RU2404253C1 - METHOD OF DETECTING MUTATION P369ins IN GENE CYP1B1 - Google Patents
METHOD OF DETECTING MUTATION P369ins IN GENE CYP1B1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2404253C1 RU2404253C1 RU2009123806/10A RU2009123806A RU2404253C1 RU 2404253 C1 RU2404253 C1 RU 2404253C1 RU 2009123806/10 A RU2009123806/10 A RU 2009123806/10A RU 2009123806 A RU2009123806 A RU 2009123806A RU 2404253 C1 RU2404253 C1 RU 2404253C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mutation
- dna
- p369ins
- cyp1b1
- gene
- Prior art date
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 101000725164 Homo sapiens Cytochrome P450 1B1 Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 27
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 5
- 206010018325 Congenital glaucomas Diseases 0.000 abstract description 7
- 201000006672 primary congenital glaucoma Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 5
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 abstract description 4
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102100027417 Cytochrome P450 1B1 Human genes 0.000 description 6
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 3
- 206010030348 Open-Angle Glaucoma Diseases 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108010077090 Cytochrome P-450 CYP1B1 Proteins 0.000 description 2
- 102000009902 Cytochrome P-450 CYP1B1 Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 2
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 2
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010047531 Visual acuity reduced Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004315 low visual acuity Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 201000006366 primary open angle glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной генетики и медицины, а именно к разработке способов обнаружения мутации P369ins в гене CYP1B1. Изобретение может быть использовано в научно-исследовательской практике при изучении механизмов развития ПВГ.The invention relates to the field of molecular genetics and medicine, namely to the development of methods for detecting the P369ins mutation in the CYP1B1 gene. The invention can be used in research practice in studying the mechanisms of development of PVG.
На сегодняшний день единственным способом профилактики слепоты от глаукомы является ее ранняя диагностика и своевременно начатое лечение. Благодаря достижениям молекулярной генетики последних десятилетий стал возможен прогресс в доклинической диагностике и понимании точных механизмов развития сотен моногенных и мультифакториальных заболеваний.To date, the only way to prevent blindness from glaucoma is its early diagnosis and timely treatment. Thanks to the advances in molecular genetics of recent decades, progress has been made possible in preclinical diagnosis and understanding of the exact mechanisms for the development of hundreds of monogenic and multifactorial diseases.
Предположение о возможной генетической предрасположенности к глаукоме впервые было высказано Benedict T.W в 1842 г. В последующем различными исследователями были описаны родословные, демонстрирующие как аутосомно-рецессивный, так и аутосомно-доминантный тип наследования заболевания со степенью пенетрантности, варьирующей от 60 до 100%. У большинства членов этих родословных заболевание развивалось в раннем возрасте (юношеская ПОУГ).The idea of a possible genetic predisposition to glaucoma was first made by Benedict T.W in 1842. Subsequently, various researchers described pedigrees that demonstrate both an autosomal recessive and an autosomal dominant type of disease inheritance with a penetrance degree ranging from 60 to 100%. In most members of these pedigrees, the disease developed at an early age (juvenile POAG).
Известно, что в 1997 году Stoilov I. et al идентифицировал мутации в гене CYP1B1, кодирующем цитохром Р4501 В1 у больных с глаукомой [Stoilov I., Akarsu A.N., Alozie I. et al. Sequence analysis and homology modeling suggest that primary congenital glaucoma on 2p21 results from mutations disrupting either the hinge region or the conserved core structures of cytochrome Р4501 В1 //Am. J. Hum. Genet. - 1998. - Vol.62. - P.573-584].It is known that in 1997 Stoilov I. et al identified mutations in the CYP1B1 gene encoding cytochrome P4501 B1 in patients with glaucoma [Stoilov I., Akarsu A.N., Alozie I. et al. Sequence analysis and homology modeling suggest that primary congenital glaucoma on 2p21 results from mutations disrupting either the hinge region or the conserved core structures of cytochrome P4501 B1 // Am. J. Hum. Genet. - 1998 .-- Vol.62. - P.573-584].
