RU2417090C2 - Макрогранулы агарозы seakem gold, содержащие секреторные клетки, и их применение - Google Patents
Макрогранулы агарозы seakem gold, содержащие секреторные клетки, и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2417090C2 RU2417090C2 RU2008114920/15A RU2008114920A RU2417090C2 RU 2417090 C2 RU2417090 C2 RU 2417090C2 RU 2008114920/15 A RU2008114920/15 A RU 2008114920/15A RU 2008114920 A RU2008114920 A RU 2008114920A RU 2417090 C2 RU2417090 C2 RU 2417090C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- islets
- agarose
- granule
- granules
- coated
- Prior art date
Links
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 title claims abstract description 64
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 18
- 239000010931 gold Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 18
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 15
- 239000007931 coated granule Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 30
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 17
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 14
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract description 14
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 31
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 30
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 21
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 21
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 16
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 13
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 6
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 238000011637 wistar furth rat Methods 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 4
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 4
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 3
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 3
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- 206010018473 Glycosuria Diseases 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010023388 Ketonuria Diseases 0.000 description 2
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000013059 nephrectomy Methods 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 206010011906 Death Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229940075894 denatured ethanol Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001019 normoglycemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004929 secretory organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 210000004887 upper abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/126—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers
- A61K2035/128—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers capsules, e.g. microcapsules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/76—Agarose, agar-agar
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Obesity (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается покрытых агарозой Seakem Gold гранул, содержащих секреторные клетки. Изобретение обеспечивает наименьшее воспаление тканей у реципиентов. 3 н. и 35 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл.
Description
ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение относится к способам повышения качества и увеличения количества секреторных клеток в содержащих их агарозных макрогранулах, покрытых агарозой. Это осуществляют, используя описанную ниже агарозу Seakem Gold.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ И УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В настоящее время установлено, что заместительная терапия островковыми клетками представляет собой подходящий метод лечения пациентов с различными нарушениями. Такие больные включают больных раком, у которых удаляют верхний отдел брюшной полости (Tzakis, et al., Lancet 336: 402- 405 (1990)); панкреатитом (Clayton, et al., Transplantation 76: 92- 98 (2003); Farney, et al., Surgery 110: 427-437 (1991); Fontes, et al., Transplant Proc 24: 2809 (1992); Obenholzer, et al., Transplantation 69: 1115-1123 (2000); Robertson, et al., Diabetes 50: 47-50 (2001)), и инсулинзависимых пациентов, где трансплантация островков представляет собой возможный метод лечения (Goss, et al., Transplantation 74: 1761-1766 (2002); Ricordi, et al, Transplantation 75: 1524-1527 (2003); Ryan, et al., Diabetes 50: 710-719 (2001); Shapiro, et al, N. Engl. J. Med 343: 230-238 (2000)).
Благодаря применению островков в терапии, как указано выше, естественно, существует интерес к созданию способов их выделения. Хотя имеется множество сообщений о выделении островков автоматическим методом (Brandhorst, et al., Exp.Clin. Endocrinol Diabetes 103 Suppl. 2: 3-14 (1995); Cui, et al., Cell Transplant 6: 48-54 (2001); Marchetti, et al., Transplantation 52: 209-213 (1991); Miyamoto, et al., Cell Transplant 7: 397-402 (1998); Nielsen, et al., Сотр. Med. 52: 127-135 (2002); Swanson, et al., Hum. Immunnol 62: 739-749 (2001); Toomey, et al., Brit. J. Surg. 80: 240-243 (1993); Toso, et al., Cell Transplant 9: 297-305 (2000); Wennberg, et al., Transplant. Proc. 33: 2537 (2001)), известно, что выделение островков остается трудной проблемой. Например, во всех нижеперечисленных сообщениях: Bosta, et al, J. Investig Med 43: 555-566 (1995); Krickhahn, et al., Cell Transplant 11: 827-838 (2002); Krickhahn, et al., Ann Transplant 6: 48-54 (2001), O'Neil, et al., Cell Transplant 10: 235-246 (2001) и White, et al., Horm. Metab. Res 31: 579-524 (1999), обсуждаются относящиеся к этому вопросы.
Производство макрогранул, которые содержат секреторные клетки и/или органеллы, такие как раковые клетки, островки и т.д., хорошо известно. См., например, патенты США No. 6818230; 6808705; RE 38027; 6303151; 6224,912; 5888497 и 5643569, а также опубликованную патентную заявку США 2005/0096561.
В этих патентных документах агарозу применяют для инкапсулирования биологических материалов, после чего полученные структуры дополнительно инкапсулируют во второй слой агарозы.
Те, кто знаком с агарозой, знают, что выпускается множество типов и разновидностей этого материала. Seakem Gold, один из таких типов агарозы, описан в патенте США No. 4983268. Авторами настоящего изобретения найдено, что Seakem Gold агароза дает продукт, чьи свойства неожиданно превосходят свойства продуктов предыдущего уровня техники.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На Фигуре 1 представлена информация о средних суточных уровнях глюкозы у тестируемых и контрольных животных.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРИМЕР 1
Островковые клетки (островки) выделяются в соответствии с методом, представленным в Gazda, et al., опубликованная патентная заявка 2006/0121445, дата публикации 8 июня 2006 года, Регистрационный номер 11/273737. Однако следует иметь в виду, что возможны и могут применяться другие методы выделения островков, так что изобретение не зависит от конкретного метода выделения.
