RU2407509C2 - Cosmetic preparation and method for making thereof - Google Patents
Cosmetic preparation and method for making thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2407509C2 RU2407509C2 RU2007112836/15A RU2007112836A RU2407509C2 RU 2407509 C2 RU2407509 C2 RU 2407509C2 RU 2007112836/15 A RU2007112836/15 A RU 2007112836/15A RU 2007112836 A RU2007112836 A RU 2007112836A RU 2407509 C2 RU2407509 C2 RU 2407509C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- telomeric
- dna
- complex
- sequence
- Prior art date
Links
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000037394 skin elasticity Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 23
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 8
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 8
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 abstract description 8
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 abstract 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 31
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 5
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150019028 Antp gene Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 2
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 2
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FXYZDFSNBBOHTA-UHFFFAOYSA-N 2-[amino(morpholin-4-ium-4-ylidene)methyl]guanidine;chloride Chemical compound Cl.NC(N)=NC(=N)N1CCOCC1 FXYZDFSNBBOHTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 206010040799 Skin atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N chembl269478 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000037075 skin appearance Effects 0.000 description 1
- 230000004215 skin function Effects 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008791 toxic response Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к области косметологии и касается средств для ухода за кожей.The present invention relates to the field of cosmetology and relates to skin care products.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Известны многочисленные косметические средства, улучшающие внешний вид кожи. В частности, известны косметические средства, применение которых позволяет накапливать и удерживать в коже воду, тем самым на некоторое время устраняя или предупреждая сухость и потерю эластичности кожи.Numerous cosmetics are known to enhance the appearance of the skin. In particular, cosmetics are known, the use of which allows you to accumulate and retain water in the skin, thereby eliminating or preventing dryness and loss of skin elasticity for some time.
Известны косметические средства, содержащие антиоксиданты, которые связывают образующиеся в коже свободные радикалы или препятствуют образованию новых, тем самым предотвращая протекание реакций с их участием, неблагоприятно сказывающихся на нормальном функционировании клетки. Например, известны препараты, содержащие в качестве антиоксидантов аскорбиновую кислоту или витамин Е (Holck David Е.Е., John D. Ng. Facial skin rejuvenation. Curr Qpin in Ophthalmol 14:249).Known cosmetics containing antioxidants that bind free radicals formed in the skin or prevent the formation of new ones, thereby preventing the occurrence of reactions with their participation that adversely affect the normal functioning of the cell. For example, preparations are known that contain ascorbic acid or vitamin E as antioxidants (Holck David EE, John D. Ng. Facial skin rejuvenation. Curr Qpin in Ophthalmol 14: 249).
Известны косметические средства, содержащие вещества (например, ретиноиды (Holck David E.E., John P. N. Facial skin rejuvenation, Curr Opin in Qphthalmol 14:248), которые стимулируют активность фибробластов и синтез новых коллагеновых волокон в дерме, а также митотическую активность и обновление клеток в эпидермисе, приводя к снижению толщины рогового слоя, увеличению толщины зернистого слоя кожи и улучшению структуры кожи.Known cosmetics containing substances (e.g. retinoids (Holck David EE, John PN Facial skin rejuvenation, Curr Opin in Qphthalmol 14: 248) that stimulate fibroblast activity and the synthesis of new collagen fibers in the dermis, as well as mitotic activity and cell renewal in epidermis, leading to a decrease in the thickness of the stratum corneum, an increase in the thickness of the granular layer of the skin and an improvement in the structure of the skin.
Недостатком известных косметических средств является то, что они не влияют на процесс старения клеток кожи организма, давая лишь относительно небольшой эффект по улучшению ее функций и внешнего вида.A disadvantage of the known cosmetics is that they do not affect the aging process of the skin cells of the body, giving only a relatively small effect on improving its functions and appearance.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей настоящего изобретения является создание косметического средства, способного препятствовать старению клеток кожи, тем самым более эффективно улучшая функции кожи и ее внешний вид.An object of the present invention is to provide a cosmetic product capable of preventing aging of skin cells, thereby improving skin function and appearance more effectively.
Указанная задача решается тем, что предложено косметическое средство, содержащее активный ингредиент и носитель, в котором согласно изобретению активный ингредиент содержит комплекс, который включает теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид, имеющий сигнал ядерной локализации (NLS), и который способен проникать через плазматическую мембрану клетки.This problem is solved by the fact that the proposed cosmetic product containing the active ingredient and the carrier, in which according to the invention the active ingredient contains a complex that includes a telomeric DNA sequence and its associated peptide having a nuclear localization signal (NLS), and which is able to penetrate through plasma cell membrane.
При применении предложенного косметического средства содержащаяся в нем теломерная последовательность ДНК проникает в ядро клетки кожи, приводя к увеличению числа делений, которые способна осуществить клетка, т.е. замедляя процесс старения клетки, в результате чего кожа приобретает большое количество молодых клеток. Тем самым обеспечивается ускорение реэпителизации кожи, увеличение плотности ее клеток и противодействие утончению кожи в эпидермисе, а также повышение выработки эластиновых волокон фибробластами в дерме. В результате достигается более эффективное улучшение внешнего вида кожи, а также более эффективное ее функционирование.When using the proposed cosmetic product, the telomeric DNA sequence contained in it penetrates the nucleus of the skin cell, leading to an increase in the number of divisions that the cell is able to carry out, i.e. slowing down the aging process of the cell, as a result of which the skin acquires a large number of young cells. This ensures the acceleration of re-epithelialization of the skin, an increase in the density of its cells and counteraction to thinning of the skin in the epidermis, as well as an increase in the production of elastin fibers by fibroblasts in the dermis. The result is a more effective improvement in the appearance of the skin, as well as its more efficient functioning.
Для образования комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки, указанный пептид, содержащийся в косметическом средстве по изобретению, может включать домен белковой трансдукции (PTD). Такие пептиды могут содержать аминокислотные последовательности GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV, RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV или GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV.To form a complex capable of penetrating the plasma membrane of a cell, said peptide contained in a cosmetic product of the invention may include a protein transduction domain (PTD). Such peptides may contain the amino acid sequences GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV , RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV or GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV .
Указанную способность проникать через плазматическую мембрану клетки можно также обеспечить путем использования комплекса, включающего в себя липосому, в которую введены указанная теломерная последовательность ДНК и указанный пептид.The indicated ability to penetrate the plasma membrane of a cell can also be achieved by using a complex including a liposome into which the indicated telomeric DNA sequence and the indicated peptide are introduced.
Указанная задача решается также тем, что предложен способ получения косметического средства, включающий синтез теломерной последовательности ДНК человека и соединение полученной теломерной последовательности с пептидом, имеющим сигнал ядерной локализации, с образованием комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки.This problem is also solved by the fact that the proposed method of obtaining a cosmetic product, including the synthesis of the telomeric sequence of human DNA and the connection of the obtained telomeric sequence with a peptide having a nuclear localization signal, with the formation of a complex that can penetrate through the plasma membrane of the cell.
Для образования комплекса можно использовать пептид, содержащий домен белковой трансдукции. В соответствии с другой формой осуществления изобретения при образовании комплекса теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид вводят в липосому.To form a complex, a peptide containing a protein transduction domain can be used. According to another embodiment of the invention, when the complex is formed, the telomeric DNA sequence and the associated peptide are introduced into the liposome.
В соответствии с еще одной формой осуществления изобретения при получении косметического средства теломерную последовательность синтезируют на основе используемой в качестве матрицы тотальной геномной ДНК, которую получают из образца крови или ткани человека, к которому предполагается применить данное косметическое средство.In accordance with another embodiment of the invention, upon receipt of a cosmetic product, the telomeric sequence is synthesized based on the total genomic DNA used as a matrix, which is obtained from a blood sample or human tissue to which the cosmetic product is intended to be applied.
Предложенное косметическое средство содержит активный ингредиент и носитель. Активный ингредиент представляет собой комплекс, включающий теломерную последовательность ДНК и способный проникать через плазматическую мембрану клетки. Комплекс содержит также пептид, связанный с теломерной последовательностью b, имеющий сигнал ядерной локализации.The proposed cosmetic product contains the active ingredient and a carrier. The active ingredient is a complex that includes a telomeric DNA sequence and is able to penetrate the plasma membrane of the cell. The complex also contains a peptide associated with the telomeric sequence b having a nuclear localization signal.
Теломерные участки, или теломеры, ДНК хромосом представляют собой специальные концевые районы линейной хромосомной ДНК, с которыми также связаны определенные белки. Считается, что теломеры, в частности, защищают хромосомы от деградации и слияния с другими хромосомами. Теломерная ДНК состоит из многократно повторяющихся коротких тандемных нуклеотидных последовательностей, где одна цепь ДНК обогащена гуанином (G), а комплементарная ей цепь обогащена цитидином (С). У человека, как и у большинства эукариот, G-богатая цепь теломерной ДНК построена из блоков TTAGGG, а С-богатая цепь содержит блоки СССТАА.Telomeric regions, or telomeres, of chromosome DNA are special terminal regions of linear chromosome DNA, to which certain proteins are also associated. It is believed that telomeres, in particular, protect chromosomes from degradation and fusion with other chromosomes. Telomeric DNA consists of repeatedly repeated short tandem nucleotide sequences, where one DNA strand is enriched in guanine (G), and its complementary strand is enriched in cytidine (C). In humans, as in most eukaryotes, the G-rich chain of telomeric DNA is constructed from TTAGGG blocks, and the C-rich chain contains CCSTAA blocks.
Предложенное косметическое средство предпочтительно включает в себя теломерные последовательности ДНК человека, содержащие от 100 до 300 п.н. Однако последовательности иной длины также могут быть использованы согласно настоящему изобретению.The proposed cosmetic product preferably includes telomeric sequences of human DNA containing from 100 to 300 bp However, sequences of a different length can also be used according to the present invention.
Под сигналом ядерной локализации имеется ввиду аминокислотная последовательность, называемая также NLS (от англ. выражения «nuclear localization sequence»), узнаваемая определенными рецепторами ядерных мембран клеток, осуществляющими перенос содержащего ее пептида из цитоплазмы внутрь ядра. Последовательности NLS описаны, например, в Jans DA. et al. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? 2000. BioEssays 22:532-544. К NLS последовательностям относится, в частности, последовательность NLS Т-антигена (T-ag) вируса SV-40, состоящая из аминокислот PKKKRKV, которая узнается и связывается с рядом рецепторов ядерных мембран человеческих клеток, участвующих в транспорте пептидов внутрь ядра, и некоторые схожие с ним аминокислотные последовательности (Jans DA et al., Signals mediating nuclear targeting and their regulation: Application in drug delivery. Med Res Rev 1998; 18:189-223: Li S, Ku C-Y. Farmer AA, Cong Y-S, Chen C-F, Lee W-H. Identification of a novel cytoplasmic protein that specifically binds to nuclear localization signal motifs. J Biol Chem 1998: 273: 6183-6189).A nuclear localization signal refers to an amino acid sequence, also called NLS (from the English expression “nuclear localization sequence”), recognized by certain receptors on the cell’s nuclear membranes that carry the peptide containing it from the cytoplasm into the nucleus. NLS sequences are described, for example, in Jans DA. et al. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? 2000. BioEssays 22: 532-544. NLS sequences include, in particular, the NLS sequence of the T-antigen (T-ag) of the SV-40 virus, consisting of PKKKRKV amino acids , which is recognized and associated with a number of receptors of the nuclear membranes of human cells involved in the transport of peptides into the nucleus, and some similar with it amino acid sequences (Jans DA et al., Signals mediating nuclear targeting and their regulation: Application in drug delivery. Med Res Rev 1998; 18: 189-223: Li S, Ku CY. Farmer AA, Cong YS, Chen CF, Lee WH. Identification of a novel cytoplasmic protein that specifically binds to nuclear localization signal motifs. J Biol Chem 1998: 273: 6183-6189).
