RU2405560C1 - Средство для защиты клеток мозга - Google Patents
Средство для защиты клеток мозга Download PDFInfo
- Publication number
- RU2405560C1 RU2405560C1 RU2009120396/15A RU2009120396A RU2405560C1 RU 2405560 C1 RU2405560 C1 RU 2405560C1 RU 2009120396/15 A RU2009120396/15 A RU 2009120396/15A RU 2009120396 A RU2009120396 A RU 2009120396A RU 2405560 C1 RU2405560 C1 RU 2405560C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- column
- protein
- kda
- molecular weight
- fraction
- Prior art date
Links
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 34
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims abstract description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims abstract 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 2
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004090 neuroprotective agent Substances 0.000 description 2
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001777 nootropic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 2
- 231100000456 subacute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000006742 locomotor activity Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000019581 neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002664 nootropic agent Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008289 pathophysiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 206010035653 pneumoconiosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006439 vascular pathology Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области фармакологии. Средство для защиты клеток мозга содержит доминирующий белковый экстракт из ткани плаценты, полученный посредством хроматографического разделения белковой фракции из 8-10 компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа. Для получения вышеуказанного средства измельченную плаценту экстрагируют слабощелочным буфером в присутствии ингибиторов протеолитического расщепления белков и центрифугируют. Центрифугат пропускают через хроматографическую колонну с анионообменным носителем, уравновешенную тем же буфером, отмывают колонну от несвязавшегося материала, элюируют белки раствором нейтральной соли. Собранный материал разбавляют водой с доведением рН до слабокислого значения и пропускают разбавленный субстрат последовательно через колонну с анионообменным носителем и колонну с катионообменным носителем, уравновешенными буферными растворами до рН около 6.0. После стерилизации получают готовый продукт. Использование способа позволяет получить эффективное средство, нормализующее функции нервной систем, высокой чистоты. 2 н.п. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.
Description
Изобретение относится к области фармакологии и представляет собой средство для защиты клеток мозга от ишемических и иных повреждений и способ его получения из ткани плаценты. Заявленное средство может использоваться в медицине как средство, нормализующее функции нервной системы.
Ишемический инсульт является одной из наиболее частых проявлений сосудистой патологии человека, одной из основных причин смерти или стойкой инвалидности у лиц в возрасте от 55 лет. При этом частота летальных исходов достигает 20-30%, а в 30-40% случаев исходом ишемического инсульта бывает глубокая инвалидность, возникающая вследствие апоптотической гибели больших популяций нейронов головного мозга, сопровождающейся резко выраженными нарушениями психических и/или моторных функций (Е.И.Гусев и др., 1998-2000).
Отсутствие заметного прогресса в лечении ишемического инсульта, несмотря на достаточную ясность его основных патофизиологических механизмов, свидетельствует о недостаточной эффективности существующих сегодня средств и методов профилактики и лечения этой патологии и стимулирует экспериментальные поиски новых более эффективных препаратов.
Известны способы получения биологически активных веществ и лекарственных средств из животного сырья (патент РФ №944191, 1994; а.с. SU №1112606, 1996; а.с. SU №1218521, 1994; а.с. SU №1227198, 1986; патент РФ №1448443, 1994; патент РФ №1522486, 1993; патент РФ №2075944, 1997; патент РФ №2161501, 2001; патент US 4341765, патент GB 1161896, 1969; патент FR 2583982, 1987).
Известен способ получения препарата, обладающего восстанавливающей активностью при нарушении функции головного мозга (патент РФ №1298979, 1993), который позволяет выделить из коры головного мозга убойных животных биологически активные пептиды, оказывающие позитивное влияние на нервные функции. Этот препарат получают путем обработки исходного сырья (серое вещество полушарий головного мозга) ацетоном при t=-10°С…-4°С и соотношении ткани мозга и ацетона 1:5 в течение 18…30 часов, гомогенизации, экстрагирования гомогената 2…4% раствором уксусной кислоты в течение 48…72 часов при рН 3,5…4,5 в присутствии хлористого цинка в концентрации 0,6…2 г/л и при соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:(8…4), центрифугирования, осаждения биологически активных веществ ацетоном при t=-3°С…-5°С и соотношении супернатанта и ацетона 1:(7…5), и ионообменной хроматографии полученного осадка на катионите "Биокарб". В результате ионообменной хроматографии получают фракцию, содержащую преимущественно щелочные полипептиды с молекулярной массой от 2000 до 6000 Да.
