RU2407750C2 - Фотобелки с усиленной биолюминесценцией и их использование в качестве внутриклеточных индикаторов кальция - Google Patents
Фотобелки с усиленной биолюминесценцией и их использование в качестве внутриклеточных индикаторов кальция Download PDFInfo
- Publication number
- RU2407750C2 RU2407750C2 RU2007133797/10A RU2007133797A RU2407750C2 RU 2407750 C2 RU2407750 C2 RU 2407750C2 RU 2007133797/10 A RU2007133797/10 A RU 2007133797/10A RU 2007133797 A RU2007133797 A RU 2007133797A RU 2407750 C2 RU2407750 C2 RU 2407750C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- calcium
- cell
- cells
- seq
- Prior art date
Links
- 239000011575 calcium Substances 0.000 title claims abstract description 70
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 51
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 abstract 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 94
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 16
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 11
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 11
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 8
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710122864 Major tegument protein Proteins 0.000 description 8
- 102100031545 Microsomal triglyceride transfer protein large subunit Human genes 0.000 description 8
- 101710148592 PTS system fructose-like EIIA component Proteins 0.000 description 8
- 101710169713 PTS system fructose-specific EIIA component Proteins 0.000 description 8
- 101710199973 Tail tube protein Proteins 0.000 description 8
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- PEHSVUKQDJULKE-UHFFFAOYSA-N imetit Chemical compound NC(=N)SCCC1=CNC=N1 PEHSVUKQDJULKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- PLYRYAHDNXANEG-QMWPFBOUSA-N (2s,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxy-n-methyloxolane-2-carboxamide Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C(=O)NC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 PLYRYAHDNXANEG-QMWPFBOUSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 102000002298 Purinergic P2Y Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010000818 Purinergic P2Y Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- -1 clitin Proteins 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HUJXGQILHAUCCV-MOROJQBDSA-N 3-iodobenzyl-5'-N-methylcarboxamidoadenosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C(=O)NC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NCC=3C=C(I)C=CC=3)=C2N=C1 HUJXGQILHAUCCV-MOROJQBDSA-N 0.000 description 2
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 2
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700108 Ctenophora <comb jellyfish phylum> Species 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 241000243320 Hydrozoa Species 0.000 description 2
- 101710128071 Mitrocomin Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 101150012763 endA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 108010089402 phialidin Proteins 0.000 description 2
- 238000005424 photoluminescence Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKAMEFMDQNTDFK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazo[4,5-b]pyrazine Chemical compound C1=CN=C2NC=NC2=N1 ZKAMEFMDQNTDFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008161 Adenosine A3 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010060261 Adenosine A3 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108090000365 Cytochrome-c oxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004384 Histamine H3 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000981 Histamine H3 receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000783645 Homo sapiens Adenosine receptor A3 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241001455930 Obelia longissima Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003185 calcium uptake Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N firefly oxyluciferin Natural products Oc1csc(n1)-c1nc2ccc(O)cc2s1 LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 108010093301 halistaurin Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 102000046278 human ADORA3 Human genes 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010023206 mnemiopsin Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N oxidized Photinus luciferin Chemical compound S1C2=CC(O)=CC=C2N=C1C1=NC(=O)CS1 JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/07—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a mitochondrial localisation signal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к фотобелкам, производным клитина, и их использованию в качестве индикаторов внутриклеточного кальция и в клеточных исследованиях. Данные белки получают мутагенезом кодирующей последовательности клитина. Кроме того, предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие данный белок, вектор, содержащий данные нуклеиновые кислоты, и клетка-хозяин, несущая вектор. Полученные белки проявляют усиленную биолюминесценцию, высокое сродство к кальцию и продолжительную световую эмиссию. Они могут найти применение в генных технологиях передачи информации для мониторинга клеточных событий, связанных с передачей сигнала и экспрессией генов. Также фотобелки настоящего изобретения могут быть использованы в качестве индикаторов внутриклеточного кальция в диагностических методах, основанных на измерении концентрации кальция в ответ на различные воздействия. 9 н. и 10 з.п. ф-лы, 16 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к фотобелкам с усиленной биолюминесценцией и их использованию в качестве внутриклеточных индикаторов кальция. Фотобелки получают мутагенезом кодирующей последовательности клитина (clytin), и они проявляют усиленную биолюминесценцию, высокое сродство к кальцию и продолжительную световую эмиссию. Они удобны в использовании в клеточных исследованиях для определения изменений концентрации внутриклеточного кальция, в частности в исследованиях по подбору молекул, проводимых с использованием оборудования с высокой и ультравысокой пропускной способностью.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Биолюминесценция представляет собой феномен, при котором видимый свет излучается живыми организмами или субстанциями, произведенными из них, через разнообразие хемилюминесцентных реакционных систем. Для биолюминесцентных реакций требуется три главных компонента: люцифирин, люцифераза и молекулярный кислород. Однако другие компоненты также могут потребоваться в некоторых реакциях, включая катионы (Ca++ и Mg++) и кофакторы (АТФ, НАД(Ф)Н). Люциферазы представляют собой ферменты, которые катализируют окисление субстрата люциферина и производят нестабильный интермедиат. Свет излучается, когда нестабильный интермедиат разрушается до основного состояния с образованием оксилюциферина. Существует много различных несвязанных типов люциферина, хотя многие виды из, по меньшей мере, семи типов используют один и тот же люциферин, известный как коэлентеразин (coelenterazine). Из некоторых животных (например, медузы) система люциферин/люцифераза может быть извлечена в виде стабильного “фотобелка”, который излучает свет при связывании кальция. Фотобелки отличаются от люцифераз в том, что они представляют собой устойчивые окисленные промежуточные комплексы люциферазы и люциферина. Фотобелки представлены во многих морских коэлентератах и позволяют данным организмам излучать свет для разных целей, включая размножение, питание и защиту 1. Существует много люминесцентных организмов, но до сих пор выделены только семь фотобелков, а именно талассиколин [2, 3], акворин [4-6], митрокомин (синоним халистаурин) [7, 8], клитин (синоним фиалидин) [8, 9], обелин [2, 6, 10, 11], мнемиопсин [12, 13] и беровин [12, 13]. Все указанные белки представляют собой комплексы, сформированные апобелком, хромофором имидазопиразином (коэлентеразин) и кислородом. Их структуры высоко консервативны, особенно в регионах, содержащих три кальцийсвязывающих участка (EF-hand структуры). Термин “фотобелок” обозначает люциферинсвязанный полипептид, который способен к люминесценции, в то время как термин “апобелок” используют для обозначения белка без люциферина.
Наиболее изученными фотобелками являются акворин, выделенный из Aequorea victoria [14], и обелин, выделенный из Obelia longissima [15]. Фотобелок может быть регенерирован из апофотобелка инкубацией с коэлентеразином, молекулярным кислородом, ЭДТА и 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом. Поскольку коэлентеразин представляет собой общий люминесцентный субстрат, используемый фотобелками акворином, митрокомином, клитином и обелином, то реакция светоизлучения, видимо, одинакова в указанных четырех фотобелках [16, 17].
Фотобелок клитин был клонирован в 1993 г. Inouye и др. [18]. До настоящего времени исследования данного фотобелка практически не проводились. Проведено выравнивание первичных структур акворина, митрокомина, клитина и обелина, и показана высокая идентичность аминокислотных последовательностей. Также установлено, что Са2+-связывающие участки являются высоко консервативными [19]. Установлено, что Са2+-связывающий белок у гидрозоев (Hydrozoa) отличается от других Са2+-связывающих белков относительно высоким содержанием остатков цистеина, гистидина, триптофана, пролина и тирозина.
Анализ первичной структуры клитина показывает, что он содержит 198 аминокислотных остатков (а.о.) и принадлежит к семейству фотобелков.
Фотобелки широко используются в генных технологиях передачи информации для мониторинга клеточных событий, связанных с передачей сигнала и экспрессией генов.