После выделения и оценки подходящие поджелудочные железы обрабатывают дальше. Железы освобождают от жира и соединительной ткани, а затем основной проток поджелудочной железы (Вирсунгов проток) канюлируют (игла 16g из нержавеющей стали с тупым концом). Раствор HBSS (солевой раствор Хэнка), содержащий коллагеназу Р, с концентрацией 1.5-2.0 г/л, вливают со скоростью 50 мл/мин при 30°С, чтобы 2 мл раствора приходилось на грамм веса поджелудочной железы.
Поджелудочную железу заливают так, чтобы покрыть ее, добавляя 500 мл раствора HBSS и 2% PS совместно с 200 мл раствора коллагеназы при 30°С. Вода с температурой 39°С, циркулирующая снаружи, медленно нагревает орган до 37°С и поддерживает температуру дигестата при 36-37°С. Когда распад органов становится очевидным (в целом через 10-20 мин и через 5-10 минут после достижения температуры 37°С), ферментативное расщепление прекращают.
Затем собранный дигестат центрифугируют, супернатанты отсасывают и полученный осадок суспендируют в 10% PS и растворе, фиксирующем орган. Затем островки очищают в прерывистом градиенте фиколла с градиентами плотности 1.105, 1.095, 1.085 и 1.05 г/см3, HBSS плюс 2% PS, в пробирках на 50 мл. Содержимое в пробирках центрифугируют при 650 g при 4°С, и слои, содержащие островки, собирают и три раза отмывают в HBSS плюс 10% PS, после чего их вручную очищают от неостровковой ткани с помощью препаровальной лупы. Островки ресуспендируют и для подсчета выхода островков используют два образца по 0.5 мл.
Средний выход для десяти опытных поджелудочных желез составляет 130000 EIN, при 1101 ETN на грамм ферментированной (переваренной, расщепленной) ткани. Чистота во всех случаях превышает 90%. В 9 органах жизнеспособность островков выше 89%.
ПРИМЕР 2
После выделения островков определяют различные показатели, включая чистоту и жизнеспособность, указанные выше.
Чистоту определяют, окрашивая около 500 EIN с помощью DTZ в течение десяти минут, а затем проводят стандартный визуальный анализ с помощью препаровальной лупы и цифровой камеры.
Жизнеспособность определяют, окрашивая образец диацетатом флуоресцеина (FDA) и бромидом этидия (ЕВ). Около 500 EIN добавляют к 1 мл RPMI, 10% PS и 1% антибиотика/антимиотика ("А/А"). Затем добавляют 20 мкл красителя FDA, приготовленного из 10 мг ГО А и 1 мл ацетона, и 200 мкл красителя ЕВ, приготовленного из 30 мкл ЕВ и 1 мл PBS. Островки окрашивают в темноте в течение семи минут, а затем случайные образцы из 10-50 островков рассматривают под флуоресцентным микроскопом и фотографируют для определения жизнеспособности стандартным визуальным анализом.
Также определяют содержание инсулина в островках, помещая около 500 EIN в спиртовый раствор кислоты для экстракции (7.2 мл 1 N НСl, 400 мл 100% денатурированного этанола). Образцы хранят при -20°С и проводят радиоиммунный анализ (РИА, RIA).
| Таблица 1 | |
| Партия № | Содержание инсулина (мЕд/500ЕIN) |
| W1561 | 338.66 |
| O2109 | 1288.69 |
| Y8641 | 775.37 |
| O37360 | 402.59 |
| O786 | 184.40 |
| Y8587 | 669.92 |
| W1102 | 590.05 |
| W1524 | Не опред. |
| O39820 | Не опред. |
| R2027 | 474.55 |
ПРИМЕР 3
В этом и последующих примерах рассматривается вопрос, действительно ли островки, идентифицированные как полезные и выделенные как описано, можно применять в макрогранулах.
Очищенные островки ресуспендируют в RPMI 1640+10% PS+1% А/А до объема 2000 EIN/мл. Островки равномерно распределяют по пробиркам, так чтобы каждая пробирка содержала 1 мл суспензии с 2000 EIN.
После осаждения по весу супернатанты удаляют и к каждому образцу добавляют 0.5 мл 1.5% агарозы Seakem Gold при 50°С, приготовленной в минимальной поддерживающей среде плюс 2.5% HEPES буфер, и равномерно перемешивают. Затем суспензию вытесняют в нижний слой стерильным минеральным маслом, получают четыре бусины (гранулы, сферы) с гладкими поверхностями и равномерным распределением островков.
Макрогранулы (макросферы) удаляют и дважды отмывают (RPMI+5% PS+1% А/А). Эти макрогранулы культивируют в том же растворе, во влажной атмосфере с 5% СО2 в течение 5-7 дней, после чего их трижды отмывают в RPMI+1% А/А, а затем наносят второе агарозное покрытие. Для этого 0.5 мл 5% агарозы в MEM плюс буфер HEPES при 60°С пипеткой переносят в стерильную пластиковую ложечку и каждую макрогранулу прикатывают 3-5 раз, получая однородное второе агарозное покрытие. После переноса в стерильное минеральное масло для получения гладкой поверхности макрогранулы (макросферы, макробусины) удаляют, дважды отмывают в RPMI+2.5% PS+1% А/А и инкубируют при 37°С в увлажненной атмосфере 5% СО2 плюс воздух. Естественно, могут применяться другие методы приготовления гранул (сфер, бусин).
Найдено, что макрогранулы (макросферы), содержащие инкапсулированные островки, остаются жизнеспособными в течение более 6 месяцев, радиоиммуноанализы, проводимые в течение этого времени, показывают, что они продолжают продуцировать высокие выходы инсулина.
ПРИМЕР 4
В данном примере описаны эксперименты, демонстрирующие способность островков поджелудочной железы свиньи функционировать in vivo.
