RU2415940C1 - PLASMID VECTOR pE-Lc-LTP, Escherichia coli BACTERIUM STRAIN FOR EXPRESSION OF LIPID-TRANSPORTING LENTIL PROTEINS Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PROTEINS - Google Patents
PLASMID VECTOR pE-Lc-LTP, Escherichia coli BACTERIUM STRAIN FOR EXPRESSION OF LIPID-TRANSPORTING LENTIL PROTEINS Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PROTEINS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2415940C1 RU2415940C1 RU2009129838/10A RU2009129838A RU2415940C1 RU 2415940 C1 RU2415940 C1 RU 2415940C1 RU 2009129838/10 A RU2009129838/10 A RU 2009129838/10A RU 2009129838 A RU2009129838 A RU 2009129838A RU 2415940 C1 RU2415940 C1 RU 2415940C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ltp
- protein
- plasmid vector
- hybrid polypeptide
- lipid
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 18
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 235000010666 Lens esculenta Nutrition 0.000 title abstract description 4
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 title description 5
- 241000219739 Lens Species 0.000 title description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 21
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 16
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 8
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 39
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 14
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 abstract description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 abstract 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract 1
- 235000019704 lentil protein Nutrition 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102220571098 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 7_M37L_mutation Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 3
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 acyl coenzyme A derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical group OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- BTLHODXEDLCLAD-VKHMYHEASA-N (2s)-2-(carboxymethylamino)butanedioic acid Chemical compound OC(=O)CN[C@H](C(O)=O)CC(O)=O BTLHODXEDLCLAD-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical class S=C1NC(=O)CN1C1=CC=CC=C1 PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014036 Castanea Nutrition 0.000 description 1
- 241001070941 Castanea Species 0.000 description 1
- 241000723382 Corylus Species 0.000 description 1
- 235000007466 Corylus avellana Nutrition 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000758791 Juglandaceae Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000207836 Olea <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108700011066 PreScission Protease Proteins 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000184 acid digestion Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- PRFXRIUZNKLRHM-OSJNIVAESA-N prostaglandin b2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\C1=C(C\C=C\CCCC(O)=O)C(=O)CC1 PRFXRIUZNKLRHM-OSJNIVAESA-N 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению липид-транспортирующих белков чечевицы Lens culinaris, которые могут найти применение в области сельского хозяйства в качестве факторов, повышающих устойчивость растений к инфекциям, и в медицинской практике для диагностики и лечения пищевой аллергии.The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the production of lipid-transporting proteins of lentils Lens culinaris, which can be used in agriculture as factors that increase the resistance of plants to infections, and in medical practice for the diagnosis and treatment of food allergies.
Растительные липид-транспортирующие белки (LTP) представляют собой семейство небольших катионных белков с молекулярной массой около 7 или 9 кДа. Данные белки характеризуются высокой стабильностью, они обладают устойчивостью к химической и тепловой денатурации, а также к действию протеаз. Для пространственной структуры LTP характерно наличие гидрофобной впадины, образованной тремя или четырьмя α-спиралями и длинным С-концевым фрагментом. Установлено, что LTP участвуют во многих биологических процессах в растениях, таких как синтез кутана, эмбриогенез, адаптация к стрессовым условиям окружающей среды, защита растений от фитопатогенов.Plant lipid-transporting proteins (LTPs) are a family of small cationic proteins with a molecular weight of about 7 or 9 kDa. These proteins are characterized by high stability, they are resistant to chemical and thermal denaturation, as well as to the action of proteases. The spatial structure of LTP is characterized by the presence of a hydrophobic depression formed by three or four α-helices and a long C-terminal fragment. It has been established that LTP is involved in many biological processes in plants, such as synthesis of cutane, embryogenesis, adaptation to stressful environmental conditions, and protection of plants from phytopathogens.
Характерным свойством растительных LTP является способность связывания и переноса липидов через биомембраны in vitro. Растительные LTP связывают жирные кислоты с цепью длиной С10-C18, ацильные производные кофермента А, фосфолипиды, липиды кожи, галактолипиды, простагландин B2 и амфотерицин В. Данные белки также осуществляют перенос фосфолипидов через мембраны. Эти свойства растительных LTP делают возможным их применение как лиганд-связывающих белков для создания систем направленной доставки лекарственных и косметических средств.A characteristic property of plant LTP is the ability to bind and transfer lipids through biomembranes in vitro. Plant LTPs bind C 10 -C 18 chain fatty acids, acyl coenzyme A derivatives, phospholipids, skin lipids, galactolipids, prostaglandin B 2 and amphotericin B. These proteins also carry phospholipids through membranes. These properties of plant-based LTPs make it possible to use them as ligand-binding proteins to create targeted drug and cosmetic delivery systems.
Растительные LTP обладают антимикробной активностью в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, а также ингибируют рост широкого спектра фитопатогенных грибов. Данные свойства успешно используют для создания трансгенных растений, несущих гены растительных LTP и обладающих повышенной устойчивостью к заболеваниям.Plant LTPs have antimicrobial activity against both gram-positive and gram-negative bacteria, and also inhibit the growth of a wide range of phytopathogenic fungi. These properties have been successfully used to create transgenic plants that carry plant LTP genes and are highly resistant to disease.
Представители семейства LTP являются растительными аллергенами, участвующими в развитии аллергических реакций на пыльцу, растительные продукты и латекс. Пищевыми аллергенами являются LTP, выделенные из ряда фруктов (яблоко, персик, слива, вишня, апельсин, виноград и др.), овощей (салат-латук, спаржа, лук, морковь), орехов (фундук, грецкий орех, каштан) и злаков (кукуруза, ячмень). Пыльцевыми аллергенами являются LTP из маслин, сельдерея, арабидопсиса, чернобыльника, турнепсиса и др. В последнее время увеличивается актуальность получения рекомбинантных белковых аллергенов, которые биохимически и иммунологически хорошо охарактеризованы и могут быть использованы для диагностики и лечения аллергии.Representatives of the LTP family are plant allergens involved in the development of allergic reactions to pollen, plant products and latex. Food allergens are LTP isolated from a number of fruits (apple, peach, plum, cherry, orange, grapes, etc.), vegetables (lettuce, asparagus, onions, carrots), nuts (hazelnuts, walnuts, chestnuts) and cereals (corn, barley). Pollen allergens are LTP from olives, celery, arabidopsis, Chernobyl, turnipsis and others. Recently, the relevance of obtaining recombinant protein allergens, which are biochemically and immunologically well characterized and can be used to diagnose and treat allergies, has been increasing.
Липид-транспортирующие белки чечевицы Lens culinaris (Lc-LTP) (SEQ ID Nos. 1-8) составляют подсемейство липид-транспортирующих белков, выделенных из проращенных семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris и подавляющих рост почвенной фитопатогенной бактерии Agrobacterium tumefaciens [Финкина Е.И. и др. (2007) Биохимия, 72(4): 533-43]. Данные белки состоят из 92-93 аминокислотных остатков и содержат восемь остатков цистеина, формирующих четыре дисульфидные связи. Белки-предшественники Lc-LTP 1-8 содержат типичный для растительных LTP сигнальный пептид, состоящий из 24-25 остатков.Lens culinaris lentil lipid-transporting proteins (Lc-LTP) (SEQ ID Nos. 1-8) comprise a subfamily of lipid-transporting proteins isolated from germinated lentil seeds of ordinary Lens culinaris and inhibiting the growth of the soil phytopathogenic bacterium Agrobacterium tumefaciens [Finkin E. I. et al. (2007) Biochemistry, 72 (4): 533-43]. These proteins are composed of 92-93 amino acid residues and contain eight cysteine residues forming four disulfide bonds. Lc-LTP 1-8 precursor proteins contain a typical plant LTP signal peptide of 24-25 residues.
