RU2407800C1 - METHOD FOR PREPARING 14α-HYDROXYDERIVATIVES OF Δ4-3,17-DIKETO-ANDROSTENE - Google Patents
METHOD FOR PREPARING 14α-HYDROXYDERIVATIVES OF Δ4-3,17-DIKETO-ANDROSTENE Download PDFInfo
- Publication number
- RU2407800C1 RU2407800C1 RU2009130277/10A RU2009130277A RU2407800C1 RU 2407800 C1 RU2407800 C1 RU 2407800C1 RU 2009130277/10 A RU2009130277/10 A RU 2009130277/10A RU 2009130277 A RU2009130277 A RU 2009130277A RU 2407800 C1 RU2407800 C1 RU 2407800C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- transformation
- hydroxy
- mycelium
- hydroxylation
- aqueous phase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical class OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 241000223211 Curvularia lunata Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 29
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 18
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 13
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims 1
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical class O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 abstract description 9
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 229960005471 androstenedione Drugs 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract 1
- 229940084434 fungoid Drugs 0.000 abstract 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 6
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 6
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 6
- LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N androsta-1,4-diene-3,17-dione Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N 0.000 description 6
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 6
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 3
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- WHBHBVVOGNECLV-OBQKJFGGSA-N 11-deoxycortisol Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WHBHBVVOGNECLV-OBQKJFGGSA-N 0.000 description 2
- 241000010216 Cunninghamella blakesleeana Species 0.000 description 2
- 241001450899 Gongronella butleri Species 0.000 description 2
- 241001506781 Mucor piriformis Species 0.000 description 2
- 241000235526 Mucor racemosus Species 0.000 description 2
- 241000235401 Phycomyces blakesleeanus Species 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- -1 methyl β-CD Chemical compound 0.000 description 2
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,16-diol Chemical class C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CC(O)CC1(C)CC2 KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZLYKIGBANMMBK-UGCZWRCOSA-N 5α-Androstane Chemical compound C([C@@H]1CC2)CCC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CCC[C@@]2(C)CC1 QZLYKIGBANMMBK-UGCZWRCOSA-N 0.000 description 1
- JWMFYGXQPXQEEM-NUNROCCHSA-N 5β-pregnane Chemical compound C([C@H]1CC2)CCC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](CC)[C@@]2(C)CC1 JWMFYGXQPXQEEM-NUNROCCHSA-N 0.000 description 1
- 241000293029 Absidia caerulea Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241001133184 Colletotrichum agaves Species 0.000 description 1
- 241000371652 Curvularia clavata Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000228417 Sarocladium strictum Species 0.000 description 1
- 102000005938 Steroid Hydroxylases Human genes 0.000 description 1
- 108010030741 Steroid Hydroxylases Proteins 0.000 description 1
- 241001450870 Thamnostylum piriforme Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001443 androstenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002054 antogonadotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N boldenone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 1
- 230000003157 cancerolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N dehydrotestosterone Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)O)C4C3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 150000003128 pregnanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000000039 preparative column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229950000126 proligestone Drugs 0.000 description 1
- MQSDUYIXZDSLSZ-QSDCUGRSSA-N proligestone[ban:inn] Chemical compound C([C@@H]12)CC3=CC(=O)CC[C@]3(C)[C@H]2CC[C@]2(C)[C@@]3(C(C)=O)CC[C@]21OC(CC)O3 MQSDUYIXZDSLSZ-QSDCUGRSSA-N 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к микробиологическим способам получения гидроксипроизводных стероидов, и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической промышленности.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to microbiological methods for producing hydroxy derivatives of steroids, and can be used in the microbiological and pharmaceutical industries.
Практически все известные гидроксистероиды (моно-, ди-, тригидроксистероиды) обладают высокой физиологической активностью. Что касается некоторых 14α-гидроксилсодержащих Δ4-3-кетостероидов, то у них установлено наличие противовоспалительной, контрацептивной и канцеролитической активностей. 14α-Гидроксистероиды перспективны в качестве исходных структур в синтезе новых физиологически активных соединений [1-3]. Например, 14α-гидроксипроизводные андростендиона (АД) и кортексолона служат в качестве базовых соединений для двух альтернативных путей синтеза высокоактивного антигонадотропного препарата пролигестона, широко используемого в гинекологической и ветеринарной практике [1].Almost all known hydroxysteroids (mono-, di-, trihydroxysteroids) have high physiological activity. As for some 14α-hydroxyl-containing Δ 4 -3-ketosteroids, they have established the presence of anti-inflammatory, contraceptive and carcinolytic activities. 14α-hydroxysteroids are promising as starting structures in the synthesis of new physiologically active compounds [1-3]. For example, the 14α-hydroxy derivatives of androstenedione (AD) and cortexolone serve as basic compounds for two alternative routes for the synthesis of the highly active antigonadotropic drug proligestone, which is widely used in gynecological and veterinary practice [1].