На настоящий момент идентифицировано 82 мутации гена CYP1B1 у пациентов с первичной врожденной и открытоугольной глаукомами, а также с аномалиями Ригера и Петерса. Среди описанных мутаций 46 миссенс-мутаций, 10 нонсенс-мутаций, 16 делеций и 8 инсерций или дупликаций и 2 молчащие мутации.To date, 82 CYP1B1 gene mutations have been identified in patients with primary congenital and open-angle glaucoma, as well as with Rieger and Peters abnormalities. Among the described mutations, 46 missense mutations, 10 nonsense mutations, 16 deletions and 8 insertions or duplications and 2 silent mutations.
Известен способ обнаружения мутаций в гене CYP1B1 путем прямого секвенирования. Этот способ применялся многими исследовательскими группами [Melki R., Colomb E., Lefort N. et al. CYP1B1 mutations in French patients with early-onset primary open-angle glaucoma // J/ Med. Genet. - 2004. - Vol.41. - P.647-651], [Reddy A.B.M., Kaur K., Mandal A.K. et al. Mutation spectrum of the CYP1B1 gene in Indian primary congenital glaucoma patients // Mol. Vision. - 2004. - Vol.10. - P. 696-702].A known method for detecting mutations in the CYP1B1 gene by direct sequencing. This method has been used by many research groups [Melki R., Colomb E., Lefort N. et al. CYP1B1 mutations in French patients with early-onset primary open-angle glaucoma // J / Med. Genet. - 2004 .-- Vol.41. - P.647-651], [Reddy A.B.M., Kaur K., Mandal A.K. et al. Mutation spectrum of the CYP1B1 gene in Indian primary congenital glaucoma patients // Mol. Vision. - 2004 .-- Vol.10. - P. 696-702].
Спектр описанных мутаций в гене CYP1B1 является этнически и популяционно-специфичным.The spectrum of the described mutations in the CYP1B1 gene is ethnically and population-specific.
В настоящее время не обнаружено работ по исследованию данного гена в российской популяции.Currently, no studies have been found on the study of this gene in the Russian population.
Задача изобретения заключается в исследовании гена CYP1B1.The objective of the invention is to study the CYP1B1 gene.
Техническим результатом изобретения является обнаружение мутации P369ins в гене CYP1B1.The technical result of the invention is the detection of a P369ins mutation in the CYP1B1 gene.
Указанный технический результат достигается тем, что обнаружение мутации P369ins в гене CYP1B1 осуществляют путем амплификации методом ПЦР 349 пар нуклеотидов 3-го экзона гена CYP1B1 с помощью специально подобранных прямого и обратного праймеровThe indicated technical result is achieved in that the detection of the P369ins mutation in the CYP1B1 gene is carried out by PCR amplification of 349 nucleotides of the 3rd exon of the CYP1B1 gene using specially selected direct and reverse primers
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3' и5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3 'and
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3'5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3 '
с проведением отжига и последующего гетеродуплексного анализа, который включает смешивание ПЦР-продукта с формамидом в отношении 1:3, денатурацию полученной пробы в кипящей воде, последующее охлаждение при комнатной температуре, электрофорез ДНК в 8% вертикальном полиакриламидном геле и визуализацию ДНК-продукта окрашиванием нитратом серебра; о наличии мутации в гетерозиготном состоянии судят по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность, как у фрагментов ДНК длиной 420 и 450 п.н., и отсутствующих у пациентов без мутации P369ins.with annealing and subsequent heteroduplex analysis, which includes mixing the PCR product with formamide in a ratio of 1: 3, denaturing the obtained sample in boiling water, subsequent cooling at room temperature, DNA electrophoresis in an 8% vertical polyacrylamide gel and visualization of the DNA product with nitrate staining silver; The presence of a mutation in the heterozygous state is judged by the formation of additional bands in the gel having electrophoretic mobility, as in DNA fragments 420 and 450 bp in length, and absent in patients without P369ins mutation.