Изучение клеточных событий и их регуляции требует чувствительных, неинвазивных аналитических методов. Фотобелки и, в целом, использование фотолюминесценции представляют собой превосходную систему передачи информации, поскольку они практически не имеют фонового излучения в отличие от флюоресцентных систем.
Фотобелки экспрессируют в клетках млекопитающих для мониторинга изменений концентрации кальция в ответ на различные воздействия. Концентрации внутриклеточного кальция могут быть измерены при добавлении кофактора коэлентеразина к клеткам млекопитающих, экспрессирующим фотобелок и улавливающим фотон излучения, которое показывает концентрацию внутриклеточного кальция. Использование клеток, которые экспрессируют и фотобелок, и рецептор, вовлеченный в модуляцию концентрации внутриклеточного кальция, обеспечивает применимую систему для отбора соединений и их воздействий на освобождение внутриклеточного кальция. Высокопроизводительные методы скрининга также могут быть созданы с использованием фотобелка в качестве системы передачи информации. Чувствительность данной системы и ее высокий сигнал по отношению к коэффициенту шума позволяет проводить исследования в малых объемах. Акворин вплоть до настоящего времени является наиболее используемым фотобелком для указанных исследовательских целей. Исследования потоков кальция обычно проводят в формате HTS, используя оптические скрининговые приборы, подходящие для одновременного анализа большого количества образцов и оборудованные системой получения люминесцентного изображения с CCD камерой-детектором. При этом одним из наиболее используемых инструментов в HTS является ридер FLIPR® (Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA), который был разработан как высокопроизводительный прибор оптического скрининга для клеточных флюоресцентных исследований. Прибор оборудован оптическим детектором, который позволяет изолировать сигнал на клеточном монослое, увеличивая, таким образом, чувствительность клеточных исследований. Источником возбуждения может быть либо аргоновый лазер, либо источник с широкой полосой пропускания, как ксеноновая лампа.
Последние версии системы FLIPR® (FLIPR3 и FLIPRTETRA) со светонепроницаемой сверхчувствительной камерой с быстрой выдержкой, с проточным дозатором жидкости пригодны также и для люминесцентных исследований, хотя и с более низкой чувствительностью по сравнению с оборудованием на базе CCD камеры.
Для использования описанных выше инструментов FLIPR®, FLIPR3 и FLIPRTETRA, и, в целом, для всех инструментов с низкой чувствительностью в люминесцентных исследованиях фотобелок с усиленной световой эмиссией представляется высоко востребованным.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
По первому аспекту изобретение предоставляет собой выделенный фотобелок, содержащий аминокислотную последовательность, которая
a) способна связать коэлентеразин и кальций, создавая биолюминесценцию;
b) идентичен, по меньшей мере, на 90%, предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 98% SEQ ID NO: 1 (клитин);
c) в выравнивании последовательностей с SEQ ID NO: 1 (клитин) представляет одну из следующих единичных или множественных замен (позиции остатков относятся к SEQ ID NO: 1):
i) C54→S;
ii) S132→C;
iii) K48→R, N195→D;
iv) Q68→R, A90→V, T184→I;
v) Y82→F, K110→N, F125→L, S149→R;
vi) G142→C;
vii) I53→V, S149→R;
viii) N18→D, I40→V, K56→R;
ix) Gly58→Glu, Asp69→Val, Ala70→Cys, Lys76→Arg, Lys77→Gly, Ile78→Cys, Asp81→Glu, Val86→Ile, Glu87→Ala, Ala90→Gln, Val92→Leu и Glu97→Gln.
В предпочтительном воплощении фотобелок содержит в своем составе аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. По сравнению с известными или коммерчески доступными фотобелками фотобелки настоящего изобретения имеют усиленную биолюминесцентную активность и/или повышенную сродство к кальцию и/или продолжительную световую эмиссию.
Помимо замещений индикаторных остатков, которые подтверждают желаемую биолюминесцентную активность фотобелка, последовательность клитина может быть далее модифицирована без негативного влияния на биолюминесцентную активность фотобелка, особенно с помощью консервативных замещений аминокислотных остатков внутри индикаторных пределов, идентифицирующих последовательность. Кроме того, из последовательности клитина могут быть вырезаны небольшие участки без изменения его фотобелковой активности.
В другом аспекте изобретение направлено на полинуклеотидное кодирование фотобелка, как определено ранее. В предпочтительном воплощении полинуклеотидную последовательность оптимизируют для использования кодонов млекопитающих согласно SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19. В другом предпочтительном воплощении молекулы нуклеиновых кислот сливают с митохондриальными целевыми последовательностями [20, 21, 22].
Согласно другому аспекту изобретение предоставляет векторы экспрессии и клетки-хозяева, содержащие индикаторные полипептиды. Клетки-хозяева, экспрессирующие фотобелок, согласно настоящему изобретению производят интенсивную биолюминесценцию в ответ на стимуляцию кальцием, которая значительно выше, чем наблюдаемая с натуральными фотобелками, в частности с одним из наиболее часто используемых акворином.
В другом аспекте изобретение предоставляет клеточное исследование для определения внутриклеточной концентрации кальция посредством фотобелка согласно настоящему изобретению.
В предпочтительном воплощении изменения внутриклеточной концентрации кальция определяют с помощью:
a) обеспечения клеточной экспрессии фотобелка SEQ ID NO: 2-10, его вариантов или фрагментов;
b) нагрузки клеток коэлентеразином;
c) взаимодействия клеток с агентом, стимулирующим поступление кальция или высвобождение кальция из внутриклеточных депо;
d) определение биолюминесценции фотобелка.
Исследование предпочтительно проводят в высокопроизводительном формате, используя оптический скрининговый инструмент или прибор, подходящий для многопробного анализа, такой как система люминесцентного изображения с CCD камерой-детектором для высокой и ультравысокой производительности или с флюориметрическим планшетным ридером FLIPR®. В обеих данных системах фотобелки настоящего изобретения дают наивысший сигнал по сравнению с известными фотобелками, обычно используемыми в автоматизированных клеточных функциональных исследованиях.
В предпочтительном воплощении клетки, экспрессирующие фотобелок и рецептор, вовлеченный во внутриклеточную мобилизацию кальция, используют для тестирования молекул-кандидатов на их воздействие на рецепторную модуляцию. Обычно клетки трансфицируют векторами экспрессии, содержащими кодирующую последовательность фотобелка, и в отсутствие интересующего эндогенного рецептора или канала. Положительные клоны отбирают и высевают в подходящей среде, культивируемые клетки нагружают субстратом коэлентеразином и запускают исследование добавлением тестируемой молекулы или воздействия. Продуцируемую люминесценцию считают подходящей детекторной системой (CCD камера или люминометр). Исследование также может быть проведено в автоматическом приборе, оборудованном ридером многолуночных планшетов, в частности FLIPR® системой. В данном случае клетки, экспрессирующие фотобелок, помещают в лунки микропланшета, который после добавления тестируемой молекулы/воздействия считывают одновременно с записью сигнала.
Высокопроизводительные скрининговые исследования, совмещенные с системой передачи информации на основе фотобелка, имеют лучшую чувствительность и отношение сигнала к шуму. Клетки, экспрессирующие фотобелок данного изобретения, производят интенсивную фотолюминесценцию в ответ на кальциевую стимуляцию, которая, как правило, выше, чем наблюдаемая у натуральных фотобелков.
В другом аспекте изобретение предоставляет набор для исследования, включающий в себя препарат клеток, экспрессирующих указанный в изобретении фотобелок под контролем стабильного или индуцируемого промотора, и реагенты, необходимые для проведения данного исследования.
Кроме того, фотобелки настоящего изобретения могут быть использованы в качестве индикаторов внутриклеточного кальция в диагностических методах, основанных на измерении концентрации клеточных ионов кальция и/или притока/оттока клеточных ионов кальция.