Помимо последовательности NLS, пептиды, входящие в состав указанного комплекса, могут содержать и другие аминокислотные последовательности.In addition to the NLS sequence, the peptides that make up this complex may contain other amino acid sequences.
Получение комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки, может быть обеспечено путем включения в него любых придающих такое свойство компонентов. Так, например, могут быть использованы белковые последовательности, называемые доменами белковой трансдукции, известные также как PTD (от англ. выражения «protein transduction domain»), или «проникающие в клетку пептиды». Домен белковой трансдукции придает пептидам, имеющим такие домены, способность проникать через плазматическую мембрану клеток. Известен ряд аминокислотных последовательностей PTD (см., например, Kabouridis PS, Biological application of protein transduction technology, TRENDS in Biotechnology, vol.21. No.11. November 2003. 498-503). К таким последовательностям PTD, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, относится, в частности, пептид, соответствующий аминокислотам 48-60 белка ТАТ вируса иммунодефицита человека (HIV), имеющий последовательность аминокислот GRKKRRQRRRPPQ (Green, M and Lowenstein PM (1998) Autonomous functional domains of chemically synthetized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell 55, 1179-1188). Другой такой последовательностью PTD является пептид, соответствующий аминокислотам 43-58 белка семейства гомеобоксных белков Antennapedia (Antp), обнаруженного у Drosophila, и имеющего аминокислотную последовательность RQIKIWFQNRRMKWKK (Kabouridis, см. выше).Obtaining a complex capable of penetrating through the plasma membrane of a cell can be achieved by including in it any components giving this property. For example, protein sequences called protein transduction domains, also known as PTDs (from the expression “protein transduction domain”), or “peptides penetrating a cell” can be used. The protein transduction domain gives peptides having such domains the ability to penetrate the plasma membrane of cells. A number of PTD amino acid sequences are known (see, for example, Kabouridis PS, Biological application of protein transduction technology, TRENDS in Biotechnology, vol.21. No.11. November 2003. 498-503). Such PTD sequences that can be used in accordance with the present invention include, in particular, a peptide corresponding to amino acids 48-60 of the human immunodeficiency virus (HIV) TAT protein having the amino acid sequence GRKKRRQRRRPPQ (Green, M and Lowenstein PM (1998) Autonomous functional domains of chemically synthetized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell 55, 1179-1188). Another such PTD sequence is a peptide corresponding to amino acids 43-58 of the protein of the family of homeobox proteins Antennapedia (Antp), found in Drosophila, and having the amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK (Kabouridis, see above).
Такие аминокислотные последовательности PTD могут быть включены в состав пептида, связанного с теломерной последовательностью и несущего NLS. Так, пептидами, которые могут быть использованы в комплексе, содержащемся в косметическом средстве по изобретению, являются, например, GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV, представляющий собой слитый белок, содержащий PTD, представляющий собой 13-аминокислотную последовательность ТАТ (48-60), и NLS, представляющий собой последовательность 7 аминокислот T-ag SV-40. Другим пептидом, который можно использовать для создания указанного комплекса, является RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV, представляющий собой слитый белок, содержащий 16-аминокислотный PTD Antp (43-58) и 7-аминокислотный NLS T-ag SV-40.Such PTD amino acid sequences can be included in a peptide linked to a telomeric sequence and carrying NLS. Thus, peptides that can be used in the complex contained in a cosmetic product according to the invention are, for example, GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV , which is a fusion protein containing PTD, which is a 13-amino acid sequence of TAT (48-60), and NLS, which is 7 amino acid sequence of T-ag SV-40. Another peptide that can be used to create this complex is RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV , which is a fusion protein containing 16-amino acid PTD Antp (43-58) and 7-amino acid NLS T-ag SV-40.
Еще одним таким пептидом является MPG, представляющий собой 27-аминокислотный пептид GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV, состоящий из гидрофобного PTD-домена, представляющего собой последовательность HIV-1 gp41 (аминокислоты 1-16), и гидрофильный домен (аминокислоты 20-27), представляющий собой T-ag SV-40 (см. также Morris МС, Chaloin L, Mery J Heitz, F and Divita G, A novel potent strategy for gene delivery using a single peptide vector as a carrier, 1999, Nucleic Acid Res., 27, 3510-3517).Another such peptide is MPG, which is a 27-amino acid peptide GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV , consisting of a hydrophobic PTD domain, which is an HIV-1 gp41 sequence (amino acids 1-16), and a hydrophilic domain (amino acids 20-27), which is T- ag SV-40 (see also Morris MC, Chaloin L, Mery J Heitz, F and Divita G, A novel potent strategy for gene delivery using a single peptide vector as a carrier, 1999, Nucleic Acid Res., 27, 3510- 3517).
Связь теломерных последовательностей с пептидом в содержащемся в косметическом средстве по изобретению комплексе может иметь разную природу. Пептиды, содержащие NLS и PTD, несут положительный заряд и могут прямо связываться с отрицательно заряженной ДНК. Химические связи между теломерными ДМК и пептидами могут быть образованы с участием химических группировок как уже присутствующих в этих молекулах, так и введенных в них путем известных модификаций, например с использованием системы биотин-стрептавидин.The association of telomeric sequences with a peptide in a complex contained in a cosmetic product according to the invention can be of a different nature. Peptides containing NLS and PTD carry a positive charge and can directly bind to negatively charged DNA. Chemical bonds between telomeric DMC and peptides can be formed with the participation of chemical groups both already present in these molecules and introduced into them by known modifications, for example, using the biotin-streptavidin system.
Для обеспечения проникновения комплекса по изобретению в клетку можно использовать и другие вещества, помимо PTD. Так, в еще одном воплощении настоящего изобретения содержащийся в косметическом средстве по изобретению комплекс теломерной ДНК и пептида, имеющего NLS, дополнительно включает в себя липосому, в которую введены указанная теломерная ДНК и указанный пептид.Other substances besides PTD can be used to allow the complex of the invention to enter the cell. Thus, in another embodiment of the present invention, the complex of telomeric DNA and peptide having NLS contained in the cosmetic product of the invention further includes a liposome into which said telomeric DNA and said peptide are introduced.