Исследования по обнаружению мутации гена цитохром Р450 (CYP1B1) проводились среди жителей Петербурга, из которых 45 человек составляли группу пробандов с первичной врожденной глаукомой, а 100 человек - контрольную группу из 100 доноров без патологии органа зрения.Studies on the detection of a mutation of the P450 cytochrome gene (CYP1B1) were carried out among residents of St. Petersburg, of which 45 were a group of probands with primary congenital glaucoma, and 100 people were a control group of 100 donors without pathology of the organ of vision.
В результате проведенных исследований у одного пациента при электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном геле были обнаружены дополнительные фрагменты в амплификате экзона 3А, которые были интерпретированы авторами как гетеродуплексы. Также при SSCP-анализе был получен образец, который значительно отличался от всех остальных образцов. Секвенирование гетерозиготного образца с мутацией выявило наличие инсерции и для однозначного прочтения последовательности потребовало клонирования мутантного аллеля в плазмидном векторе.As a result of studies in one patient, by electrophoresis of amplification products in a polyacrylamide gel, additional fragments were found in the amplification of exon 3A, which were interpreted by the authors as heteroduplexes. SSCP analysis also yielded a sample that was significantly different from all other samples. Sequencing of a heterozygous sample with a mutation revealed the presence of insertion and, for an unambiguous reading of the sequence, required the cloning of the mutant allele in the plasmid vector.
Секвенирование мутантного аллеля выявило инсерцию тринуклеотида СТС и появление дополнительного остатка пролина в 369-ом положении белка цитохрома. По правилам номенклатуры эту мутацию следует называть с.1508ins3 или Sequencing of the mutant allele revealed the insertion of CTC trinucleotide and the appearance of an additional proline residue at the 369th position of the cytochrome protein. According to the rules of nomenclature, this mutation should be called p. 1508ins3 or
c.1508insCTC при нумерации по канонической последовательности кДНК NM_000104.3, или g.7942ins3 при нумерации по канонической последовательности U56438 гена CYP1B1, или же p.P369ins при нумерации по последовательности белка человека NP_000095.1.c.1508insCTC when numbering according to the canonical sequence of cDNA NM_000104.3, or g.7942ins3 when numbering according to the canonical sequence U56438 of CYP1B1 gene, or p.P369ins when numbering according to the sequence of the human protein NP_000095.1.
Мутация P369ins была найдена только у одного из 45 пробандов с ПВГ и не обнаружена ни у одного из 100 доноров без патологии органа зрения, составляющих группу контроля.The P369ins mutation was found in only one of 45 probands with PVG and was not found in any of the 100 donors without pathology of the organ of vision that make up the control group.
Лейциновый остаток в 369-ом положении входит в состав последовательности RLP (аминокислотные остатки 368-370, нумерация по последовательности белка человека NP_000095.1), идентичной между белком человека и его гомологами у шимпанзе, собаки, быка, мыши, крысы, курицы и рыбы Danio rerio.The leucine residue at the 369th position is part of the RLP sequence (amino acid residues 368-370, sequence numbering according to the human protein NP_000095.1), identical between the human protein and its homologs in chimpanzee, dog, bull, mouse, rat, chicken and fish Danio rerio.
В результате мутации в белке цитохрома CYP1B1 возникает последовательность RPLP с двумя близко расположенными остатками пролина. Остатки пролина образуют другой валентный угол в полипептидной цепи, чем остатки других аминокислот, и вставка дополнительного пролина должна существенно изменить пространственную укладку полипептидной цепи цитохрома, что скажется на его функции. Описанная нами мутация не индексирована в Human Genome Mutation Database и в обзоре, обобщающем результаты поиска мутаций в CYP1B1 в разных популяциях мира [Vasiliou V., Gonzalez F.J. Role of CYP1B1 in glaucoma //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2008. - Vol.48. - P.333-358].As a result of a mutation in the cytochrome CYP1B1 protein, an RPLP sequence occurs with two closely spaced proline residues. Proline residues form a different valence angle in the polypeptide chain than the residues of other amino acids, and the insertion of additional proline should significantly change the spatial folding of the cytochrome polypeptide chain, which will affect its function. The mutation described by us is not indexed in the Human Genome Mutation Database and in a review summarizing the search results for mutations in CYP1B1 in different world populations [Vasiliou V., Gonzalez F.J. Role of CYP1B1 in glaucoma // Annu. Rev. Pharmacol Toxicol. - 2008 .-- Vol. 48. - P.333-358].