Настоящее изобретение описано в деталях в следующей экспериментальной части.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реагенты
Ферменты рестрикции приобретают в New England Biolabs и используют согласно инструкции производителя. Набор Ligation Independent Cloning (LIC) получен из Novagen (Nottingham, UK). Для in vitro транскрипции и трансляции используют набор TNT Quick coupled kit от Promega (Madison, WI). Реагенты для ПЦР и компетентные клетки E. coli штаммов XL-1Blue и BL21-Gold(DE3) получены от Stratagene (La Jolla, CA). Олигонуклеотиды приобретают в Primm (Milan). Коэлентеразин приобретают в Pharma Tech. International Inc. (Fairfield, NJ). Все другие реагенты были из стандартных источников и имели марку "чистый" и выше.
1. Создание библиотеки методом случайного мутагенеза и скрининг
1.1 Оптимизация фотобелка для экспрессии в клетках млекопитающих (GENEART GmbH, Regensburg, Germany)
Использование кодона гена клитина дикого типа адаптируют для кодонового смещения высокоэкспрессивных генов млекопитающих. Кроме того, по возможности избегают регионов с очень высоким (>80%) или очень низким (<30%) содержанием GC.
Для эффективной инициации трансляции консенсусную последовательность Козака вводят перед стартовым кодоном. Два стоп-кодона добавляют для эффективной терминации.
1.2 Случайный мутагенез
Набор GeneMorph II Random Mutagenesis (Stratagene) используют согласно инструкции производителя. Для достижения высокой степени мутагенеза используют два разных начальных количества целевой ДНК, 0,1 нг и 0,01 нг.
ПЦР-праймеры создают соответствующим образом с содержанием 5' LIC удлиняющих сегментов (показаны курсивом), соответствующих последовательностям, описанным в наборе Ek/LIC Cloning Kit (Novagen)
верхний: GATGACGACGACAAG-ATGGCCGACACCGCCAG (SEQ ID NO: 20)
нижний: GAGGAGAAGCCCGGT-TTATCAAGGACACGAAGT (SEQ ID NO: 21)
Амплификацию производят в термоциклере Perkin Elmer 2400 по следующему протоколу:
однократно следующая стадия:
| Пре-ПЦР | 2' при 94°C |
30 раз следующие стадии:
| денатурация | 30” при 94°C |
| отжиг | 30” при 56°C |
| элонгация | 40” при 72°C |
однократно следующая стадия:
| элонгация | 10' при 72°C |
Ожидаемая длина специфического продукта ПЦР: 630 п.н.
Для количественного определения полученной ДНК продукты амплификации анализируют электрофорезом в 1% агарозном геле в буфере 1xTAE согласно стандартной процедуре, как описано Maniatis с соав. Пробы сравнивают с маркером молекулярного веса ДНК (MWXVI5 Roche).
1.3 Клонирование Ek/LIC
Набор Novagen Ligation Independent Cloning (LIC) используют согласно инструкции производителя для получения направленного клонирования продуктов ПЦР без обработки ферментами рестрикции и реакции сшивки. Выбирают вектор pET-30 Ek/LIC, сконструированный для экспрессии целевого белка непосредственно после сайта расщепления энтерокиназы.
1.4 Трансформация
Для хорошей экспрессии белков выбирают клетки BL21-Gold(DE3) (Stratagene), производные E.coli B, усовершенствованный штамм BL21. Генотип данного штамма: E.coli B F- ompT hsdS (rB - mB -) dcm+ Tetr gal λ (DE3) endA Hte. В данном штамме отсутствуют обе протеазы lon и ompT, которые могут разрушить белки во время очистки. Фенотип Hte увеличивает эффективность трансформации (>1×108 КОЕ/мкг pUC18 ДНК). Кроме того, ген endA, который кодирует эндонуклеазу I, инактивирован (не происходит деградации плазмидной ДНК).
Для получения компетентных клеток с высокой эффективностью трансформации следуют стандартному протоколу для приготовления и электротрансформирования клеток BL21-Gold(DE3), описанному в руководстве E. coli Pulser Transformation apparatus manual (BioRad).
Эффективность трансформации определяют с помощью pUC18 ДНК и pET ДНК векторов, и полученные значения составляют:
1×1010 КОЕ/мкг для pUC18 ДНК
1×108 КОЕ/мкг для pET ДНК
Используя указанные высокоэлектрокомпетентные клетки, получают библиотеку из приблизительно 84000 колоний, экспрессирующих случайным образом мутированный фотобелок - клитин.
1.5 Посев на планшеты, индукция и зарядка
Трансформированные клетки высевают на планшеты с LB агаром и выращивают в течение ночи при 37°C. После ночного роста колоний индукцию выполняют добавлением 10 мМ IPTG и 5 мМ ЭДТА и инкубацией 4 часа при 37°C. Колонии нагружают 10 мкМ раствором коэлентеразина и инкубируют в течение ночи при 4°C и в отсутствие света.
1.6 Измерение CCD камерой
Биолюминесценцию исследуют определением сигнала через фиксированный период времени, 30 сек. В момент времени 0, через 3 мин и через 5 мин после первого измерения.
1.7 Сбор колоний и повторное тестирование
Лучшие колонии собирают и выращивают в 1 мл жидкой среды LB и проводят повторное тестирование при условиях, описанных ранее.
2 Транскрипция и трансляции in vitro
Трансляцию фотобелков проводят в бесклеточной системе кроличьих ретикулоцитов (TNT Quick coupled kit, Promega) согласно инструкции производителя. Для каждой реакционной смеси для транскрипции/трансляции in vitro используют 500 нг ДНК. Реакционный объем (10 мкл) включает 8 мкл TNT T7 Quick Master Mix, 1,6 мкл ДНК, 0,2 мкл метионинового буфера и 0,2 мкл коэлентеразина (0,5 мМ). В конце 5 мкл каждого образца трансляционной смеси тестируют на световую эмиссию добавлением раствора кальция и измеряют на люминоскане Ascent (Labsystems).
3. Получение рекомбинантного белка
Для получения рекомбинантного белка используют протокол очистки малых количеств белка при нативных условиях. Из-за присутствия N-терминального His-тага в данной конструкции экспрессированные белки очищали на колонке Ni-NTA Spin Columns (Qiagen) согласно протоколу производителя.
4. Кривая концентрации кальция
Для оценки ответа фотобелка на различные концентрации кальция рекомбинантный белок в количестве 0,05 нг/лунку (96-луночного планшета) нагружают 10 мкМ коэлентеразином в течение ночи при 4°C.
После инкубации добавляют различные концентрации CaCl2 и измеряют испускаемый свет люминосканом Ascent со временем интеграции 20 мсек в течение общего времени 10 сек.
5. Экспрессия мутантного фотобелка в клетках млекопитающих
Реагенты
Ферменты рестрикции приобретают в New England Biolabs (Beverly, MA) и используют согласно инструкции производителя. Набор Rapid DNA ligation kit и Fugene transfection реагент приобретают в Roche (Basel, CH). Коэлентеразин получают от Pharma Tech. International Inc. (Fairfield, NJ). Все другие реагенты были из стандартных источников и имели марку "чистый" и выше.
Процедура клонирования
Наиболее перспективные мутантные фотобелковые клоны субклонируют для тестирования их экспрессии в клетках млекопитающих.
В качестве матрицы в ПЦР анализе используют 2 мкл плазмиды.