Несмотря на уникальную биологическую активность и огромный интерес исследователей к 14-гидроксилсодержащим стероидам, в мировой практике используется только несколько препаратов этого ряда, что объясняется сложностью введения гидроксильной группы в 14-положение.Despite the unique biological activity and the huge interest of researchers in 14-hydroxyl-containing steroids, only a few drugs of this series are used in world practice, due to the difficulty of introducing a hydroxyl group into the 14-position.
Введение 14α-гидрокси-группы химическим путем нецелесообразно вследствие токсичности используемых реагентов, жестких условий реакции и соответственно низких выходов. Поэтому стереоселективный, экологически безопасный и не требующий предварительной защиты функциональных групп и двойных связей микробиологический способ является в данном случае единственно возможным.The introduction of a 14α-hydroxy group by chemical means is not practical due to the toxicity of the reagents used, harsh reaction conditions, and accordingly low yields. Therefore, a stereoselective, environmentally safe and not requiring prior protection of functional groups and double bonds microbiological method is in this case the only possible.
Известны работы, в которых с целью применения в качестве биокатализатора для введения в стероидную молекулу 14α-гидроксигруппы изучены плесневые грибы Absidia coerulea [2], Acremonium strictum [3], Colletotrichum antirrhini [4], Cunninghamella blakesleeana [5], Curvularia clavata [6], C.lunata [7], Gongronella butleri [8], Mucor racemosus [9], M.piriformis [10], Neurospora crassa [11], Phycomyces blakesleeanus [12], Thamnostylum piriforme [13].Known works are those in which the fungi Absidia coerulea [2], Acremonium strictum [3], Colletotrichum antirrhini [4], Cunninghamella blakesleeana [5], Curvularia clavata [6] were studied with the aim of using a 14α-hydroxy group as a biocatalyst ], C. lunata [7], Gongronella butleri [8], Mucor racemosus [9], M. piriformis [10], Neurospora crassa [11], Phycomyces blakesleeanus [12], Thamnostylum piriforme [13].
Однако с помощью указанных грибов получено ограниченное количество стероидов, содержащих 14α-гидроксигруппу. По-видимому, это связано с очень высокой специфичностью стероидных гидроксилаз по отношению к структуре стероидной молекулы. Сообщается о 14α-гидроксилировании стероидов ряда андростана и прегнана, причем в случае прегнанов, например кортексолона, 14α-гидроксипроизводные образуются, как правило, в качестве побочных продуктов. Нагрузка трансформируемых субстратов в цитируемых работах (за исключением одного примера с АД [7]) составляла не более 2 г/л, а продолжительность процесса гидроксилирования достигала 120 ч.However, using these fungi, a limited number of steroids containing a 14α-hydroxy group were obtained. Apparently, this is due to the very high specificity of steroid hydroxylases with respect to the structure of the steroid molecule. 14α-hydroxylation of steroids of a number of androstane and pregnane has been reported, moreover, in the case of pregnanes, for example cortexolone, 14α-hydroxy derivatives are formed, as a rule, as by-products. The load of transformable substrates in the cited works (with the exception of one example with blood pressure [7]) was no more than 2 g / l, and the duration of the hydroxylation process reached 120 h.