Известен способ получения Lc-LTP, заключающийся в гомогенизации проращенных семян чечевицы, экстракции, высаливании белков и нескольких последовательных стадий очистки, включающих гель-фильтрацию, ионообменную и обращенно-фазовую хроматографии [Финкина Е.И. и др. (2007) Биохимия, 72(4): 533-43]. Недостатками данного способа является сложная схема очистки и трудность очистки целевого белка от примеси родственных изоформ.A known method of producing Lc-LTP, which consists in the homogenization of germinated lentil seeds, extraction, salting out of proteins and several successive purification steps, including gel filtration, ion exchange and reverse phase chromatography [Finkina E.I. et al. (2007) Biochemistry, 72 (4): 533-43]. The disadvantages of this method is the complex purification scheme and the difficulty of purification of the target protein from impurities of related isoforms.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента биологически активных растительных белков и получения липид-транспортирующих белков чечевицы Lens culinaris (Lc-LTP).The invention solves the problem of expanding the range of biologically active vegetable proteins and obtaining lipid-transporting proteins of lentils Lens culinaris (Lc-LTP).
Поставленная задача решается за счет конструирования плазмидного вектора pE-Lc-LTP для экспрессии в клетках Escherichia coli белков Lc-LTP, содержащего ген гибридного полипептида Trx-Lc-LTP, включающего аминокислотную последовательность Lc-LTP, последовательность белка тиоредоксина и аффинную метку, создания штамма-продуцента данного гибридного полипептида на основе штамма E.coli путем трансформации его указанным вектором и способа получения целевого белка Lc-LTP путем экспрессии содержащего его гибридного полипептида Trx-Lc-LTP в клетках указанного штамма, разрушения клеток, аффинной очистки гибридного полипептида Trx-Lc-LTP на металлохелатном носителе, расщепления гибридного белка по сайту, расположенному между последовательностями Lc-LTP и тиоредоксина, и очистки целевого белка Lc-LTP с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.The problem is solved by constructing the plasmid vector pE-Lc-LTP for expression of Lc-LTP proteins in Escherichia coli cells containing the Trx-Lc-LTP hybrid polypeptide gene, including the amino acid sequence Lc-LTP, the thioredoxin protein sequence and affinity tag, creating a strain producer of this hybrid polypeptide based on the E. coli strain by transforming it with the indicated vector and a method for producing the target Lc-LTP protein by expressing the Trx-Lc-LTP hybrid polypeptide containing it in cells of the specified strain, sheniya cells, affinity purification of the fusion polypeptide Trx-Lc-LTP on the metal chelate carrier, the fusion protein cleavage site located between the sequences of Lc-LTP and thioredoxin and purification Lc-LTP target protein by reverse-phase HPLC.
Особенностью предлагаемого вектора pE-Lc-LTP является присутствие в его составе гена, кодирующего один из белков подсемейства липид-транспортирующих белков чечевицы (Lc-LTP). Высокого уровня экспрессии и растворимости Lc-LTP в клетках Е.coli достигают за счет того, что указанный ген кодирует гибридный белок Trx-Lc-LTP, содержащий, наряду с аминокислотной последовательностью белка Lc-LTP, белок тиоредоксин в качестве белка-носителя. С целью дальнейшего высвобождения целевого белка Lc-LTP из молекулы гибридного белка Trx-Lc-LTP между последовательностями Lc-LTP и тиоредоксина вводят, как минимум, один сайт, позволяющий проводить избирательное расщепление гибридного полипептида химическим или ферментативным способом. Сайт для расщепления химическим способом может представлять собой остаток Met (расщепление бромцианом), дипептид Asp-Pro (расщепление кислотным гидролизом при нагревании), дипептид Asn-Gly (расщепление гидроксиламином). Сайт для расщепления ферментативным способом может представлять собой сайт расщепления тромбином, энтерокиназой, фактором Ха, протеазой PreScission, протеазой TEV или протеазой HRV 3С [Amau J. et al. (2006) Protein Expr Purif. 48(1): 1-13].A feature of the proposed vector pE-Lc-LTP is the presence in its composition of a gene encoding one of the proteins of the subfamily of lipid-transporting proteins of lentils (Lc-LTP). The high level of expression and solubility of Lc-LTP in E. coli cells is achieved due to the fact that this gene encodes a Trx-Lc-LTP fusion protein containing, along with the amino acid sequence of the Lc-LTP protein, a thioredoxin protein as a carrier protein. In order to further release the target Lc-LTP protein from the Trx-Lc-LTP fusion protein molecule, at least one site is introduced between the Lc-LTP and thioredoxin sequences, allowing the chemical polypeptide to be selectively cleaved by a chemical or enzymatic method. The chemical cleavage site may be a Met residue (cyanogen bromide cleavage), Asp-Pro dipeptide (acid hydrolysis digestion when heated), Asn-Gly dipeptide (hydroxylamine cleavage). The enzymatic cleavage site may be a thrombin, enterokinase, factor Xa, PreScission protease, TEV protease or HRV 3C protease cleavage site [Amau J. et al. (2006) Protein Expr Purif. 48 (1): 1-13].
При расщеплении гибридного белка Trx-Lc-LTP бромцианом целесообразным является использование в качестве партнера для гетерологичной экспрессии модифицированного тиоредоксина А Е.coli, содержащего замену внутреннего остатка метионина на остаток другой аминокислоты, например, на лейцин (M37L). Известно, что подобное незначительное изменение первичной структуры не оказывает влияния на пространственную структуру и свойства тиоредоксина [Rudresh et al. (2002) Protein Eng. 15(8): 627-33]. Отсутствие внутренних остатков метионина в последовательности белка-носителя уменьшает число индивидуальных полипептидных фрагментов, образующихся в результате реакции с бромцианом. В предпочтительном случае расщепление гибридного белка дает всего один побочный продукт, значительно отличающийся по физико-химическим свойствам от целевого белка, что облегчает процесс очистки последнего.When splitting the Trx-Lc-LTP fusion protein with cyanogen bromide, it is advisable to use E. coli modified thioredoxin A as a partner for heterologous expression, containing the substitution of the internal methionine residue for a residue of another amino acid, for example, leucine (M37L). It is known that such a slight change in the primary structure does not affect the spatial structure and properties of thioredoxin [Rudresh et al. (2002) Protein Eng. 15 (8): 627-33]. The absence of internal methionine residues in the carrier protein sequence reduces the number of individual polypeptide fragments resulting from a reaction with cyanogen bromide. In a preferred case, the cleavage of the hybrid protein gives only one by-product, significantly different in physicochemical properties from the target protein, which facilitates the process of purification of the latter.
Очистку целевого белка Lc-LTP упрощают за счет включения в состав гибридного полипептида Trx-Lc-LTP аффинной метки - аминокислотной последовательности, позволяющей проводить аффинную очистку гибридного полипептида на сорбентах с иммобилизованными (хелатированными) ионами металлов, т.е. металлохелатную очистку. В качестве такой последовательности обычно используют последовательность из 4-10 остатков гистидина, чаще всего - последовательность из шести остатков гистидина, которая вводится в N-концевую или С-концевую область гибридного белка, либо в область, разделяющую белок-носитель и целевой белок [Terpe K. (2003) Appl Microbiol Biotechnol. 60(5): 523-33]. В качестве аффинной метки для металлохелатной очистки также используют фрагменты HAT и 6×HN [U.S. Pat. No. 7,176,298].Purification of the target Lc-LTP protein is simplified by the inclusion of an affinity tag, an amino acid sequence that allows affinity purification of the hybrid polypeptide on sorbents with immobilized (chelated) metal ions, to the Trx-Lc-LTP hybrid polypeptide. metal chelate cleaning. As such a sequence, a sequence of 4-10 histidine residues is usually used, most often a sequence of six histidine residues, which is introduced into the N-terminal or C-terminal region of the fusion protein, or into the region separating the carrier protein and the target protein [Terpe K. (2003) Appl Microbiol Biotechnol. 60 (5): 523-33]. HAT and 6 × HN fragments are also used as an affinity tag for metal chelate purification [U.S. Pat. No. 7,176,298].