Стандартная процедура ПЦР соответствовала указанной Perkin Elmer. Используют следующий ПЦР протокол:
Праймеры:
верхний праймер: TCGTTGGGATCCGCCACCATGGCCGACACCGCC (SEQ ID NO: 22)
нижний праймер: GGGCCCTCTAGATTATCAAGGCACGAA (SEQ ID NO: 23)
ПЦР реакционная смесь:
| 2 мкл | матрица |
| 5 мкл | 10 × Pfx буфер (GIBCO-LifeTechnologies) |
| 1,5 мкл | 10 мМ dNTPs |
| 1 мкл | 50 мМ MgSO4 (GIBCO-LifeTechnologies) |
| 2,5 мкл | верхний праймер (10 мкМ) |
| 2,5 мкл | нижний праймер (10 мкМ) |
| 2,5 Ед | Platinum Pfx (GIBCO-LifeTechnologies) |
| 35 мкл | H2O |
Протокол амплификации, выполненной в термоциклере Perkin Elmer 2400:
однократно следующая стадия:
| Пре-ПЦР | 2' при 94°C |
25 раз следующие стадии:
| денатурация | 15” при 94°C |
| отжиг | 30” при 56°C |
| элонгация | 40” при 68°C |
однократно следующая стадия:
| элонгация | 10' при 68°C |
Ожидаемая длина специфического продукта ПЦР: 630 п.н.
Продукты амплификации анализируют электрофорезом в 1% агарозном геле в буфере 1xTAE согласно стандартной процедуре, как описано Maniatis с соав.
Продукт ПЦР очищают на колонке Qiagen с гелем и обрабатывают ферментами рестрикции BamHI и XbaI.
Создание pcDNA3neo-/mito-мутированного клитина
Вектор pcDNA3 (Invitrogen) в собственной модификации содержит кодирующую последовательность митохондриального целевого пептида из субъединицы VIII цитохром С оксидазы человека (20, 21, 22), так что она может быть использована в рамке считывания 5'-конца использующего кодон гена оптимизированного фотобелка. Продукт амплификации, полученный в результате вышеупомянутого ПЦР, клонируют в данный модифицированный pcDNA3 вектор, лишенный гена устойчивости к неомицину, для экспрессии в клеточных линиях млекопитающих.
Сигнальная последовательность для митохондриальной направленности:
5'-ATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTTGACAGGCTCGGC
CCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGCCAAGATCCATTCGTTGGGATCCGCCACC-3' (SEQ ID NO: 24).
Создание pcDNA3neo-/cyto-мутированного-клитина
Ген мутированного клитина получают из pcrScript/h-мутированного-клитина вектора расщеплением ферментами рестрикции BamHI и XbaI и очищают. Затем ген мутированного клитина помещают в pcDNA3neo-вектор для получения pcDNA3neo-CYTO-h-мутированного-клитина.
Обе полученные конструкции проверяют полноразмерным дидеокси-секвенированием.
Клеточная культура
Культуральная среда, посев и инкубация: DMEM/F12 с глутамаксом (GIBCO cod. 31331-028), 10% ЭБС, 1% пен./стреп. (Invitrogen cod. 15140-122), 25 мМ Hepes буфер (GIBCO cod. 15630-056), 1,0 мМ пируват натрия (GIBCO cod. 11360-039), 1,5 г/л бикарбонат натрия (GIBCO cod. 25080-060).
Прекультуральные условия: клетки высевают для экспериментов, когда степень смыкания монослоя составляет 70-80%.
Условия клеточной культуры:
отделение дважды в неделю 3,0×105 клеток/фляшку Т75 (восстановление: 8,0×106 клеток).
Процесс селекции клона:
CHO-K1 трансфицируют воздействием pcDNA3Neo-/MITO-h-мутированного-клитина или pcDNA3Neo-/CYTO-h-мутированного-клитина.
Через 24 часа после трансфекции обработанные клетки высевают в 10×96-луночные планшеты в полной среде DMEM.
При слиянии монослоя 10×96-луночных планшетов дублируют на 10 белых планшетах. За 3,5 часов до измерения среду замещают 50 мкл/лунку буфером Тироде (2 мМ Ca2+ плюс коэлентеразин, 10 мкМ).
Положительные клоны выбирают, оценивая:
Первую селекцию проводят, лизируя клетки Тритоном Х-100. Условия для CCD камеры: низкая чувствительность, время интегрирования 1 сек, считывание в течение 5 сек.
Выбирают пять клонов, каждый разводят в 3×96-луночные планшеты.
При слиянии монослоя 15×96-луночных планшетов дублируют на 15 белых планшетах. За 3,5 часов до измерения среду замещают 50 мкл/лунку буфером Тироде (2 мМ Ca2+ и 10 мкМ коэлентеразин).
Вторую селекцию производят с 10 мкл АТФ, исследуя кинетику, и затем лизируют клетки Тритоном Х-100. Условия для CCD камеры: низкая чувствительность, время интегрирования 1 сек, считывание в течение 30 сек для измерения АТФ с последующими 30 сек для Тритона Х-100.
Производят четыре лимитирующих разведения выбранного лучшего клона, 0,3 клетки на лунку в 10×96-луночных планшетах.
Финальный клон выбирают после 4 лимитирующих разведений, отобранных с 0,25 мкМ ДНК, 5 мкМ коэлентеразина.
Полную оптимизацию исследования выполняют на клоне с наилучшим ответом.
Параметры измерения CCD камерой:
Клетки CHO высевают в различных концентрациях в 384 MTP (500, 750, 1000, 1500 клеток/лунку) в среде роста, дополненной, как указано выше, и измеряют CCD камерой через 24 и 48 часов после посева на планшеты. Перед экспериментами удаляют ростовую среду и нагружают клетки буфером Тироде плюс коэлентеразин при 37°C в течение 3 часов. В заключение наблюдают люминесценцию CCD камерой после добавления агониста (30 сек кинетически).
Измерения флюориметрическим планшетным ридером (FLIPR
®
)
Параметры FLIPR
3
для стандартного протокола исследований определения люминесценции
планшеты с 384 белыми лунками с чистым дном
посев клеток за 24 часа до эксперимента
удаление среды
добавление буфера Тироде плюс коэлентеразин 25 мкл/лунку
инкубация 4 часа при 37 °C
эксперименты проводят в FLIPR3: двойное (2×) введение в буфере Тироде (25 мкл/лунку).
Значения всех параметров являются стандартными измерительными значениями за исключением следующих:
Предварительные стадии исследования:
1) Конфигурация камеры:
выдержка = 0,7
увеличение = 200
2) Параметры последовательности работы:
распределяющая насадка на 384 лунки
уровень = 30 мкл
скорость = 25 мкл/сек.
Параметры FLIPR
TETRA
для стандартного протокола исследований для определения люминесценции
планшеты с 384 белыми лунками с чистым дном
посев клеток за 24 часа до эксперимента
удаление среды
добавление буфера Тироде плюс коэлентеразин 25 мкл/лунку
инкубация 4 часа при 37 °C
эксперименты проводят в FLIPRTETRA: двойное (2×) введение в буфере Тироде (25 мкл/лунку).
Все значения параметров являются стандартными измерительными значениями за исключением следующих:
Настройка режима считывания:
1) Конфигурация камеры:
увеличение = 200
выдержка = 0,5
2) Параметры последовательности работы:
уровень = 30 мкл
скорость = 25 мкл/сек.
Контрольные соединения:
АТФ (Sigma, A-7699) растворяют в H2O в концентрации 100 мМ и хранят в аликвотах при -20°C. Делают свежеприготовленный рабочий раствор в буфере Тироде.
Композиция буфера Тироде: NaCl 130 мМ, KCl 5 мМ, CaCl2 2 мМ, MgCl2 1 мМ, NaHCO3 5 мМ, HEPES 20 мМ, pH 7,4.
IMETIT (Sigma, I-135)
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг.1: Повторное тестирование мутантных колоний с тремя концентрациями кальция.
Фиг.2: Транскрипция и трансляция in vitro. Измерение световой эмиссии после введения 5 мМ кальция.
Фиг.3: Транскрипция и трансляция in vitro. Измерение световой эмиссии после введения 1 мМ кальция.
Фиг.4: Кинетика измерения световой эмиссии после введения 1 мМ кальция для рекомбинантных фотобелков.