Липосомы представляют собой везикулы, имеющие мембраны, которые состоят из бислоев липидов, преимущественно фосфолипидов, и содержащие внутреннюю водную фазу. Липосомы широко применяются в медицине и косметологии для доставки заключенных в них веществ в клетки.Liposomes are vesicles having membranes that consist of lipid bilayers, mainly phospholipids, and which contain an internal aqueous phase. Liposomes are widely used in medicine and cosmetology to deliver the substances enclosed in them into cells.
Косметическое средство по изобретению может содержать как однослойные, так и многослойные липосомы. Липосомы, полезные в таком косметическом средстве, могут содержать традиционные ингредиенты. Так, липиды представляют собой преимущественно фосфолипиды и их производные. К широко применяемым липидам относятся, в частности, фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеилфосфатидилглицерин, диолеилфосфатидилэтаноламин и другие. Водная фаза в липосомах, содержащихся в косметическом средстве по изобретению, помимо связанных с пептидами теломерных ДНК может также содержать вспомогательные ингредиенты, традиционные для липосом, например буферы, антиоксиданты (например, аскорбат натрия) и хелатирующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусную кислоту).A cosmetic product according to the invention may contain both single and multi-layer liposomes. Liposomes useful in such a cosmetic product may contain traditional ingredients. So, lipids are mainly phospholipids and their derivatives. Commonly used lipids include, in particular, phosphatidylcholine, cholesterol, phosphatidylethanolamine, dioleylphosphatidylglycerol, dioleylphosphatidylethanolamine and others. The aqueous phase in the liposomes contained in the cosmetic product according to the invention, in addition to telomeric DNA bound peptides, may also contain auxiliary ingredients traditional for liposomes, e.g. buffers, antioxidants (e.g. sodium ascorbate) and chelating agents (e.g. ethylenediaminetetraacetic acid).
Носители, которые могут быть использованы в составе предложенного косметического средства, представляют собой буферные растворы, основы для мазей и кремов и другие традиционные носители для косметических препаратов. В носителях могут содержаться буферные агенты, желирующие агенты, консерванты и другие используемые в данной области экципиенты.Carriers that can be used as part of the proposed cosmetic products are buffers, bases for ointments and creams, and other traditional carriers for cosmetic preparations. Carriers may contain buffering agents, gelling agents, preservatives, and other excipients used in the art.
Предложенный способ получения косметического средства включает синтез теломерной последовательности ДНК человека и соединение полученной теломерной последовательности ДНК с пептидом, имеющим сигнал ядерной локализации, с образованием комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки.The proposed method of obtaining a cosmetic product includes the synthesis of a telomeric sequence of human DNA and the connection of the obtained telomeric DNA sequence with a peptide having a nuclear localization signal, with the formation of a complex that can penetrate through the plasma membrane of the cell.
Теломерную последовательность ДНК человека можно получать и амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве затравки тотальной геномной ДНК, выделенной из тканей организма человека. Например, удобно получать ДНК из клеток крови человека. Тотальную геномную ДНК выделяют из полученной у человека ткани, в частности из лейкоцитов крови, известными способами, например методом фенол-хлороформной экстракции. Подбор условий для ПЦР является рутинной процедурой и проводится известными методами. Для наработки количества теломерной ДНК ПЦР-продукт можно подвергать повторной амплификации.The telomeric sequence of human DNA can be obtained and amplified by polymerase chain reaction (PCR) using total genomic DNA isolated from human body tissues as a seed. For example, it is convenient to obtain DNA from human blood cells. Total genomic DNA is isolated from human tissue, in particular from blood leukocytes, by known methods, for example, phenol-chloroform extraction. Selection of conditions for PCR is a routine procedure and is carried out by known methods. To generate telomeric DNA, the PCR product can be amplified again.
Из полученного в ПЦР пула теломерных последовательностей разной длины последовательности желаемой длины выделяют, например, с помощью гель-электрофореза с последующей экстракцией ДНК из геля, при этом подбор условий для проведения такого выделения также является рутинной процедурой для специалистов.From a pool of telomeric sequences obtained in PCR of different lengths, sequences of the desired length are isolated, for example, by gel electrophoresis followed by extraction of DNA from the gel, and the selection of conditions for such isolation is also a routine for specialists.
Клонирование в плазмидах также можно использовать для наработки дополнительного количества теломерных последовательностей ДНК и их хранения. К подходящим плазмидам относится, например, pCR 2.1. Клонирование удобно проводить с использованием наборов «TA-cloning kit» (Invitrogen).Cloning in plasmids can also be used to generate additional numbers of telomeric DNA sequences and their storage. Suitable plasmids include, for example, pCR 2.1. Cloning is conveniently performed using the TA-cloning kit (Invitrogen).
Пептиды, содержащие NLS, а также пептиды, содержащие как NLS, так и PTD, например, такие, как описано выше, можно получить, например, химическим синтезом.Peptides containing NLS, as well as peptides containing both NLS and PTD, for example, such as described above, can be obtained, for example, by chemical synthesis.
Образование комплекса теломерных последовательностей ДНК с пептидом, имеющим NLS, осуществляют, например, путем внесения обоих компонентов в носитель, представляющий собой буферный раствор, имеющий значение рН, близкое к 7,0. Предпочтительное молярное соотношение пептида и теломерных последовательностей составляет 100:1 и выше. Электрофорез в 1% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и съемкой в УФ-свете позволяет детектировать задержку миграции фрагментов ДНК в геле, что свидетельствует об образовании комплекса.The formation of a complex of telomeric DNA sequences with a peptide having NLS is carried out, for example, by introducing both components into a carrier, which is a buffer solution having a pH close to 7.0. The preferred molar ratio of the peptide to telomeric sequences is 100: 1 and higher. Electrophoresis in a 1% agarose gel followed by staining with ethidium bromide and UV light photography allows detection of a delay in the migration of DNA fragments in the gel, which indicates the formation of the complex.
