or halide,
and at least one of R ₁ , R ₂ , R ₄ , R ₆ , R ₇ , R ₈ or R ₉ means a hydroxy group, and the structural element

means a benzene ring or a C6 ring with 0, 1 or 2 double bonds CC,
or hydroxysteroid compounds derived from bile acids such as cholic acid, chenodeoxycholic acid, 12-oxocholic acid, 3-hydroxy-12-oxocholic acid, ketolitocholic acid,
moreover, the hydroxysteroid compound is oxidized with hydroxysteroid dehydrogenase in the presence of the cofactor NAD or NADP, characterized in that
a) a hydroxysteroid compound is present in the reaction mixture at a concentration of ≥50 g / l,
b) the reduced NADH or NADPH cofactor formed by hydroxysteroid dehydrogenase is continuously regenerated through the reduction of the keto compound of the general formula R _X R _Y CO, where R _X , R _Y independently are branched or unbranched C ₁ -C ₈ -alkyl, and C _total ≥3, or through reduction of a C ₄ -C ₆ cycloalkanone, and
c) additional oxidoreductase / alcohol dehydrogenase is used to reduce the keto compound of the general formula R _X R _Y CO or cycloalkanone.

14. The method according to item 13, wherein the ketone of the general formula R _X R _Y CO is acetone, 2-butanone, 2-pentanone, 4-methyl-2-pentanone, 2-hexanone, 2-heptanone, 5 -methyl-2-hexanone or 2-octanone, and cyclohexanone is used as cycloalkanone.

15. The method according to PP.13 or 14, characterized in that it is carried out in an aqueous-organic two-phase system.

16. The method according to clause 15, wherein the organic solvent is additionally used, such as diethyl ether, tert-butyl methyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, ethyl acetate, butyl acetate, heptane, hexane or cyclohexane.

17. The method according to item 13, wherein the TTN (total turn over number = moles of oxidized hydroxysteroid compounds per mole of cofactor used) is ≥10 ³ .

18. The method according to item 13, wherein in the range of 2-96 hours at least 50% of the hydroxysteroid compound used is oxidized to the oxosteroid compound.