Фиг.5: Кривая зависимости от дозы кальция для рекомбинантного фотобелка 25N03b.
Фиг.6: Пик световой интенсивности для рекомбинантных фотобелков после введения 1 мМ кальция.
Фиг.7: Кинетика ответа на 10 мкМ АТФ в CCD камере для клеточной линии CHOK1/mito25N03b.
Фиг.8: Кривая зависимости от дозы АТФ для клеточной линии CHOK1/mito25N03b.
Фиг.9: Кинетика зависимости от дозы АТФ для клеточной линии CHOK1/mito12mutCly, полученная в CCD камере при тестировании 500 клеток/лунку через 24 часа после посева.
Фиг.10: Кривая зависимости от дозы АТФ для клеточной линии CHOK1/mito12mutCly, полученная в CCD камере с разным количеством клеток/лунку, с разными концентрациями коэлентеразина и временем инкубации.
Фиг.11: Кривая зависимости от дозы АТФ для клеточной линии CHOK1/cyto12mutCly, полученная в CCD камере, с разным количеством клеток/лунку.
Фиг.12: Кривая зависимости от дозы IMETIT для клеточной линии CHOK1/mito12mutCly/H3, полученная в CCD камере, с разным количеством клеток/лунку.
Фиг.13: Кривая зависимости от дозы IMETIT для клеточной линии CHOK1/mito12mutCly/H3, полученная в FLIPR3.
Фиг.14: Кривая зависимости от дозы агониста A3 (IB MECA) для клеточной линии CHOK1/mito25N03b-A3, полученная в Lumitox CCD камере, 500 клеток/лунку, через 24 часа после посева, 5 мкМ коэлентеразина. Чувствительность камеры 5, измерение 60 сек.
Фиг.15: Кривая зависимости от дозы агониста A3 (IB MECA) для клеточной линии CHOK1/mito25N03b-A3, полученная в CyBi Lumax HT CCD камере, 2500 клеток/лунку, через 24 часа после посева, 5 мкМ коэлентеразина. Чувствительность камеры HV 10 аналог, измерение 60 сек.
Фиг.16: Кривая зависимости от дозы агониста A3 (IB MECA) для клеточной линии CHOK1/mito25N03b-A3, полученная в FLIPTTETRA, 2500 клеток/лунку, через 24 часа после посева, 10 мкМ колентеразина. Время экспозиции 2 сек, увеличение 240.
ПРИМЕРЫ
1. Создание библиотеки методом случайного мутагенеза и скрининг
Библиотеку случайных мутантов получают с помощью набора GeneMorph II Random Mutagenesis (Stratagene). Для достижения высокой частоты мутаций используют два разных начальных количеств целевой ДНК: 0,1 нг и 0,01 нг. Всего люминесцентную активность проверяют у 83305 бактериальных колоний. Из них 1089 являются позитивными и, следовательно, обладают биолюминесцентными свойствами. Всего собирают 289 лучших колоний, из них повторным тестированием окончательно выбирают 16 наилучших.
На фиг.1 показаны результаты, полученные на кривой зависимости от дозы CaCl2, полученные с 8 мутантами.
2. Исследование фотобелков
Смешивают 5 мкл трансляционной смеси с 95 мкл фосфатного буфера непосредственно в 96-луночном планшете, который устанавливают в люминометер (Berthold). Для инициации световой эмиссии фотобелка в лунку вводят 5 пМ CaCl2 и записывают люминесценцию в течение 10 сек.
На фиг.2 показаны результаты in vitro транскрипции и трансляции ДНК 8 мутантов.
Проводят новый эксперимент in vitro транскрипции и трансляции с лучшим мутантом 25N03b (sequence ID n°16) и с фотобелком акворином (фиг.3) для сравнения световой эмиссии при введении 1 мМ CaCl2.
3. Рекомбинантный фотобелок и кривая концентрации кальция
Рекомбинантные фотобелки, соответствующие некоторым мутантам, получают при нативных условиях, следуя протоколу очистки малых количеств белка. Измеряют световую эмиссию после введения 1 мМ кальция, соответствующие кинетические кривые представлены на фиг.4.
Рекомбинантный мутантный фотобелок, соответствующий клону 25N03b, лучше охарактеризован на полной кривой зависимости от дозы кальция, которая показана на фиг.5.
В другом эксперименте сравнивают рекомбинантный фотобелок 25N03b с рекомбинантным акворином. Световая эмиссия, записанная после введения 1 мМ CaCl2, была выше в случае мутанта 25N03b, как показано на фиг.6.
4 Клеточные функциональные исследования
4.1 CHOmito25N03b-экспрессирующий клон (CHOK1/mito25N03b) получают трансфекцией клеток CHO-Kl (см. раздел Материалы и методы). Через 48 часов после трансфекции клетки трипсинизируют и помещают в 10×96-луночные планшеты MTP (Microtiter Plates) в полной среде MEM. При слиянии монослоя клеток 10×96 MTP дуплицируют, используя MATRIX (Hudson, NH, USA) в 10×96 белых MTP. За 3 часа до измерения среду в лунках замещают 50 мкл буфера Тироде, содержащего 2 мМ Ca2+ и 10 мкМ коэлентеразина. Клоны выбирают на основе их функционального ответа (люминесцентный сигнал) на АТФ, которая стимулирует CHO эндогенный рецептор P2Y и увеличивает концентрацию цитоплазматического Ca2+. В конце каждого эксперимента клетки лизируют перфузией раствора Тритон Х-100. Активный фотобелок восстанавливают, инкубируя клетки с 10 мкМ коэлентеразином, растворенном в буфере Тироде, содержащем 2 мМ Ca2+, в темноте при 37°C, в 5% CO2 атмосфере в течение 3 часов. Для измерения световой эмиссии клетки лизируют в присутствии кальция и записывают излучаемую люминесценцию. Число фотонов, испускаемых в первые 30 сек, интегрируют CCD камерой и визуализируют на экране. Клетки, трансфицированные пустой плазмидой или не трансфицированные, не увеличивают эмиссию фотонов. Для определения изменений концентрации кальция вводят 10 мкМ АТФ и определяют кинетику ответа. Полученная кривая представлена на фиг.7.
Финальный клон высевают в 384-луночный планшет и проверяют с возрастающими концентрациями АТФ, как показано на кривой зависимости от дозы на фиг.8.
Клеточную линию CHOK1/mito25N03b трансфицируют G-белоксвязывающим рецептором, аденозин А3 рецептором и химерным Gα-белком для переключения сигнала на PLC/IP путь. Создают стабильную клеточную линию (далее именуемую как CHOK1/mito25N03b/A3 клон).
После стимуляции агонистом рецептор А3 вызывает увеличение внутриклеточной концентрации кальция, которое измеряют люминесценцией mito25N03b.
Финальные клоны CHO клеточных линий, экспрессирующие mito25N03b и аденозин А3 рецептор человека, выращивают до 80-95% слияния монослоя в культуральных фляшках и собирают трипсинизацией. Готовят клеточные разведения различной плотности в 384-луночном планшете в ростовой среде (DMEM/F12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки), и инкубируют 24 и 48 часов при 37°C во влажном инкубаторе с 5% CO2. В день эксперимента удаляют культуральную среду и для экспериментов с люминесценцией нагружают клетки 5 мкМ коэлентеразином в течение 3 часов при 37°C в 5% CO2. Кальциевый ответ стимулируют добавлением АТФ в различных концентрациях в каждую лунку. Кинетику отслеживают CCD камерой, которая вводит реагенты и записывает световую эмиссию для каждой лунки.
Готовят разведения агониста и антагониста в различных концентрациях в буфере Тироде. Приблизительно 25 мкл данных растворов вводят отдельно в каждую лунку и измеряют ответ CCD камерой, результаты представлены на фиг.15.