Недостатками рассматриваемых процессов являются неполная конверсия субстрата при сокращении времени трансформации, низкий выход целевых 14α-гидроксилированных производных, образование смеси побочных продуктов. Например, после гидроксилирования 1.0 г/л АД мицелием G. butleri из реакционной среды через 72 ч выделено 21.8% 14α-гидрокси-АД и четыре побочных продукта. При гидроксилировании андростадиендиона (АДД) через 96 ч реакционная смесь состояла из 39% АДД, 16.6% 14α-гидрокси-АДД и двух побочных стероидов в суммарном количестве 28%. Даже в лучшем примере - трансформации 1.0 г/л 9α-гидрокси-АД реакционная смесь после 96 ч инкубирования состояла из 8.1% исходного, 52% целевого 9α,14α-дигидрокси-АД и 29% побочного 6β,9α-дигидрокси-АД [8].The disadvantages of the processes under consideration are incomplete conversion of the substrate while reducing the transformation time, low yield of the desired 14α-hydroxylated derivatives, and the formation of a mixture of by-products. For example, after hydroxylation of 1.0 g / L of blood pressure with G. butleri mycelium, 21.8% of 14α-hydroxy-blood pressure and four by-products were isolated from the reaction medium after 72 hours. When androstadienedione (ADD) was hydroxylated after 96 h, the reaction mixture consisted of 39% ADD, 16.6% 14α-hydroxy-ADD and two side steroids in a total amount of 28%. Even in the best example, transformations of 1.0 g / l 9α-hydroxy-AD, the reaction mixture after 96 h of incubation consisted of 8.1% of the original, 52% of the target 9α, 14α-dihydroxy-AD and 29% of the secondary 6β, 9α-dihydroxy-AD [8 ].
Известен способ гидроксилирования АД растущей культурой С.lunata NRRL 2380 [7], согласно которому трансформацию осуществляют в ферментере при нагрузке субстрата 5.0 г/л в среде, содержащей кукурузный экстракт и соевую муку. Стероиды экстрагируют из культуральной жидкости, не отделяя мицелий, метилизобутилкетоном, экстракт упаривают и выделяют 14α-гидрокси-АД с выходом 60% методом препаративной хроматографии на колонке.A known method of hydroxylation of blood pressure by a growing culture of C. lunata NRRL 2380 [7], according to which the transformation is carried out in a fermenter with a substrate load of 5.0 g / l in a medium containing corn extract and soy flour. Steroids were extracted from the culture fluid without separating the mycelium with methyl isobutyl ketone, the extract was evaporated and 14α-hydroxy-AD was isolated in 60% yield by preparative column chromatography.
Необходимость использования колоночной хроматографии, нежелательной при масштабировании процесса, вызвана, по-видимому, наличием в реакционной смеси побочных гидроксистероидов, а также содержанием в экстракте продуктов метаболизма гриба и липидных компонентов среды, что может быть следствием использования в этом способе культуры гриба, растущей в богатой органическими компонентами питательной среде.The necessity of using column chromatography, which is undesirable in scaling the process, is apparently caused by the presence of side hydroxysteroids in the reaction mixture, as well as by the content of the products of the metabolism of the fungus and lipid components of the medium in the extract, which may be a consequence of the use of a culture of the fungus growing in a rich organic components of the nutrient medium.
Поскольку указанный способ иллюстрирован одним примером, не известно об эффективности 14α-гидроксилазной системы используемого штамма гриба в отношении других стероидов.Since this method is illustrated by one example, the effectiveness of the 14α-hydroxylase system of the fungal strain used against other steroids is not known.
Сущность заявляемого способа заключается в использовании в качестве биокатализатора для введения 14α-гидроксигруппы в 3,17-дикетоандростаны отмытого от питательной среды мицелия нового штамма гриба С.lunata ВКПМ F-981, не образующего других гидроксистероидов, кроме как содержащих 14α-гидроксигруппу.The essence of the proposed method consists in the use of a new strain of C. lunata VKPM F-981 fungus washed from the nutrient medium of mycelium washed from the nutrient medium as a biocatalyst for introducing the 14α-hydroxy group in the mycelium, which does not form other hydroxysteroids except those containing the 14α-hydroxy group.
Трансформацию с помощью указанного штамма проводят в водной среде, в которой отсутствуют компоненты, необходимые для роста гриба. Стероиды для трансформации вносят в количестве не менее 2.0 г/л либо в виде водной суспензии микрокристаллов, либо в виде водорастворимого комплекса с химически модифицированным β-циклодекстрином (ЦД), например метил-ЦД, оксипропил-ЦД.Transformation using the specified strain is carried out in an aqueous medium in which there are no components necessary for the growth of the fungus. Steroids for transformation are added in an amount of not less than 2.0 g / l either as an aqueous suspension of microcrystals or as a water-soluble complex with chemically modified β-cyclodextrin (CD), for example methyl-CD, hydroxypropyl-CD.
Максимальное время трансформации не превышает 45 ч. Конверсия стероидов в конце процесса 14α-гидроксилирования составляет 85-95%. В зависимости от структуры, количества и формы внесения субстратов (в виде микрокристаллов или в виде водорастворимого комплекса с ЦД) 14α-гидроксипродукты преимущественно находятся либо на мицелии, либо в водной фазе, что существенно облегчает их выделение.The maximum transformation time does not exceed 45 hours. The steroid conversion at the end of the 14α-hydroxylation process is 85-95%. Depending on the structure, amount and form of application of substrates (in the form of microcrystals or in the form of a water-soluble complex with CD), 14α-hydroxy products are predominantly either on the mycelium or in the aqueous phase, which greatly facilitates their isolation.
