RU2410439C1 - Способ абляции целевой днк с поверхности днк-биочипов - Google Patents
Способ абляции целевой днк с поверхности днк-биочипов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2410439C1 RU2410439C1 RU2009125627/10A RU2009125627A RU2410439C1 RU 2410439 C1 RU2410439 C1 RU 2410439C1 RU 2009125627/10 A RU2009125627/10 A RU 2009125627/10A RU 2009125627 A RU2009125627 A RU 2009125627A RU 2410439 C1 RU2410439 C1 RU 2410439C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- ablation
- target dna
- biochips
- sample
- Prior art date
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000002679 ablation Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims abstract description 7
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N Alumina Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000003574 free electron Substances 0.000 claims abstract description 4
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 claims 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 54
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000000608 laser ablation Methods 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000010199 gene set enrichment analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N trimethoxy-[3-(oxiran-2-ylmethoxy)propyl]silane Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCOCC1CO1 BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000605222 Acidithiobacillus ferrooxidans Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 208000006968 Helminthiasis Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910021419 crystalline silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 229920006334 epoxy coating Polymers 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000003500 gene array Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000001845 vibrational spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, лазерной технике и медицине. Предложен способ абляции целевой ДНК с поверхности ДНК-биочипов, включающий иммобилизацию ДНК-пробы на подложку, гибридизацию иммобилизованной ДНК-пробы с целевой ДНК, абляцию целевой ДНК с гибридизованного биочипа путем воздействия лазерного излучения с последующим определением структуры продуктов абляции с помощью ПНР. При этом абляцию осуществляют терагерцовым излучением лазера на свободных электронах с длиной волны 120-135 мкм, интенсивностью 20-40 Вт/см2, частотой следования импульсов 5.6 МГц, длительностью импульсов 50 нс при минимальнай относительной ширине линии воздействия 3×10-3. В качестве подложки используют предварительно отполированные и активированные пластины из высокоомного кремния или пористого оксида алюминия «silufol». Способ обеспечивает неразрушающую ДНК «мягкую» абляцию и позволяет анализировать целевую ДНК по специфической первичной структуре и функциональной биологической активности. 2 з.п. ф-лы, 5 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для повышения эффективности (результативности, точности, качества) аналитических и диагностических операций с использованием твердых подложек (чипов) с нанесенными на них дезоксирибонуклеиновыми кислотами (ДНК) (ДНК-биочипов).
В последние годы лавинообразно возросло количество исследований с использованием биочипов (gene arrays), которые представляют собой небольшого размера стеклянные, полимерные, керамические пластинки или нейлоновые мембраны, несущие на своей поверхности биополимеры, например белки, ДНК, фрагменты ДНК.
Существенным преимуществом биочипов по сравнению с традиционными методами анализа биологического материала является возможность одновременного анализа огромного (до 100 тыс.) количества проб. Появление ДНК-биочипов позволило использовать их для комплексной диагностики генетических, инфекционных и онкогенных заболеваний человека в лечебных учреждениях. Возможность определения уровня экспрессии 42 тыс. генов и белков человека позволяет биотехнологическим компаниям использовать биочипы для разработки и апробации новых лекарственных препаратов для быстрого выявления болезнетворных бактерий и вирусов в организме человека.