Для получения косметического средства в соответствии с изобретением при образовании указанного комплекса теломерную последовательность ДНК и пептид можно вводить в липосому. Образование липосом, содержащих ДНК, связанную с пептидом, осуществляют по стандартным методикам. Липосомы, содержащие указанные активные вещества, получают, например, диспергированием липидов и комплексов ДНК/пептид в водной среде с последующим механическим перемешиванием, обработкой ультразвуком и/или экструзией через фильтры с определенным размером пор. Липосомы также можно получать солюбилизацией липидов и активных веществ в органических растворителях или детергентах, смешиванием с водной средой и последующим удалением растворителя, а также другими известными методами.In order to obtain a cosmetic product in accordance with the invention, when the complex is formed, the telomeric DNA sequence and peptide can be introduced into the liposome. The formation of liposomes containing DNA associated with the peptide is carried out according to standard methods. Liposomes containing these active substances are obtained, for example, by dispersing lipids and DNA / peptide complexes in an aqueous medium, followed by mechanical stirring, sonication and / or extrusion through filters with a defined pore size. Liposomes can also be obtained by solubilization of lipids and active substances in organic solvents or detergents, mixing with an aqueous medium and subsequent removal of the solvent, as well as other known methods.
ПримерExample
Тотальную ДНК выделяли из лейкоцитов крови человека (0,5 мл цельной крови), стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Выход ДНК после экстракции составлял 40-50 мкг.Total DNA was isolated from human blood leukocytes (0.5 ml whole blood) using the standard phenol-chloroform extraction method. The DNA yield after extraction was 40-50 μg.
Амплификацию ДНК-повторов теломер осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Tris-HCL (рН 8.8), 16.6 мМ (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 2.0 мМ MgCL2, 0.5% диметилсульфоксид (DMSO), 4% формамид, 3 мкл 25 мМ dNTP, 3 ед Taq ДНК полимеразы, 2 мкг выделенной геномной ДНК, 30 пкмоль прямого (Forward) праймера (TTAGGG)5, 20 пкмоль обратного (Reverse) праймера (ААТССС)5. Оба праймера были получены согласно методике, предложенной в работе Lorite et al., J. of Heredity 2002:93(4). ПЦР проводили на термоциклере, используя hot-start. После первоначальной денатурации при 94°С в течение 3 мин с праймером Forward, вносили Taq полимеразу и инкубировали дополнительно 7 мин при этой же температуре. Далее проводили 10 циклов амплификации в следующем режиме: плавление 94°С в течение 1 мин, отжиг 70°С в течение 1 мин, синтез 72°С в течение 1 мин. После завершения 10 циклов устанавливали паузу 90°С - 10 мин, вносили праймер Reverse. Затем проводили 35 циклов амплификации в таком же температурно-временном режиме, как для предыдущих 10 циклов. После завершения 35 циклов амплификации проводили заключительный синтез при 72°С в течение 7 мин.The telomere DNA repeat amplification was carried out by polymerase chain reaction (PCR), which was carried out in 30 μl of a reaction mixture containing 67 mM Tris-HCL (pH 8.8), 16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X-100, 2.0 mM MgCL 2 , 0.5% dimethyl sulfoxide (DMSO), 4% formamide, 3 μl 25 mM dNTP, 3 u Taq DNA polymerase, 2 μg isolated genomic DNA, 30 pmol forward (Forward) primer (TTAGGG) 5 , 20 pmol reverse ( Reverse) primer (AATCCC) 5 . Both primers were obtained according to the technique proposed by Lorite et al., J. of Heredity 2002: 93 (4). PCR was performed on a thermal cycler using a hot-start. After initial denaturation at 94 ° C for 3 min with Forward primer, Taq polymerase was introduced and incubated for an additional 7 min at the same temperature. Then, 10 amplification cycles were performed in the following mode: melting at 94 ° С for 1 min, annealing at 70 ° С for 1 min, synthesis of 72 ° С for 1 min. After completion of 10 cycles, a pause of 90 ° C was established for 10 min, and a Reverse primer was introduced. Then, 35 cycles of amplification were carried out in the same temperature-time regime as for the previous 10 cycles. After completion of 35 amplification cycles, the final synthesis was carried out at 72 ° C for 7 min.
Отбирали 1 мкл полученного ПЦР продукта, разводили водой в соотношении 1/100 и добавляли 1 мкл полученного раствора в реакционную смесь для новой ПЦР, которую осуществляли в условиях и режиме, описанных выше.1 μl of the obtained PCR product was taken, diluted with water in a ratio of 1/100, and 1 μl of the resulting solution was added to the reaction mixture for new PCR, which was carried out under the conditions and conditions described above.
20 мкг ПЦР-продукта, полученного после реамплификации реакционной смеси, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем ТАЕ (Трис-ацетатный буфер, 40 мМ Tris-base, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ EDTA) при градиенте 8V/см. После окончания электрофореза гель окрашивали этидийбромидом и фотографировали в УФ-свете. В качестве маркеров молекулярного веса использовали наборы фирмы Stratagen (США).20 μg of the PCR product obtained after reamplification of the reaction mixture was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel containing TAE (Tris-acetate buffer, 40 mM Tris-base, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA) at a gradient of 8 V / cm. After electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide and photographed in UV light. As molecular weight markers, kits from Stratagen (USA) were used.
Полоски агарозного геля, соответствующие фрагментам теломерной ДНК 100-300 п.н., вырезали из геля и выделение из них ДНК проводили с использованием набора Qiagen (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Получали 20 мкл раствора, содержащего 100 нг теломерных последовательностей ДНК.Strips of agarose gel corresponding to fragments of telomeric DNA of 100-300 bp were excised from the gel and DNA was extracted from them using the Qiagen kit (Qiagen) in accordance with the manufacturer's instructions. Received 20 μl of a solution containing 100 ng of telomeric DNA sequences.