При трансформации андростенов в виде комплекса с ЦД водную фазу после извлечения стероидных метаболитов используют повторно для трансформации без регенерации ЦД.During the transformation of androstenes in the form of a complex with CD, the aqueous phase after extraction of steroid metabolites is used repeatedly for transformation without regeneration of CD.
Выход 14α-гидроксипродуктов в зависимости от структуры исходного субстрата, количества и формы его внесения в реакционную среду составляет 40-70%.The yield of 14α-hydroxy products depending on the structure of the starting substrate, the amount and form of its introduction into the reaction medium is 40-70%.
Способ иллюстрируется следующими примерами, выход выделенного продукта в которых выражен в % от теоретически возможного.The method is illustrated by the following examples, the yield of the selected product in which is expressed in% of theoretically possible.
Пример 1. Трансформация АД при нагрузке 2.0 г/л в виде микрокристаллов.Example 1. Transformation of blood pressure at a load of 2.0 g / l in the form of microcrystals.
Споры гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981 переносили со скошенного агара в жидкую среду, содержащую: (г/л) глюкозу - 20.0, пептон - 5.0, дрожжевой экстракт - 5.0, соевую муку - 10.0, КН2РO4 - 4.0, рН 6.2-6.5. Выращивали культуру в течение 3 сут. на качалке при 28°С, после чего полученный вегетативный посевной материал переносили в такую же среду и инкубировали в тех же условиях 30-35 ч. Мицелий отделяли от среды, промывали фосфатным буфером, полученную биомассу распределяли в качалочные колбы с фосфатным буфером, в которые добавляли водную суспензию АД с размером частиц до 20 мкм в присутствии твина-80. Трансформацию 2.4 г АД осуществляли в течение 26 ч. Анализировали содержание стероидных метаболитов на мицелии и в водной фазе. Продукт 14α-гидрокси-АД извлекали из мицелия экстракцией этилацетатом. Отдельно экстрагировали водную фазу. Определяли отсутствие в ней побочных продуктов, после чего экстракты объединяли, упаривали и получали 1.9 г технического продукта. Кристаллизацией из этилацетата получали 1.3 г 14α-гидрокси-АД, т.пл. 257-261°С. Лит. 259- 262°С [9], выход 54%.Spores of the fungus Curvularia lunata VKPM F-981 were transferred from mown agar to a liquid medium containing: (g / l) glucose - 20.0, peptone - 5.0, yeast extract - 5.0, soy flour - 10.0, KH 2 PO 4 - 4.0, pH 6.2 -6.5. The culture was grown for 3 days. on a shaker at 28 ° С, after which the obtained vegetative inoculum was transferred to the same medium and incubated under the same conditions for 30-35 h. The mycelium was separated from the medium, washed with phosphate buffer, the resulting biomass was distributed into rocking flasks with phosphate buffer, into which added an aqueous suspension of blood pressure with a particle size of up to 20 μm in the presence of tween-80. Transformation of 2.4 g of blood pressure was carried out for 26 hours. The content of steroid metabolites on the mycelium and in the aqueous phase was analyzed. The product 14α-hydroxy-AD was recovered from the mycelium by extraction with ethyl acetate. The aqueous phase was extracted separately. The absence of by-products in it was determined, after which the extracts were combined, evaporated and 1.9 g of technical product was obtained. Crystallization from ethyl acetate gave 1.3 g of 14α-hydroxy-HELL; mp. 257-261 ° C. Lit. 259–262 ° С [9], yield 54%.
Пример 2. Трансформация АД при нагрузке 6.0 г/л в виде комплекса с метил-β-ЦД.Example 2. Transformation of blood pressure at a load of 6.0 g / l in the form of a complex with methyl β-CD.
Мицелий для трансформации 3.0 г АД получали аналогично примеру 1, но АД подвергали гидроксилированию в течение 42 ч в виде комплекса с метил-β-ЦД в фосфатном буфере, используя мольное отношение АД/ЦД 1:1.Mycelium for transformation of 3.0 g of AD was obtained analogously to Example 1, but AD was hydroxylated for 42 h as a complex with methyl β-CD in phosphate buffer using a 1: 1 molar ratio AD / CD.