В опыте участвуют не страдающие ожирением, но страдающие диабетом самцы мышей СВ-PrKdc<scid>/J в возрасте 7-9 недель. После акклиматизации в течение недели животным дают 275 мг/кг стрептозотоцина, который вызывает диабет. Через девять дней, когда уровни глюкозы в крови в среднем составляют 480 мг/дл, начинают терапию инсулином.
На 34-35 день после введения стрептозотоцина животные получают около 1000 EIN островков поджелудочной железы свиньи, которые переносят в сгустке крови по методу, описанному в статье Bowen et al., Aust. J. Exp.Biol. Med. Sci. 58: 441-447 (1980). Коротко говоря, островки осаждают (пеллетируют) из суспензии и среды отсасывают. Затем у животного берут около 5-10 мкл крови, добавляют к островкам и дают возможность свертываться. Животных - реципиентов анестезируют равными объемами кетамина (167 мг/дл), ксилазина (33 мг/мл) и физиологического раствора. Смесь вводят подкожно в дозе 0.5 мл/100 г. На левом боку делают небольшой разрез для того, чтобы открыть почку, и с помощью препаровальной лупы делают небольшой разрез в капсуле (оболочке) почки. Затем оболочку отделяют от почки, островки/сгусток помещают под оболочку, разрез закрывают и животных оставляют восстанавливаться.
На 38-39 день проводят нефрэктомию на животных. Коротко говоря, после анестезии почку, несущую трансплантат, раскрывают, кровеносные сосуды почки лигируют и у каждого животного отсекают почку. Через пять дней животных умерщвляют и поджелудочные железы собирают для гистологического подтверждения полного разрушения островковых бета клеток.
Образцы ткани помещают в 10% нейтральный буфер на 24 часа, а затем переносят в 70% этиловый спирт.
После этого ткани заключают в парафин и срезы по 5 мкм окрашивают гематоксилином и эозином. Срезы поджелудочной железы и трансплантированной почки окрашивают традиционными методами для определения инсулин- и глюкагонсодержащих клеток, а затем исследуют.
После пересадки островков все мыши становятся нормогликемическими. После нефрэктомии у всех мышей в течение четырех дней наблюдается гипергликемия.
ПРИМЕР 5
В данном примере описываются эксперименты, предпринятые для определения величины (степени), до которой гранулы (сферы, бусины), покрытые агароза-агарозной оболочкой, приготовленной из различных видов агарозы, вызывают тканевую реакцию, т.е. воспаление, у реципиентов.
В эксперименте участвуют две линии крыс, а именно крысы Wistar и Sprague Dawley. Всего в испытании участвует 29 крыс (14 Wistar, 15 Sprague Dawley). Три крысы каждой линии участвуют в испытании Seakem Gold, покрытых агароза-агарозной оболочкой гранул по изобретению. Три крысы каждой линии участвуют в испытании типов агарозы FMC HGT(P) и Amresco. Две крысы линии Wistar и четыре крысы линии Sprague Dawley участвуют в испытании агарозы Sigma HV. И наконец, три крысы линии Wistar и две крысы линии Sprague Dawley участвуют в испытании агарозы Sigma LV.
Всего шестьдесят пустых (незаполненных, без нагрузки) гранул (сфер, бусин) каждого типа имплантируют в брюшную полость крыс, за двумя исключениями. Двум крысам линии Sprague Dawley имплантируют либо 54, либо 59 гранул агарозы Sigma HV. За крысами наблюдают в течение 3 месяцев, а затем умерщвляют. Для изучения воспаления извлекают различные органы (селезенку, печень, почку, скелетную мышцу, поджелудочную железу и брыжейку).
Воспаление ткани оценивают по стандартам, одобренным Американским Обществом Ветеринарной Патологии. При оценке применяют 6-балльную шкалу для определения воспаления, в основном следующим образом:
0 = нормальное состояние
1 = минимальное (менее 10% воспаление)
2 = слабое (10-25% воспаление)
3 = умеренное (50-75% воспаление)
4 = выраженное (50-75% воспаление)
5 = тяжелое (более 75% воспаление)
Оцениваются данные для каждого животного, затем они усредняются. Результаты представлены ниже:
Средние оценки тяжести по (показателям) ткани:
| Wistar | |||||
| Изобретение | FMC HGT(P) | Sigma HV | Amresco | Sigma LV | |
| Селезенка | 1.0 | 1.7 | 1.3 | 1.0 | 0.7 |
| Печень | 0.0 | 0.3 | 0.3 | 1.0 | 0.7 |
| Почка | 0.3 | 0.7 | 0.3 | 0.5 | 0.7 |
| Скелетная мышца | 0.5 | 1.3 | 1.7 | 0.0 | 2.5 |
| Поджелудочная железа | 1.7 | 1.7 | 1.3 | 2.5 | 2.0 |
| Брыжейка | 2.3 | 3.0 | 2.0 | 2.5 | 3.3 |
| Всего | 5.8 | 8.7 | 6.9 | 7.5 | 9.9 |
| Грубая оценка | 19 | 36 | 25 | 24 | 20 |
Средние оценки тяжести по (показателям) ткани
| Sprague Dawley | |||||
| Изобретение | FMC HGT(P) | Sigma HV | Amresco | Sigma LV | |
| Селезенка | 1.3 | 2.0 | 2.3 | 2.3 | 2.0 |
| Печень | 0.0 | 0.0 | 0.7 | 0.0 | 0.0 |
| Печень | 1.0 | 0.7 | 1.0 | 1.3 | 0.0 |
| Скелетная мышца | 1.3 | 1.0 | 1.5 | 1.5 | 1.0 |
| Поджелудочная железа | 1.7 | 1.3 | 1.7 | 2.3 | 1.0 |
| Брыжейка | 2.3 | 3.0 | 3.0 | 2.3 | 1.5 |
| Всего | 7.6 | 8.0 | 10.2 | 9.7 | 5.5 |
| Грубая оценка | 15 | 24 | 29 | 22 | 27 |
Сумма средних оценок тяжести
| Wistar+Sprague Dawley | |||||
| Изобретение | FMC HGT(P) | Sigma HV | Amresco | Sigma LV | |
| Селезенка | 2.3 | 3.7 | 3.7 | 3.3 | 2.7 |
| Печень | 0.0 | 0.3 | 1.0 | 1.0 | 0.7 |
| Печень | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.8 | 0.7 |
| Скелетная мышца | 1.8 | 2.3 | 3.2 | 1.5 | 3.5 |
| 3.3 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 4.8 | 4.8 |
| Брыжейка | 4.7 | 6.0 | 5.0 | 4.8 | 4.8 |
| Всего | 13.6 | 16.6 | 17.2 | 17.2 | 15.4 |
| Грубая оценка | 34 | 60 | 54 | 46 | 47 |
Очевидно, что покрытые двойной агарозной оболочкой гранулы по изобретению вызывают наименьшее воспаление.