В последние годы количество данных по применению биочипов в научных и клинических исследованиях экспоненциально возросло в связи с высокой эффективностью их использования в реальной практике. Соответственно этому существенно выросло количество производителей биочипов и методов их производства. Необходимость сравнивать результаты анализа в разных экспериментах, между разными лабораториями и базами данных стала весьма насущной. В связи с этим к настоящему времени многие исследователи активно заинтересовались сравнением разных платформ и анализом результатов применения биочипов различных производителей на идентичных смесях нуклеиновых кислот (Harbig J, Sprinkle R, Enkemann SA. A sequence-based identification of the genes detected by probesets on the Affymetrix U133 plus 2.0 array. Nucleic Acids Res 2005; 33 (3): e31). К 2003 году стало ясно, что результаты идентификации последовательностей ДНК на биочипах различных производителей имеют общую сходимость всего около 4% при анализе идентичных смесей ДНК (E.Marshall SCIENCE 2004, V.306, 22, OCTOBER, рр.630-631). Исследователи и производители биочипов во всем мире предприняли гигантские усилия для решения этой проблемы и уже к 2007 году сходимость результатов существенно повысилась до 23%. Один из аспектов проблемы состоит в том, что для идентификации экспрессии одного и того же гена разные производители биочипов используют пробы с разной последовательностью нуклеотидов. Использование для сравнения только той части проб, которая имеет сходную последовательность, повышает сходимость результатов, однако существенно ограничивает информативность анализа. Только постоянный мониторинг экспрессии и последующее применение методов статистической обработки gene set enrichment analysis (GSEA) и parametric analysis of gene enrichment (PAGE) позволило получить приемлемую повторяемость результатов. Таким образом, вопрос о том, что же за последовательность на самом деле гибридизуется на биочипе, все также является актуальной.
Сегодня и в России формируется рынок биочипов отечественного производства. Впервые в мире в России были разработаны биочипы для быстрой идентификации лекарственно-устойчивых форм туберкулеза. Ведутся работы по созданию биочипов для типирования вируса гриппа, тестирования гельминтозов, идентификации и опознания личности, для исследования специфичности ДНК-белковых взаимодействий.
Однако до сих пор не существует возможности напрямую сравнивать результаты гибридизации целевых ДНК на микроячейках биочипов. Это оставляет открытой проблему идентификации целевых ДНК, гибридизованных на микроячейки биочипов. Поэтому задача диагностики идентичности ДНК-биочипов разного производства, созданных по сходным технологиям, является актуальной.
В настоящее время для абляции (удаления) биополимеров с поверхности чипов, в частности биочипов, используют различные химические, физические и физико-химические методы. В патентной заявке JP 2004212215 A, оп. 29.07.2004 описан способ абляции с поверхности биочипов, таких биополимеров, как нуклеиновые кислоты, пептиды, полисахариды, посредством сфокусированного лазерного импульсного излучения с последующим анализом биополимеров на квадрупольном масс-спектрометре. Аналогичный подход использован в патентной заявке US 20030469160 A1, оп. 21.02.2002 для абляции РНК, ДНК, пептидов и сахаров ультракороткими импульсами лазерного излучения для ионизации и перевода биополимеров в атомарное состояние с последующей масс-спектрометрией. В патентной заявке US 2005185260 A1, оп 24.02.2005, описано использование оптиковолоконного устройства для облучения биочипов пикосекундным и наносекундным импульсным террагерцовым излучением и абляции биополимеров. В патентной заявке US 2003180720 A1, оп. 25.09.2003, для абляции биомолекул, в частности протеинов и нуклеиновых кислот, с поверхности биочипов, используют раман-спектроскопию. В патентной заявке US 2003162216 Al, оп. 28.08.2003 для анализа коньюгированных с поверхности биочипа исследуемых протеинов (клеток, вирусов, бактерий), а также ДНК, гормонов, сахаров, кофакторов, продуктов метаболизма, лекарственных препаратов и токсинов используют специфические для каждого объекта реагенты. В патентной заявке US 2006443639 A1, оп. 30.05.2006 описан способ связывания биополимеров с поверхностью биочипов с помощью террагерцового и гигагерцового излучения с длиной волны от 3 мм до 3 мкм и частотой следования импульсов в диапазоне от 0,1 до 100 ТГц. Детекцию связывания анализируемых биомолекул с биочипом, на поверхности которого иммобилизован специфически связывающий компонент, осуществляют по соотношению уровней интенсивности вибрационных спектров гигагерцового и терагерцового излучения до и после образования биомолекулярных комплексов. Способ позволяет с высокой точностью зафиксировать специфическое связывание анализируемых биомолекул.