В РФ исследования гена CYP1B1 ранее не проводились. В настоящем исследовании была идентифицирована первая специфичная для России мутация гена CYP1B1, что может быть использовано в научно-исследовательской практике при изучении механизмов развития ПВГ. Сущность изобретения поясняется чертежом, на котором представлена детекция мутации P369ins (c.1508ins3) в гетерозиготном состоянии в гене CYP1B1 с помощью гетеродуплексного анализа.In the Russian Federation, studies of the CYP1B1 gene have not been previously conducted. In the present study, the first Russian-specific mutation of the CYP1B1 gene was identified, which can be used in research practice to study the mechanisms of PVG development. The invention is illustrated by the drawing, which shows the detection of the mutation P369ins (c.1508ins3) in the heterozygous state in the CYP1B1 gene using heteroduplex analysis.
На чертеже следующие обозначения:In the drawing, the following notation:
Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н.; 2 - образец гетерозиготный по мутации P369ins; 3 - образец без мутации P369ins; электрофорез в 8% ПААГ, окрашивание ДНК нитратом серебра.Lanes: 1 - molecular weight marker in increments of 100 bp; 2 - sample heterozygous for P369ins mutation; 3 - sample without mutation P369ins; electrophoresis in 8% SDS page; DNA staining with silver nitrate.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Исследуют ген цитохрома Р450 (CYP1B1). Обнаружение мутации проводят методом (ПЦР) ДНК с использованием специально подобранных прямого и обратного праймеров:The cytochrome P450 gene (CYP1B1) is examined. Mutation detection is carried out by DNA method (PCR) using specially selected forward and reverse primers:
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3' и5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3 'and
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3'5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3 '
Размеры фракционированных фрагментов ДНК: 3 экзон площадка 3А - 349 п.н. (размер ампликона).Sizes of fractionated DNA fragments: 3 exon site 3A - 349 bp (amplicon size).
ДНК в пробу добавляют в количестве 50-100 нг. В качестве контроля используют пробу, не содержащую геномной ДНК. ПЦР проводят в 0.5 мл центрифужных пробирках на аппарате «Терцик» (ДНК-Технология, Москва, Россия) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР.DNA is added to the sample in an amount of 50-100 ng. As a control, a sample that does not contain genomic DNA is used. PCR is carried out in 0.5 ml centrifuge tubes on the apparatus "Tertsik" (DNA-Technology, Moscow, Russia) with a set of programs that determine the temperature regime of PCR.
Составляют смесь для ПЦР с указанными ниже конечными концентрациями реагентов:Compose a mixture for PCR with the following final concentrations of reagents:
Используют следующий температурный режим:Use the following temperature conditions:
Для оценки количества и специфичности полученного в результате проведения ПЦР амплификата проводят одномерный электрофорез в вертикальных пластинах полиакриламидного геля (80×100×1 мм) в 8% ПААГ (соотношение акриламид: бисакриламид =29:1) в 1xТВЕ.To assess the amount and specificity of the amplified by PCR, one-dimensional electrophoresis is carried out in vertical plates of polyacrylamide gel (80 × 100 × 1 mm) in 8% SDS page (the ratio of acrylamide: bisacrylamide = 29: 1) in 1 x TBE.