4.2 Для получения клеточной линии CHOK1/mitol2mutCly клетки CHOK1 трансфицируют мутантом 12mutCly (SEQ ID NO: 19), клонированным в pcDNA3neo-mito (см. раздел Материалы и методы).
Финальный клон выбирают на основе функционального ответа (люминесцентный сигнал) на АТФ, которая стимулирует CHO эндогенный рецептор P2Y и увеличивает концентрацию цитоплазматического Ca2+. В конце каждого эксперимента клетки лизируют перфузией раствора, содержащего Тритон Х-100. Активный фотобелок восстанавливают, инкубируя клетки с 2,5 или 5 мкМ коэлентеразина, растворенными в буфере Тироде, содержащем 2 мМ Ca2+, в темноте при 37°C, в 5% CO2 атмосфере в течение 3 часов. Для измерения световой эмиссии клетки лизируют в присутствии кальция и записывают излучаемую люминесценцию. Число фотонов, испускаемых в первые 30 сек, интегрируют люминометром на основе CCD камеры и визуализируют на экране. Клетки, трансфицированные пустой плазмидой или не трансфицированные, не увеличивают эмиссию фотонов. Клетки в различном количестве высевают в 384 MTP. Через 24 часа для определения изменений концентрации кальция вводят различные концентрации АТФ и определяют кинетику ответа. Примеры кинетических кривых, полученных на посеве 500 клеток/лунку за 24 часа до теста, представлены на фиг.9.
Высокая световая эмиссия и чувствительность к Ca2+, наблюдаемые в клеточной линии CHOK1/mitol2mutCly, позволяют использовать меньшее число клеток и более низкую концентрацию коэлентеразина даже при меньшем времени по сравнению со стандартными условиями для клеточных исследований на основе фотобелков.
На фиг.10a и 10b показаны примеры кривых зависимости от дозы АТФ, полученные при посеве от 100 до 600 клеток/лунку за 24 часа до теста и инкубации клеток с 2,5 и 5 мкМ коэлентеразина, растворенного в буфере Тироде, содержащем 2 мМ Ca2+, в темноте при 37°C, в 5% CO2 атмосфере в течение 2 и 3 часов.
Клеточную линию CHOK1 cytol2mutCly получают трансфекцией клеток CHO-Kl (см. раздел Материалы и методы).
Финальный клон выбирают на основе функционального ответа (люминесцентный сигнал) на АТФ, которая стимулирует CHO эндогенный рецептор P2Y и увеличивает концентрацию цитоплазматического Ca2+. В конце каждого эксперимента клетки лизируют перфузией раствора Тритон Х-100. Активный фотобелок восстанавливают, инкубируя клетки с 2,5 или 5 мкМ коэлентеразина, растворенными в буфере Тироде, содержащем 2 мМ Ca2+, в темноте при 37°C, в 5% CO2 атмосфере в течение 3 часов. Для измерения световой эмиссии клетки лизируют в присутствии кальция и записывают излучаемую люминесценцию. Число фотонов, испускаемых в первые 30 сек интегрируют люминометром на основе CCD камеры и визуализируют на экране. Клетки, трансфицированные пустой плазмидой или не трансфицированные, не увеличивают эмиссию фотонов. Клетки в различных количествах высевают в 384 MTP. Через 24 и 48 часов для определения изменений концентраций кальция вводят АТФ в различных концентрациях и определяют кинетику ответа. На фиг.11 показаны кривые зависимости от дозы АТФ, полученные при посеве 500, 1000 и 2000 клеток/лунку за 24 часа до теста, и инкубации клеток с 2,5 и 5 мкМ коэлентеразина, растворенного в буфере Тироде, содержащем 2 мМ Ca2+, в темноте при 37°C, в 5% CO2 атмосфере в течение 2 и 3 часов.
Клеточную линию CHOK1 mitol2mutCly трансфицируют G-белоксвязывающим рецептором, гистамин-3 рецептором и химерным Gα-белком для переключения сигнала на PLC/IP путь. Создают стабильную клеточную линию (далее именуемую как CHOK1/mito12mutCly/H3 клеточная линия) (см. раздел Материалы и методы).
После стимуляции агонистом (IMETIT) рецептор H3 вызывает увеличение внутриклеточной концентрации кальция, которое измеряют люминесценцией mito12mutCly.
На фиг.12 показаны кривые зависимости от дозы IMETIT, полученные при посеве 250, 500, 750 и 1000 клеток/лунку за 24 часа до теста и при инкубации клеток с 5 мкМ коэлентеразина, растворенного в буфере Тироде, содержащем 2 мМ Ca2+, в темноте при 37°C, в 5% CO2 атмосфере в течение 2 и 3 часов.
5. Клеточные исследования в FLIPR
CHOK1/mito25N03b/A3 и CHOK1/mitol2mutCly/H3 тестируют в FLIPR путем измерения сигнала люминесценции, вызванной активацией трансфекторного рецептора. Измеренная в FLIPR люминесценция представлена в единицах изменения люминесценции на фиг.13, где показаны результаты измерения испускания света, вызванного стимуляцией IMETIT на CHOK1/mitol2mutCly/H3. Высевают 500 клеток/лунку в 384 MTP за 24 часа до эксперимента. Среду удаляют и заменяют 25 мкл коэлентеразина в двойной (2×) концентрации (10 мкМ), растворенного в буфере Тироде, содержащем 2 мМ Ca2+, на 3 часа в темноте при 37°C, в 5% CO2 атмосфере. Соединение IMETIT (2×) в различных концентрациях добавляют к клеткам (25 мкл/лунку).
На фиг.16 люминесценция, измеренная FLIPRTETRA, представлена в ОСЕ (относительные световые единицы), где показаны результаты испускания света, вызванные IB-MECA стимуляцией на CHOK1/mito25N03b/A3. Высевают 2500 клеток/лунку в 384 MTP за 24 часа до эксперимента. Среду удаляют и вместо нее используют 25 мкл двойной (2×) концентрации коэлентеразина (10 мкМ), растворенного в буфере Тироде, содержащем 2 мМ Ca2+, на 3 часа в темноте при 37°C, в 5% CO2 атмосфере. Соединение IB-MECA (2×) в различных концентрациях добавляют к клеткам (25 мкл/лунку).
Список литературы
1. Kendall, J.M. and Badminton, M.N. (1998) Aequorea victoria bioluminescence moves into an exciting new era. Trends Biotechnology. 16(5):216-24.
2. Campbell, A.K., Hallet, R.A., Daw, M.E., Ryall, R.C., Hart and Herring P.J. (1981) Application of the photoprotein obelin to the measurament of free Ca++ in cells. In Bioluminescence and Chemiluminescence, basic Chemistry and Analytical applications (Edited by M.A. deLuca and W.D. McElroy), pp. 601-607. Academy Press, New York.
3. Herring, P.J. (1979) Some features of the bioluminescence of the radiolarian Thalassicola sp. Mar. Biol. 53, 213-216.
4. Shimomura, O., Johnson F.H., and Saiga, Y (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 59,223-239.
5. Shimomura, O., Johnson F.H., and Saiga, Y (1963) Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62, 1-8.
6. Morin, J.G. and Hastings J.W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol. 77, 305-311.
7. Shimomura, O., Johnson, F.H. and Saiga, Y. (1963) Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan Halistaura. J. Cell. Physiol. 62, 9-15.
8. Shimomura, O. and Shimomura, A. (1985) Halistaurin, phialidin and modified forms of aequorin as Ca++ indicator in biological systems. Biochem. J. 228,745-749.
9. Levine, L.D., and Ward, W.W. (1982) Isolation and characterization of a photoprotein “phialidin” and a spectrally unique green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish Phialidium gregarium. Comp. Biochem. Physiol. 72B,77-85.
10. Morin, J.G. and Hastings (1971) Energy transfer in a bioluminescent system. J. Cell. Physiol. 77, 313-318.
11. Campbell, A.K. (1974) Extraction, partial purification and properties of obelin the calcium-activated protein from the hydroid Obelia geniculata. Biochem.J. 143,411-418.