Все описанные способы абляции биологических макромолекул (биополимеров) с поверхности твердых подложек (биочипов), в том числе и лазерные, не позволяют детектировать исследуемые объекты по их специфической первичной структуре, а функциональная биологическая активность (ферментативная, регуляторная, рецепторная и т.д.) биополимеров полностью утрачивается за счет «жесткого» воздействия на функциональные макромолекулы, приводящего к изменению конформации макромолекул, активных центров, вторичной и третичной структуры.
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом является способ абляции биополимеров с твердой подложки с помощью эксимерного лазера (прибор ProteinChip Reader Model PBS II) с последующим определением структуры и специфической активности продуктов абляции (He Z, Zhong H, Hu Y, Xiao S, Xu J. Analysis of differential protein expression in Acidithiobacillus ferrooxidans grown under different energy resources respectively using SELDI-ProteinChip technologies, Anal Biochem. 2005 May 15; 340 (2): 317-29). Однако известный способ не позволяет осуществить неразрушающую «мягкую» абляцию биополимера.
Недостатком прототипа, а также всех известных лазерных способов абляции биополимеров является то, что они не позволяют достичь «мягкой» абляции с поверхности биочипа биополимеров с сохранением их структуры и специфической биологической функциональной активности, что снижает информативность и качество анализа биологических объектов, у которых специфическая активность (ферментативная, регуляторная, рецепторная) является основным критерием их биоспецифичности.
В современной научно-технической литературе не описаны способы «мягкой» абляции биополимеров, в частности ДНК, с поверхности твердых подложек, в том числе биочипов, которые позволяют сохранить специфические виды их биологической активности.
Технической задачей настоящего изобретения является расширение функциональных возможностей способа и повышение его информативности.
Поставленная техническая задача достигается посредством неразрушающей («мягкой») абляции целевой ДНК с поверхности ДНК-биочипа с помощью терагерцового излучения лазера на свободных электронах (ЛСЭ) с длиной волны 120-135 мкм.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. На полированную и активированную пластину из высокоомного кристаллического кремния или оксида алюминия иммобилизуют ДНК-пробу, проводят гибридизацию иммобилизованной ДНК-пробы с целевой ДНК (образец), далее осуществляют мягкую абляцию целевой ДНК с гибридизованного биочипа с последующей оценкой результатов мягкой абляции с помощью ПЦР. При этом абляцию ДНК осуществляют терагерцовым излучением лазера на свободных электронах с длиной волны 120-135 мкм, с интенсивностью 20-40 Вт/см2, частотой следования импульсов 5.6 МГц, длительностью импульсов 50 нс при минимальнай относительной ширине линии воздействия 3×10-3.
Абляция с использованием терагерцового излучения ЛСЭ представляет собой перевод молекул в аэрозольную фазу из твердой или жидкой фазы без изменения молекулярной структуры, при этом сохраняются полная идентичность последовательности нуклеотидов исходной целевой ДНК и аблированного после гибридизации олигонуклеотида.
Для проведения "мягкой" лазерной абляции биомакромолекул без их деструкции использовали анализатор для анализа ДНК-биочипов.
На фиг.1 представлена принципиальная схема действия такого анализатора. Под действием излучения водородные связи, стабилизирующие молекулы ДНК-ДНК гибрида, разрушаются и ДНК зонд аблирует и попадает в ток азота. ДНК-зонд, попавший в поток азота, собирается на мембрану-ловушку и затем проводится его анализ методом ПЦР.
Для подтверждения эффективности "мягкой" лазерной абляции ДНК электрофоретическими методами были препаративно выделены отдельные фрагменты ДНК фага лямбда, гидролизованного рестриктазой HindIII и проведена мягкая лазерная абляция фрагментов ДНК размером 3000 нуклеотидных пар (нп), 9000 нп и 23000 нп.
На фиг.2 представлены результаты измерений диффузионного размера аэрозольных частиц, полученных при мягкой абляции под действием ТГц-излучения с длиной волны 128 мкм заявляемым способом.
Из фиг.2 видно, что диффузионные размеры частиц, получаемых при воздействии ТГц-излучения, достаточно хорошо соответствуют линейным размерам полимерных цепей ДНК, взятых в эксперимент. Полученные данные свидетельствуют о том, что методика неразрушающей мягкой абляции применима к анализу ДНК-гибридов.