Дальнейшие исследования воспаления проводят на собаках, сравнивая гранулы (бусины, сферы) по изобретению с гранулами, изготовленными из FMC HGT(P) агарозы (FMC HGTP агарозы) и покрытыми ею. И снова гранулы с агароза-агарозными покрытиями по изобретению вызывают меньшее воспаление.
В следующем исследовании собаки получали гранулы с агароза-агарозным покрытием, которые содержат островки поджелудочной железы свиньи. Животных умерщвляют через 2.5 года и наблюдают только минимальное воспаление. По сравнению с контрольными животными, которым не имплантированы островковые клетки, брюшина и брыжейка имеют совершенно нормальный внешний вид.
ПРИМЕР 6
В этих экспериментах макрогранулы из Seakem Gold агарозы, содержащие островки, которые культивировали in vitro, сравнивают с контрольными (пустыми, без нагрузки) макрогранулами.
Островки, инкапсулированные в Seakem агарозу, готовят как описано выше в Примере 3.
В качестве подопытных животных используют двенадцать самцов спонтанно-диабетических ВВ крыс. Все животные в возрасте 10-15 недель, и у всех животных клинические признаки диабета наблюдаются через 3-16 дней.
На 20-21 день после поступления ВВ крыс анестезируют, вводя подкожно кетамин/ксилазин/NaCl в дозе 2.2-2.3 мл/кг массы тела. После анестезии животным пересаживают имплантат из макрогранул, содержащих островки, в дозе, эквивалентной 1.0-кратной суточной потребности в инсулине, или адекватное количество незаполненных (пустых) макрогранул (без нагрузки).
После имплантации животных наблюдают, причем ежедневно записывают клинические наблюдения, включая общее состояние (хорошее, удовлетворительное или неудовлетворительное), масса тела, уровень глюкозы в крови, содержание глюкозы в моче и содержание кетоновых тел в моче, в процессе исследования отбирают образцы сыворотки, чтобы использовать для определения инсулина, глюкагона и свиного С пептида. Для определения этих характеристик применяют радиоиммунный анализ. Также проводят интраперитонеальные тесты на толерантность к глюкозе.
Через девяносто семь дней после имплантации проводят полное некроскопическое обследование животных. Животных усыпляют, обескровливают и вскрывают брюшную полость.
За время исследования в течение 97 дней шести животным, которые получали гранулы из Seakem агарозы, содержащие островки, не требовалось введение инсулина в отличие от животных, которым имплантировали незаполненные макрогранулы. Этим животным начинали вводить экзогенный инсулин через два дня после начала исследования, так как уровни глюкозы в крови поднимались до 300-500 мг/дл. Два из этих контрольных животных обнаружены мертвыми на третий день исследования, по-видимому, вследствие недостаточности инсулина.
У животных, которые получали гранулы из Seakem агарозы, содержащие островки, средние суточные уровни глюкозы в крови значительно ниже, чем у контрольных. Также у шести подопытных животных наблюдается очень узкий интервал отклонений суточных уровней глюкозы, даже без терапии инсулином.
Через один месяц у этих животных, которым пересадили островки, наблюдается умеренная гипергликемия, но с ограниченной гликемической подвижностью (около 100 мг/дл). Этот результат отличаются от результатов, полученных на контрольных животных, у которых наблюдается экстремальное изменение, около 400- 500 мг/дл, несмотря на введение экзогенного инсулина в дозе 2-3 ед./сутки.
Сначала интраперитонеальные тесты на толерантность к глюкозе проводят на всех животных, чтобы подтвердить клинический диагноз диабета типа I. Этот тест проводят также на 8 и 90 дни после трансплантации. За пять дней до трансплантации реакция на сахарную нагрузку не была явной, но на восьмой день после имплантации реципиенты макрогранул, содержащих островки, проявляют заметную реакцию на сахарную нагрузку, т.е. сначала повышение уровня глюкозы в крови с последующим возвратом к нормогликемии. Равным образом гипергликемия не ингибируется у животных, которые получали незаполненные (пустые) макрогранулы, несмотря на одновременную терапию инсулином, описанную выше.
На 90 день после имплантации проводили другой интраперитонеальный тест на толерантность к глюкозе. Снова восстанавливают исходный (базовый) уровень гликемии для крыс, которые получали макрогранулы с островками, но начальные уровни глюкозы в крови значительно выше, а именно 400 мг/дл. Крысам, которые получали незаполненные макрогранулы, не удается восстановить базовую гликемию (исходный уровень).