Необходимо отметить, что способ, описанный в патенте РФ №1298979, не позволяет извлечь из коры головного мозга кислые и нейтральные полипептиды, а также очистить получаемый продукт от примесей, а полученный конечный продукт обладает относительно невысокой терапевтической эффективностью.
В практике лечения ишемического инсульта в настоящее время широко применяется препарат «Церебролизин» ("EBEWE", Австрия), представляющий собой гетерогенную смесь пептидов и аминокислот, получаемых из мозга свиней путем стандартизованной ферментативной обработки (Церебролизин: фармакологические эффекты и место в клинической практике. Сб. докладов 6-го Международного симпозиума, Москва, 2002). Установлено, что данный препарат биологического происхождения обладает определенным уровнем нейротрофической активности и тормозит апоптоз нейронов, подвергаемых разного рода неблагоприятным воздействиям. В то же время сам факт нерешенности проблемы профилактики и лечения ишемического инсульта свидетельствует о недостаточной эффективности церебролизина (равно как и любых других применяемых сегодня ноотропов и нейропротекторов биологического происхождения или синтезированных химическим путем) и определяет необходимость разработки и внедрения новых более действенных препаратов.
Эффективность препарата «церебролизин» проявляется при его использовании в дозах 4-10 мг/кг при ежедневных парентеральных введениях в течение 7-10 и более дней после перенесенного инсульта. При таком применении препарата наблюдается тенденция к снижению частоты летальных исходов и некоторое снижение частоты случаев тяжелой инвалидизации по сравнению с пациентами, получавшими плацебо (В.И.Скворцова. Церебролизин в лечении острого ишемического инсульта. Церебролизин: фармакологические эффекты и место в клинической практике. Сб. докладов 6-го Международного симпозиума, Москва, 2002, 28-35).
Понимание биологических основ патологического процесса указывает на то, что прогресс в его лечении может быть достигнут на путях поиска и внедрения более активных нейротрофических и нейропротекторных препаратов. Известно, что источником большого количества трофических факторов является плацента, обеспечивающая и поддерживающая быстрый рост и ускоренное развитие нервной ткани и других органов и тканей формирующегося плода.
Из публикации заявки на патент РФ №2007 118245 известен пептидный экстракт плаценты, содержащий 5.0-35.0 мг/мл белка, 2.0-5.0 мг/мл гликопротеинов и 0,5-1.0 мг/мл тритона Х100, и способ его получения, основанный на экстракции биологического материала - плаценты, которую измельчают, заливают фосфатным буфером с добавлением тритона, после чего из нее посредством центрифугирования выделяют экстракт с последующей очисткой от примесей.
Также из публикации заявки на патент РФ №2004130760 А от 10.04.2006 известно средство, обладающее нейропротекторной и ноотропной активностью, содержащее белки, полученные путем экстракции плаценты слабощелочным буфером. В этой публикации описан способ получения этого средства путем измельчения плаценты человека, экстрагирования слабощелочным буфером, центрифугирования, хроматографирования центрифугата с анионообменным носителем с уравновешиванием тем же буфером, отмывания хроматографической колонки от несвязавшегося материала с последующим элюированием белков раствором хлорида натрия и стерилизацией с помощью фильтрации через антимикробные фильтры.
Данный способ, позволяющий в принципе в лабораторных условиях получить как таковой целевой продукт, на практике в производственных масштабах не позволял выделить готовый продукт требуемой чистоты, лишенный балластных примесей белковой природы.
Задачей предлагаемого технического решения является получение эффективного средства, нормализующего функции нервной системы, высокой чистоты приемлемым в промышленном масштабе способом.
Решением поставленной задачи служит средство для защиты клеток мозга от ишемических и иных повреждений, содержащее доминирующий белковый экстракт из ткани плаценты с получением за счет хроматографического разделения белковой фракции из 8-10 компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа, а 20-30% фракции приходятся на белки с молекулярной массой от 15 до 60 кДа и от 100 до 200 кДа.