Соответствие молекулярных весов амплификатов оценивают с помощью маркера молекулярного веса от 100 до 1000 пар нуклеотидов фирмы «Медиген» (Новосибирск). После электрофореза ДНК-продукт окрашивают серебром или бромистым этидием.The correspondence of the molecular weights of the amplifications is assessed using a molecular weight marker from 100 to 1000 nucleotide pairs of Medigen (Novosibirsk). After electrophoresis, the DNA product is stained with silver or ethidium bromide.
Полученный ПЦР-продукт размером 349 п.н. подвергают гетеродуплексному анализу для поиска мутации. Для этого пробы ДНК от пациентов смешивают с формамидом в соотношении 1:3, денатурируют в кипящей воде в течение 5 минут, затем охлаждают пробы до комнатной температуры в течение 10 минут и проводят вертикальный электрофорез в 8% ПААГ. Визуализацию ДНК-продукта проводят путем окрашивания нитратом серебра. Соответствие молекулярных весов амплификатов оценивают с помощью маркера молекулярного веса от 100 до 1000 пар нуклеотидов фирмы «Медиген» (Новосибирск). О наличии мутации в гетерозиготном состоянии судят по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность как двунитевые фрагменты ДНК длиной 420 и 450 п.н. и отсутствующих у пациентов без мутации P369ins.The resulting PCR product of 349 bp subjected to heteroduplex analysis to search for mutations. For this, DNA samples from patients are mixed with formamide in a ratio of 1: 3, denatured in boiling water for 5 minutes, then samples are cooled to room temperature for 10 minutes and vertical electrophoresis is carried out in 8% SDS page. Visualization of the DNA product is carried out by staining with silver nitrate. The correspondence of the molecular weights of the amplifications is assessed using a molecular weight marker from 100 to 1000 nucleotide pairs of Medigen (Novosibirsk). The presence of a mutation in a heterozygous state is judged by the formation of additional bands in the gel having electrophoretic mobility as double-stranded DNA fragments 420 and 450 bp long. and absent in patients without P369ins mutation.
Сущность способа подтверждается следующими примерами.The essence of the method is confirmed by the following examples.
Пример 1. Больной И. 1981 г.р. Страдает первичной врожденной глаукомой с 1981 года, которая была обнаружена при рождении в роддоме. При проведении гониоскопии угол передней камеры закрыт мезодермальной тканью. ВГД 31 мм рт.ст. на обоих глазах. Было выполнено множество оперативных вмешательств на обоих глазах для компенсации глаукомного процесса. Величина Э/Д (экскавация диска) составила 0,9 на обоих глазах. По данным кинетической периметрии на ПРП-60 с белым объектом величиной 1,0 см и яркостью 0/0 было выявлено сужение поля зрения на правом глазу до 25° от точки фиксации с носовой, нижне-носовой, верхне-носовой и нижней сторон, сужение до 35° с нижней стороны и сужение до 50° со всех остальных сторон. Поле зрения на левом глазу невозможно было определить из-за очень низкой остроты зрения (светоощущение с неправильной светопроекцией). Передне-задний размер правого глаза 27,26 мм. Диаметр роговицы - 15 мм.Example 1. Patient I. born in 1981 Suffers from primary congenital glaucoma since 1981, which was discovered at birth in the hospital. When conducting gonioscopy, the angle of the anterior chamber is closed by mesodermal tissue. IOP 31 mmHg in both eyes. Many surgical interventions were performed on both eyes to compensate for the glaucoma process. The value of E / D (disk excavation) was 0.9 in both eyes. According to the kinetic perimetry on PRP-60 with a white object of 1.0 cm and a brightness of 0/0, a narrowing of the visual field in the right eye was revealed to 25 ° from the fixation point from the nasal, lower nasal, upper nasal and lower sides, narrowing to 35 ° from the bottom and narrowing to 50 ° from all other sides. The field of view in the left eye could not be determined due to the very low visual acuity (light perception with incorrect light projection). The anteroposterior size of the right eye is 27.26 mm. The diameter of the cornea is 15 mm.