В состав предлагаемого вектора pE-Lc-LTP включают регуляторные элементы, контролирующие экспрессию гибридного белка: промотор для РНК-полимеразы, сайт связывания бактериальной рибосомы, стартовый и стоп-кодоны. В качестве промотора используют природный (lac, Т5, Т7) или искусственный (tac) сайт инициации транскрипции. Для подавления базальной экспрессии гена гибридного белка в его регуляторную область может быть внедрен, как минимум, один сайт связывания lac-репрессора (lac оператор), а в состав вектора - дополнительный ген lac-репрессора (lacI).The composition of the proposed vector pE-Lc-LTP includes regulatory elements that control the expression of a hybrid protein: a promoter for RNA polymerase, a bacterial ribosome binding site, start and stop codons. As a promoter, a natural (lac, T5, T7) or artificial (tac) transcription initiation site is used. To suppress the basal expression of the hybrid protein gene, at least one lac repressor binding site (lac operator) can be introduced into its regulatory region, and an additional lac repressor gene (lacI) can be introduced into the vector.
В состав предлагаемого вектора pE-Lc-LTP также входят регуляторные элементы, необходимые для его репликации в клетках Е.coli, например, ori (ориджин репликации) плазмиды pBR322, pUC19 или pSC101.The composition of the proposed vector pE-Lc-LTP also includes regulatory elements necessary for its replication in E. coli cells, for example, ori (origin of replication) of the plasmid pBR322, pUC19 or pSC101.
Предлагаемый вектор содержит, как минимум, один маркерный ген, позволяющий проводить отбор клеток, содержащих векторную ДНК, путем выращивания на соответствующей селективной питательной среде. Маркерным геном может быть ген, определяющий устойчивость к антибиотику или семейству антибиотиков, например, к ампициллину (bla), тетрациклину (tet), канамицину (kan), стрептомицину (str) или хлорамфениколу (cat).The proposed vector contains at least one marker gene, allowing selection of cells containing vector DNA by growing on an appropriate selective nutrient medium. The marker gene can be a gene that determines resistance to an antibiotic or family of antibiotics, for example, ampicillin (bla), tetracycline (tet), kanamycin (kan), streptomycin (str) or chloramphenicol (cat).
Конструирование новой векторной ДНК pE-Lc-LTP, экспрессирующей гибридный белок Trx-Lc-LTP, содержащий последовательность целевого белка Lc-LTP, может быть осуществлено путем лигирования фрагмента плазмиды, содержащего область инициации репликации и маркерный ген, со вставкой, кодирующей ген гибридного белка. Искусственный ген, который кодирует гибридный белок, может быть получен химическим синтезом набора олигонуклеотидных фрагментов с последующей сборкой и амплификацией промежуточных и конечного продуктов при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выбор структуры олигонуклеотидных праймеров для синтеза каждого из структурных элементов (промотора, терминатора, оператора, сайта связывания рибосомы, тиоредоксина, аффинной последовательности, Lc-LTP) основывают на данных по их нуклеотидным последовательностям, доступных из открытых источников (GenBank, EMBL-Bank, DDBJ). Матрицей для амплификации последовательности тиоредоксина служит бактериальный геном, либо плазмида рЕТ-32а(+). Замену метионинового кодона в составе тиоредоксина (M37L) при необходимости осуществляют на стадии сборки методом направленного мутагенеза при помощи ПЦР. Перед лигированием для получения липких концов очищенный ампликон и плазмидный вектор обрабатывают рестриктазами. Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки Е.coli штамма с выключенной системой рекомбинации и рестрикции ДНК, например, DH5α, DH10B или XL1-Blue. Отбор клонов, содержащих плазмидный вектор со вставкой, проводят при помощи ПЦР, а также рестрикционным анализом выделенной векторной ДНК. Правильность сборки конструкции определяют секвенированием векторной ДНК.The construction of a new vector pE-Lc-LTP vector expressing the Trx-Lc-LTP fusion protein containing the sequence of the target Lc-LTP protein can be performed by ligation of a plasmid fragment containing the replication initiation region and marker gene with an insert encoding the fusion protein gene . An artificial gene that encodes a hybrid protein can be obtained by chemical synthesis of a set of oligonucleotide fragments, followed by assembly and amplification of the intermediate and final products using polymerase chain reaction (PCR). The choice of the structure of oligonucleotide primers for the synthesis of each of the structural elements (promoter, terminator, operator, ribosome binding site, thioredoxin, affinity sequence, Lc-LTP) is based on data on their nucleotide sequences available from open sources (GenBank, EMBL-Bank, DDBJ ) The template for amplification of the thioredoxin sequence is the bacterial genome, or plasmid pET-32a (+). The replacement of the methionine codon in the composition of thioredoxin (M37L), if necessary, is carried out at the stage of assembly by the method of directed mutagenesis using PCR. Before ligation, the purified amplicon and plasmid vector are treated with restrictase enzymes to obtain sticky ends. The ligase reaction products transform competent cells of the E. coli strain with the DNA recombination and restriction system turned off, for example, DH5α, DH10B or XL1-Blue. The selection of clones containing the plasmid vector with the insert is carried out using PCR, as well as restriction analysis of the isolated vector DNA. The correct assembly of the construct is determined by vector DNA sequencing.
Штамм-продуцент гибридного белка Trx-Lc-LTP, содержащего последовательность целевого белка Lc-LTP, получают путем трансформации препаратом векторной ДНК рЕ-Lc-LTP компетентных клеток Е.coli и отбора клонов, обладающих способностью экспрессировать рекомбинантный белок. Наличие и уровень экспрессии рекомбинантного белка контролируют с помощью денатурирующего ПААГ-электрофореза. В качестве родительского штамма для создания штамма-продуцента используют штамм Е.coli, способный осуществлять контролируемую (индуцируемую) транкрипцию и трансляцию гена гибридного белка в составе pE-Lc-LTP. Так, например, штамм-продуцент для экспрессии гибридного белка под контролем промоторов для РНК-полимеразы Е.coli (lac, tac, T5) в комбинации с lac-оператором можно получить на основе штамма, обеспечивающего высокий уровень экспрессии lac-penpeccopa (M15(pREP4), XL I-Blue, JM109). При использовании промотора бактериофага Т7 необходимо использовать штамм, содержащий ген Т7 РНК-полимеразы под контролем lacUV5 промотора, например, BL21(DE3) или BL21(DE3)Origami, либо производить инфекцию штамма фагом-помощником СЕ6, содержащим ген Т7 РНК-полимеразы.The Trx-Lc-LTP fusion protein producing strain containing the sequence of the target Lc-LTP protein is obtained by transforming competent E. coli cells with pE-Lc-LTP vector DNA and selecting clones capable of expressing the recombinant protein. The presence and level of expression of the recombinant protein is controlled using denaturing PAAG electrophoresis. As a parent strain to create a producer strain, an E. coli strain is used that is capable of carrying out controlled (inducible) transcription and translation of the hybrid protein gene in pE-Lc-LTP. For example, a producer strain for expression of a hybrid protein under the control of promoters for E. coli RNA polymerase (lac, tac, T5) in combination with a lac operator can be obtained on the basis of a strain that provides a high level of expression of lac-penpeccopa (M15 ( pREP4), XL I-Blue, JM109). When using the T7 bacteriophage promoter, it is necessary to use a strain containing the T7 RNA polymerase gene under the control of the lacUV5 promoter, for example, BL21 (DE3) or BL21 (DE3) Origami, or to infect the strain with CE6 helper phage containing the T7 RNA polymerase gene.