Для получения средства в соответствии с поставленной задачей этап гель-фильтрации был заменен на дополнительный (завершающий) этап комбинированной ионообменной хроматографии. А именно первичный элюат, содержащий препарат NP-3, 3-кратно разбавляли дистиллированной водой для снижения концентрации NaCl, доводили рН раствора до 6,0, после чего полученный раствор пропускали через две последовательно соединенные колонки с анионообменным и катионообменным носителями. Объем носителей брали из расчета 1 мл геля на 50 мг суммарного белка раствора. Раствор, прошедший через обе ионообменных колонки без связывания с носителями, содержал очищенный препарат NP-3, тогда как примесные балластные продукты связывались с анионообменным либо с катионообменным носителями.
Таким образом, способ получения средства заключается в том, что измельченную плаценту экстрагируют слабощелочым буфером в присутствии ингибиторов протеолитического расщепления белков, центрифугируют, центрифугат пропускают через хроматографическую колонну с анионообменным носителем, уравновешенную тем же буфером, отмывают колонну от несвязавшегося материала, элюируют белки раствором нейтральной соли, собранный материал разбавляют водой с доведением рН до слабокислого значения и пропускают разбавленный субстрат последовательно через колонну с анионообменным носителем и колонну с катионообменным носителем, уравновешенными буферными растворами с низкой концентрацией солей и рН около 6.0, после стерилизации получают готовый продукт. Раствор, прошедший через обе ионообменных колонки без связывания с носителями, содержал очищенный препарат (NP-3), тогда как примесные балластные продукты связывались с анионообменным либо с катионообменным носителями. Готовый препарат (NP-3) представлял собой белковую фракцию, состоящую из 8-10 компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа, и обладал способностью эффективно защищать клетки мозга от ишемических и иных повреждений.
Пример1
Получение препарата NP-3
Свежий препарат плаценты экстрагируют слабощелочным буфером (например, 0.01 М трис-HCl, рН 8 в присутствии общеупотребляемых ингибиторов протеолитического расщепления белков), центрифугируют и пропускают через хроматографическую колонку с анионообменным носителем (например, ДЕАЕ-целлюлоза), уравновешенную тем же буфером.
Отмывают колонку от несвязанного материала 0,05 М раствором нейтральной соли, например, 0,05 М раствора NaCl на исходном буфере без ингибиторов протеолиза.
Элюируют фракцию целевого продукта пропусканием через колонку 0,15 М раствора NaCl. Собирают белковый пик.
Полученный материал 3-кратно разбавляют дистиллированной водой, доводят рН раствора до 6,0 и пропускают через две последовательно соединенные колонки с анионообменным и катионообменным носителями (например, ДЕАЕ-целлюлоза и КМ-целлюлоза), уравновешенными 0.01 М буферными растворами с рН 6.0. Объем носителей брали из расчета 1 мл геля на 50 мг суммарного белка раствора. Раствор, прошедший через обе ионообменных колонки без связывания с носителями, содержал очищенный препарат NP-3, тогда как примесные балластные продукты связывались с анионообменным либо с катионообменным носителями, которые могли быть регенерированы по стандартным протоколам и использоваться многократно.
Собранный материал стерилизуют (например, фильтрацией через безмикробные фильтры), измеряют концентрацию белка (например, по методу Лоури), фасуют и хранят до использования при -40°С.
Полученный продукт имеет следующие характеристики:
A) По данным электрофореза в 10% полиакриламидном геле (в присутствии додецилсульфата натрия и дитиотреитола): белковая фракция, состоящая из 8-10 родственных компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа.
Б) Главный белковый компонент фракции, на долю которого приходится 70-80% суммарного белка, иммунохимически (с помощью твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга) был идентифицирован как альфа-фетопротеин.