Далее образовывали комплекс теломерных ДНК с пептидом GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (описан выше), производства Института особо чистых препаратов (Санкт-Петербург), путем внесения в 25 мкл 0,05М фосфатного буфера (рН 7.0), используемого в качестве носителя, 20 нг полученных теломерных последовательностей ДНК и указанного пептида в молярном соотношении пептид:ДНК 100:1 и выше. Детектирование комплекса ДНК-пептид проводили при электрофорезе в 1% агарозном геле окрашиванием бромистым этидием и последующей съемкой в УФ-свете. Задержка (ретардация) миграции фрагмента ДНК в геле свидетельствовала об образовании комплекса.Next, a complex of telomeric DNAs with the peptide GRKKRRQRRRPPQPKKKKRKV (described above), produced by the Institute of Highly Pure Preparations (St. Petersburg), was formed by adding 20 ng of the obtained telomeric DNA sequences in 25 μl of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) used as a carrier and said peptide in a molar ratio of peptide: DNA of 100: 1 and higher. Detection of the DNA-peptide complex was carried out by electrophoresis on a 1% agarose gel by staining with ethidium bromide and subsequent exposure to UV light. The delay (retardation) of migration of the DNA fragment in the gel indicated the formation of the complex.
Применение косметического средства можно осуществлять разными путями. Указанное косметическое средство может быть представлено, например, в форме кремов, мазей, гелей и т.п., предназначенных для нанесения на кожу, либо растворов, предназначенных как для нанесения на кожу (например, с помощью пластырей), так и для подкожного введения, полезного для воздействия на клетки дермы, например на фибробласты.The use of cosmetics can be carried out in various ways. The specified cosmetic product can be presented, for example, in the form of creams, ointments, gels, etc., intended for application to the skin, or solutions intended both for application to the skin (for example, using patches), and for subcutaneous administration useful for acting on dermal cells, for example fibroblasts.
Известно, что нормальные соматические клетки человека способны делиться лишь ограниченное число раз (так называемый «лимит Хейфлика»). Доказано, что с каждым делением соматической клетки в результате так называемой проблемы «концевой недорепликации» длина теломерной ДНК сокращается (Greider С. М., 1996, Annual Rev. Biochem., 65, 337-365); при укорачивании теломер до определенной длины клетка перестает делится, переходя в состояние одряхления, или сенесенса, после чего она перестает нормально функционировать и гибнет.It is known that normal human somatic cells are able to divide only a limited number of times (the so-called "Hayflick limit"). It is proved that with each division of the somatic cell, as a result of the so-called “terminal underreplication” problem, the length of telomeric DNA is reduced (Greider S. M., 1996, Annual Rev. Biochem., 65, 337-365); when the telomere is shortened to a certain length, the cell ceases to divide, turning into a state of decrepitude, or senesensa, after which it ceases to function normally and dies.
При введении в кожу предложенного косметического средства теломерная ДНК и связанный с ней пептид проникают в клетки благодаря наличию в пептиде компонента, такого как PTD, придающего комплексу, содержащему ДНК и пептид, способность проникать через мембрану клетки, или благодаря липосоме, в которую введены ДНК и пептид и которая способна транспортировать ее содержимое через клеточную мембрану. Наличие в составе пептида сигнала ядерной локализации позволяет комплексу пептид-теломерная ДНК проникать через ядерную мембрану в ядро клетки. Проникнувшая в ядро клетки теломерная последовательность ДНК с помощью ферментных систем, присутствующих в клетке, присоединяется к концам хромосом, надстраивая их. В результате удлинения теломерных участков хромосом клетка «омолаживается», т.е. становится способной осуществлять большее число делений.When the proposed cosmetic product is introduced into the skin, telomeric DNA and its associated peptide penetrate into the cells due to the presence in the peptide of a component, such as PTD, which gives the complex containing DNA and peptide the ability to penetrate the cell membrane, or due to the liposome into which the DNA and a peptide and which is capable of transporting its contents across the cell membrane. The presence of a nuclear localization signal in the peptide allows the peptide-telomeric DNA complex to penetrate through the nuclear membrane into the cell nucleus. Penetrated into the nucleus of the cell, the telomere DNA sequence, using the enzyme systems present in the cell, attaches to the ends of the chromosomes, attaching them. As a result of lengthening the telomeric regions of the chromosomes, the cell “rejuvenates”, i.e. becomes able to carry out more divisions.
Таким образом, кожа, в которую введено косметическое средство, производит большее количество молодых клеток. В результате ускоряется процесс реэпителизации эпидермиса, что обеспечивает поверхность кожи более молодыми и плотно расположенными клетками. Кроме того, благодаря производству большого количества молодых клеток обеспечивается эффективное поддержание толщины эпидермиса. Наконец, проникновение комплекса теломерная ДНК-пептид, содержащегося в косметическом средстве, в фибробласты, находящиеся в дерме, обеспечивает производство в ней большего количества молодых фибробластов, которые, в отличие от старых, вырабатывают больше эластиновых волокон, что придает коже большую эластичность. Обеспечение поверхности кожи молодыми и плотно расположенными клетками, поддержание толщины эпидермиса и повышение эластичности кожи обеспечивают эффективное улучшение функций и внешнего вида кожи.Thus, the skin into which the cosmetic is introduced produces more young cells. As a result, the epidermal re-epithelialization process is accelerated, which provides the skin surface with younger and denser cells. In addition, through the production of a large number of young cells, the epidermis is effectively maintained. Finally, the penetration of the telomeric DNA-peptide complex contained in the cosmetic product into the fibroblasts located in the dermis ensures the production of more young fibroblasts in it, which, unlike the old ones, produce more elastin fibers, which gives the skin more elasticity. Providing the skin surface with young and densely spaced cells, maintaining the thickness of the epidermis and increasing skin elasticity provide an effective improvement in the functions and appearance of the skin.