В 2007 г. больному были проведены исследования ДНК, заключающиеся в амплификации методом ПЦР 349 пар нуклеотидов 3-го экзона гена CYP1B1 с помощью специально подобранных прямого и обратного праймеровIn 2007, the patient underwent DNA studies, which consisted in PCR amplification of 349 nucleotides of the 3rd exon of the CYP1B1 gene using specially selected forward and reverse primers
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3'и5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3'i
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3'5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3 '
при температуре отжига 60°С и проведении последующего гетеродуплексного анализа, который включает смешивание ПЦР-продукта с формамидом в отношении 1:3, денатурацию полученной пробы в кипящей воде в течение 5 мин, последующее охлаждение до комнатной температуры в течение 10 мин, электрофорез ДНК в 8% вертикальном полиакриламидном геле и визуализацию ДНК-продукта окрашиванием нитратом серебра. В результате проведенных исследований была обнаружена мутация в гетерозиготном состоянии, о наличии которой судили по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность, как у фрагментов ДНК длиной 420 и 450 п.н., и отсутствующих у пациентов без мутации P369ins (см. чертеж).at an annealing temperature of 60 ° C and subsequent heteroduplex analysis, which includes mixing the PCR product with formamide in a ratio of 1: 3, denaturing the obtained sample in boiling water for 5 minutes, then cooling to room temperature for 10 minutes, DNA electrophoresis 8% vertical polyacrylamide gel and visualization of the DNA product by silver nitrate staining. As a result of the studies, a mutation in the heterozygous state was detected, the presence of which was judged by the formation of additional bands in the gel having electrophoretic mobility, as in DNA fragments 420 and 450 bp in length, and absent in patients without P369ins mutation (see drawing )
Пример 2. Обследуемая И. является матерью пробанда. 1955 г.р. (53 года). На момент обследования клинические признаки заболевания глаукомой отсутствовали. ВГД на обоих глазах было 20 мм рт.ст. При проведении гониоскопии угол передней камеры открыт, средней ширины. Величина Э/Д (экскавация диска) составила 0,3 на обоих глазах. В полях зрения имеются небольшие отклонения неспецифического характера на правом глазу, но, учитывая большой процент ошибки при выполнении данного исследования пациенткой, нельзя опираться только на этот показатель при выставлении диагноза какого-либо глазного заболевания. При выполнении ретинальной томографии зрительного нерва на Гейдельбергском ретинальном томографе HRT III отклонений в показателях, применяемых для оценки диска зрительного нерва от среднестатистических значений, не выявлено.Example 2. Surveyed I. is the mother of a proband. Born 1955 (53 years old). At the time of the examination, there were no clinical signs of glaucoma. IOP in both eyes was 20 mmHg. When conducting gonioscopy, the angle of the anterior chamber is open, of medium width. The value of E / D (disk excavation) was 0.3 in both eyes. In the fields of vision there are small deviations of a nonspecific nature in the right eye, but, given the large percentage of errors in the patient performing this study, one cannot rely solely on this indicator when diagnosing any eye disease. When performing retinal tomography of the optic nerve on the HRT III Heidelberg retinal tomograph, deviations in the indices used to assess the optic nerve disc from the average values were not detected.