Таким образом, впервые показана возможность «мягкой» лазерной абляции молекул ДНК при сохранении их молекулярной структуры.
Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
А) Активация кремниевой поверхности подложки (чипа)
В качестве подложки для иммобилизации образцов ДНК использовали круглую, диаметром 20 мм и толщиной 1 мм, пластинку из высокоомного (6-8 кОм/см) кремния.
После изготовления пластинку полировали, так как полированная кремневая пластинка не дает аэрозольных частиц при абляции и имеет высокий коэффициент пропускания в рабочей области спектра излучения ЛСЭ, следовательно, мало нагревается при облучении и не приводит к тепловой деструкции биополимера.
Для активации кремниевой поверхности чипа (создание эпокси-покрытия) кремниевую пластину вымачивали в растворе 0.1% GPS (glycidoxypropyltrimethoxysilane) в толуоле (Aldrich, 244511-1L) в течение 30 мин при 40°C, промывали трижды в толуоле и затем высушивали при температуре 110°C.
Б) Иммобилизация ДНК-пробы на подложку (чип)
Для фиксации ДНК-пробы на поверхности чипа использовали олигонуклеотид заданной длины с ковалентно пришитой молекулой линкера к 5'-концу.
Структура пробы: линкер (L1)-5'-ATATCAGATCGCAGTGT-3'
На фиг.3 представлена химическая структура линкера 1 с разветвленной структурой.
На активированную поверхность чипа, в центральную часть, был нанесен раствор ДНК-пробы (2 наномоля в 2 мкл 3×SSC). После нанесения пробы на эпокси-поверхность для увеличения эффективности его иммобилизации использовали следующую процедуру: чип в чашке Петри оставляли на ночь в эксикаторе с насыщенным раствором NaCl (для обеспечения 50% влажности) при температуре 42°C, затем промывали в 0,2% SDS 2 мин на шейкере (Eppendorf) и затем трижды промывали бидистиллированной водой, инкубировали в бидистиллированной воде (50°C) 20 минут и высушивали.
В) Гибридизация образца с пробой, отмывка и сушка чипа
В качестве целевой ДНК (образец 1) был использован фрагмент ДНК длиной 50 нуклеотидов с флуоресцентной меткой по 5'-концу. В качестве флуоресцентного красителя (метки) использовали Fluorescein-6 (FAM6). Структура гибридизуемого образца 1:
5'-6FAM-TCCCTCCTGAGTTCCCCTGCACACACAACGGCACACTGCGATCTGATAT-3'
Гибридизационный буфер содержал раствор 3×SSC с добавлением 0.5% SDS. Для гибридизации использовали 2 наномоля образца 1. Гибридизацию проводили в течение ночи в гибридизационной камере Corning при 50°C с постепенным понижением температуры до 37°C.
После гибридизации чипы промывали в водном растворе 1×SSC 2 раза по 30 с при 37°C. Сушку чипов проводили при комнатной температуре.
Г) Проведение мягкой абляции целевой ДНК гибридизованного биочипа.
На поверхность гибридизованного биочипа с молекулой целевой ДНК подавалось терагерцовое излучение, генерируемое на ЛСЭ со следующими параметрами:
| Длина волны, мкм | 120 |
| Длительность импульса, нс | 50 |
| Частота следования импульсов, МГц | 5.6 |
| Инстенсивность, Вт/см2 | 20 |
| Минимальная относительная ширина линии | 3·10-3 |
После «мягкой» абляции молекулу целевой ДНК, переведенную в аэрозольную фазу током азота, собирали на нитроцеллюлозный фильтр (Millipore, 0.22 мкм). Собранные на фильтр частицы целевой ДНК элюировали 200 мкл ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCl (pH 8), 1 мМ ЭДТА (pH 8)), 15 минут при 65°С, и определяли последовательность собранной ДНК с помощью ПЦР.