По сравнению с часто применяемым переносом молекул ДНК векторами на основе вирусов транспортировка теломерной последовательности ДНК в клетку, осуществляемая при использовании предложенного косметического средства, позволяет избежать нежелательных иммунологических реакций, токсического ответа и возможных мутаций.Compared with the frequently used transfer of DNA molecules by virus-based vectors, the transportation of the telomeric DNA sequence into the cell, carried out using the proposed cosmetic product, avoids undesirable immunological reactions, toxic response and possible mutations.
Схема эксперимента.The scheme of the experiment.
1 часть1 part
Две группы по семь крыс. Первая группа получала инъекции физиологического р-ра хлорида натрия внутридермально в область шеи, вторая группа получала инъекции физиологического р-ра хлорида натрия, содержащего комплексы транспортный пептид (последовательность аминокислот GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV) - фрагмент теломерной ДНК внутридермально. Производили по одной инъекции в день (1 мл препарата) в течение месяца. После чего производилось изъятие данных участков кожи с последующим гистологическим исследованием у пяти из семи особей в каждой группе. При этом во второй группе наблюдалось утолщение слоя дермы в 1.5 раза и увеличение количества эластиновых волокон примерно в 3 раза, что можно характеризовать как увеличение эластичности кожи. У оставшихся крыс (по две в каждой группе) производилось изъятие данных участков кожи через 6 месяцев после инъекций с последующим гистологическим исследованием на предмет онкотрансформации.Two groups of seven rats. The first group received injections of a physiological solution of sodium chloride intradermally in the neck, the second group received injections of a physiological solution of sodium chloride containing transport peptide complexes (amino acid sequence GRKKRRQRRRPPQPKKKKKVK) - a fragment of telomeric DNA intradermally. Produced one injection per day (1 ml of the drug) for a month. After that, these skin areas were removed with subsequent histological examination in five of seven individuals in each group. Moreover, in the second group, a 1.5-fold thickening of the dermis layer and an increase in the number of elastin fibers by about 3 times were observed, which can be characterized as an increase in skin elasticity. In the remaining rats (two in each group), these skin sections were removed 6 months after injection, followed by histological examination for oncotransformation.
2 часть2 part
Две группы по семь крыс. Первой группе наносили на поверхность кожи в области шеи смесь липосом и ланолина, второй группе наносили на поверхность кожи в области шеи смесь липосом в соединении с комплексами транспортный пептид (последовательность аминокислот RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV) - фрагмент теломерной ДНК и ланолина. Производили по одной аппликации в день (1 мл препарата) в течение месяца. После чего производилось изъятие данных участков кожи с последующим гистологическим исследованием у пяти из семи особей в каждой группе. При этом во второй группе наблюдалось утолщение слоя дермы в 1.5 раза и увеличение количества эластиновых волокон примерно в 1.5 раза, что можно характеризовать как увеличение эластичности кожи. У оставшихся крыс (по две в каждой группе) производилось изъятие данных участков кожи через 6 месяцев после нанесения смеси на поверхность кожи с последующим гистологическим исследованием на предмет онкотрансформации.Two groups of seven rats. A mixture of liposomes and lanolin was applied to the first surface of the skin in the neck region, a mixture of liposomes in combination with transport peptide complexes (amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKKKV), a fragment of telomeric DNA and lanolin, was applied to the skin surface in the neck region. Produced one application per day (1 ml of the drug) for a month. After that, these skin areas were removed with subsequent histological examination in five of seven individuals in each group. Moreover, in the second group, a 1.5-fold thickening of the dermis layer and an increase in the number of elastin fibers by about 1.5 times were observed, which can be characterized as an increase in skin elasticity. The remaining rats (two in each group) were removed from these skin areas 6 months after applying the mixture to the skin surface, followed by histological examination for oncotransformation.
3 часть3 part
Две группы по семь крыс. Первая группа получала инъекции физиологического р-ра хлорида натрия внутридермально в область шеи, вторая группа получала инъекции физиологического р-ра хлорида натрия, содержащего комплексы транспортный пептид (последовательность аминокислот GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV) - фрагмент теломерной ДНК внутридермально. Производили по одной инъекции в день (1 мл препарата) в течение месяца. После чего производилось изъятие данных участков кожи с последующим гистологическим исследованием у пяти из семи особей в каждой группе. При этом во второй группе наблюдалось утолщение слоя дермы в 1.6 раза и увеличение количества эластиновых волокон примерно в 2.8 раза, что можно характеризовать как увеличение эластичности кожи. У оставшихся крыс (по две в каждой группе) производилось изъятие данных участков кожи через 6 месяцев после инъекций с последующим гистологическим исследованием на предмет онкотрансформации.Two groups of seven rats. The first group received injections of a physiological solution of sodium chloride intradermally in the neck, the second group received injections of a physiological solution of sodium chloride containing transport peptide complexes (amino acid sequence GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV) - a fragment of telomeric DNA intradermally. Produced one injection per day (1 ml of the drug) for a month. After that, these skin areas were removed with subsequent histological examination in five of seven individuals in each group. Moreover, in the second group, a thickening of the dermis layer was observed by 1.6 times and an increase in the number of elastin fibers by about 2.8 times, which can be characterized as an increase in skin elasticity. In the remaining rats (two in each group), these skin sections were removed 6 months after injection, followed by histological examination for oncotransformation.
Явлений онкотрансформации клеток кожи и подкожной клетчатки в областях инъекций и аппликаций у крыс через 6 месяцев не обнаружено.Oncotransformation of skin cells and subcutaneous tissue in the injection and application areas in rats after 6 months was not detected.
Сходство результатов эксперимента в группах 1 и 3 (идентичность во всем, кроме последовательностей аминокислот транспортного пептида) говорит о том, что основным фактором, влияющим на повышение эластичности кожи, являются фрагменты теломерной ДНК.The similarity of the experimental results in groups 1 and 3 (identity in everything except the amino acid sequences of the transport peptide) suggests that fragments of telomeric DNA are the main factor influencing the increase in skin elasticity.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Данное изобретение может быть использовано в различных средствах ухода за кожей, применяемых в косметологии для улучшения внешнего вида кожи человека.This invention can be used in various skin care products used in cosmetology to improve the appearance of human skin.
Claims (5)
GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV
RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV
GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV,
и способный проникать через плазматическую мембрану клетки.1. A cosmetic product to increase skin elasticity, containing the active ingredient and a carrier, characterized in that it is a complex comprising a telomeric DNA sequence of 100-300 bp in size synthesized based on human genomic DNA and a fusion peptide consisting of a peptide having a nuclear localization signal, and a peptide containing a protein transduction domain with an amino acid sequence selected from the group:
GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV
RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV
GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV,
and capable of penetrating the plasma membrane of a cell.
полученную теломерную последовательность ДНК соединяют с пептидом, имеющим сигнал ядерной локализации, и пептидом, содержащим домен белковой трансдукции, с последовательностью аминокислот, выбранной из группы:
GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV
RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV
GALFLGFLGAAGSTMGAWSGPKSKRKV,
с образованием комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки.3. The method of obtaining a cosmetic product according to claim 1, characterized in that the telomeric sequence of human DNA of size 100-300 bp is synthesized. and
the obtained telomeric DNA sequence is combined with a peptide having a nuclear localization signal, and a peptide containing a protein transduction domain, with an amino acid sequence selected from the group:
GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV
RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV
GALFLGFLGAAGSTMGAWSGPKSKRKV,
with the formation of a complex capable of penetrating the plasma membrane of the cell.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007112836/15A RU2407509C2 (en) | 2004-09-06 | 2004-09-06 | Cosmetic preparation and method for making thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007112836/15A RU2407509C2 (en) | 2004-09-06 | 2004-09-06 | Cosmetic preparation and method for making thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007112836A RU2007112836A (en) | 2008-10-27 |
| RU2407509C2 true RU2407509C2 (en) | 2010-12-27 |
Family
ID=44055924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007112836/15A RU2407509C2 (en) | 2004-09-06 | 2004-09-06 | Cosmetic preparation and method for making thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2407509C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2846338C1 (en) * | 2024-10-17 | 2025-09-04 | Артур Владимирович РЫБАКИН | Heterocomplex based on telomeric sequence for recovery of muscular tissue |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN119708158A (en) * | 2024-12-25 | 2025-03-28 | 复旦大学附属中山医院 | Shuttle peptide targeting YY 1S 247 phosphorylation and application thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6294332B1 (en) * | 1996-07-01 | 2001-09-25 | Telogene Inc. | Composition and methods for modulating the length of telomeres |
| US20030211590A1 (en) * | 2002-05-13 | 2003-11-13 | Hwu Paul L. | Fusion protein for use as vector |
-
2004
- 2004-09-06 RU RU2007112836/15A patent/RU2407509C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6294332B1 (en) * | 1996-07-01 | 2001-09-25 | Telogene Inc. | Composition and methods for modulating the length of telomeres |
| US20030211590A1 (en) * | 2002-05-13 | 2003-11-13 | Hwu Paul L. | Fusion protein for use as vector |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FUTAKI S. et al. Membrane permeability commonly shared arginine-rich peptides, J. Mol. Recognit., 2003, v.16, №3, p.260-264. MARTY С et al. Enhanced heparin sulfate proteoglucan mediated uptake of cell-penetrating peptide-modified liposomes, Cell Mol. Life SCI., 2004, v.61, p.1785-1794. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2846338C1 (en) * | 2024-10-17 | 2025-09-04 | Артур Владимирович РЫБАКИН | Heterocomplex based on telomeric sequence for recovery of muscular tissue |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007112836A (en) | 2008-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230257738A1 (en) | Modified messenger rna comprising functional rna elements | |
| KR20220133957A (en) | Method for preparing lipid nanoparticles | |
| US20220287968A1 (en) | Lipid vesicle-mediated delivery to cells | |
| CN114727964A (en) | Lyophilized composition of lipid nanoparticles | |
| WO2020227642A1 (en) | Compositions for skin and wounds and methods of use thereof | |
| RU2762293C2 (en) | Antisense analgesic for scn9a | |
| KR20210027389A (en) | Compositions and methods for genome editing by insertion of donor polynucleotides | |
| EP0581848A1 (en) | Closed sense and antisense oligonucleotides and uses thereof | |
| KR20170031068A (en) | Skin penetrating peptide and method of use thereof | |
| KR101813560B1 (en) | Topical formulation with Skin Physiological Activity Composed of Cell Permeable Growth Factors | |
| Robbins et al. | Peptide delivery to tissues via reversibly linked protein transduction sequences | |
| EP3336098B1 (en) | Skin permeable peptide and method for using same | |
| RU2407509C2 (en) | Cosmetic preparation and method for making thereof | |
| KR102824695B1 (en) | Novel cell-penetrating peptides and composition including the same | |
| Nakashima-Kamimura et al. | Prevention of chemotherapy-induced alopecia by the anti-death FNK protein | |
| WO2006036082A1 (en) | Cosmetic agent and a method for the production thereof | |
| RU2766701C2 (en) | Antisense oligonucleotides for snap25 | |
| US20040234527A1 (en) | Peptides for use as translocation factors | |
| EP1444253B1 (en) | Pna-conjugates for treating chronic myeloid leukemia (cml) | |
| CN112625089B (en) | Active protein peptide gene with excellent repairing effect and coded protein peptide | |
| CN103936834B (en) | PH selectivity tumor protein p53 and application thereof | |
| JP6776360B2 (en) | A composition for skin penetration containing a cationic molecule transporter and a protein. | |
| WO2023250174A1 (en) | Split prime editors | |
| CN119770672A (en) | A cardiac-targeted nanoliposome delivery carrier, a circular RNA drug for treating cardiovascular diseases, and a preparation method and application thereof | |
| AU2002319407A1 (en) | Peptides for use as translocation factors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170907 |