В 2007 г. обследуемой были проведены исследования ДНК, заключающиеся в амплификации методом ПЦР 349 пар нуклеотидов 3-го экзона гена CYP1B1 с помощью специально подобранных прямого и обратного праймеровIn 2007, the subject examined DNA studies, which consisted in PCR amplification of 349 nucleotides of the 3rd exon of the CYP1B1 gene using specially selected forward and reverse primers
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3' и5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3 'and
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3'5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3 '
при температуре отжига 60°С и проведении последующего гетеродуплексного анализа, который включает смешивание ПЦР-продукта с формамидом в отношении 1:3, денатурацию полученной пробы в кипящей воде в течение 5 мин, последующее охлаждение до комнатной температуры в течение 10 мин, электрофорез ДНК в 8% вертикальном полиакриламидном геле и визуализацию ДНК-продукта окрашиванием нитратом серебра. В результате проведенных исследований была обнаружена мутация в гетерозиготном состоянии, о наличии которой судили по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность, как у фрагментов ДНК длиной 420 и 450 п.н., и отсутствующих у пациентов без мутации P369ins (см. чертеж).at an annealing temperature of 60 ° C and subsequent heteroduplex analysis, which includes mixing the PCR product with formamide in a ratio of 1: 3, denaturing the obtained sample in boiling water for 5 minutes, then cooling to room temperature for 10 minutes, DNA electrophoresis 8% vertical polyacrylamide gel and visualization of the DNA product by silver nitrate staining. As a result of the studies, a mutation in the heterozygous state was detected, the presence of which was judged by the formation of additional bands in the gel having electrophoretic mobility, as in DNA fragments 420 and 450 bp in length, and absent in patients without P369ins mutation (see drawing )
Предлагаемый способ позволяет идентифицировать мутацию P369ins (с.1508ins3) в гене CYP1B1. Исследования проводились среди жителей г.Санкт-Петербурга. Способ может быть использован в научно-исследовательской практике при изучении механизмов развития ПВГ.The proposed method allows to identify the mutation P369ins (s.1508ins3) in the CYP1B1 gene. Studies were conducted among residents of St. Petersburg. The method can be used in research practice when studying the mechanisms of development of PVG.
Claims (1)
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3' и
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3',
проведении отжига и последующего гетеродуплексного анализа, который включает смешивание ПЦР-продукта с формамидом в отношении 1:3, денатурацию полученной пробы в кипящей воде, последующее охлаждение до комнатной температуры, электрофорез ДНК в 8% вертикальном полиакриламидном геле и визуализацию ДНК-продукта окрашиванием нитратом серебра; о наличии мутации в гетерозиготном состоянии судят по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность фрагментов ДНК длиной 420 и 450 п.н. и отсутствующих у пациентов без мутации P369ins. A method for detecting the P369ins mutation in the CYP1B1 gene, which consists in PCR amplification of 349 nucleotides of the 3rd exon of the CYP1B1 gene using specially selected forward and reverse primers
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3 'and
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3 ',
conducting annealing and subsequent heteroduplex analysis, which includes mixing the PCR product with formamide in a ratio of 1: 3, denaturing the obtained sample in boiling water, then cooling to room temperature, electrophoresis of DNA in an 8% vertical polyacrylamide gel and visualization of the DNA product by staining with silver nitrate ; The presence of a mutation in a heterozygous state is judged by the formation of additional bands in the gel having electrophoretic mobility of DNA fragments 420 and 450 bp in length. and absent in patients without P369ins mutation.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009123806/10A RU2404253C1 (en) | 2009-06-22 | 2009-06-22 | METHOD OF DETECTING MUTATION P369ins IN GENE CYP1B1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009123806/10A RU2404253C1 (en) | 2009-06-22 | 2009-06-22 | METHOD OF DETECTING MUTATION P369ins IN GENE CYP1B1 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2404253C1 true RU2404253C1 (en) | 2010-11-20 |
Family
ID=44058446