Д) Оценка результатов мягкой абляции с помощью ПЦР
Для идентификации структуры и целостности молекулы целевой ДНК, смытой с фильтра после проведения процедуры мягкой абляции, были использованы следующие праймеры:
For: 5'-TTCCCTCCTGAGTTCCCC-3'
Rev: 5'-ATATCAGATCGCAGTGTGCC-3'
Были использованы следующие условия ПЦР:
32 цикла в режиме: денатурация 0.5 мин при 95°C; отжиг 0.5 мин при 53°C; синтез 0.5 мин при 7°C. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала: 1 мкл образца 1 с концентрацией 5×105 молекул/мкл, по 0,25 мкМ праймеров, 0,2 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов dNTP, ПЦР-буфер (75 мМ Трис-HCl (pH 9), 1,5 мМ MgCl2, 20 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20) и 0,4 ед. Taq-полимеразы. Установлено, что последовательности нуклеотидов исходной целевой ДНК и аблированного после гибридизации олигонуклеотида идентичны.
Пример 2
Эксперимент проводили аналогично примеру 1, кроме следующего.
В качестве подложки для нанесения исследуемого биополимера использовали круглую, отполированную и активированную пластинку из пористого оксида алюминия «silufol» диаметром 20 мм и толщиной 1 мм.
В качестве целевой ДНК (образец 2) был использован фрагмент ДНК длиной 90 нуклеотидов, без флуоресцентной метки по 5'-концу. Структура гибридизуемого образца 2:
5'TTCCCTCCTGAGTTCCCCTACACACACAACCACACACAACCACACACAACCACACACAACCACACACAACGGCACACTGCGATCTGATAT-3'
В качестве ДНК-пробы на поверхности биочипа был закреплен комплементарный образцу 2 олигонуклеотид длиной 17 н.п.
Структура пробы: линкер (L2)-5'-ATATCAGATCGCAGTGT-3'
На фиг.4 представлена химическая структура линкера 2 с линейной структурой.
Абляцию целевой ДНК с поверхности гибридизованного биочипа проводили с помощью терагерцового излучения, генерируемого на ЛСЭ со следующими параметрами:
| Длина волны, мкм | 135 |
| Длительность импульса, нс | 50 |
| Частота следования импульсов, МГц | 5.62 |
| Интенсивность, Вт/см2 | 40 |
| Минимальная относительная ширина линии | 3·10-3 |
После «мягкой» абляции молекулу целевой ДНК, переведенную в аэрозольную фазу током азота, собирали на нитроцеллюлозный фильтр (Millipore, 0.22 мкм). Собранные на фильтр частицы целевой ДНК элюировали 200 мкл ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCl (pH 8), 1 мМ ЭДТА (pH 8)), 15 минут при 65°C.
Аблированная с поверхности биочипа ДНК была амплифицирована методом ПЦР-реакции. После чего ее последовательность была определена с использованием Big Dye®-технологии (Applied Biosystems). Результаты представлены на фиг.5. Взаимокомплементарные последовательности целевой ДНК (образец 2) и ДНК-пробы отмечены фигурной скобкой.
Из фиг.5 видно, что последовательности нуклеотидов исходной целевой ДНК и аблированного после гибридизации олигонуклеотида идентичны.
Таким образом, в результате мягкой неразрушающей абляции удалось перевести в аэрозольную фазу, собрать и амплифицировать целевую ДНК (образцы 1 и 2) с поверхности биочипа под действием терагерцового излучения ЛСЭ и установить идентичность структуры аблированного после гибридизации олигонуклеотида структуре целевой ДНК.
Использование «мягкой» абляции целевой ДНК с поверхности биочипов при использовании терагерцового излучения, генерируемого на ЛСЭ, позволяет сохранить исходную структуру молекулы ДНК и повысить информативность и качество анализов с использованием биочипов.
Claims (3)
1. Способ абляции целевой ДНК с поверхности ДНК-биочипов, включающий иммобилизацию тест-пробы на подложку, специфическое связывание иммобилизованной тест-пробы с целевой пробой, абляцию целевой пробы с биочипа путем воздействия лазерного излучения с последующим определением структуры продуктов абляции, отличающийся тем, что воздействие осуществляют терагерцовым излучением лазера на свободных электронах с длиной волны 120-135 мкм, интенсивностью 20-40 Вт/см2.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве подложки используют предварительно отполированные и активированные пластины из высокоомного кремния или пористого оксида алюминия «silufol».