12. Ward, W.W. and Selinger (1974) Extraction and purification of calcium-activated photoprotein from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Bern ovata. Biochemistry 13, 1491-1499.
13. Ward, W.W. and Seliger H.H. (1974) Properties of mnemiopsin and berovin, calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroё ovata. Biochemistry 13, 1500-1510.
14. Johnson, F.H. and Shimomura, O. (1978) Introduction to the bioluminescence of medusae, with special reference to the photoprotein aequorin. Methods Enzymol. 57,271-291.
15. Illarionov B.A., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Sequence of the cDNA encoding the Ca++-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Gene. 1995 14;153(2):273-4.
16. Blinks, J.R., Weir, W.G., Hess, P. and Prendergast, F.G. (1982). Measurement of Ca++ concentrations in living cells. Prog. Biophys. Mol. Biol. 40,1-114.
17. Markova S.V., Vysotski E.S., Blinks J.R., Burakova L.P., Wang B.C., Lee J., (2002) Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression and comparison of some properties with those of other Ca2+-regulated photoproteins. Biochemistry. 2002 Feb 19;41(7):2227-36.
18. Inouye S., Tsuji F.I. (1993) Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-activated photoprotein, clytin. FEBS Lett. Jan 11;315(3):343-6.
19. Tsuji F.I., Ohmiya Y., Fagan T.F., Toh H., Inouye S. (1995) Molecular evolution of the Ca(2+)-binding photoproteins of the Hydrozoa. Photochem Photobiol. Oct 62(4):657-61.
20. Rizzuto, R., Simpson, A.W.M., Brini, M. and Pozzan, T. (1992) Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature, 358, 325-328.
21. Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M. and Pozzan, T. (1993) Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighbouring mitochondria. Science, 262, 744-747.
22. Rizzuto, R., Bastianutto, C., Brini, M., Murgia, M. and Pozzan, T. (1994) Mitochondrial Ca2+ homeostasis in intact cells. J. Cell Biol., 126, 1183-1194.
Claims (19)
1. Выделенный фотобелок, представляющий собой внутриклеточный индикатор кальция, содержащий аминокислотную последовательность, которая
a) способна связать коэлентеразин и кальций, производя биолюминесценцию;
b) идентична, по меньшей мере, на 90% SEQ ID NO: 1 (клитин);
c) при выравнивании последовательностей SEQ ID NO: 1, представляет одно из следующих единичных или множественных замещений (позиции остатке в относятся к SEQ ID NO: 1):
i) C54→S;
ii) S132→C;
iii) К48→Р, N195→D;
iv) Q68→R, A90→V, T184→I;
v) Y82→F, K110→N, F125→L149→R;
vi) G142→C;
vii) I53→V, S149→R;
viii) N18→D, I40→V, K56→R;
ix) Gly58→Glu, Asp69→Val, Ala70→Cys, Lys76→Arg, Lys77→Gly, Ile78→Cys, Asp81→Glu, Val86→Ile, Glu87→Ala, Ala90→Gln, Val92→Leu и Glu97→Gln.
a) способна связать коэлентеразин и кальций, производя биолюминесценцию;
b) идентична, по меньшей мере, на 90% SEQ ID NO: 1 (клитин);
c) при выравнивании последовательностей SEQ ID NO: 1, представляет одно из следующих единичных или множественных замещений (позиции остатке в относятся к SEQ ID NO: 1):
i) C54→S;
ii) S132→C;
iii) К48→Р, N195→D;
iv) Q68→R, A90→V, T184→I;
v) Y82→F, K110→N, F125→L149→R;
vi) G142→C;
vii) I53→V, S149→R;
viii) N18→D, I40→V, K56→R;
ix) Gly58→Glu, Asp69→Val, Ala70→Cys, Lys76→Arg, Lys77→Gly, Ile78→Cys, Asp81→Glu, Val86→Ile, Glu87→Ala, Ala90→Gln, Val92→Leu и Glu97→Gln.
2. Фотобелок по п.1, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 95% SEQ ID NO: 1.
3. Фотобелок по п.2, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 98% SEQ ID NO: 1.
4. Фотобелок по п.3, содержащий аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10.
5. Фотобелок по пп.1-4, где указанная последовательность дополнительно соединена с митохондриальной целевой последовательностью.
6. Выделенный полинуклеотид, кодирующий фотобелок по пп.1-5.
7. Полинуклеотид по п.6, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19.
8. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по любому из пп.6 и 7.
9. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин для продукции фотобелка по пп.1-5, содержащая вектор по п.8.
10. Клетка-хозяин из млекопитающего для продукции фотобелка по пп.1-5, определенная в п.9.
11. Способ для определения изменений внутриклеточной концентрации кальция in vitro, который включает:
a) обеспечение клеточной экспрессии фотобелка по пп.1-5;
b) нагрузки клетки коэлентразином;
c) взаимодействие клетки с агентом, вызывающим приток кальция в клетку или высвобождение кальция из внутриклеточных запасов;
d) определение фотобелковой биолюминесценции.
a) обеспечение клеточной экспрессии фотобелка по пп.1-5;
b) нагрузки клетки коэлентразином;
c) взаимодействие клетки с агентом, вызывающим приток кальция в клетку или высвобождение кальция из внутриклеточных запасов;
d) определение фотобелковой биолюминесценции.
12. Способ по п.11, который выполняют в высокопроизводительном формате.
13. Способ по п.12, который выполняют с высокопроизводительным оптическим скрининговым аппаратом для многопробного анализа.
14. Способ скрининга соединений, модулирующих концентрацию внутриклеточного кальция, который включает:
a) обеспечение клеточной экспрессии фотобелка по пп.1-5;
b) нагрузки клетки коэлентразином;
c) взаимодействие клетки с соединением-кандидатом;
d) определение биолюминесценции фотобелка.
a) обеспечение клеточной экспрессии фотобелка по пп.1-5;
b) нагрузки клетки коэлентразином;
c) взаимодействие клетки с соединением-кандидатом;
d) определение биолюминесценции фотобелка.
15. Способ по п.14, который выполняют в высокопроизводительном формате.
16. Способ по п.15, который выполняют с высокопроизводительным оптическим скрининговым аппаратом для многопробного анализа.
17. Применение фотобелка по пп.1-5 как индикатора внутриклеточного кальция.
18. Применение фотобелка по п.17 в клеточном высокопроизводительном исследовании.