Мицелий отделяли от водной фазы и экстрагировали этилацетатом. Отдельно экстрагировали водную фазу. Экстракты объединяли и упаривали. Получали 2.53 г технического продукта, перекристаллизацией которого в этилацетате получали 2.1 г 14α-гидрокси-АД, идентичного ранее выделенному, т.пл. 258-263°С, выход 62%.The mycelium was separated from the aqueous phase and extracted with ethyl acetate. The aqueous phase was extracted separately. The extracts were combined and evaporated. Received 2.53 g of technical product, recrystallization of which in ethyl acetate received 2.1 g of 14α-hydroxy-AD identical to the previously isolated, so pl. 258-263 ° C, yield 62%.
Пример 3. Трансформация АД при нагрузке 4.0 г/л в виде комплекса с повторно используемым метил-β-ЦД.Example 3. Transformation of blood pressure at a load of 4.0 g / l in the form of a complex with reused methyl-β-CD.
Трансформацию АД и выделение 14α-гидрокси-АД проводили согласно примеру 2, но в качестве реакционной среды использовали водную фазу после выделения продуктов трансформации примера 2, в которую добавляли АД и свежую порцию мицелия, приготовленного для первого цикла трансформации по примеру 2 и хранившегося сутки при 4-5°С, либо выращенного повторно согласно примеру 1. Трансформацию проводили в течение 24 ч. Продукт, идентичный ранее выделенному, получали с выходом 52%.The transformation of blood pressure and the isolation of 14α-hydroxy-blood pressure was carried out according to example 2, but the aqueous phase was used as the reaction medium after isolation of the products of the transformation of example 2, to which was added blood pressure and a fresh portion of mycelium prepared for the first transformation cycle of example 2 and stored for 24 hours 4-5 ° C, or re-grown according to example 1. Transformation was carried out within 24 hours. A product identical to the previously isolated was obtained with a yield of 52%.
Пример 4. Трансформация АД при нагрузке 6.0 г/л в виде комплекса с оксипропил-β-ЦД.Example 4. Transformation of blood pressure at a load of 6.0 g / l in the form of a complex with oxypropyl-β-CD.
Трансформацию 1.6 г АД осуществляли согласно примеру 2, но в качестве солюбилизатора использовали оксипропил-β-ЦД в мольном отношении АД/ЦД 1:1. Через 45 ч инкубации, когда конверсия достигла 98%, мицелий отделяли от водной фазы. Экстракцией мицелия этилацетатом выделено 0.68 г 14α-гидрокси-АД, т.пл. 258-262°С, выход 40%. Из водной фазы выделено также 0.17 г 14α-гидрокси-АДД (выход 10%), т пл. 282-285°С. Лит. 284-287°С [14].Transformation of 1.6 g of blood pressure was carried out according to example 2, but as a solubilizer used oxypropyl-β-CD in a molar ratio of AD / CD 1: 1. After 45 hours of incubation, when the conversion reached 98%, the mycelium was separated from the aqueous phase. Extraction of mycelium with ethyl acetate gave 0.68 g of 14α-hydroxy-AD, mp 258-262 ° C, yield 40%. 0.17 g of 14α-hydroxy-ADD was also isolated from the aqueous phase (yield 10%), mp 282-285 ° C. Lit. 284-287 ° C [14].
Пример 5. Трансформация АДД при нагрузке 3.0 г/л в виде комплекса с оксипропил-β-ЦД.Example 5. The transformation of the ADD at a load of 3.0 g / l in the form of a complex with oxypropyl-β-CD.
Трансформацию 2.1 г АДД и выделение продуктов гидроксилирования осуществляли согласно примеру 4. Полную конверсию АДД наблюдали через 24 ч. Из мицелия выделено 1.55 г 14α-гидрокси-АДД, из водной фазы - 0.85 г смеси 14α-гидрокси-АДД и дегидротестостерона в отношении 1:1. После кристаллизации 14α-гидрокси-АДД из экстрактов мицелия и водной фазы его выход составил 69.8%. Т.пл. 283-285°С.The transformation of 2.1 g of ADD and the isolation of the products of hydroxylation was carried out according to example 4. Complete conversion of ADD was observed after 24 hours. 1.55 g of 14α-hydroxy-ADD was isolated from mycelium, 0.85 g of a mixture of 14α-hydroxy-ADD and dehydrotestosterone in the ratio 1 was extracted from the aqueous phase: one. After crystallization of 14α-hydroxy-ADD from extracts of mycelium and the aqueous phase, its yield was 69.8%. Mp 283-285 ° C.