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что для активации пластины вымачивают в растворе 0,1% GPS в толуоле в течение 30 мин при 40°С, промывают трижды в толуоле и высушивают при температуре 110°С.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009125627/10A RU2410439C1 (ru) | 2009-07-06 | 2009-07-06 | Способ абляции целевой днк с поверхности днк-биочипов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009125627/10A RU2410439C1 (ru) | 2009-07-06 | 2009-07-06 | Способ абляции целевой днк с поверхности днк-биочипов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2410439C1 true RU2410439C1 (ru) | 2011-01-27 |
Family
ID=46308418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009125627/10A RU2410439C1 (ru) | 2009-07-06 | 2009-07-06 | Способ абляции целевой днк с поверхности днк-биочипов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2410439C1 (ru) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109856641A (zh) * | 2019-01-17 | 2019-06-07 | 北京农业信息技术研究中心 | 禽畜体内生物芯片的太赫兹检测方法 |
| US11156603B2 (en) | 2010-04-05 | 2021-10-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11162132B2 (en) | 2015-04-10 | 2021-11-02 | Spatial Transcriptomics Ab | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| US11208684B2 (en) | 2010-04-05 | 2021-12-28 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11286515B2 (en) | 2013-06-25 | 2022-03-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| US11352659B2 (en) | 2011-04-13 | 2022-06-07 | Spatial Transcriptomics Ab | Methods of detecting analytes |
| US11733238B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-08-22 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| USRE50065E1 (en) * | 2012-10-17 | 2024-07-30 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
-
2009
- 2009-07-06 RU RU2009125627/10A patent/RU2410439C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ПЕТРОВ А.К. и др. Мягкая абляция биологических объектов под воздействием субмиллиметрового излучения лазера на свободных электронах. Доклады академии наук, 2005, т.404, №5, с.698-700. ПЕТРОВ А.К., ПЕЛЬТЕК С.Е. Лазер нацелен на ДНК. Наука в Сибири, №12 (2547), март 2006. * |
Cited By (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11560587B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-01-24 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11401545B2 (en) | 2010-04-05 | 2022-08-02 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US12391980B2 (en) | 2010-04-05 | 2025-08-19 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11208684B2 (en) | 2010-04-05 | 2021-12-28 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US12391979B2 (en) | 2010-04-05 | 2025-08-19 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11293917B2 (en) | 2010-04-05 | 2022-04-05 | Prognosys Biosciences, Inc. | Systems for analyzing target biological molecules via sample imaging and delivery of probes to substrate wells |
| US12297488B2 (en) | 2010-04-05 | 2025-05-13 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11313856B2 (en) | 2010-04-05 | 2022-04-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US12297487B2 (en) | 2010-04-05 | 2025-05-13 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US12234505B2 (en) | 2010-04-05 | 2025-02-25 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11365442B2 (en) | 2010-04-05 | 2022-06-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11371086B2 (en) | 2010-04-05 | 2022-06-28 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11384386B2 (en) | 2010-04-05 | 2022-07-12 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11866770B2 (en) | 2010-04-05 | 2024-01-09 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11549138B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-01-10 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11479810B1 (en) | 2010-04-05 | 2022-10-25 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11767550B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-09-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11519022B2 (en) | 2010-04-05 | 2022-12-06 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11156603B2 (en) | 2010-04-05 | 2021-10-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11542543B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-01-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | System for analyzing targets of a tissue section |