19. Применение фотобелка по пп.1-5 для изготовления диагностической композиции.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP05005390.9 | 2005-03-11 | ||
| EP05005390A EP1700865A1 (en) | 2005-03-11 | 2005-03-11 | Photoproteins with enhanced bioluminescence and their use as intracellular calcium indicators |
| EP06000171.6 | 2006-01-05 | ||
| EP06000171 | 2006-01-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007133797A RU2007133797A (ru) | 2009-03-20 |
| RU2407750C2 true RU2407750C2 (ru) | 2010-12-27 |
Family
ID=36649448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007133797/10A RU2407750C2 (ru) | 2005-03-11 | 2006-03-09 | Фотобелки с усиленной биолюминесценцией и их использование в качестве внутриклеточных индикаторов кальция |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7981602B2 (ru) |
| EP (2) | EP1700865A1 (ru) |
| JP (1) | JP4962981B2 (ru) |
| KR (1) | KR20070121689A (ru) |
| CN (1) | CN101137667A (ru) |
| AT (1) | ATE422504T1 (ru) |
| AU (1) | AU2006222182A1 (ru) |
| CA (1) | CA2601029A1 (ru) |
| DE (1) | DE602006005141D1 (ru) |
| DK (1) | DK1858921T3 (ru) |
| ES (1) | ES2321029T3 (ru) |
| IL (1) | IL185857A (ru) |
| PT (1) | PT1858921E (ru) |
| RU (1) | RU2407750C2 (ru) |
| WO (1) | WO2006094805A1 (ru) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1973937B1 (en) * | 2006-01-11 | 2011-05-25 | Axxam S.P.A. | Luminescent transgenic non human animals, progeny, cell derivatives and uses thereof |
| JP5374840B2 (ja) | 2006-07-20 | 2013-12-25 | Ｊｎｃ株式会社 | カルシウム結合発光蛋白質、それをコードする遺伝子およびその用途 |
| GB0625678D0 (en) * | 2006-12-21 | 2007-01-31 | Lux Biotechnology Ltd | Composition and method for detection of demineralisation |
| DE102007011241A1 (de) * | 2007-03-08 | 2008-09-11 | Bayer Healthcare Ag | Isoliertes Photoprotein mtClytinDecay, sowie dessen Verwendung |
| JP5304275B2 (ja) * | 2009-01-29 | 2013-10-02 | Ｊｎｃ株式会社 | アポクライティン−ｉｉをコードするコドン最適化核酸およびその使用方法 |
| EP2454279A1 (en) * | 2009-07-14 | 2012-05-23 | EMD Millipore Corporation | Modified photoproteins with increased affinity for calcium and enhanced bioluminescence and uses thereof |
| EP2635583B1 (en) | 2010-11-02 | 2015-06-03 | Promega Corporation | Coelenterazine derivatives and methods of using same |
| WO2013033515A1 (en) * | 2011-09-02 | 2013-03-07 | Promega Corporation | Compounds and methods for assaying redox state of metabolically active cells and methods for measuring nad(p)/nad(p)h |
| CA2859475C (en) | 2011-12-16 | 2015-07-07 | Li-Cor, Inc. | Luminescence imaging scanner |
| CN103958684A (zh) * | 2012-03-19 | 2014-07-30 | 瑞健生物医药（苏州）有限公司 | 氧化还原敏感的钙传感蛋白及其用途方法 |
| MX371282B (es) | 2013-06-29 | 2020-01-24 | Firmenich & Cie | Metodos para identificar, aislar y usar receptores de odorizantes y aroma. |
| WO2016099131A1 (ko) * | 2014-12-15 | 2016-06-23 | 주식회사 엘지생활건강 | 피부 외용제 조성물 |
| GB201700317D0 (en) | 2017-01-09 | 2017-02-22 | Calcivis Ltd | Detection device |
| US20210063404A1 (en) * | 2018-03-02 | 2021-03-04 | The Governors Of The University Of Alberta | Low affinity red fluorescent indicators for imaging ca2+ in excitable and nonexcitable cells |
| USD1042180S1 (en) | 2020-05-28 | 2024-09-17 | Calcivis Limited | Dental detection device |
| CN115197301B (zh) * | 2022-06-10 | 2024-07-16 | 北京师范大学 | 用于胞内钙信号检测及相关药物筛选的钙指示工具及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2340629C2 (ru) * | 2002-10-21 | 2008-12-10 | Аксам С.Р.Л. | Фотобелок с повышенной биолюминесценцией |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5360728A (en) * | 1992-12-01 | 1994-11-01 | Woods Hole Oceanographic Institution (W.H.O.I.) | Modified apoaequorin having increased bioluminescent activity |
| US5714666A (en) * | 1993-02-09 | 1998-02-03 | Children's Hospital Of Philadelphia | Measurement of intracellular calcium using bioluminescent apoaequorin expressed in mammalian cells |
| WO1995021191A1 (en) * | 1994-02-04 | 1995-08-10 | William Ward | Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein |
| FR2827292B1 (fr) * | 2001-07-12 | 2004-06-18 | Centre Nat Rech Scient | Photoproteines mutees et leurs applications |
-
2005
- 2005-03-11 EP EP05005390A patent/EP1700865A1/en not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-03-09 WO PCT/EP2006/002172 patent/WO2006094805A1/en not_active Ceased
- 2006-03-09 DE DE602006005141T patent/DE602006005141D1/de active Active
- 2006-03-09 CA CA002601029A patent/CA2601029A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-09 AU AU2006222182A patent/AU2006222182A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-09 AT AT06723320T patent/ATE422504T1/de active
- 2006-03-09 JP JP2008500125A patent/JP4962981B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-09 RU RU2007133797/10A patent/RU2407750C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-03-09 US US10/587,523 patent/US7981602B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-09 EP EP06723320A patent/EP1858921B1/en active Active
- 2006-03-09 ES ES06723320T patent/ES2321029T3/es active Active
- 2006-03-09 DK DK06723320T patent/DK1858921T3/da active
- 2006-03-09 PT PT06723320T patent/PT1858921E/pt unknown
- 2006-03-09 CN CNA200680007800XA patent/CN101137667A/zh active Pending
- 2006-03-09 KR KR1020077021664A patent/KR20070121689A/ko not_active Ceased
-
2007
- 2007-09-10 IL IL185857A patent/IL185857A/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2340629C2 (ru) * | 2002-10-21 | 2008-12-10 | Аксам С.Р.Л. | Фотобелок с повышенной биолюминесценцией |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| VYSOTSKI E.S. et al.: "Ca2+-regulated photoproteins: structural insight into the bioluminescence mechanism", Accounts Of Chemical Research, 2004, v.37, n.6, p.405-415. CHIESA a el al.: "Recombinant aequorin and green fluorescent protein as valuable tools in the study of cell signaling", Biochem. J., 2001, v.355, p.1-12. SHIMOMURA O. ET AL.: "Halistaurin, phialidin and modified forms of aequorin as Ca2+ indicator in biological systems", Biochem. J., 1985, v. 228, p.745-749. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7981602B2 (en) | 2011-07-19 |
| CA2601029A1 (en) | 2006-09-14 |
| JP4962981B2 (ja) | 2012-06-27 |
| KR20070121689A (ko) | 2007-12-27 |
| PT1858921E (pt) | 2009-04-14 |
| US20070259389A1 (en) | 2007-11-08 |
| JP2008532504A (ja) | 2008-08-21 |
| CN101137667A (zh) | 2008-03-05 |
| EP1700865A1 (en) | 2006-09-13 |
| RU2007133797A (ru) | 2009-03-20 |
| ES2321029T3 (es) | 2009-06-01 |
| WO2006094805A1 (en) | 2006-09-14 |
| AU2006222182A1 (en) | 2006-09-14 |
| EP1858921B1 (en) | 2009-02-11 |
| EP1858921A1 (en) | 2007-11-28 |
| IL185857A0 (en) | 2008-01-06 |
| DK1858921T3 (da) | 2009-05-18 |
| DE602006005141D1 (de) | 2009-03-26 |
| IL185857A (en) | 2012-02-29 |
| ATE422504T1 (de) | 2009-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2340629C2 (ru) | Фотобелок с повышенной биолюминесценцией | |
| RU2407750C2 (ru) | Фотобелки с усиленной биолюминесценцией и их использование в качестве внутриклеточных индикаторов кальция | |
| Stepanyuk et al. | Interchange of aequorin and obelin bioluminescence color is determined by substitution of one active site residue of each photoprotein | |
| JP4480674B2 (ja) | コペポーダ種由来の蛍光たんぱく質および該たんぱく質の使用方法 | |
| JP2009011316A (ja) | 蛍光タンパク質およびその使用方法 | |
| EP1339853B1 (de) | Isolierte luziferasen sowie deren verwendung | |
| JP6785008B2 (ja) | 新規人工生物発光酵素群 | |
| Golz | Reporter Genes in Cell Based ultra High Throughput Screening | |
| Shaner | Engineering novel fluorescent proteins | |
| Heim | Genetically encoded calcium indicators based on troponin C and fluorescent proteins | |
| EP1908775A1 (en) | Fluorescent proteins from the Ctenophora phylum and methods of use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130310 |