(Альфа-фетопротеин (АФП) описан, в частности, в автореферате диссертации С.Ю.Родионова (Пермь - 2003). АФП - это гликопротеин с молекулярной массой 69000 дальтон, состоящий из одной полипептидной цепи, включающей около 600 аминокислот и содержащий около 4% углеводов. Он входит в состав генетического семейства альбуминоидов, расположенного у человека в 4-й хромосоме. В работе исследована эффективность использования АФП в практике терапии следующих внутренних болезней:
- пневмокониозов;
- бронхиальной астмы;
- инфильтративного туберкулеза легких;
- аутоиммунного тиреоидита;
- хронического гепатита и цирроза печени).
B) Выход активного вещества (препарат NP-3), выделенного из тканей плаценты), составляет не менее 100 мг на 1 кг исходного сырья.
Г) Очищенный, стерильно фильтрованный и расфасованный препарат, отправляемый на хранение, представляет собой розоватый прозрачный раствор с концентрацией суммарного белка 1 мг/мл.
Экспериментальная проверка показала, что предлагаемое техническое решение обеспечивает максимальную биологическую стабильность и терапевтическую эффективность препарата, нормализующего функции клеток головного мозга, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.
В экспериментах на лабораторных животных было выявлено следующее.
Пример 2.
Изучение возможной пирогенности препарата
Исследование проводилось на взрослых беспородных кроликах-самцах весом 2,5-3 кг общепринятым методом (ГФ XI, вып.2, с.183) при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций.
Показано, что введения препарата не сопровождались подъемом температуры тела, т.е. препарат не обладает пирогенными свойствами.
Пример 3.
Изучение возможной токсичности препарата
A) Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении препарата.
Б) Исследование по изучению острой токсичности было проведено на белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-24 г. Животные были рандомизированно разделены на группы по 5 мышей. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 25 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.
B) Исследование по изучению подострой токсичности было проведено на белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-200 г, рандомизированно разделенных на группы по 5 животных. Препарат вводили внутримышечно ежедневно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор NaCl. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав периферической крови. Статистически достоверных различий между изучаемыми параметрами в контрольной и опытных группах выявлено не было (р>0.1).
Г) Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев на белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-200 г рандомизированно разделенных на группы по 5 животных. Животные опытных групп получали ежедневно препарат внутримышечно в течение 6 мес. в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор NaCl в том же объеме. До введения препарата, на 90 сутки и на 180 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав периферической крови, скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и содержание общего белка в сыворотке крови по методу Лоури. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, щитовидной железы, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почек, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса и селезенки. Статистически достоверных различий между изучаемыми параметрами в контрольной и опытных группах выявлено не было (р>0.07).
Таким образом, было показано, что введения препарата во всех использованных дозах не сопровождались токсическими реакциями, что свидетельствует о большой терапевтической широте дозировок препарата.
Пример 4. Экспериментальное использование препарата (описание методик см. (Poletaev А.В., Arapov N.A. Pharmacologyonline, 2006, 3, 73-79. (http://www.unisa.it/download/196614518051168815.Poletaev.pdf)
1. Лабораторных взрослых крыс обучали лабиринтному поведению с положительным пищевым подкреплением в водном лабиринте Морриса по стандартным методикам.
2. Лабораторных взрослых крыс обучали поведению пассивного избегания затемненного отсека с электроболевым подкреплением по стандартным методикам.
3. Лабораторных взрослых крыс тестировали на поведение в «открытом поле» по стандартным методикам.
4. Производили двустороннее 30-минутное лигирование обоих сонных артерий на уровне верхних шейных отделов по стандартным методикам.
5. Спустя 3 часа после модельной ишемизации головного мозга животным внутрибрюшинно однократно вводили препарат NP-3 в дозе 0,2 мг/кг веса или церебролизин в дозе 10 мг/кг (активный контроль).
6. Спустя 7 дней оценивали уровень общей двигательной и ориентировочно-исследовательской активности животных и уровень воспроизведения у них ранее выработанных навыков (группы сравнения: 1. крысы после острой ишемии мозга, получавшие церебролизин, 2. крысы после острой ишемии мозга, получавшие препарат NP-3, 3. крысы пассивного контроля, не подвергавшиеся ишемизации).