Анализ на свиной С-пептид не обнаружил пептид в подопытных животных до имплантации или у реципиентов незаполненных (пустых) макрогранул. Напротив, пептид обычно обнаруживают в сыворотке крыс, которым имплантировали макрогранулы с островками, со средним уровнем 0.880 0.249 нг/мл на 21 день после имплантации до 0.662 0.160 нг/дл по окончании исследования.
Подопытных животных также проверяют на гликозурию, кетонурию и необходимость введения бикарбоната. Перед имплантацией заметные различия отсутствуют; однако после этого у реципиентов гранул с островками наблюдалось значительно меньше случаев гликозурии (37 из 56 образцов по сравнению с 67 из 81) и кетонурии (20 из 64 по сравнению с 32 из 54). Необходимость в терапии бикарбонатом также значительно снижается (2 по сравнению с 26).
ПРИМЕР 7
Следующие эксперименты демонстрируют, что Seakem агарозные макрогранулы, которые улавливают островки, могут культивироваться in vitro в течение длительного периода времени и все еще оставаться функциональными.
В этих экспериментах участвует группа из 12 диабетических ВВ мышей, которые удовлетворяют тем же критериям, что и крысы в Примере 6, см. выше, а также 23 крысы Wistar-Furth в возрасте 7-ми недель. Эта вторая группа крыс служит в качестве стандартного контроля.
Пятерым из этих крыс Wistar-Furth инъецируют в хвостовую вену 65 мг/кг стрептозотоцина, чтобы вызвать диабет. Когда два раза подряд получают уровни глюкозы в крови >500 мг/дл, крысы начинают получать терапию инсулином, описанную выше.
Животных анестезируют на 20-21 дни после поступления, вводя внутримышечно 0.1 мл/100 г кетамина / (60 мг/мл), ксилазин (6 мг/мл), /бутарфенол (3 мг/мл).
После анестезии все ВВ крысы получают гранулы Seakem агарозы, содержащие островки, как описано выше. Крыс делят на три группы по 4 крысы и дают макрогранулы, которые культивировали, in vitro, в течение 9 недель, 40 недель или 67 недель. Количество введенных макрогранул эквивалентно 1.0х суточной потребности животного в инсулине.
Пять крыс Wistar-Furth получают макрогранулы, которые культивировали, in vitro, в течение 7.8-11.5 недель, в той же дозе, что и ВВ крысы. Это составляет примерно 45-49 макрогранул на крысу Wistar-Furth и 56-60 на крысу ВВ.
За время экспериментов крысы прибавляют в весе в среднем около 75 г. В результате на 97 день после первой имплантации проводят дополнительную имплантацию крысам ВВ. Среднее необходимое крысам количество инсулина перед имплантации составляет 0.0083 ед. инсулина/ г веса тела. Расчеты исходя из этого значения показывают, что для выработки 39.19 ед. инсулина за 24 часа нужно 17 макрогранул, содержащих островки. Как объясняется ниже, вследствие того, что перед второй имплантацией у каждой крысы извлекают 4 гранулы, вводят 21 макрогранулу, которую культивировали в течение 19 недель. Крысы Wistar- Furth не получают второй имплантат.
В данном Примере проводят различные анализы и теми же методами, что и Примере 7.
В дни 201-202 после имплантации проводят полную некроскопию, так же как описано выше.
Средние суточные уровни глюкозы в крови показаны на фигуре 1. После имплантации нормогликемия (100-200 мг/дл) у ВВ крыс восстанавливается примерно в течение одного месяца. После этого у ВВ крыс развивается умеренная гипергликемия (200-400 мг/дл), и этот показатель устойчиво удерживается остальное время эксперимента. Это развитие (появление) умеренной гипергликемии и достижение максимального веса тела происходит одновременно. Вес тела остается постоянным, тогда как уровни глюкозы в крови колеблются между 300- 400 мг/дл в течение остального времени эксперимента. В трех группах крыс, которые получали содержащие островки макрогранулы Seakem Gold, не наблюдается разницы между средними суточными уровнями глюкозы вне зависимости от продолжительности in vitro культивирования гранул.
У крыс Wistar-Furth, у которых был вызван диабет, также визуализируется нормогликемия примерно в течение месяца, после чего наблюдается умеренная гипергликемия.
Выше отмечалось, что второй имплантат вводят крысам ВВ через 97 дней после включения в исследования. Этот второй имплантат не влияет на величины суточных уровней глюкозы в крови.
Свиной С пептид также анализируют и обнаруживают во всех трех группах крыс ВВ. В течение 88 дней эксперимента средний уровень свиного С пептида снижается от 0.6-0.9 нг/мл до 0.2-0.4 нг/мл. На 116 день после введения второго имплантата уровни пептидов повышаются в среднем до 0.3-0.7 нг/мл, причем при некроскопии в перитонеальной жидкости наблюдается повышение в 40 раз.
Тесты с сахарной нагрузкой проводят в течение всего исследования на всех крысах, которым вводят имплантаты макрогранул с островками. Не наблюдают никакой разницы в способности макрогранул, культивированных различное время, отвечать на сахарную нагрузку. А именно уровни глюкозы в крови у всех ВВ крыс примерно удваиваются по сравнению с начальной величиной 100-200 мг/дл. Возврат к исходной гликемии происходит через 120 минут у 10 из 12 животных. Эта реакция аналогична реакции, наблюдаемой у нормальных животных линии Wistar-Furth.