Пример 6. Трансформация 9α-гидрокси-АД в виде микрокристаллов при нагрузке 2.0 г/л.Example 6. Transformation of 9α-hydroxy-HELL in the form of microcrystals at a load of 2.0 g / L.
Трансформацию и выделение продукта гидроксилирования проводили согласно примеру 1. Через 40 ч трансформации конверсия составила 95%, выход кристаллического 9α,14α-дигидрокси-АД 52%, т.пл. 240-243°С. Лит. данные 241-244°С [15].The transformation and isolation of the hydroxylation product was carried out according to example 1. After 40 hours of transformation, the conversion was 95%, the yield of crystalline 9α, 14α-dihydroxy-AD was 52%, mp 240-243 ° C. Lit. data 241-244 ° C [15].
Пример 7. Трансформация 9α-гидрокси-АД при нагрузке 2 г/л в виде комплекса с оксипропил-β-ЦД.Example 7. Transformation of 9α-hydroxy-AD at a load of 2 g / l in the form of a complex with oxypropyl-β-CD.
Трансформацию 2.8 г 9α-гидрокси-АД и выделение продукта реакции осуществляли согласно примеру 4. Получено 55% кристаллического 9α,14α-дигидрокси-АД, т.пл. 241-244°С.The transformation of 2.8 g of 9α-hydroxy-AD and the isolation of the reaction product was carried out according to example 4. 55% of crystalline 9α, 14α-dihydroxy-AD were obtained, mp. 241-244 ° C.
ЛитератураLiterature
1. Smid P.M., van Zoest W.J., Weber P.O., Marx A.F. // 14α,17α-Dihydroxy-17β-substituted steroids. US Patent 5 093 502. 1992.1. Smid P.M., van Zoest W.J., Weber P. O., Marx A.F. // 14α, 17α-Dihydroxy-17β-substituted steroids. US Patent 5,093,502. 1992.
2. Brzezowska E., Dmochowska-Gladysz J., Kolek T. J.Steroid Biochem. Mol. Biol. V.57, no.5-6, pp.357-362. 1996.2. Brzezowska E., Dmochowska-Gladysz J., Kolek T. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. V.57, no.5-6, pp.357-362. 1996.
3. Yoshihama M., Tamura К., Miyata N., Nakayama S., Nakakoshi M. Novel androst-4-ene-3,17-dione derivatives and process for their preparation. EP 0 300 062.1988.3. Yoshihama M., Tamura K., Miyata N., Nakayama S., Nakakoshi M. Novel androst-4-ene-3,17-dione derivatives and process for their preparation. EP 0 300 062.1988.
4. Niar V.C., Shapiro S., Arunachalam Т., Caspi E. //Biotransformation of progesterone to 14α-hydroxypregna-l,4-diene-3,20-dione, a novel fungal metabolite, by Colletotrichum antirrihini. J.Steroid Biochem. V. 22, no.3, pp.399-400. 1985.4. Niar V.C., Shapiro S., Arunachalam T., Caspi E. // Biotransformation of progesterone to 14α-hydroxypregna-l, 4-diene-3,20-dione, a novel fungal metabolite, by Colletotrichum antirrihini. J. Steroid Biochem. V. 22, no.3, pp.399-400. 1985.
5. Chincholkar S.B., Laxman R.S., Wakharkar R.D. // Hydroxylation of progesterone by Cunninghamella blakesleeana NCIM 687. World J. Microbiol. Biotechnol. V.11, pp.357-358. 1995.5. Chincholkar S. B., Laxman R. S., Wakharkar R. D. // Hydroxylation of progesterone by Cunninghamella blakesleeana NCIM 687. World J. Microbiol. Biotechnol. V.11, pp. 357-358. 1995.
6. Vujic M., Jankov R.M. // Microbiologic transformation of progesterone by Curvularia clavata. Steroids, V.55, no. 1, pp.17-21. 1990.6. Vujic M., Jankov R.M. // Microbiologic transformation of progesterone by Curvularia clavata. Steroids, V. 55, no. 1, pp. 17-21. 1990.
7. Weber A., Kennecke M. //Verfahren zu herstellung von 14α-hydroxy-4-androsten-3,17-dion. WO 93/05170. 1993.7. Weber A., Kennecke M. // Verfahren zu herstellung von 14α-hydroxy-4-androsten-3,17-dion. WO 93/05170. 1993.