Влияние препарата NP-3 на выживаемость и функции нервной системы у крыс, подвергавшихся ишемизации головного мозга (Poletaev А.В., Arapov N.A. Pharmacologyonline, 2006, 3, 73-79. (http://www.unisa.it/download/196614518051168815.Poletaev.pdf)
Таблица
| Смертность после острой ишемии мозга | Средний уровень локомоторной активности в группах (баллы) | Воспроизведение лабиринтных навыков (Средний уровень в группах) | Воспроизведение навыков пассивного избегания (Средний уровень по группам животных) | |
| 1. Крысы группы активного контроля (n=20) | 18% | 21 | 24% | 44% |
| 2. Крысы, получавшие NP-3 (n=20) | 10%∗ | 48∗ | 77%∗∗ | 85%∗ |
| 3. Крысы, не подвергавшиеся ишемии мозга (n=12) | 0% | 52 | 92% | 97% |
| Уровни достоверности отличий:* - р<0.05, ** - р<0.01 | ||||
Предусматривается введение препарата в организм человека в виде назальных капельных вливаний (по 1 капле в каждую ноздрю), ежедневно, на протяжении 12-14 дней, хотя возможно и внутривенное или интралюмбарное введение препарата с соответствующим перерасчетом дозировок.
Claims (3)
1. Средство для защиты клеток мозга, содержащее доминирующий белковый экстракт из ткани плаценты, полученный с помощью хроматографического разделения белковой фракции из 8-10 компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа.
2. Средство по п.1, отличающееся тем, что 20-30% фракции приходится на белки с молекулярной массой от 15 до 60 кДа и от 100 до 200 кДа.
3. Способ получения средства для защиты клеток мозга по п.1, заключающийся в том, что измельченную плаценту экстрагируют слабощелочным буфером в присутствии ингибиторов протеолитического расщепления белков, центрифугируют, центрифугат пропускают через хроматографическую колонну с анионообменным носителем, уравновешенную тем же буфером, отмывают колонну от несвязавшегося материала, элюируют белки раствором нейтральной соли, собранный материал разбавляют водой с доведением рН до слабокислого значения и пропускают разбавленный субстрат последовательно через колонну с анионообменным носителем и колонну с катионообменным носителем, уравновешенными буферными растворами до рН около 6.0, после стерилизации получают готовый продукт.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009120396/15A RU2405560C1 (ru) | 2009-05-29 | 2009-05-29 | Средство для защиты клеток мозга |
| PCT/RU2010/000264 WO2010138024A2 (ru) | 2009-05-29 | 2010-05-25 | Средство для защиты клеток мозга |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009120396/15A RU2405560C1 (ru) | 2009-05-29 | 2009-05-29 | Средство для защиты клеток мозга |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2405560C1 true RU2405560C1 (ru) | 2010-12-10 |
Family
ID=43223295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009120396/15A RU2405560C1 (ru) | 2009-05-29 | 2009-05-29 | Средство для защиты клеток мозга |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2405560C1 (ru) |
| WO (1) | WO2010138024A2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2633480C1 (ru) * | 2016-09-15 | 2017-10-12 | Александр Борисович Полетаев | Средство для стимуляции когнитивных функций при аутизме у детей |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103285372B (zh) * | 2013-05-10 | 2014-04-16 | 海南通用同盟药业有限公司 | 一种脑蛋白水解物及其注射剂制剂 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000006180A1 (es) * | 1998-07-28 | 2000-02-10 | Centro De Histoterapia Placentaria | Composicion para la estimulacion de la sintesis del pigmento melanico y procedimiento para su obtencion |
| RU2004130760A (ru) * | 2004-10-21 | 2006-04-10 | Медицинский исследовательский центр "Иммункулус" (RU) | Средство, обладающее нейропротекторной и ноотропной активностью, и способ его получения |