Клетки штамма-продуцента сохраняют культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки родительского штамма Е.coli. Клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, 1×3,5 мкм, подвижные, хорошо растут на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой). Рост в жидких средах характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует. Клетки растут при температуре от 4°С до 42°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5; в качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевого экстракта. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют аминокислоты, глицерин, углеводы.The cells of the producer strain retain the cultural-morphological and physiological-biochemical characteristics of the parent E. coli strain. Small rod-shaped cells, gram-negative, 1 × 3.5 μm, motile, grow well on ordinary nutrient media (MPA, MPB, LB-broth, LB-agar, minimal medium with glucose). Growth in liquid media is characterized by even turbidity; sediment easily sedimentes. Cells grow at temperatures from 4 ° C to 42 ° C with optimum pH from 6.8 to 7.5; as a source of nitrogen, both mineral ammonium salts and organic compounds of the amino acid, peptone, tryptone, yeast extract are used. When growing on a minimal medium, amino acids, glycerin, and carbohydrates are used as a carbon source.
Штамм-продуцент хранят на чашках и косяках при температуре 4°С, пересевая на свежие среды один раз в месяц, а также при температуре минус 70°С в среде LB с добавлением 10-30% глицерина.The producer strain is stored on dishes and jambs at a temperature of 4 ° C, transferring to fresh media once a month, as well as at a temperature of
Биосинтез продукта (экспрессию) проводят следующим образом: клетки штамма-продуцента выращивают в питательной среде (например, LB, MBL или М9) с добавлением необходимых селективных агентов (например, 100 мкг/мл ампициллина) при температуре 20-37°С до достижения культурой средней или поздней логарифмической фазы роста, ступенчато увеличивая объем культуральной жидкости путем последовательных пересевов материала, после чего индуцируют синтез белка и инкубируют дополнительно в течение 2-24 часов при температуре 20-37°С. Увеличения выхода рекомбинантного белка достигают с помощью принудительной аэрации культуральной жидкости и культивирования штамма-продуцента на обогащенных питательных средах (например, с добавлением глюкозы, глицерина, дикарбоновых кислот, аминокислот, неорганических солей, в т.ч. содержащих микроэлементы).The biosynthesis of the product (expression) is carried out as follows: the cells of the producer strain are grown in a nutrient medium (for example, LB, MBL or M9) with the addition of the necessary selective agents (for example, 100 μg / ml ampicillin) at a temperature of 20-37 ° C until the culture middle or late logarithmic growth phase, stepwise increasing the volume of the culture fluid by successive transfers of material, after which protein synthesis is induced and incubated for an additional 2-24 hours at a temperature of 20-37 ° C. An increase in the yield of the recombinant protein is achieved by forced aeration of the culture fluid and cultivation of the producer strain on enriched nutrient media (for example, with the addition of glucose, glycerol, dicarboxylic acids, amino acids, inorganic salts, including those containing trace elements).
Очистка липид-транспортирующего белка Lc-LTP включает следующие обязательные стадии: разрушение клеток, металлохелатную очистку гибридного белка Trx-Lc-LTP, обработку гибридного белка реагентом, расщепляющим его по сайту, введенному между последовательностями тиоредоксина и целевого белка, разделение продуктов реакции и очистку целевого белка Lc-LTP методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Purification of the lipid-transporting protein Lc-LTP includes the following mandatory steps: cell disruption, metal chelate purification of the Trx-Lc-LTP fusion protein, treatment of the fusion protein with a reagent that cleaves it at a site inserted between the thioredoxin and target protein sequences, separation of reaction products and purification of the target Lc-LTP protein by reverse phase HPLC.
Для очистки клеточного материала от примесей, содержащихся в культуральной жидкости, особенно при выделении белка из клеточной культуры с низкой плотностью, желательным является предварительное концентрирование клеток с помощью центрифугирования или фильтрации. Разрушение (лизис) клеток осуществляют физическим или химическим способом или комбинацией способов, например, с помощью ультразвукового дезинтегратора. Френч-пресса, дезинтегратора Гаулина, с помощью осмотического шока, детергентов, хаотропных агентов, гидролитических ферментов. С целью снижения нагрузки на аффинный сорбент нерастворимые примеси из клеточного лизата могут быть удалены центрифугированием или фильтрацией. Для металлохелатной очистки может быть использован сорбент, содержащий такие хелатирующие группы как иминодиацетат (IDA), нитрилотриацетат (NTA) или карбоксиметиласпартат (СМА, TALON) в комплексе с катионами Ni2+, Со2+ или Cu2+ [Chaga G S. (2001) J Biochem Biophys Methods. 49(1-3): 313-34]. Элюирование гибридного белка проводят, используя градиент рН или концентрации имидазола, либо добавляя в буфер ЭДТА. При необходимости проводят очистку продуктов реакции расщепления гибридного белка с помощью повторной металлохелатной хроматографии. На завершающей стадии может быть проведена повторная очистка целевого белка методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.To purify cell material from impurities contained in the culture fluid, especially when isolating protein from a cell culture with a low density, it is desirable to pre-concentrate the cells by centrifugation or filtration. The destruction (lysis) of cells is carried out physically or chemically or by a combination of methods, for example, using an ultrasonic disintegrator. French press, Gaulin disintegrator, using osmotic shock, detergents, chaotropic agents, hydrolytic enzymes. In order to reduce the load on the affinity sorbent, insoluble impurities from the cell lysate can be removed by centrifugation or filtration. For metal chelate cleaning, a sorbent containing chelating groups such as iminodiacetate (IDA), nitrilotriacetate (NTA) or carboxymethylaspartate (CMA, TALON) in combination with Ni 2+ , Co 2+ or Cu 2+ cations [Chaga G S. ( 2001) J Biochem Biophys Methods. 49 (1-3): 313-34]. Elution of the hybrid protein is carried out using a pH gradient or imidazole concentration, or by adding to the EDTA buffer. If necessary, purification of the products of the fusion protein cleavage reaction is carried out using repeated metal chelate chromatography. At the final stage, repeated purification of the target protein by reverse-phase HPLC can be carried out.
Идентичность полученного Lc-LTP природному белку устанавливают методами денатурирующего электрофореза в ПААГ, MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии, секвенированием N-концевой аминокислотной последовательности по методу Эдмана, тестированием антимикробной активности методом серийных разведении в жидкой питательной среде. Степень очистки определяют методами денатурирующего ПААГ-электрофореза и MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии, а также с помощью повторной обращенно-фазовой ВЭЖХ.The identity of the obtained Lc-LTP to a natural protein is established by methods of denaturing electrophoresis in SDS page, MALDI time-of-flight mass spectrometry, sequencing of the N-terminal amino acid sequence by the Edman method, testing of antimicrobial activity by serial dilution in a liquid nutrient medium. The degree of purification is determined by the methods of denaturing PAGE-electrophoresis and MALDI time-of-flight mass spectrometry, as well as by means of repeated reverse-phase HPLC.
На фиг.1 представлена физическая карта рекомбинантного вектора для экспрессии Lc-LTP. На фиг.2 показаны результаты электрофоретического анализа гибридного белка и Lc-LTP на разных стадиях очистки. На фиг.3 представлена хроматограмма очистки Lc-LTP методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. На фиг.4 приведен масс-спектр очищенного Lc-LTP2.Figure 1 presents a physical map of a recombinant vector for the expression of Lc-LTP. Figure 2 shows the results of electrophoretic analysis of the hybrid protein and Lc-LTP at different stages of purification. Figure 3 presents the chromatogram of the purification of Lc-LTP by reverse phase HPLC. Figure 4 shows the mass spectrum of purified Lc-LTP2.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1Example 1
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pE-Lc-LTP для экспрессии Lc-LTPConstruction of recombinant plasmid DNA pE-Lc-LTP for the expression of Lc-LTP
Нуклеотидную последовательность (SEQ ID No. 9, нуклеотиды 10-807), содержащую промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, lac-оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид, содержащий последовательно связанные гистидиновый октамер, тиоредоксин с заменой M37L, сайт расщепления кислотным гидролизом, сайт расщепления бромцианом и Lc-LTP, получают химико-ферментативным синтезом с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Олигонуклеотиды, используемые в ПЦР, синтезируют твердофазным фосфоамидитным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтилдиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Фрагмент, кодирующий белок-носитель тиоредоксин (M37L), получают методом ПЦР-амплификации и направленного мутагенеза с помощью ген-специфических праймеров, используя в качестве исходной матрицы плазмиду рЕТ32а(+), содержащую ген тиоредоксина.The nucleotide sequence (SEQ ID No. 9, nucleotides 10-807) containing the T7 RNA polymerase transcription promoter, a lac operator, a ribosome binding site, and a hybrid polypeptide coding region containing a sequentially linked histidine octamer, thioredoxin with M37L substitution, cleavage site by acid hydrolysis, a bromine cyan cleavage site and Lc-LTP, are obtained by enzyme-chemical synthesis using polymerase chain reaction (PCR). The oligonucleotides used in PCR are synthesized by the solid-state phosphoamidite method with the growth of the oligonucleotide chain in the direction from the 3'-end to the 5'-end using protected phosphamidites - 5'-dimethoxytrityl-N-acyl-2'-deoxynucleoside-3'-O- (β-cyanoethyl diisopropylamino) phosphites activated with tetrazole. The fragment encoding the carrier protein thioredoxin (M37L) was obtained by PCR amplification and directed mutagenesis using gene-specific primers using the pET32a (+) plasmid containing the thioredoxin gene as the initial template.
Фрагмент, кодирующий зрелый Lc-LTP, получают методом ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду pGEM-T (Promega) с клонированным фрагментом кДНК предшественника изоформы Lc-LTP2. Для получения данной плазмиды из проращенных семян чечевицы Lens culinaris выделяют суммарную РНК, проводят реакцию обратной транскрипции с олиго-dT праймером, после чего проводят быструю амплификацию 3'-концов кДНК Lc-LTP, используя вырожденные ген-специфичные праймеры на консервативный участок, соответствующий сигнальному пептиду Lc-LTP, затем клонируют полученный ампликон в pGEM-T векторе, проводят скрининг клонов и с помощью секвенирования по Сэнгеру находят клон, содержащий искомую плазмиду.The fragment encoding mature Lc-LTP was obtained by PCR using the plasmid pGEM-T (Promega) with the cloned cDNA fragment of the precursor of the Lc-LTP2 isoform as a template. To obtain this plasmid, total RNA is isolated from germinated lentil seeds of Lens culinaris, a reverse transcription reaction is performed with an oligo-dT primer, and then the 3'-ends of Lc-LTP cDNA are rapidly amplified using degenerate gene-specific primers to a conserved region corresponding to the signal the Lc-LTP peptide, then the resulting amplicon is cloned into the pGEM-T vector, the clones are screened and a clone containing the desired plasmid is found using Sanger sequencing.
Остальные участки последовательности pE-Lc-LTP получают путем последовательного отжига и элонгации взаимно перекрывающихся олигонуклеотидов, а также отжига, элонгации и амплификации промежуточных продуктов синтеза. На завершающей стадии синтеза последовательность амплифицируют с помощью праймеров, несущих на 5'-концах сайты узнавания рестриктаз BglII и XhoI. Продукт амплификации гидролизуют указанными рестриктазами, очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле, полосу ДНК величиной 790 п.о. выделяют из геля методом электроэлюции в 15% раствор ПЭГ-6000 и лигируют с фрагментом ДНК размером 5,3 тыс. п.о., полученным в результате обработки плазмиды pET31b(+) рестриктазами BglII и XhoI. В результате лигазной реакции образуется кольцевая ковалентно замкнутая ДНК размером 6041 п.о. Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки E.coli DH10B, приготовленные с помощью 0,1 М хлорида кальция. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°С и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.The remaining sections of the pE-Lc-LTP sequence are obtained by sequential annealing and elongation of mutually overlapping oligonucleotides, as well as annealing, elongation and amplification of intermediate synthesis products. At the final stage of the synthesis, the sequence is amplified using primers carrying restriction enzyme recognition sites BglII and XhoI at the 5'-ends. The amplification product is hydrolyzed by the indicated restriction enzymes, purified by electrophoresis in a 1.5% agarose gel, a 790 bp DNA band. PEG-6000 is isolated from the gel by electroelution in a 15% solution and ligated with a 5.3 thousand bp DNA fragment obtained by processing the plasmid pET31b (+) with BglII and XhoI restriction enzymes. As a result of the ligase reaction, circular covalently closed DNA of 6041 bp is formed. The ligase reaction products transform competent E. coli DH10B cells prepared with 0.1 M calcium chloride. After transformation, the bacterial suspension is mixed with LB medium, grown for 1 h at 37 ° C and plated on Petri dishes with LB agar containing 50 μg / ml ampicillin.
Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, осуществляют методом «ПЦР с клонов» с использованием праймеров на плазмидный остов и вставку. Отобранные клоны подращивают в жидкой питательной среде и выделяют плазмидной ДНК, которую анализируют на наличие вставки с помощью рестрикционного анализа. Окончательное строение плазмид, содержащих требуемый фрагмент, подтверждают определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру. По данным секвенирования отбирают ту плазмиду, у которой нуклеотидная последовательность лигированной вставки полностью идентична запланированной (фиг.2, SEQ ID No. 9).The primary selection of clones containing the desired plasmid is carried out by the method of "PCR from clones" using primers for the plasmid backbone and insert. Selected clones are grown in a liquid nutrient medium and plasmid DNA is isolated, which is analyzed for the presence of insert using restriction analysis. The final structure of plasmids containing the desired fragment is confirmed by determining the nucleotide sequence by Sanger sequencing. According to sequencing data, the plasmid is selected in which the nucleotide sequence of the ligated insert is completely identical to the planned one (FIG. 2, SEQ ID No. 9).
Пример 2Example 2
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pE-Lc-LTP для экспрессии Lc-LTPConstruction of recombinant plasmid DNA pE-Lc-LTP for the expression of Lc-LTP
Фрагмент ДНК (SEQ ID No. 10, нукюотиды 10-784), содержащий промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид, содержащий последовательно связанные гистадиновый октамер, тиоредоксин (M37L), сайт расщепления кислотным гидролизом, сайт расщепления бромцианом и Lc-LTP, получают химико-ферментативным синтезом, как описано в примере 1, используя в качестве матрицы для амплификации фрагмента, кодирующего Lc-LTP, плазмиду pGEM-T с клонированным фрагментом кДНК изоформы Lc-LTP4. Продукт амплификации гидролизуют рестриктазами BglII и XhoI, очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле, полосу ДНК величиной 765 п.о. выделяют из геля методом электроэлюции в 15% раствор ПЭГ-6000 и лигируют с фрагментом ДНК размером 3,5 тыс. п о., полученным в результате обработки плазмиды pET20b(+) рестриктазами BglII и XhoI. В результате лигазной реакции образуется кольцевая ковалентно замкнутая ДНК размером 4270 п.о. Дальнейшие операции совершают, как описано в примере 1. Методом секвенирования по Сэнгеру подтверждают соответствие нуклеотидной последовательности полученной конструкции SEQ ID No. 10.DNA fragment (SEQ ID No. 10, nuquotides 10-784) containing the T7 RNA polymerase transcription promoter, a ribosome binding site and a hybrid polypeptide coding region containing the sequentially linked histadine octamer, thioredoxin (M37L), acid digestion site, site cleavage with cyanogen bromide and Lc-LTP is obtained by enzyme-chemical synthesis as described in Example 1, using the plasmid pGEM-T with the cloned cDNA fragment of the Lc-LTP4 isoform as an amplification matrix for the fragment encoding Lc-LTP. The amplification product is hydrolyzed with restriction enzymes BglII and XhoI, purified by electrophoresis in a 1.5% agarose gel, a 765 bp DNA band. PEG-6000 is isolated from the gel by electroelution in a 15% solution and ligated with a 3.5 kb DNA fragment obtained by treatment of plasmid pET20b (+) with restriction enzymes BglII and XhoI. As a result of the ligase reaction, a ring covalently closed DNA of 4270 bp is formed. Further operations are performed as described in Example 1. Using the Sanger sequencing method, the nucleotide sequence of the obtained construct is confirmed to be consistent with SEQ ID No. 10.