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009123806/10A RU2404253C1 (en) | 2009-06-22 | 2009-06-22 | METHOD OF DETECTING MUTATION P369ins IN GENE CYP1B1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2404253C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111304226A (en) * | 2019-11-21 | 2020-06-19 | 福州福瑞医学检验实验室有限公司 | Nucleic acid for coding CYP1B1 gene mutant and application thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962230A (en) * | 1997-02-13 | 1999-10-05 | The University Of Connecticut | Diagnosis and treatment of glaucoma |
| RU2365379C2 (en) * | 2003-12-17 | 2009-08-27 | Алькон, Инк. | Application of serumal amyloid gene a in diagnostics and treatment of glaucoma and determination of antiglaucoma agents |
-
2009
- 2009-06-22 RU RU2009123806/10A patent/RU2404253C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962230A (en) * | 1997-02-13 | 1999-10-05 | The University Of Connecticut | Diagnosis and treatment of glaucoma |
| RU2365379C2 (en) * | 2003-12-17 | 2009-08-27 | Алькон, Инк. | Application of serumal amyloid gene a in diagnostics and treatment of glaucoma and determination of antiglaucoma agents |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KAKIUCHI-MATSUMOTO ЕТ AL., Am. J. Ophthalmol., 2001, 131(3), 345-350. * |
| MARKOFF A. ЕТ AL., ClinicalChemistry, 1997, 43(1), 30-35. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111304226A (en) * | 2019-11-21 | 2020-06-19 | 福州福瑞医学检验实验室有限公司 | Nucleic acid for coding CYP1B1 gene mutant and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Brancati et al. | A locus for autosomal dominant keratoconus maps to human chromosome 3p14–q13 | |
| KR101729340B1 (en) | Method of identifying disease risk factors | |
| Hansen et al. | Genetic heterogeneity in microcornea-cataract: five novel mutations in CRYAA, CRYGD, and GJA8 | |
| Stockton et al. | A novel locus for Leber congenital amaurosis on chromosome 14q24 | |
| Nemesure et al. | A genome-wide scan for primary open-angle glaucoma (POAG): the Barbados Family Study of Open-Angle Glaucoma | |
| Sullivan et al. | Genomic rearrangements of the PRPF31 gene account for 2.5% of autosomal dominant retinitis pigmentosa | |
| Wissinger et al. | Cone dystrophy with supernormal rod response is strictly associated with mutations in KCNV2 | |
| Lowe et al. | Linkage mapping of the primary disease locus for collie eye anomaly☆ | |
| Gould et al. | Genetic evaluation of candidate genes for the Mom1 modifier of intestinal neoplasia in mice | |
| Schuetz et al. | Implication of complex vertebral malformation and bovine leukocyte adhesion deficiency DNA-based testing on disease frequency in the Holstein population | |
| CN102251045B (en) | Screening kit for detecting high myopia | |
| Kim et al. | Association of β2-adrenoreceptor polymorphisms with nocturnal cough among atopic subjects but not with atopy and nonspecific bronchial hyperresponsiveness | |
| Ramprasad et al. | Truncating mutation in the NHS gene: phenotypic heterogeneity of Nance-Horan syndrome in an asian Indian family | |
| RU2404253C1 (en) | METHOD OF DETECTING MUTATION P369ins IN GENE CYP1B1 | |
| Yang et al. | A novel mutation in the RDS/Peripherin gene causes adult-onset foveomacular dystrophy | |
| Kniazeva et al. | A new locus for dominant drusen and macular degeneration maps to chromosome 6q14 | |
| Wang et al. | Autosomal-dominant cerulean cataract in a chinese family associated with gene conversion mutation in beta-B2-crystallin | |
| CN110184275B (en) | NF1 new mutation pathogenic gene, application and kit | |
| González-Huerta et al. | A CRYGC gene mutation associated with autosomal dominant pulverulent cataract | |
| WO2017214471A1 (en) | Methods for detecting structural variants in neurodegenerative disease | |
| Crandall et al. | Bb2Bb3 regulation of murine Lyme arthritis is distinct from Ncf1 and independent of the phagocyte nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase | |
| Barragan et al. | Mutation screening of three candidate genes, ELOVL5, SMAP1 and GLULD1 in autosomal recessive retinitis pigmentosa | |
| Poloschek et al. | Syndromic choroideremia: sublocalization of phenotypes associated with Martin-Probst deafness mental retardation syndrome | |
| Singh et al. | Homozygous null mutations in the ABCA4 gene in two families with autosomal recessive retinal dystrophy | |
| Houshmand et al. | Identification of a new human mtDNA polymorphism (A14290G) in the NADH dehydrogenase subunit 6 gene |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110623 |