| RU2355405C2 (ru) * | 2007-05-17 | 2009-05-20 | Михаил Аркадьевич Шурдов | Пептидный экстракт плаценты и способ его изготовления |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60199819A (ja) * | 1984-03-23 | 1985-10-09 | Kowa Co | トロンビン結合性物質およびその製法 |
| JPS61277626A (ja) * | 1985-05-31 | 1986-12-08 | Sugiura Shinyaku Kaihatsu Kenkyusho:Kk | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼを高濃度に含有する胎盤エキスおよびその製法 |
-
2009
- 2009-05-29 RU RU2009120396/15A patent/RU2405560C1/ru active
-
2010
- 2010-05-25 WO PCT/RU2010/000264 patent/WO2010138024A2/ru not_active Ceased
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000006180A1 (es) * | 1998-07-28 | 2000-02-10 | Centro De Histoterapia Placentaria | Composicion para la estimulacion de la sintesis del pigmento melanico y procedimiento para su obtencion |
| RU2004130760A (ru) * | 2004-10-21 | 2006-04-10 | Медицинский исследовательский центр "Иммункулус" (RU) | Средство, обладающее нейропротекторной и ноотропной активностью, и способ его получения |
| RU2355405C2 (ru) * | 2007-05-17 | 2009-05-20 | Михаил Аркадьевич Шурдов | Пептидный экстракт плаценты и способ его изготовления |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FREYSSINET JM et al. Coextraction of thrombomodulin and tissue factor from human placenta: effects of concanavalin A and phospholipid environment on activity. Thromb Haemost, 1986, 28, 55(1), p.112-8, PMID: 3010487, реф., найдено в PubMed, найдено 04.03.2010. KHALIL FK et al. Purification of placental alpha-1-foetoprotein. Clin Chim Acta, 1978, 15, 88 (1), p.167-72, PMID: 79457, реф., найдено в PubMed, найдено 04.03.2010. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2633480C1 (ru) * | 2016-09-15 | 2017-10-12 | Александр Борисович Полетаев | Средство для стимуляции когнитивных функций при аутизме у детей |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010138024A2 (ru) | 2010-12-02 |
| WO2010138024A3 (ru) | 2011-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2186423C (en) | Protein which induces interferon-gamma production by immunocompetent cell | |
| US20150031621A1 (en) | Method for purification of complement factor h | |
| RU2405560C1 (ru) | Средство для защиты клеток мозга | |
| WO2004067549A2 (de) | Peptide gegen kälteunverträglichkeit hervorrufende autoantikörper und ihre verwendung | |
| CN102439175A (zh) | 免疫调节治疗剂 | |
| US7238662B2 (en) | Alpha 2HS glycoprotein for treatment of cancer and a method for preparation thereof | |
| CN101575365B (zh) | 一种抗病毒蛋白及其制备方法和应用 | |
| EA010735B1 (ru) | Средство, нормализующее репродуктивную функцию у мужчин, и способ его получения | |
| US9744217B2 (en) | Bilirubin excretion enhancer | |
| EA015272B1 (ru) | Способ лечения заболевания | |
| RU2302871C1 (ru) | Средство, нормализующее функции головного мозга, и способ его получения | |
| RU2302868C1 (ru) | Средство, нормализующее функции почек, и способ его получения | |
| RU2301071C1 (ru) | Гепатопротекторное средство и способ его получения | |
| JPS60243018A (ja) | ヒト内来性癌制御因子 | |
| CN1128810C (zh) | 防治肝病的鲨鱼肝多肽结构及纯化 | |
| RU2302872C9 (ru) | Средство, нормализующее функции хрящевой ткани, и способ его получения | |
| RU2302875C1 (ru) | Средство, нормализующее функции щитовидной железы, и способ его получения | |
| US20040247589A1 (en) | Anti-tumor activity from reptile serum | |
| CN1089248C (zh) | 一种治疗神经系统疾病的药物及其制备方法 | |
| RU2134581C1 (ru) | Средство для лечения облученных млекопитающих | |
| RU2302867C1 (ru) | Средство, нормализующее тонус мочевого пузыря, и способ его получения | |
| RU2301072C1 (ru) | Средство, нормализующее функции кровеносных сосудов, и способ его получения | |
| JPH051098A (ja) | 新規ペプチド | |
| CN1369507A (zh) | 从人血浆中分离纯化巨核细胞刺激因子的方法及应用 | |
| WO1984003104A1 (fr) | Substance reduisant la synthese de l'adn |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20130325 |