В конечном счете у всех подопытных животных появляется умеренная гипергликемия, но тест с сахарной нагрузкой на 105 день после трансплантации начальный подъем, а затем возврат к начальной (базовой) гликемии. Через 200 дней после трансплантации наблюдается только слабое повышение исходной гликемии после введения глюкозы, а затем возврат к базовой (исходной, начальной) гликемии.
Результаты этих исследований при сравнении их с работой Jain et al. в Transplantation, см. выше, показывают, что содержащие островки агарозные гранулы, в которых агароза представляет собой Seakem Gold, неожиданно оказались лучше, чем гранулы, описанные Jain et al.. Например, Jain et al. сообщают, что 40% подопытных животных умерли к 200 дню, тогда как коэффициент смертности при использовании макрогранул по изобретению равен нулю. Кроме того, результаты, достигнутые в данном описании, получают, используя половинное от описанного в Jain et al. количество макрогранул. Далее в результатах, не представленных конкретно в данном описании, после некроскопии определялись уровни продуцирования инсулина в извлеченных макрогранулах, и они значительно выше, чем уровни инсулина в макрогранулах, извлеченных после некроскопии, в работе Jain et al.
ПРИМЕР 8
Проводят эксперименты по сравнению прочности гранул по изобретению с гранулами, приготовленными из FMC HGT(P) агарозы и покрытыми ею.
В этих тестах гранулы помещают по отдельности в устройство для компрессии (пресс) с верхней и нижней пластиной. Верхнюю пластину опускают вниз со скорость 12 дюймов (304.8 мм) в минуту, и на гранулы оказывают давление до тех пор, пока они не разрушатся. Определяют силу сжатия (максимальное сжатие) в lbf.
Для HGT(P) максимальная величина сжатия находится в интервале 0.714-3.183 lbf, среднее значение 1.958 и стандартное отклонение 0.5444. Для продуктов по изобретению интервал составляет 2.322-6.418 lbf, среднее значение 4.282 и стандартное отклонение 1.096.
Очевидно, что гранулы по изобретению являются механически более прочными, чем гранулы с другими агароза-агарозными покрытиями.
В предыдущих примерах описаны различные признаки изобретения, которые относятся к содержащим секреторные клетки агарозные макрогранулы, покрытые агарозой, где используемая агароза представляет собой агарозу Seakem Gold.
Употребляемый в данном описании термин "макрогранула" ("макросфера", "макробусина") относится к структуре, которая является практически сферической, с диаметром примерно от 4 до примерно 10-12 мм, наиболее предпочтительно около 6-8 мм в диаметре. Толщина второго агарозного слоя предпочтительно составляет около 0.05-5 мм, более предпочтительно около 0.5-5 мм, еще более предпочтительно около 1.0-3 мм и наиболее предпочтительно, около 1.0-2.0 мм. Второй агарозный слой может представлять собой, но не обязательно, слой из Seakem Gold агарозы.
"Макрогранулы" ("макробусины", "макросферы") используют в качестве предпочтительной структуры; однако любая твердая агарозная структура, которая инкапсулирует секреторные клетки и предпочтительно покрыта вторым агарозным слоем, является отличительным признаком изобретения.
Секреторные клетки могут варьироваться (отличаться). Любая клетка или органелла, которая дает заданный секреторный продукт, может быть инкапсулирована. Островки, раковые клетки и стволовые клетки являются примерами типов материалов, которые можно использовать. Каждая гранула может содержать различное число клеточных органелл, что касается островков примерно 50-5000 островков, более предпочтительно примерно 100-2500 островков, еще более предпочтительно примерно 250-1000 и наиболее предпочтительно примерно 475-550 островков. Особенно предпочтительно около 500 островков.
Другие аспекты изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники и не требуют дополнительных уточнений.
Употребляемые термины и выражения используются в качестве терминов для описания, а не для ограничения или для исключения любых эквивалентов показанных или описанных отличительных признаков или их элементов, очевидно, что в объеме формулы изобретения возможны различные модификации.
Claims (38)
1. Способ получения покрытой агарозой гранулы из Seakem Gold агарозы для лечения диабета, содержащей секреторные клетки, включающий
(а) суспендирование секреторных клеток в Seakem Gold агарозе,
(б) образование гранулы из указанных суспендированных секреторных клеток со стадии (а),
(в) инкубацию гранулы, полученной на стадии (б), в увлажненной атмосфере,
(г) нанесение на гранулу, полученную на стадии (в), покрытия из агарозы для получения покрытой агарозой гранулы из агарозы Seakem Gold с секреторными клетками.
(а) суспендирование секреторных клеток в Seakem Gold агарозе,
(б) образование гранулы из указанных суспендированных секреторных клеток со стадии (а),
(в) инкубацию гранулы, полученной на стадии (б), в увлажненной атмосфере,
(г) нанесение на гранулу, полученную на стадии (в), покрытия из агарозы для получения покрытой агарозой гранулы из агарозы Seakem Gold с секреторными клетками.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий прикатывание гранулы, полученной на стадии (в), в 5%-ной агарозе, контактирование прикатанной гранулы с минеральным маслом и промывку прикатанной гранулы с образованием покрытой агарозой макрогранулы из агарозы Seakem Gold с секреторными клетками.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что секреторные клетки представляют собой островки поджелудочной железы.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что островки представляют собой островки поджелудочной железы человека.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что островки представляют собой островки поджелудочной железы крупного рогатого скота.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что островки представляют собой островки поджелудочной железы свиньи.
7. Способ по п.3, отличающийся тем, что гранула содержит 50- 5000 островков.
8. Способ по п.3, отличающийся тем, что гранула содержит 100- 2500 островков.
9. Способ по п.3, отличающийся тем, что гранула содержит 475- 550 островков.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что гранула представляет собой макрогранулу диаметром 4-12 мм.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что диаметр макрогранулы равен 4-10 мм.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что диаметр макрогранулы равен 4-8 мм.
13. Способ по п.10, отличающийся тем, что диаметр макрогранулы равен 6-8 мм.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что покрытие гранулы слоем агарозы имеет толщину 0,05-5,0 мм.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что покрытие гранулы слоем агарозы имеет толщину 1,0-3,0 мм.
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что покрытие гранулы слоем агарозы имеет толщину 1,0-2,0 мм.
17. Покрытая агарозой гранула из Seakem Gold агарозы с секреторными клетками, предназначенная для лечения диабета.
18. Гранула по п.17, отличающаяся тем, что гранула содержит островки поджелудочной железы
19. Гранула по п.18, отличающаяся тем, что островки представляют собой островки поджелудочной железы человека.
20. Гранула по п.18, отличающаяся тем, что островки представляют собой островки поджелудочной железы крупного рогатого скота.
21. Гранула по п.18, отличающаяся тем, что островки представляют собой островки поджелудочной железы свиньи.
22. Гранула по п.18, содержащая 50-5000 островков.
23. Гранула по п.18, содержащая 100-2500 островков.
24. Гранула по п.18, содержащая 475-550 островков.
25. Гранула по п.18, диаметр которой равен 4-12 мм.
26. Гранула по п.18, диаметр которой равен 4-10 мм.
27. Гранула по п.18, диаметр которой равен 4-8 мм.
28. Гранула по п.18, диаметр которой равен 6-8 мм.
29. Гранула по п.17, отличающаяся тем, что она покрыта слоем агарозы толщиной 0,05-5,0 мм.
30. Гранула по п.17, отличающаяся тем, что она покрыта слоем агарозы толщиной 1,0-3,0 мм.
31. Гранула по п.17, отличающаяся тем, что она покрыта слоем агарозы толщиной 1,0-2,0 мм.
32. Способ лечения диабета, заключающийся во введении покрытых агарозой гранул из Seakem Gold агарозы с секреторными клетками по п.17.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что указанное состояние представляет собой инсулинозависимый диабет.
34. Способ по п.32, отличающийся тем, что гранула содержит островки.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что островки представляют собой островки поджелудочной железы человека.
36. Способ по п.34, отличающийся тем, что островки представляют собой островки поджелудочной железы свиньи.
37. Способ по п.34, отличающийся тем, что островки представляют собой островки поджелудочной железы крупного рогатого скота.
38. Способ по п.32, отличающийся тем, что гранулы помещают в брюшную полость больного диабетом.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72091705P | 2005-09-26 | 2005-09-26 | |
| US60/720,917 | 2005-09-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008114920A RU2008114920A (ru) | 2009-11-10 |
| RU2417090C2 true RU2417090C2 (ru) | 2011-04-27 |
Family
ID=37900243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008114920/15A RU2417090C2 (ru) | 2005-09-26 | 2006-09-14 | Макрогранулы агарозы seakem gold, содержащие секреторные клетки, и их применение |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8518394B2 (ru) |
| EP (1) | EP1928249B1 (ru) |
| JP (1) | JP4937265B2 (ru) |
| KR (1) | KR101110386B1 (ru) |
| CN (1) | CN101272690B (ru) |
| AT (1) | ATE547004T1 (ru) |
| AU (1) | AU2006295114B2 (ru) |
| CA (1) | CA2622529C (ru) |
| DK (1) | DK1928249T3 (ru) |
| ES (1) | ES2379008T3 (ru) |
| IL (1) | IL190028A (ru) |
| NO (1) | NO341154B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ566621A (ru) |
| PL (1) | PL1928249T3 (ru) |
| PT (1) | PT1928249E (ru) |
| RU (1) | RU2417090C2 (ru) |
| WO (1) | WO2007038029A2 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2801370C (en) | 2010-11-23 | 2018-03-06 | The Rogosin Institute, Inc. | Method for isolating a chemotherapeutic agent resistant cancer cell with stem cell properties |
| KR101722824B1 (ko) * | 2012-01-31 | 2017-04-03 | 로고신 인스티튜트 | 매크로비드의 개선된 제조방법 |
| US9555007B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-01-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Multi-layer hydrogel capsules for encapsulation of cells and cell aggregates |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE38027E1 (en) * | 1994-01-13 | 2003-03-11 | The Rogosin Institute | Preparation of agarose coated, solid agarose-collagen beads containing secretory cells |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5441878A (en) * | 1987-12-08 | 1995-08-15 | Thies Technology, Inc. | Preparation of uniform droplets by using gas pressure to force liquid from a syringe and flowing gas to detach droplets |
| US5053332A (en) * | 1989-07-24 | 1991-10-01 | Cook Richard B | Agarose beads, preferably incorporating biological materials |
| US4983268A (en) * | 1989-08-03 | 1991-01-08 | Fmc Corporation | High gel strength low electroendosmosis agarose |
| CA2140864A1 (en) * | 1992-07-23 | 1994-02-03 | William C. Snow | Glucomannan spongeous matrices |
| US5651980A (en) * | 1994-04-15 | 1997-07-29 | Biohybrid Technologies, Inc. | Methods of use of uncoated gel particles |
| US6224912B1 (en) * | 1996-04-03 | 2001-05-01 | The Rogo Institute | Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment |
| US5888497A (en) * | 1996-04-03 | 1999-03-30 | The Rogosin Institute | Agarose coated agarose beads containing cancer cells that produce material which suppresses cancer cell proliferation |
| US6303151B1 (en) * | 1996-04-03 | 2001-10-16 | The Rogosin Institute | Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment |
| US7128931B2 (en) * | 2003-10-17 | 2006-10-31 | Francois Leblond | Semi-permeable microcapsule with covalently linked layers and method for producing same |
| US6997864B2 (en) * | 2003-11-03 | 2006-02-14 | Otologics, Llc | Method for obtaining diagnostic information relating to a patient having an implanted transducer |
| KR100890375B1 (ko) * | 2004-11-17 | 2009-03-25 | 더 로고신 인스티튜트, 인크. | 아일렛 분리를 위한 췌장 적합성을 판단하는 점수 부여방법 |
-
2006
- 2006-09-14 NZ NZ566621A patent/NZ566621A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-09-14 WO PCT/US2006/036125 patent/WO2007038029A2/en not_active Ceased
- 2006-09-14 ES ES06803714T patent/ES2379008T3/es active Active
- 2006-09-14 AT AT06803714T patent/ATE547004T1/de active
- 2006-09-14 CA CA2622529A patent/CA2622529C/en active Active
- 2006-09-14 DK DK06803714.2T patent/DK1928249T3/da active
- 2006-09-14 AU AU2006295114A patent/AU2006295114B2/en not_active Ceased
- 2006-09-14 US US11/521,977 patent/US8518394B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-14 KR KR1020087007337A patent/KR101110386B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-14 PT PT06803714T patent/PT1928249E/pt unknown
- 2006-09-14 RU RU2008114920/15A patent/RU2417090C2/ru active
- 2006-09-14 CN CN2006800352377A patent/CN101272690B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-14 PL PL06803714T patent/PL1928249T3/pl unknown
- 2006-09-14 EP EP06803714A patent/EP1928249B1/en active Active
- 2006-09-14 JP JP2008532295A patent/JP4937265B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-03-09 IL IL190028A patent/IL190028A/en active IP Right Grant
- 2008-03-10 NO NO20081232A patent/NO341154B1/no not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE38027E1 (en) * | 1994-01-13 | 2003-03-11 | The Rogosin Institute | Preparation of agarose coated, solid agarose-collagen beads containing secretory cells |
| RU2208636C2 (ru) * | 1994-01-13 | 2003-07-20 | Дзе Рогозин Институт | Макрогранула с секреторными клетками, способ ее получения и способ лечения заболеваний, вызванных нарушением функционирования секреторных клеток |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BURLAND V. et al. Agarose gel analysis of 15-40-kb PCR amplimers. Biotechniques. 1996, Jul.; 21 (1):142-4. * |
| www.cambrex.com/bioproducts. MARGEL S. et al. Specific hemoperfusion through agarose acrobeads. Appl Biochem Biotechnol. 1986 Feb; 12(1):37-66. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2006295114A1 (en) | 2007-04-05 |
| CN101272690A (zh) | 2008-09-24 |
| NZ566621A (en) | 2010-07-30 |
| WO2007038029A3 (en) | 2007-09-20 |
| IL190028A (en) | 2014-12-31 |
| CA2622529A1 (en) | 2007-04-05 |
| DK1928249T3 (da) | 2012-06-18 |
| AU2006295114B2 (en) | 2010-01-28 |
| ES2379008T3 (es) | 2012-04-19 |
| CA2622529C (en) | 2014-02-18 |
| US20070071732A1 (en) | 2007-03-29 |
| NO20081232L (no) | 2008-04-23 |
| WO2007038029A2 (en) | 2007-04-05 |
| ATE547004T1 (de) | 2012-03-15 |
| JP4937265B2 (ja) | 2012-05-23 |
| EP1928249A4 (en) | 2010-04-07 |
| CN101272690B (zh) | 2012-08-29 |
| EP1928249B1 (en) | 2012-02-29 |
| JP2009509507A (ja) | 2009-03-12 |
| PL1928249T3 (pl) | 2012-11-30 |
| PT1928249E (pt) | 2012-05-25 |
| IL190028A0 (en) | 2008-08-07 |
| KR101110386B1 (ko) | 2012-03-08 |
| US8518394B2 (en) | 2013-08-27 |
| NO341154B1 (no) | 2017-09-04 |
| HK1116995A1 (en) | 2009-01-09 |
| RU2008114920A (ru) | 2009-11-10 |
| KR20080071122A (ko) | 2008-08-01 |
| EP1928249A2 (en) | 2008-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Korbutt et al. | Large scale isolation, growth, and function of porcine neonatal islet cells. | |
| KR100374976B1 (ko) | 기능성랑게르한스섬의시험관내성장및그생체내사용방법 | |
| US8142769B2 (en) | Preparation and xenotransplantation of porcine islets | |
| O'neil et al. | The isolation and function of porcine islets from market weight pigs | |
| RU2417090C2 (ru) | Макрогранулы агарозы seakem gold, содержащие секреторные клетки, и их применение | |
| US7507581B2 (en) | Inhibition of pancreatic islet aggregation | |
| WO2010068728A2 (en) | Engineering functional tissue from cultured cells | |
| US7413871B2 (en) | Scoring method for determining pancreas suitability for islet isolation | |
| CA2887532A1 (en) | Improved reliability of assays using a multi-divot platform and multi-source, multi-cell type clusters | |
| MX2008003102A (en) | Secretory cell-containing macrobeads comprising seakem gold agarose, and uses thereof | |
| EP1812583B1 (en) | Scoring method for determining pancreas suitability for islet isolation | |
| HK1116995B (en) | Secretory cell-containing macrobeads comprising seakem gold agarose, and uses thereof |