8. Kollerov V.V., Shutov A.A., Fokina V.V., Sukhodolskaya G.V., Donova M.V. // Biotransformation of 3-ketoandrostanes by Gongronella butleri VKMF-1033. J.Mol.CatalysisB: Enz. V.55, pp.61-68. 2008.8. Kollerov V.V., Shutov A.A., Fokina V.V., Sukhodolskaya G.V., Donova M.V. // Biotransformation of 3-ketoandrostanes by Gongronella butleri VKMF-1033. J. Mol. Catalysis B: Enz. V. 55, pp. 61-68. 2008.
9. Faramazzi M.A., Badiee M., Yazdi M.T., Amini M., Torshabi M. // Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3,17-dione by filamentous fungus Mucor racemosus. J. Molec.Catalysis B: Enz. V.50, no.5. 2008.9. Faramazzi M.A., Badiee M., Yazdi M.T., Amini M., Torshabi M. // Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3,17-dione by filamentous fungus Mucor racemosus. J. Molec. Catalysis B: Enz. V.50, no.5. 2008.
10. Madyashta K.M., Joseph TV/Study on the 14a-hydroxylation of progesterone in Mucor piriformis. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., V.45, no.6, pp.563-569. 1993.10. Madyashta K.M., Joseph TV / Study on the 14a-hydroxylation of progesterone in Mucor piriformis. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., V.45, no.6, pp. 563-569. 1993.
11. Smith К., Kirk D., Latif S. // Transformation of progesterone, testosterone and androstenedione by Phycomyces blakesleeanus. J. Steroid Biochem. V.32, no.3, pp.445-451. 1989.11. Smith K., Kirk D., Latif S. // Transformation of progesterone, testosterone and androstenedione by Phycomyces blakesleeanus. J. Steroid Biochem. V.32, no.3, pp.445-451. 1989.
12. Hu S.-H., Genain G., Azerad R. // Microbial transformation of steroids: Contribution to 14a-hydroxylations. Steroids, V.60, no.4, pp.337-352. 1995.12. Hu S.-H., Genain G., Azerad R. // Microbial transformation of steroids: Contribution to 14a-hydroxylations. Steroids, V.60, no.4, pp. 337-352. 1995.
13. Steroids, V.73, pp.13-18. 2008.13. Steroids, V.73, pp. 13-18. 2008.
14. Iizuka H., Naito A., Sato Y. J.Gen.Appl. Microbiol. V.7, p.118, 1961.14. Iizuka H., Naito A., Sato Y. J. Gen. Appl. Microbiol. V.7, p. 118, 1961.
15. Kondo E., Tori К. // J.Am.Chem.Soc. V.86, p.736, 1964.15. Kondo E., Tori K. // J. Am. Chem. Soc. V.86, p. 736, 1964.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009130277/10A RU2407800C1 (en) | 2009-08-07 | 2009-08-07 | METHOD FOR PREPARING 14α-HYDROXYDERIVATIVES OF Δ4-3,17-DIKETO-ANDROSTENE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009130277/10A RU2407800C1 (en) | 2009-08-07 | 2009-08-07 | METHOD FOR PREPARING 14α-HYDROXYDERIVATIVES OF Δ4-3,17-DIKETO-ANDROSTENE |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2407800C1 true RU2407800C1 (en) | 2010-12-27 |
Family
ID=44055791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009130277/10A RU2407800C1 (en) | 2009-08-07 | 2009-08-07 | METHOD FOR PREPARING 14α-HYDROXYDERIVATIVES OF Δ4-3,17-DIKETO-ANDROSTENE |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2407800C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114507630A (en) * | 2022-01-25 | 2022-05-17 | 天津科技大学 | A kind of genetic engineering bacteria for synthesizing 14α-hydroxy-androstanedione and its application |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL6715404A (en) * | 1966-11-15 | 1968-05-16 | ||
| US5093502A (en) * | 1985-01-14 | 1992-03-03 | Akzo N.V. | 14α,17α-dihydroxy-17β-substituted steroids |
| DE4129005A1 (en) * | 1991-08-28 | 1993-03-04 | Schering Ag | METHOD FOR PRODUCING 14 (ALPHA) -HYDROXY-4-ANDROSTEN-3,17-DION |
| RU2156302C1 (en) * | 1998-12-28 | 2000-09-20 | Донова Марина Викторовна | Method of producing 1,2-dehydroderivatives of 4-delta-3-keto-steroids |
-
2009
- 2009-08-07 RU RU2009130277/10A patent/RU2407800C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL6715404A (en) * | 1966-11-15 | 1968-05-16 | ||
| US5093502A (en) * | 1985-01-14 | 1992-03-03 | Akzo N.V. | 14α,17α-dihydroxy-17β-substituted steroids |