| US11733238B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-08-22 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11761030B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-09-19 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11732292B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-08-22 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays correlating target nucleic acid to tissue section location |
| US11634756B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-04-25 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11479809B2 (en) | 2011-04-13 | 2022-10-25 | Spatial Transcriptomics Ab | Methods of detecting analytes |
| US11352659B2 (en) | 2011-04-13 | 2022-06-07 | Spatial Transcriptomics Ab | Methods of detecting analytes |
| US11795498B2 (en) | 2011-04-13 | 2023-10-24 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods of detecting analytes |
| US11788122B2 (en) | 2011-04-13 | 2023-10-17 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods of detecting analytes |
| USRE50065E1 (en) * | 2012-10-17 | 2024-07-30 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| US11821024B2 (en) | 2013-06-25 | 2023-11-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| US11618918B2 (en) | 2013-06-25 | 2023-04-04 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| US11753674B2 (en) | 2013-06-25 | 2023-09-12 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| US11359228B2 (en) | 2013-06-25 | 2022-06-14 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| US11286515B2 (en) | 2013-06-25 | 2022-03-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| US11613773B2 (en) | 2015-04-10 | 2023-03-28 | Spatial Transcriptomics Ab | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| US11390912B2 (en) | 2015-04-10 | 2022-07-19 | Spatial Transcriptomics Ab | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| US11739372B2 (en) | 2015-04-10 | 2023-08-29 | Spatial Transcriptomics Ab | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| US11299774B2 (en) | 2015-04-10 | 2022-04-12 | Spatial Transcriptomics Ab | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| US11162132B2 (en) | 2015-04-10 | 2021-11-02 | Spatial Transcriptomics Ab | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| CN109856641A (zh) * | 2019-01-17 | 2019-06-07 | 北京农业信息技术研究中心 | 禽畜体内生物芯片的太赫兹检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2410439C1 (ru) | Способ абляции целевой днк с поверхности днк-биочипов | |
| Hwang et al. | Ultra-fast and recyclable DNA biosensor for point-of-care detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) | |
| US11209383B2 (en) | Integrated electrochemical detection and purification of nucleic acid biomarkers | |
| US20100076185A1 (en) | Selective Processing of Biological Material on a Microarray Substrate | |
| US10724089B2 (en) | Spatial molecular analysis of tissue | |
| CN101506374B (zh) | 含有捕获探针的用于实时pcr的并可以通过杂交检测pcr产物而不需要打开pcr管的反应室 | |
| US20120058547A1 (en) | Method and system for nucleic acid detection using electroconductive or electrochemically active labels | |
| US20100184028A1 (en) | Method and system for real time quantification and monitoring of nucleic acid amplification using electroconductive or electrochemically active labels | |
| CN105648070A (zh) | 基于酶循环放大及纳米颗粒增强spr检测核酸或细胞的方法 | |
| CN110218818B (zh) | 一种登革病毒基因片段sers检测试剂盒及其制备方法 | |
| WO2003100413A2 (en) | Surface acoustic wave sensors and methods for detecting target analytes | |
| JP2008532003A (ja) | 複合混合物中の分子標的を分離するための方法及びデバイス | |
| JP2008532003A5 (ru) | ||
| KR20030072883A (ko) | Ｄｎａ 마이크로어레이 스팟의 품질관리방법 | |
| EP2334810B1 (en) | Method for immobilizing nucleic acids on a support | |
| JP4122854B2 (ja) | 選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法とハイブリダイゼーション装置および選択結合性物質固定用基材 | |
| CA2510721C (en) | Method and device for pcr amplification and detection of nucleotide sequences | |
| US20030203384A1 (en) | Multiplex detection of biological materials in a sample | |
| JP2012501174A (ja) | インピーダンス分光法を用いたｄｎａの測定 | |
| US8975025B2 (en) | Method and system for nucleic acid detection using electroconductive or electrochemically active labels | |
| CN111534571A (zh) | 一种用于铅离子检测的cha-sers生物传感器及其制备方法和应用 | |
| US20050009066A1 (en) | Methods for localizing target molecules in a flowing fluid sample | |
| WO2004067765A2 (en) | Organism fingerprinting using nicking agents | |
| RU2732791C2 (ru) | Иммобилизация модифицированного олигонуклеотида на полимерном субстрате посредством физической адсорбции | |
| CN101253275A (zh) | 固定超螺旋dna的方法和分析dna修复的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200707 |