Пример 3Example 3
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pE-Lc-LTP для экспрессии Lc-LTPConstruction of recombinant plasmid DNA pE-Lc-LTP for the expression of Lc-LTP
Фрагмент ДНК (SEQ ID No. 11, нуклеотиды 119-743), кодирующий гибридный полипептид, содержащий последовательно связанные тиоредоксин A E.coli, сайт расщепления кислотным гидролизом, сайт расщепления бромцианом и Lc-LTP, получают химико-ферментативным синтезом, как описано в примере 1, используя в качестве матрицы для амплификации фрагмента, кодирующего Lc-LTP, плазмиду pGEM-T с клонированным фрагментом кДНК изоформы Lc-LTP8. Продукт амплификации гидролизуют рестриктазами BamHI и BglII, очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле, полосу ДНК величиной 615 п.о. выделяют из геля методом электроэлюции в 15% раствор ПЭГ-6000 и лигируют с линеаризованной плазмидной ДНК pQE-70 (Qiagen) размером 3,4 тыс. п.о., полученной в результат обработки рестриктазами BamHI и BglII. В результате лигазной реакции образуется кольцевая ковалентно замкнутая ДНК размером 4035 п.о. Дальнейшие операции выполняют, как описано в примере 1. Методом секвенирования по Сэнгеру подтверждают соответствие нуклеотидной последовательности полученной конструкции SEQ ID No. 11.A DNA fragment (SEQ ID No. 11, nucleotides 119-743) encoding a hybrid polypeptide containing sequentially linked E. coli thioredoxin A, an acid hydrolysis cleavage site, a bromine cyan cleavage site and Lc-LTP, is obtained by enzymatic-chemical synthesis as described in Example 1, using the plasmid pGEM-T with the cloned cDNA fragment of the Lc-LTP8 isoform as the matrix for amplification of the fragment encoding Lc-LTP. The amplification product is hydrolyzed with restriction enzymes BamHI and BglII, purified by electrophoresis in a 1.5% agarose gel, a 615 bp DNA band. isolated from the gel by electroelution in a 15% solution of PEG-6000 and ligated with linearized plasmid DNA pQE-70 (Qiagen) of 3.4 thousand bp obtained by treatment with restriction enzymes BamHI and BglII. As a result of the ligase reaction, a ring covalently closed DNA of 4035 bp is formed. Further operations are performed as described in Example 1. Using the Sanger sequencing method, the nucleotide sequence of the obtained construct is confirmed to be consistent with SEQ ID No. eleven.
Пример 4Example 4
Получение штамма-продуцента E.coli, вырабатывающего гибридный белок, содержащий Lc-LTP, и определение его продуктивностиObtaining a producer strain of E. coli producing a hybrid protein containing Lc-LTP, and determining its productivity
Проводят трансформацию клеток Е.coli BL21(DE3) плазмидой pE-Lc-LTP, описанной в примере 1. Бактериологической петлей переносят выросшие колонии в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, подращивают до оптической плотности OD600 0,7 на термостатируемой качалке со скоростью вращения 200 мин-1 при температуре 37°С, отбирают 0,3 мл культуры для последующего электрофоретического анализа, добавляют индуктор - изопропилтио-β-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают инкубацию при температуре 37°С в течение 5 ч, отбирая каждый час пробы по 0,3 мл для определения оптической плотности OD600 и последующего электрофоретического анализа. Равные аликвоты суспензии клеток, отобранных до внесения индуктора и после завершения роста, центрифугируют, отделяют супернатант и анализируют осадок клеток ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях. Для этого образцы лизируют буфером, содержащим 2% SDS, на водяной бане в течение 5 мин. Электрофорез проводят в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают 0,1% кумасси G-250 в присутствии 25% изопропилового спирта по стандартной методике. Появление отчетливой полосы в районе 23 кДа в образцах, отобранных после индукции, свидетельствует о способности штамма синтезировать гибридный полипептид, содержащий Lc-LTP. Относительное содержание рекомбинантного белка, составляющее около 20%, определяют путем сканирования и денситометрического анализа окрашенных гелей.The E. coli BL21 (DE3) cells are transformed with the plasmid pE-Lc-LTP described in Example 1. The grown colonies are transferred with a bacteriological loop in 10 ml of LB liquid medium containing 150 μg / ml ampicillin, grown to an optical density of OD 600 0.7 on a thermostatic shaker with a rotation speed of 200 min -1 at a temperature of 37 ° C, 0.3 ml of culture is taken for subsequent electrophoretic analysis, an inducer of isopropylthio-β-galactoside is added to a concentration of 0.2 mM and incubation is continued at a temperature of 37 ° C in for 5 hours, taking 0.3 ml samples every hour determination of optical density OD 600 and subsequent electrophoretic analysis. Equal aliquots of the cell suspension, taken before the inducer was introduced and after growth was complete, were centrifuged, the supernatant was separated, and the cell pellet was analyzed by SDS-PAGE under denaturing conditions. For this, the samples are lysed with a buffer containing 2% SDS in a water bath for 5 minutes. Electrophoresis is carried out in 15% SDS-PAGE. The gel is stained with 0.1% Coomassie G-250 in the presence of 25% isopropyl alcohol according to standard methods. The appearance of a distinct band at 23 kDa in the samples taken after induction indicates the ability of the strain to synthesize a hybrid polypeptide containing Lc-LTP. A relative recombinant protein content of about 20% is determined by scanning and densitometric analysis of the stained gels.
Пример 5Example 5
Получение рекомбинантного липид-транспортирующего белка Lc-LTPObtaining recombinant lipid-transporting protein Lc-LTP
Культивирование клеток штамма-продуцента Eschenchia coli, полученного согласно примеру 4, проводят следующим образом:The cultivation of cells of the producer strain of Eschenchia coli obtained according to example 4, is carried out as follows:
Клетки штамма-продуцента выращивают в жидкой среде LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы до достижения культурой оптической плотности OD600 0,7 при температуре 37°С. Индукцию синтеза белка проводят с помощью изопропил-β-D-галактозида в концентрации 1,0 мМ, после чего инкубируют 4 часа при температуре 37°С. Уровень экспрессии гибридного белка, а также содержание гибридного белка и Lc-LTP2 в препарате на разных стадиях очистки определяют с помощью ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях (фиг.2).The producer strain cells are grown in LB liquid medium with the addition of 100 μg / ml ampicillin and 1% glucose until the culture reaches an optical density of OD 600 0.7 at 37 ° C. Protein synthesis is induced using isopropyl-β-D-galactoside at a concentration of 1.0 mM, after which it is incubated for 4 hours at a temperature of 37 ° C. The level of expression of the hybrid protein, as well as the content of the hybrid protein and Lc-LTP2 in the preparation at different stages of purification, is determined using PAGE electrophoresis under denaturing conditions (Fig. 2).
По окончании ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин, ресуспендируют в буфере А (50 мМ трис-HCl, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазола, рН 7,8, 1 мМ PMSF) и разрушают с помощью ультразвукового гомогенизатора. Полученный лизат центрифугируют при 25000 g в течение 20 мин. Все работы по получению осветленного лизата проводят при температуре 4°С. Очистку гибридного белка, содержащего аффинную октагистидиновую последовательность, осуществляют с помощью металлохелатной хроматографии на препаративной колонке с Ni-NTA агарозой, уравновешенной тем же буфером А. Для этого осветленный лизат наносят на колонку и элюируют связавшийся с носителем гибридный белок буфером В (50 мМ трис-HCl, 0,5 М NaCl, 0,5 М имидазола, рН 7,8). Детектирование ведут при длине волны 280 нм Элюат, содержащий гибридный белок, диализируют относительно воды в течение ночи и лиофильно высушивают.After fermentation, the cells of the hybrid protein producer (biomass) are separated by centrifugation at 4000 g for 10 min, resuspended in buffer A (50 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 7.8, 1 mM PMSF) and destroyed using an ultrasonic homogenizer. The resulting lysate is centrifuged at 25,000 g for 20 minutes. All work on obtaining clarified lysate is carried out at a temperature of 4 ° C. Purification of the fusion protein containing the affinity octahystidine sequence is carried out using metal chelate chromatography on a preparative column with Ni-NTA agarose equilibrated with the same buffer A. For this, the clarified lysate is applied to the column and the fusion protein bound to the carrier is eluted with buffer B (50 mM Tris- HCl, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole, pH 7.8). Detection is carried out at a wavelength of 280 nm. The eluate containing the hybrid protein is dialyzed relative to water overnight and freeze-dried.
Очищенный гибридный белок растворяют в 80% трифторуксусной кислоте в концентрации 10 мг/мл, добавляют равную массу бромциана (1 г бромциана на 1 г белка) и выдерживают при температуре 25°С в защищенном от света месте в течение 16 ч. Реакцию останавливают добавлением пятикратного объема деионизированной воды, после чего образец лиофильно высушивают. Процедуру добавления воды и упаривания повторяют трижды.The purified hybrid protein is dissolved in 80 mg trifluoroacetic acid at a concentration of 10 mg / ml, an equal mass of bromine cyan (1 g bromine cyan per 1 g protein) is added and kept at 25 ° C in a dark place for 16 hours. The reaction is stopped by adding five times volume of deionized water, after which the sample is freeze-dried. The procedure for adding water and evaporation is repeated three times.
Продукты реакции растворяют в 80% трифторуксусной кислоте. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Очистку Lc-LTP2 проводят с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на препаративных колонках в линейном градиенте концентрации ацетонитрила 5-80% в течение 60 мин в присутствии 0,1% ТФУ (фиг.3). Детектирование ведут при длине волны 214 нм. Фракцию, содержащую Lc-LTP2, собирают и лиофильно высушивают.The reaction products are dissolved in 80% trifluoroacetic acid. Insoluble precipitate was separated by centrifugation and discarded. Purification of Lc-LTP2 is carried out using reverse phase HPLC on preparative columns in a linear gradient of the concentration of acetonitrile 5-80% for 60 min in the presence of 0.1% TFU (figure 3). Detection is carried out at a wavelength of 214 nm. The fraction containing Lc-LTP2 is collected and freeze-dried.
Для определения N-концевой аминокислогной последовательности Lc-LTP2 применяют автоматическое микросеквенирование на приборе Precise 491 cLC Protein Sequencing System (PE Applied Biosystems). Идентификацию фенилтиогидантоин-производных аминокислот проводят на анализаторе 120А РТН Analyzer (Applied Biosystems). В основе методики автомачического определения аминокислотной последовательности пептидов и белков лежит метод химической деградации полипептидной цепи по методу Эдмана, позволяющий последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов и идентифицировать отщепленные производные аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. В результате автоматического микросеквенирования установлена идентичность аминокислотных последовательностей генно-инженерного и природного Lc-LTP2.To determine the N-terminal amino acid sequence of Lc-LTP2, automatic microsequencing is used on a Precise 491 cLC Protein Sequencing System (PE Applied Biosystems). The identification of phenylthiohydantoin derivatives of amino acids is carried out on a 120A PTH Analyzer (Applied Biosystems). The methodology for the automatic determination of the amino acid sequence of peptides and proteins is based on the method of chemical degradation of the polypeptide chain according to the Edman method, which allows sequentially cleaving N-terminal amino acid residues in the form of phenylthiohydantoins and identifying cleaved amino acid derivatives by reverse phase HPLC. As a result of automatic microsequencing, the amino acid sequences of the genetic engineering and natural Lc-LTP2 were identified.
Для определения молекулярной массы очищенного белка используют MALDI-времяпролетный масс-спектрометрический анализ на приборе Reflex III (Bruker Daltonics), оснащенном УФ-лазером с длиной волны 336 нм. В качестве матрицы используют 2,5-дигидроксибензойную кислоту в смеси, содержащей 20% ацетонитрил и 0,1% трифторуксусную кислоту. Полученный пик с т/г 9283,416 (фиг.4) соответствует молекулярному иону природного Lc-LTP2 (расчечная молекулярная масса составляет 9282,73 Да).To determine the molecular weight of the purified protein, MALDI time-of-flight mass spectrometric analysis was used on a Reflex III instrument (Bruker Daltonics) equipped with a 336 nm UV laser. As a matrix, 2,5-dihydroxybenzoic acid is used in a mixture containing 20% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid. The resulting peak with t / g 9283,416 (Fig. 4) corresponds to the molecular ion of natural Lc-LTP2 (the molecular weight of the tracer is 9282.73 Da).
Пример 6Example 6
Тестирование антимикробной активности Lc-LTPAntimicrobial Activity Testing Lc-LTP
Антибактериальную активность природного и рекомбинантного Lc-LTP2 в отношении Agrobacterium tumefaciens штамма А281 определяют методом серийных разведении в жидкой питательной среде, используя 96-луночные планшеты. Бактериальные клетки культивируют в течение ночи при 30°С на стерильной чашке Петри с LB агаром. Свежую биомассу тест-культуры вносят в 3 мл двукратно разбавленной среды LB (ЅLB), и инкубируют при 30°С на роторной качалке до достижения клетками 1÷1,5 единиц оптической плотности, что соответствует 2·108 клеток/мл. К аликвотам (110 мкл) десятикратно разбавленной экспоненциальной культуры в среде ЅLB добавляют по 10 мкл стерильных растворов белка различной концентрации в 0,1% ТФУ и инкубируют в термостатируемом шейкере при 30°С. Бактериальный рост оценивают микроспектрофотометрически, измеряя оптическую плотность культуры в лунках при 620 нм при помощи планшетного фотометра Multiscan EX (Thermo). В качестве отрицательного контроля используют 0,1% ТФУ. Полученный рекомбинантный Lc-LTP2 ингибирует рост грамотрицательной фитопатогенной бактерии Agrobacterium tumefaciens с той же эффективностью, что и природный белок. В присутствии генно-инженерного или природного Lc-LTP2 в концентрациях 40,5 мкМ по истечении 24 ч наблюдается 50% ингибирование роста бактериальных клеток.The antibacterial activity of natural and recombinant Lc-LTP2 against Agrobacterium tumefaciens strain A281 is determined by serial dilution in a liquid nutrient medium using 96-well plates. Bacterial cells were cultured overnight at 30 ° C in a sterile Petri dish with LB agar. Fresh biomass of the test culture is introduced into 3 ml of doubly diluted LB medium (ЅLB), and incubated at 30 ° C on a rotary shaker until the cells reach 1 ÷ 1.5 optical density units, which corresponds to 2 · 10 8 cells / ml. Aliquots (110 μl) of a tenfold diluted exponential culture in LB medium are supplemented with 10 μl of sterile protein solutions of various concentrations in 0.1% TFA and incubated in a thermostatic shaker at 30 ° C. Bacterial growth was evaluated microspectrophotometrically by measuring the absorbance of the culture in the wells at 620 nm using a Multiscan EX plate photometer (Thermo). As a negative control using 0.1% TFU. The resulting recombinant Lc-LTP2 inhibits the growth of gram-negative phytopathogenic bacteria Agrobacterium tumefaciens with the same efficiency as the natural protein. In the presence of genetically engineered or natural Lc-LTP2 at concentrations of 40.5 μM, after 24 hours, 50% inhibition of bacterial cell growth is observed.
Claims (9)
аффинная метка - аминокислотная последовательность, позволяющая проводить аффинную очистку гибридного полипептида на сорбентах с иммобилизованными ионами металлов,
сайт расщепления - участок аминокислотной последовательности, расположенный между последовательностями липид-транспортирующего белка Lc-LTP и тиоредоксина, позволяющий проводить частичное расщепление гибридного полипептида химическим или ферментативным способом.1. Plasmid vector pE-Lc-LTP for expression of Lens culinaris lentil lipid transporting proteins in Escherichia coli cells, containing the Trx-Lc-LTP hybrid polypeptide gene comprising the thioredoxin protein amino acid sequence, affinity tag, cleavage site, and lipid transporting protein sequence Lc-LTP selected from the sequence group SEQ ID Nos. 1-8, where
affinity tag - an amino acid sequence that allows affinity purification of a hybrid polypeptide on sorbents with immobilized metal ions,
cleavage site - a portion of the amino acid sequence located between the sequences of the lipid-transporting protein Lc-LTP and thioredoxin, allowing partial cleavage of the hybrid polypeptide by chemical or enzymatic methods.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009129838/10A RU2415940C1 (en) | 2009-08-04 | 2009-08-04 | PLASMID VECTOR pE-Lc-LTP, Escherichia coli BACTERIUM STRAIN FOR EXPRESSION OF LIPID-TRANSPORTING LENTIL PROTEINS Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PROTEINS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009129838/10A RU2415940C1 (en) | 2009-08-04 | 2009-08-04 | PLASMID VECTOR pE-Lc-LTP, Escherichia coli BACTERIUM STRAIN FOR EXPRESSION OF LIPID-TRANSPORTING LENTIL PROTEINS Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PROTEINS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009129838A RU2009129838A (en) | 2011-02-10 |
| RU2415940C1 true RU2415940C1 (en) | 2011-04-10 |
Family
ID=44052145
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009129838/10A RU2415940C1 (en) | 2009-08-04 | 2009-08-04 | PLASMID VECTOR pE-Lc-LTP, Escherichia coli BACTERIUM STRAIN FOR EXPRESSION OF LIPID-TRANSPORTING LENTIL PROTEINS Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PROTEINS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2415940C1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114045294B (en) * | 2021-11-22 | 2023-03-24 | 昆明理工大学 | Lipid transport protein gene and application thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6A (en) * | 1836-08-10 | Thomas Blanchard | Machine for forming end pieces of plank blocks for ships | |
| RU2316590C1 (en) * | 2006-06-16 | 2008-02-10 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук | RECOMBINANT PLASMID DNA pE-His8-TrxL-Ar2 ENCODING FUSION PROTEIN COMPRISING ANTIMICROBIAL SEA ANNELID WORM Arenicola marina PEPTIDE ARENICIN AND STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 AS PRODUCER OF ARENICIN-CONTAINING FUSION PROTEIN |
-
2009
- 2009-08-04 RU RU2009129838/10A patent/RU2415940C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6A (en) * | 1836-08-10 | Thomas Blanchard | Machine for forming end pieces of plank blocks for ships | |
| RU2316590C1 (en) * | 2006-06-16 | 2008-02-10 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук | RECOMBINANT PLASMID DNA pE-His8-TrxL-Ar2 ENCODING FUSION PROTEIN COMPRISING ANTIMICROBIAL SEA ANNELID WORM Arenicola marina PEPTIDE ARENICIN AND STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 AS PRODUCER OF ARENICIN-CONTAINING FUSION PROTEIN |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009129838A (en) | 2011-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| IL180694A (en) | Detoxifizyme having activity of transforming aflatoxin and the gene encodes thereof | |
| CN105037521B (en) | A plant stress resistance-related protein TaWrky48 and its encoding gene and application | |
| CN110922457B (en) | Plant immune-inducing protein FgPII1 secreted by Fusarium graminearum and its application | |
| Montfort-Gardeazabal et al. | Expression and purification of the antimicrobial peptide Bin1b in Escherichia coli tagged with the fusion proteins CusF3H+ and SmbP | |
| CN107779464A (en) | A kind of preparation method of human source copper-zinc superoxide dismutase | |
| Campos et al. | Two different late embryogenesis abundant proteins from Arabidopsis thaliana contain specific domains that inhibit Escherichia coli growth | |
| JP7637903B2 (en) | Modified cyanobacteria, method for producing modified cyanobacteria, and method for producing proteins | |
| KR101774354B1 (en) | Z domain-calsequestrin fusion protein for antibody isolation and purification and method of isolating and purifying antibody using the same | |
| CN113684199B (en) | Rice cysteine protease coding gene OsRD21 and application thereof in rice blast resistance | |
| RU2415940C1 (en) | PLASMID VECTOR pE-Lc-LTP, Escherichia coli BACTERIUM STRAIN FOR EXPRESSION OF LIPID-TRANSPORTING LENTIL PROTEINS Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PROTEINS | |
| Kuddus et al. | Enhanced expression of cysteine‐rich antimicrobial peptide snakin‐1 in Escherichia coli using an aggregation‐prone protein coexpression system | |
| Phadtare et al. | Cold-shock proteins | |
| RU2580031C2 (en) | PLASMID VECTOR pET-His8-TrxL-Acip1 STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 FOR EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE ACIPENSINA-1 AND METHOD OF PRODUCING SAID PEPTIDE | |
| RU2618850C2 (en) | pET-mChBac75Na PLASMID VECTOR, ESCHRICHIA COLI BL21(DE3/ pET-mChBac75Na BACTERIA STRAINS FOR CHBAC7NA MINIBACTENECIN ANTIMICROBIAL PEPTIDE EXPRESSION AND METHODS FOR PRODUCTION OF THESE PEPTIDES | |
| RU2456345C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pЕ-Trx-Lc-def, Escherichia coli STRAIN FOR EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE OF LENTIL DEFENSIN Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PEPTIDE | |
| RU2316595C1 (en) | Method for preparing antimicrobial peptide arenicin | |
| RU2316590C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pE-His8-TrxL-Ar2 ENCODING FUSION PROTEIN COMPRISING ANTIMICROBIAL SEA ANNELID WORM Arenicola marina PEPTIDE ARENICIN AND STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 AS PRODUCER OF ARENICIN-CONTAINING FUSION PROTEIN | |
| RU2412999C1 (en) | PLASMID VECTOR pE-Trx-Aur, STRAIN ESCHERICHIA COLI FOR EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE AURELIN AND METHOD OF SAID PEPTIDE OBTAINING | |
| US7232673B2 (en) | Antimicrobial protein from Lyophyllum shimeji | |
| KR20220110048A (en) | Z domain-calsequestrin fusion protein with improved reactivity, stability and antibody recovery and method of isolating and purifying antibody using the same | |
| CN113355334A (en) | Corn salt-tolerant gene and application thereof | |
| CN111138518B (en) | Expression and application of bacterial transposon component protein and truncation thereof | |
| RU2347811C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pET-KSI-Buf2, CODING HYBRID PROTEIN, CONTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE BUFORIN-2, STRAIN OF Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2-PRODUCER OF INDICATED PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE BUFORIN-2 | |
| Xu et al. | Cloning and sequencing of a gene encoding a novel salt stress-induced membrane protein from Rhodobacter sphaeroides f. sp. denitrificans | |
| CN113929757B (en) | Method for enhancing cold tolerance of rice by mutating calcium ion binding protein OsCIP1/2 |