| DE4129005A1 (en) * | 1991-08-28 | 1993-03-04 | Schering Ag | METHOD FOR PRODUCING 14 (ALPHA) -HYDROXY-4-ANDROSTEN-3,17-DION |
| RU2156302C1 (en) * | 1998-12-28 | 2000-09-20 | Донова Марина Викторовна | Method of producing 1,2-dehydroderivatives of 4-delta-3-keto-steroids |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЯДЕРЕЦ В.В. и др. Изучение стероидгидроксилирующей активности мицелия Cuvularia lunata. - Прикладная биохимия и микробиология, 2007, т.43, №6, с.695-700. ДРУЖИНИНА А.В. Превращение 17α-Метилтестостерона в метандростенолон с помощью бактерии Pimelobacter Simplex ВКПМ AC-1632 в присутствии циклодекстринов. Прикладная биохимия и микробиология, 2008, т.44, №6, с.642-646. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114507630A (en) * | 2022-01-25 | 2022-05-17 | 天津科技大学 | A kind of genetic engineering bacteria for synthesizing 14α-hydroxy-androstanedione and its application |
| CN114507630B (en) * | 2022-01-25 | 2023-12-26 | 天津科技大学 | Genetically engineered bacterium for synthesizing 14 alpha-hydroxy-androstanedione and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shah et al. | Biotransformation of 17α-ethynyl substituted steroidal drugs with microbial and plant cell cultures: a review | |
| US20040137555A1 (en) | Microorganism having ability to convert sterol into androst-4-ene-3,17-dione/androsta-1,4-diene-3,17-dione and preparation method and use thereof | |
| CN102321678A (en) | The method of 1 alpha-hydroxy vitamin D is made in a kind of microbial transformation | |
| CN103740799B (en) | A kind of bioconversion phytosterol prepares the method for Steroid medicine intermediates | |
| JP2719377B2 (en) | Microbiological production of 9α-hydroxy-17-ketosteroid | |
| RU2407800C1 (en) | METHOD FOR PREPARING 14α-HYDROXYDERIVATIVES OF Δ4-3,17-DIKETO-ANDROSTENE | |
| GB2123833A (en) | Steroid 1,2-dehydrogenation using dried microbial cells | |
| CN103361394B (en) | Utilize the method that microorganism converts preparation 9 Alpha-hydroxies-androstenedione | |
| US4528271A (en) | Process for the intensification of microbiological conversions of steroids using cyclodextrin additives | |
| Andrushina et al. | Hydroxylation of steroids by Curvularia lunata mycelium in the presence of methyl-β-cyclodextrine | |
| EP1066399B1 (en) | Process for the microbial conversion of phytosterols to androstenedione and androstadienedione | |
| RU2644190C1 (en) | Microbiological method of obtaining 17alpha-hydrocortizone acetate from 17alpha,21-cortexolone diacetate | |
| RU2236464C2 (en) | Method for preparing metandrostenolone | |
| CN103451242A (en) | Method for preparing 1alpha-hydroxy vitamin D through microbial conversion | |
| EP0922770B1 (en) | A microbiological process for the transformation of 17beta-carboxy substituted 3-oxo-4-azasteroids and the use of such products as inhibitors of the enzyme 5alpha-reductase | |
| US11254924B2 (en) | Method for biocatalysis using filamentous fungi | |
| US20040171853A1 (en) | Microbial process to prepare5-androsten-3beta,7alpha, 15alpha-triol-17-one and related analogues | |
| RU2399674C2 (en) | Method of delta4-3-ketosteroids 11 beta-hydroxylation | |
| CN109536562B (en) | A kind of method for preparing steroid drug intermediate by mixed bacteria fermentation and transforming phytosterol | |
| US2872380A (en) | Process for the production of 17-beta hydroxysteroids by neocosmospora | |
| MXPA06003504A (en) | Fermentation method for the preparation of testolactone by fusarium species. | |
| HU212769B (en) | Process for producing 4-pregnene-3,20-dione and its derivatives | |
| JPH0117678B2 (en) | ||
| HK1134684A (en) | Method for biocatalysis using filamentous fungi | |
| JPS61280293A (en) | Production of phosphoric acid ester of steroid compound |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180921 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |