[go: up one dir, main page]

RU2495881C2 - Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера - Google Patents

Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера Download PDF

Info

Publication number
RU2495881C2
RU2495881C2 RU2011142332/04A RU2011142332A RU2495881C2 RU 2495881 C2 RU2495881 C2 RU 2495881C2 RU 2011142332/04 A RU2011142332/04 A RU 2011142332/04A RU 2011142332 A RU2011142332 A RU 2011142332A RU 2495881 C2 RU2495881 C2 RU 2495881C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
peptide
conjugate
physiologically active
peg
active polypeptide
Prior art date
Application number
RU2011142332/04A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011142332A (ru
Inventor
Дае Хае СОНГ
Дзае Хи ШИН
Дзае Мин ЛИ
Янг Киунг ПАРК
Се Чанг КВОН
Гван Сун ЛИ
Original Assignee
Ханми Холдингс Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ханми Холдингс Ко., Лтд. filed Critical Ханми Холдингс Ко., Лтд.
Publication of RU2011142332A publication Critical patent/RU2011142332A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2495881C2 publication Critical patent/RU2495881C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение предоставляет способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера посредством регулирования рН и содержания спирта реакционной среды. Способ предназначен для предотвращения образования побочных конъюгатов, в которых непептидильный полимер связывается с физиологически важным аминокислотным остатком. 14 з.п. ф-лы, 36 ил., 2 табл., 25 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способу получения сайт-специфического физиологически активного полипептидного конъюгата, более конкретно - к способу получения указанного конъюгата с высоким выходом посредством связывания физиологически активного полипептида с непептидильным полимером.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пептиды легко денатурируются вследствие своей низкой стабильности, in vivo деградации протеазами и экскреции через почки вследствие своего относительно малого размера. В связи с этим, для того, чтобы поддерживать специфическую концентрацию в крови пептидного лекарственного средства в его активной форме необходимо часто вводить пептидное лекарственное средство пациенту. Однако пептидные лекарственные средства обычно вводятся в форме инъецируемых препаратов, и такое частое введение вызывает тяжелый дискомфорт у пациентов. Для решения этой проблемы был разработан ряд способов, например, способ переноса пептидного лекарственного средства посредством ротоглоточной или носоглоточной ингаляции путем увеличения проникновения пептидного лекарственного средства через биологические мембраны, способ модификации специфической аминокислотной последовательности, которая чувствительна к протеазам (например, аминокислотная последовательность GLP-1 для предотвращения утраты титров посредством дипептидил пептидазы), для того, чтобы стабилизировать пептид посредством ингибирования деградации ферментом, и способ химического присоединения непептидильного полимера с высокой растворимостью, такого как полиэтиленгликоль (PEG) к поверхности пептида.
PEG, который был использован как один из непептидильных полимеров, не специфически связывается со специфическим сайтом или множеством сайтов целевого полипептида для приобретения эффекта увеличения молекулярной массы пептида, полученный PEG-пептид препятствует выведению через почки и ферментативному гидролизу без каких-либо побочных эффектов. Например, в Международной Патентной Публикации № WO 2006/076471 описывается поддержание физиологической активности натрийуретического пептида B-типа (BNP), используемого как терапевтический агент при застойной сердечной недостаточности посредством связывания с ним PEG, и в Патенте США №6924264 описывается увеличение in vivo времени удержания лекарственного средства эксендина-4 путем связывания PEG с его лизиновым остатком.
Эти способы удлиняют in vivo время удержания пептидного лекарственного средства посредством увеличения молекулярной массы PEG, но по мере того, как молекулярная масса увеличивается, титр пептидного лекарственного средства значительно снижается. В дополнение не специфическое связывание PEG может защищать активный домен физиологически активного полипептида от значительного снижения активности полипептида.
Поэтому существует необходимость в разработке улучшенного способа получения конъюгата физиологически активного полипептида и непептидильного полимера, в котором полимер связан с пептидом сайт-специфическим образом, который не влияет на полипептидную активность.
Авторы настоящего изобретения разработали изобретение посредством подтверждения того, что физиологически активный полипептидный конъюгат, содержащий сайт-специфически связанный непептидильный полимер, может быть получен с высоким выходом посредством регулирования pH и содержания спирта реакционной среды.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В связи с этим целью настоящего изобретения является предоставление высокопродуктивного способа получения физиологически активного полипептидного конъюгата, в котором непептидильный полимер сайт-специфически связывается с физиологически активным полипептидом.
В соответствии с одним аспектом по настоящему изобретению предоставляется способ получения сайт-специфического физиологически активного полипептидного конъюгата, включающий стадии: i) проведения реакции физиологически активного полипептида и непептидильного полимера в реакционной среде, которая содержит специфическое количество спирта и имеет специфический pH, дающие возможность непептидильному полимеру связываться с целевым сайтом физиологически активного полипептида; и ii) выделения и очистки физиологически активного полипептидного конъюгата из реакционной смеси стадии (i) посредством ионообменной хроматографии с использованием спирта.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Вышеуказанные и другие цели и признаки настоящего изобретения станут очевидными из следующего описания изобретения, которое представлено в связи с прилагаемыми чертежами, которые соответственно показывают:
Фиг.1: профиль очистки позиционных изомеров DA-эксендин-4-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.2: профиль очистки позиционных изомеров CA-эксендин-4-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.3: график, показывающий Lys27-пегилированные изомеры, полученные, когда CA-эксендин-4 пегилируется при варьирующем pH;
Фиг.4: график, показывающий Lys27-пегилированные изомеры, полученные, когда CA-эксендин-4 пегилируется при варьирующем pH и в 45% EtOH;
Фиг.5: график, показывающий Lys27-пегилированные изомеры, полученные, когда CA-эксендин-4 пегилируется при pH 7,5 и в варьирующем количестве (%) этанола;
Фиг.6: график, показывающий Lys27-пегилированные изомеры, полученные, когда CA-эксендин-4 пегилируется при pH 7,5 и в варьирующем количестве (%) изопропанола;
Фиг.7: анализ SDS-PAGE [электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия] CA-эксендин-4-PEG-Fc иммуноглобулин;
Фиг.8: анализ SDS-PAGE CA-эксендин-PEG Lys12 и Lys27;
Фиг.9: анализ профиля Lys12-пегилированных изомеров CA-эксендин-4 посредством пептидного картирования;
Фиг.10: анализ профиля Lys27-пегилированных изомеров CA-эксендин-4 посредством пептидного картирования;
Фиг.11: профиль очистки позиционных изомеров оксинтомодулин-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.12: профиль очистки позиционных изомеров имидазоацетил оксинтомодулин-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.13: анализ профиля Lys30-пегилированных изомеров оксинтомодулина посредством пептидного картирования;
Фиг.14: профиль очистки конъюгата имидазоацетил оксинтомодулин-PEG и Fc иммуноглобулина с использованием колонки SOURCE Q;
Фиг.15: анализ SDS-PAGE конъюгата имидазоацетил оксинтомодулин-PEG и Fc иммуноглобулина;
Фиг.16: профиль очистки позиционных изомеров аналога оксинтомодулина-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.17: анализ профиля Lys27-пегилированных изомеров аналога оксинтомодулина посредством пептидного картирования;
Фиг.18: профиль очистки позиционных изомеров аналога имидазоацетил оксинтомодулин-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.19: анализ профиля Lys27-пегилированных изомеров аналога имидазоацетил оксинтомодулина посредством пептидного картирования;
Фиг.20: профиль очистки конъюгата аналога имидазоацетил оксинтомодулин-PEG и Fc иммуноглобулина с использованием колонки SOURCE Q;
Фиг.21: анализ SDS-PAGE конъюгата аналога имидазоацетил оксинтомодулин-PEG и Fc иммуноглобулина;
Фиг.22: профиль очистки позиционных изомеров GLP-1-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.23: анализ профиля Lys34-пегилированных изомеров GLP-1 посредством пептидного картирования;
Фиг.24: профиль очистки позиционных изомеров имидазоацетил GLP-1-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.25: анализ профиля Lys34-пегилированных изомеров имидазоацетил GLP-1 посредством пептидного картирования;
Фиг.26: профиль очистки конъюгата имидазоацетил GLP-1-PEG и Fc иммуноглобулина с использованием колонки SOURCE Phe;
Фиг.27: анализ SDS-PAGE конъюгата имидазоацетил GLP-1-PEG и Fc иммуноглобулина;
Фиг.28: профиль очистки позиционных изомеров GLP-2-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.29: анализ профиля Lys30-пегилированных изомеров GLP-2 посредством пептидного картирования;
Фиг.30: профиль очистки позиционных изомеров имидазоацетил GLP-2-PEG с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.31: профиль очистки конъюгата имидазоацетил GLP-2-PEG и Fc иммуноглобулина с использованием колонки SOURCE Phe;
Фиг.32: анализ SDS-PAGE конъюгата имидазоацетил GLP-2-PEG и Fc иммуноглобулина;
Фиг.33: профиль очистки позиционных изомеров человеческого инсулин-PEG (B1F) с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.34: профиль очистки позиционных изомеров человеческого инсулин-PEG (A1G) с использованием колонки SOURCE S;
Фиг.35: профиль очистки позиционных изомеров человеческого инсулин-PEG (B29K) с использованием колонки SOURCE S; и
Фиг.36: анализ профиля A1G-, B1F- или B29K-пегилированных изомеров человеческого инсулина человека посредством пептидного картирования.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В дальнейшем настоящее изобретение описывается подробно.
Настоящее изобретение предоставляет способ получения сайт-специфического физиологически активного полипептидного конъюгата, включающий стадии:
i) обработки физиологически активного полипептида непептидильным полимером в реакционной среде, которая содержит специфическое количество спирта и имеет специфический pH, дающие возможность связыванию непептидильного полимера с целевым сайтом физиологически активного полипептида; и
ii) выделения и очистки физиологически активного полипептидного конъюгата из реакционной смеси стадии (i) посредством ионообменной хроматографии с использованием спирта.
Физиологически активный полипептидный конъюгат в соответствии с настоящим изобретением относится к веществу, в котором физиологически активный полипептид и конец непептидильного полимера ковалентно связаны друг с другом, и настоящее изобретение отличается связыванием полипептида с полимером при специфических условиях и выделением полученного полипептидного конъюгата, содержащего полимер, связанный с его целевым сайтом.
Термин «физиологически активный полипептид или пептид», как использовано в данном описании, относится к пептиду, который может проявлять физиологическую активность in vivo, например, может быть выбран из группы, состоящей из инсулинотропного пептида, фактора крови, пищеварительного гормона, адренокортикотропного гормона, гормона щитовидной железы, кишечного гормона, цитокина, фермента, фактора роста, нейропептида, гипофизеотропного гормона, гипофизиотропного гормона, пептида против ожирения, противовирусного пептида и неприродных пептидных производных, сохраняющих физиологически активное свойство, но не ограничиваясь ими. Более конкретно- физиологически активный полипептид или пептид выбран из группы, состоящей из эритропоэтина, GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов), амилина, глюкагона, инсулина, соматостатина, PYY (пептид YY), NPY (нейропептид Y), GLP-1, GLP-2, эксендина-4, оксинтомодулина, грелина, ангиотензина, брадикинина, кальцитонина, кортикотропина, эледоисина, гастрина, лептина, окситоцина, вазопрессина, LH (лютеинизирующий гормон), пролактина, FSH (фолликулостимулирующий гормон), PTH (паратиреоидный гормон, [гормон паращитовидных желез]), секретина, серморелина, hGH (гормон роста человека), высвобождающего гормон роста пептида, G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), интерферонов, интерлейкинов, высвобождающего пролактин пептида, орексина, пептида тиролиберина, холецистокинина, ингибирующего гастрин пептида, кальмодулина, высвобождающего гастрин пептида, мотилина, вазоактивного кишечного пептида, ANP (предсердный натрийуретический пептид), BNP (натрийуретический пептид головного мозга), CNP (натрийуретический пептид C-типа), нейрокинина A, нейромедина, ренина, эндотелина, пептида сарафотоксина, пептида карсоморфина, дерморфина, динорфина, эндорфина, энкефалина, T-клеточного фактора, фактора некроза опухоли, рецептора фактора некроза опухоли, урокиназного рецептора, опухоль ингибирующего фактора, коллагеназного ингибитора, тимопоэтина, тимулина, тимопентина, тимозина, гуморального фактора тимуса, адреномодуллина, аллатостатина, фрагмента белка бета-амилоида, противомикробного пептида, антиоксидантного пептида, бомбезина, остеокальцина, CART пептида, E-селектина, ICAM-1, VCAM-1, лейкокина, [белка с доменом] kringle-5, ламинина, ингибина, галанина, фибронектина, панкреастатина и фузеона. В дополнение, физиологически активный полипептид включает предшественник, производное, фрагмент или его вариант.
Предпочтительный физиологически активный полипептид, используемый в настоящем изобретении, представляет собой эксендин, инсулин, GLP-1, GLP-2, оксинтомодулин, грелин, ангиотензин, брадикинин, кальцитонин или его производное. Его производное может быть получено, например, посредством химического замещения (например, альфа-метилирование или альфа-гидроксилирование), делеции (например, дезаминирование или углеродная делеция) или модификации (например, N-метилирование) любых групп на аминокислотном остатке, и конкретнее - получение производного эксендина описано подробно в Патентной заявке Кореи №2008-69234.
При этом термин «непептидильный полимер», как использовано в данном описании, относится к биосовместимому полимеру, включающему две или более повторяющихся единиц, связанных друг с другом ковалентной связью, исключая пептидную связь.
Непептидильный полимер, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из: полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и полипропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биодеградируемых полимеров, таких как PLA (поли(молочная кислота)) и PLGA (полимолочная-гликолевая кислота), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций, и предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль. Его производное, которое известно в данной области или которое легко получить специалисту в данной области, также включается в объем настоящего изобретения. Непептидильный полимер, который может быть использован в настоящем изобретении, служит для увеличения молекулярной массы физиологически активного полипептида с предотвращением выведения конъюгата через почки. Любой непептидильный полимер, если он резистентен к in vivo протеазе, может быть использован без какого-либо ограничения. Молекулярная масса непептидильного полимера может находиться в диапазоне от 0,5 до 100 кД, предпочтительно от 0,5 до 20 кД и приемлемое молярное отношение физиологически активного полипептида и непептидильного полимера может быть выбрано в диапазоне от 1:1 до 1:50.
Непептидильный полимер, использованный в настоящем изобретении, содержит реакционноспособную группу на одном конце или на обоих концах. В случае, если непептидильный полимер содержит реакционноспособную группу на обоих концах, он может связываться с физиологически активным носителем и белковым лекарственным средством, которые способствуют функционированию в качестве длительно действующего состава.
Реакционноспособная группа на одном конце или на обоих концах непептидильного полимера предпочтительно выбирается из группы, состоящей из реакционноспособной альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидной группы. Примеры сукцинимидной группы включают сукцинимидил пропионат, сукцинимидил бутаноат, гидрокси сукцинимидил, сукцинимидил карбоксиметил или сукцинимидил карбонат. В частности, когда непептидильный полимер содержит реакционноспособную альдегидную группу или реакционноспособную сукцинимидильную группу на одном конце, он является эффективным при связывании на обоих концах с физиологически активным полипептидом и иммуноглобулином с минимальными неспецифическими реакциями. Альдегидная реакционноспособная группа селективно связывается с N-концом при низком pH и может связываться с лизиновым остатком с образованием аминной связи при высоком pH, таком как pH 9,0. В добавление сукцинимидильная реакционноспособная группа может образовывать стабильную амидную связь с N-концом или лизиновым остатком при pH 7,0~9,0.
Далее реакционноспособные группы на обоих концах непептидильного полимера могут быть одинаковыми или различными. В случае, если полиэтиленгликоль, содержащий реакционноспособную гидроксильную группу на своих обоих концах, используется как непептидильный полимер, гидроксильная группа может быть активирована в различные реакционноспособные группы посредством известных химических реакций, или может быть использован коммерчески пригодный полиэтиленгликоль, содержащий модифицированную реакционноспособную группу.
Стадия (i) настоящего изобретения состоит в получении физиологически активного полипептидного конъюгата посредством сайт-специфического связывания непептидильного полимера с физиологически активным полипептидом в приемлемой реакционной среде.
Термин «сайт-специфический» или «сайт-специфически», как использовано в данном описании, относится к связыванию непептидильного полимера со специфическим целевым аминокислотным сайтом физиологически активного полипептида, предпочтительно амином лизинового остатка или N-концом. Сайт-специфическое связывание или связь может предотвращать образование побочных конъюгатов, в которых непептидильный полимер связывается с физиологически важным аминокислотным остатком. Например, когда непептидильный полимер связывается с N-концом эксендина-4, in vitro активность эксендина-4 снижается, но когда непептидильный полимер связывается с лизиновым остатком, in vitro активность сохраняется. В частности, когда непептидильный полимер связывается с 27-м лизиновым остатком скорее, чем с 12-м лизиновым остатком, наблюдалась значительно более высокая in vitro активность (см. пример 10 и таблицу 2).
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что присутствие спирта в реакционной среде и pH реакций среды на стадии (i) являются критическими факторами сайт-специфической связи непептидильного полимера и физиологически активного полипептида. Соответственно на стадии (i) настоящего изобретения непептидильный полимер связывается со специфическим сайтом физиологически активного полипептида с использованием реакционной среды, содержащей специфическое содержание спирта и имеющей специфический pH.
В специфическом варианте осуществления настоящего изобретения отношение специфического позиционного изомера полипептидного конъюгата может варьироваться на основе pH реакционной среды или на основе концентрации (%) спирта при таком же pH. Поэтому возможно связывание непептидильного полимера с желательной аминокислотой физиологически активного полипептида сайт-специфическим образом.
То есть стадия (i) настоящего изобретения выполняется при специфическом pH, давая возможность непептидильному полимеру связываться с желательным (или целевым) сайтом, то есть эта доза не влияет на полипептидную активность. Диапазон pH может зависеть от типов физиологически активного полипептида. Например, в случае инсулинотропного пептида (например, эксендин-4) изомер, в котором полимер связан с 12-м лизином, в высокой степени наблюдался при низком pH реакционной среды, тогда как изомер, в котором полимер связан с 27-м лизином, который не влияет на инсулинотропную активность, в высокой степени наблюдался при высоком pH реакционной среды. (см. пример 3 и фиг.3). Соответственно стадия (i) предпочтительно выполняется при pH от 7,5 до 9,0, так что непептидильный полимер селективно связывается с 27-м лизином.
Далее стадия (i) настоящего изобретения выполняется в реакционной среде, содержащей спирт, с тем, чтобы непептидильный полимер мог связываться с сайтом, который не влияет на полипептидную активность. Примеры спирта включают первичный, вторичный и третичный спирт, предпочтительно спирт, содержащий число атомов углерода от одного до десяти, более предпочтительно- этанол или изопропанол. В случае инсулинотропного пептида (например, эксендин-4) спирт может находиться в реакционной среде в количестве, изменяющемся от 0,1% до 100% по объему, предпочтительно от 25% до 90%, более предпочтительно от 35% до 60% на основе общего объема реакционной среды, для того, чтобы дать возможность непептидильному полимеру связываться с 27-м лизином, который не влияет на инсулинотропную активность.
В варианте настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой эксендин-4 или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Lys27. В другом варианте настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой кальцитонин, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 4,0 до 6,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с N-концом. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой оксинтомодулин или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Lys27 или Lys30. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения когда физиологически активный полипептид представляет собой инсулин человека или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 4,0 до 6,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Phe1 (1-й фенилаланин) N-конца в B цепи. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой инсулин человека или его производное, pH применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Gly1 (1-й глицин) N-конца в A цепи или с Lys29 (29-й лизин) в B цепи. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой GLP-1 или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Lys34. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой GLP-2 или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Lys30.
Соответственно предпочтительный сайт-специфический физиологически активный полипептидный конъюгат представляет собой конъюгат эксендина-4, в котором PEG связан с Lys27, конъюгат кальцитонина, в котором PEG связан с N-концом, конъюгат оксинтомодулина или его аналога, в котором PEG связан с Lys27 или Lys30, конъюгат инсулина человека или его аналога, в котором PEG связан с Phe1 N-конца в B цепи, Gly1 N-конца в A цепи или с Lys29 в B цепи, или конъюгат GLP-1 или GLP-2, в котором PEG связан с Lys34 или Lys30.
В предпочтительном аспекте настоящего изобретения пептидное производное (или аналог) могут быть использованы для облегчения сайт-специфической связи между непептидильным полимером и физиологически активным полипептидом. Производное представляет собой пептид, содержащий любой из других не целевых аминокислотных сайтов, делетированных или защищенных для того, чтобы предотвратить нежелательное связывание. Например, в случае инсулинотропного пептида, такого как эксендин, могут быть использованы различные производные эксендина, такие как Des-аминогистидил (DA)-эксендин-4 формулы (I), Бета-гидроксиимидазопропионил(HY)-эксендин-4 формулы (II), Имидазоацетил(CA)-эксендин-4 формулы (III) и Диметил-гистидил(DM)-эксендин-4 формулы (IV), которые получены с использованием способов, в которых альфа аминогруппа N-концевой аминокислоты гистидина делетирована, N-концевая аминогруппа замещена гидроксильной группой, N-концевая альфа аминогруппа гистидина модифицирована с использованием двух метильных групп или альфа углерод N-концевого гистидина и аминогруппа, связанная с ним, делетированы для удаления имидазоацетильной группы, но не ограничиваясь ими. Структуры таких примерных эксендиновых производных и способы их получения описаны в Корейской нерассмотренной патентной публикации №2009-0008151, которая включена в объем настоящего изобретения посредством ссылок.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Аналогично оксинтомодулин, GLP-1 и GLP-2, содержащие гистидин как 1-ю аминокислоту, могут быть также использованы как производное, имеющее любую структуру, выбранную из формул (I)-(IV).
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения авторы настоящего изобретения исследовали эффекты pH и содержания спирта (%) реакционной среды на аспект сайт-специфического связывания непептидильного полимера и подтвердили, что отношение конъюгатов инсулинотропного пептида, содержащих полимер, связанный с 12-м лизином/27-м лизином, варьируется в зависимости от изменения pH и количества этанола или изопропанола, в частности. В частности, более предпочтительный изомер, содержащий непептидильный полимер, связанный с 27-м лизиновым остатком, преимущественно получали, когда от 35% до 55%, предпочтительно примерно 45% этанола или изопропанола используется при pH 7,5.
После увеличения отношения желательный непептидильный полимер-физиологически активный полипептидный конъюгат посредством регулирования специфического pH и содержания спирта на стадии (i), желательный конъюгат может быть выделен и очищен посредством ионообменной хроматографии с использованием спирта на стадии (ii).
Спирт, используемый на стадии (ii), присутствует в очищенном растворе и его специфические примеры такие же, как определены на стадии (i). Однако спирт стадии (i) применяется для цели увеличения полипептидной реакционной способности и сайт-специфичности посредством модификации его вторичной или третичной структуры, тогда как спирт стадии (ii) применяется с целью облегчения высокопроизводительного выделения и очистки сайт-специфического физиологически активного полипептидного конъюгата посредством снижения неспецифической связи между ионообменной колонкой и конъюгатом. Выделение и очистка могут быть выполнены посредством использования различных методов, известных специалисту в данной области, предпочтительно посредством ионообменной хроматографии, более предпочтительно- посредством ионообменной хроматографии при высоком давлении.
При этом для облегчения выделения и очистки позиционного изомера ионообменная хроматография может быть выполнена при специфическом pH. pH приемлемо регулировался для увеличения сайт-специфичности конъюгата на стадии (i), тогда как повторно регулировался для связывания конъюгата и удаления его из ионообменной колонки в очищающем растворе, содержащем спирт стадии (ii). Приемлемый pH, применяемый на стадии (ii), может находиться в диапазоне от примерно 2,0 до примерно 6,0.
Кроме того, физиологически активный полипептид по настоящему изобретению может быть далее связан с физиологически активным носителем. В этом случае непептидильный полимер должен представлять собой непептидильный полимер с обоими концами, для того, чтобы связываться с физиологически активным носителем. То есть физиологический активный носитель ковалентно связывается с концом непептидильного полимера, который не ковалентно связан с физиологически активным полипептидом, и, таким образом, может быть получен конъюгат, в котором оба конца непептидильного полимера связаны с физиологически активным полипептидом и физиологически активным носителем.
Как описано выше, физиологически активный полипептидный конъюгат, полученный на стадии (ii), может далее связываться с физиологически активным носителем, и полученный в результате конъюгат полипептид-полимер-носитель проявляет совершенно различные свойства по сравнению с конъюгатом полипептид-полимер, т.е. выдающиеся физиологические свойства, такие как превосходное пролонгированное действие фармакологических эффектов физиологически активного полипептида, нацеленного на специфическую область, такую как повреждение, для лечения или индукции некроза.
Термин «физиологически активный носитель», как использован в данном описании, относится к физиологически активному веществу, проявляющему дополнительные свойства, отличающиеся от природной физиологической активности полипептида, которые могут поддерживать физиологическую активность полипептида, такую как фармакологические эффекты или индукция нацеливания на специфическую область или [область] некроза посредством связывания с непептидильным полипептидом совместно с физиологически активным полипептидом.
Физиологически активный носитель, используемый в настоящем изобретении, включает вещество, имеющее вышеупомянутые свойства без любого ограничения, например, альбумин, Fc область иммуноглобулина, трансферрин, аптамер, токсин, коллаген, декстран, полисахариды, жирные кислоты, фибриноген и подобное. Предпочтительно физиологически активный носитель может быть выбран из альбумина, Fc области иммуноглобулина и трансферрина, более предпочтительно Fc области иммуноглобулина.
Fc область иммуноглобулина по настоящему изобретению относится к константной области 2 тяжелой цепи (CH2) и константной области 3 тяжелой цепи (CH3) иммуноглобулина, исключая вариабельные области тяжелой и легкой цепей, константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и константную область 1 легкой цепи (CL1). Она может далее включать шарнирную область константной области тяжелой цепи. Также Fc область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой удлиненную форму, содержащую часть или всю Fc область, включающую константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и/или константную область 1 легкой цепи (CL1), за исключением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей до тех пор, пока она проявляет физиологическую функцию, существенно сходную или более лучшую, чем [физиологическая функция] природной Fc [области] иммуноглобулина, и может включать области Fc иммуноглобулина, модифицированные посредством фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и подобное. Область Fc иммуноглобулина, способ ее получения и способ ковалентного связывания Fc иммуноглобулина с конъюгатом- непептидильный полимер-физиологически активный полипептид раскрыты в Корейском патенте №№775343, 725314, 725315 и 824505, которые включены в объем настоящего изобретения посредством ссылок.
В соответствии со способом по настоящему изобретению желательный полипептидный конъюгат, имеющий превосходную физиологическую активность, может быть получен с высоким выходом посредством сайт-специфического связывания непептидильного полимера со специфической аминокислотой физиологически активного полипептида, который минимизирует образование дополнительных конъюгатов.
Следующие примеры предназначены для дальнейшей иллюстрации настоящего изобретения без ограничения его объема.
Пример 1: Получение и выделение конъюгата пегилированный DA-эксендин-4 (Lys27)
<1-1> Получение конъюгата пегилированный DA-эксендин-4 (Lys27)
Для того чтобы получить пегилированный пептидный конъюгат посредством ковалентного связывания Lys в пептиде с PEG des-амино-гистидил-эксендин-4 (DA-эксендин-4, AP, США) и 3.4K PropionALD(2) PEG (PEG, имеющий две пропиональдегидные группы, IDB Inc., Корея) подвергали реакции при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES буфер (pH 7,5), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды, и 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент добавляли в нее.
<1-2> Выделение позиционного изомера
Моно-пегилированный пептид сначала очищали из реакционной смеси примера <1-1> посредством использования SOURCE Q ионообменной хроматографии (XK 16 мл, GE healthcare, Корея) при следующих условиях, и позиционные изомеры выделяли посредством использования SOURCE S ионообменной хроматографии (XK 16 мл GE healthcare, Корея) при следующих условиях. В этом процессе этанол использовали для облегчения выделения изомеров посредством включения его в очищающий раствор. Пегилированные сайты подтверждали по элюированным пикам посредством метода пептидного картирования.
Колонка: SOURCE Q
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис, pH 8,5) и B (A+0,5М NaCl); градиент A 0→40%, 80 мин
Колонка:SOURCE S
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ лимонная кислота, pH 3,0+45% этанол) и B (A+45% этанол+0,5М KCl); градиент A 0→100%, 45 мин
Из анализа профиля очистки позиционных изомеров обнаружили, что пик Lys12-пегилированный DA-эксендин-4 элюировался раньше, и затем Lys27-пегилированный пик элюировался в последней порции (фиг.1).
Пример 2: Получение и выделение конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27)
Процедуру примера 1 повторяли за исключением использования имидазоацетил-эксендин-4 (CA-эксендин-4, Bachem, США) вместо DA-эксендина-4 в примере 1 с получением конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27). Из анализа профиля очистки позиционных изомеров обнаружили, что пик Lys12-пегилированного CA-эксендин-4 элюировался раньше, и затем Lys27-пегилированного пик элюировался с последней порцией (фиг.2).
Пример 3: Изменение в отношении конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27) в соответствии с pH реакционной среды
Для исследования изменения в отношении полипептида, пегилированного в специфическом сайте посредством pH, CA-эксендин-4 и 3.4K PropionALD(2) PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ лимонной кислоты (pH 3,0), 100 мМ NaOAc (pH 4,5), 100 мМ Na-P (pH 7,5), 100 мМ Na-P (pH 8,5), 100 мМ HEPES (pH 8,0) и 100 мМ Na-бората (pH 9,2) буферы использовали в качестве реакционной среды соответственно и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. Каждую реакционную смесь очищали посредством метода, описанного в примере 1, с последующим анализом отношения Lys27-пегилированного конъюгата. Как показано на фиг.3, отношение Lys27-пегилированного конъюгата увеличивалось на основе увеличения pH и подтвердили, что оптимальный pH составляет от 7,0 до 10,0.
Пример 4: Изменение в отношении конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27) в соответствии с pH реакционной среды, содержащей этанол
Для исследования изменения в отношении полипептида, пегилированного в специфическом сайте посредством этанола и pH, CA-эксендин-4 и 3.4K PropionALD(2) PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ лимонной кислоты (pH 3,0)/45% этанол, 100 мМ NaOAc (pH 4,5)/45% этанол, 100 мМ Na-P (pH 7,5)/45% этанол, 100 мМ HEPES (pH 8,0)/45% этанол и 100 мМ Na-P (pH 8,5)/45% этанол буферы использовали в качестве реакционной среды, соответственно, и 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент добавляли к ней. Каждую реакционную смесь очищали посредством метода, описанного в примере 1, с последующим анализом отношения Lys27-пегилированного конъюгата. Как показано на фиг.4, отношение Lys27-пегилированного конъюгата увеличивалось на основе увеличения pH в 45% EtOH-содержащей реакционной среде и подтвердили, что оптимальный pH составляет от 7,0 до 9,0.
Пример 5: Изменение в отношении конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27) в соответствии с концентрацией этанола в реакционной среде
Для исследования изменения в отношении полипептида, пегилированного в специфическом сайте посредством концентрации этанола в реакционной среде, CA-эксендин-4 и 3.4K PropionALD(2) PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5)/0% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/25% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/35% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/45% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/55% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/75% этанол и 100 мМ HEPES (pH 7,5)/90% этанол буферы использовали в реакционной среде, соответственно, и 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент добавляли в нее. Каждую реакционную смесь очищали посредством метода, описанного в примере 1, с последующим анализом отношения Lys27-пегилированного конъюгата. Как показано на фиг.5, отношение Lys27-пегилированного конъюгата увеличивалось до тех пор, пока количество этанола достигало примерно 50%, в то время как снижалось при более чем 50% этанола и подтвердили, что оптимальное количество этанола составляет от 35% до 60%.
Пример 6: Изменение в отношении конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27) в соответствии с концентрацией изопропанола в реакционной среде
Для исследования изменения в отношении полипептида, пегилированного в специфическом сайте посредством использования изопропанола вместо этанола в реакционной среде, CA-эксендин-4 и 3.4K PropionALD(2) PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5)/0% изопропанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/30% изопропанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/45% изопропанол и 100 мМ HEPES (pH 7,5)/60% изопропанол буферы использовали в качестве реакционной среды, соответственно, и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. Каждую реакционную смесь очищали посредством метода, описанного в примере 1, с последующим анализом отношения Lys27-пегилированного конъюгата. Как показано на фиг.6, отношение Lys27-пегилированного конъюгата увеличивалось до тех пор, пока количество изопропанола достигало примерно 50%, в то время как снижалось при более чем 50% изопропанола и подтвердили, что оптимальное количество изопропанола составляет от 35% до 60%.
Пример 7: Получение конъюгата CA-эксендин-4 (Lys27)-PEG и Fc иммуноглобулина
Конъюгат CA-эксендин-4 (Lys27)-PEG сочетали с фрагментом Fc иммуноглобулина (Hanmi Pharm. Co. Ltd., Корея) посредством реакции конъюгата и фрагмента при 4°C в течение 16 часов в молярном отношении 1:8 с пептидной концентрацией 20 мг/мл. В это время 100 мМ K-P буфер (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. После реакции сочетания двустадийную очистку выполняли с использованием колонок SOURCE phe и SOURCE Q при следующих условиях.
Колонка: SOURCE Phe (XK 16 мл, GE healthcare)
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис, pH 7,5) и B (A+1,5М NaCl); градиент A 0→40%, 80 мин
Колонка SOURCE Q (XK 16 мл, GE healthcare )
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис, pH 7,5) и B (A+1М NaCl); градиент A 0→40%, 80 мин
Конъюгат, полученный ранее, анализировали с использованием SDS-PAGE. Как показано на фиг.7, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях, тогда как две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.
Пример 8: Идентификация пегилированного сайта конъюгата CA-эксендин-4 (Lys27)-PEG
Для идентификации сайта связывания PEG с CA-эксендин-4 конъюгаты CA-эксендин-4(Lys27)-PEG переваривали протеазным ферментом лизином-C и анализировали с использованием обращенной хроматографии.
В частности, изомеры CA-эксендин-4-PEG анализировали посредством SDS-PAGE (фиг.8) и затем очищенный конъюгат CA-эксендин-4-PEG и CA-эксендин-4 растворяли в буфере триэтиламин-соляная кислота (10 мМ/л; pH 7,5), 10 мкл фермента (0,1 мг/мл) добавляли к нему и проводили реакцию при 37°C в течение 4 часов. После окончания реакции реакционную смесь анализировали посредством обращенной хроматографии (HPLC (Agilent), Jupiter C18 (Phenomenex)). Анализ результатов показан на фиг.9 и 10. Lys12-пегилированный CA-эксендин-4 изомер подтвердили посредством одновременного исчезновения #1 и #2, как показано на фиг.9, и изомер Lys27-пегилированный CA-эксендин-4 подтвердили посредством одновременного исчезновения #2 и #3, как показано на фиг.10.
Пример 9: Идентификация выхода пегилирования посредством концентрации изопропанола при N-концевом пегилировании
Для пегилирования метокси полиэтиленгликоля 5K ALD (NOF Inc., Япония) на N-конце кальцитонина лосося (Bachem, США), кальцитонин лосося и PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 1 часа в молярном отношении 1:1 с пептидной концентрацией 1 мг/мл. В это время 100 мМ NaAc pH 5,2/0% изопропанола, 100 мМ NaAc pH 5,2/45% изопропанола буферы использовали в качестве реакционной среды, соответственно, и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. Моно-пегилированный пептид очищали из каждой реакционной смеси посредством колонки SOURCE S (XK 16 мл, GE healthcare, Корея) при следующем условии. Результаты показаны в таблице 1 ниже.
Колонка: SOURCE S
Скорость потока: 2,5 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ ацетат, pH 5,2) и B (A+1М NaCl); градиент A 0→40%, 60 мин
Таблица 1
Раствор реакционного буфера Выход моно-пегилированного кальцитонина-5K (%)
0,1М NaAc pH 5,2 36
0,1М NaAc pH 5,2/45% IPA 51,3
Как показано в таблице 1, выход пегилированного кальцитонина увеличивается посредством добавления изопропанола.
Пример 10: Измерение in vitro активности эксендин-4 посредством пегилирования и пегилированного сайта
Для измерения эффективности длительно действующего препарата эксендин-4 посредством пегилирования и пегилированного сайта использовали метод измерения in vitro активности. Измерение in vitro активности GLP-1 представляет собой метод измерения того, увеличивается ли в клетке уровень цАМФ после обработки GLP-1 в клеточных линиях CHO, в которых клонировали рецепторы GLP-1.
В частности, CHO/GLP-1R, клеточную линию, в которой клонируется GLP-1, обрабатывали GLP-1, эксендин-4 и тестируемыми материалами, описанными в таблице 1, при варьирующих концентрациях. Наличие цАМФ измеряли и отсюда значения EC50 сравнивали друг с другом. В качестве контроля использовали коммерчески пригодный Баета (Eli Lilly). In vitro активности (%) в соответствии с обработкой тестируемыми материалами показаны в таблице 2.
Таблица 2
Тестируемый материал In vitro активность (%)
Баета 100
CA-эксендин-4 77
CA-эксендин-4-PEG (Lys12) 2,1
CA-эксендин-4-PEG (Lys27) 8,5
Как показано в таблице 2, физиологическая активность пептида относительно мало изменялась, когда PEG модифицирует Lys27 в сравнении с Lys12.
Пример 11: Получение и выделение конъюгата пегилированный оксинтомодулин (Lys30)
<11-1> Получение конъюгата пегилированный оксинтомодулин (Lys30)
Для получения конъюгата пегилированный оксинтомодулин 3.4K PropionALD(2) PEG и оксинтомодулин (Anygen, Корея) подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 4,5 часов в молярном отношении 1:15 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ Na-борат буфер (pH 9,0), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 в качестве восстанавливающего агента.
<11-2> Выделение позиционного изомера
Lys30-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.11).
Колонка: SOURCE S
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 0→40%, 222 мин
Пример 12: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил оксинтомодулин (Lys30)
Процедуру примера 11 повторяли за исключением использования имидазоацетил оксинтомодулина (Anygen, Корея) вместо оксинтомодулина и использования 100 мМ HEPES буфера (pH 7,5), содержащего 45% изопропанола, в примере 11 с получением конъюгата пегилированный имидазоацетил оксинтомодулин (Lys30).
Изомеры, очищенные с использованием колонки SOURCE Q, показаны на фиг.12, и пептидное картирование с использованием протеазы Asp-N показано на фиг.13. Как показано на фиг.13, часть #4:Asp(22)-(37) исчезала посредством PEG-модификации Lys30.
Пример 13: Получение конъюгата имидазоацетил оксинтомодулин (Lys30)-PEG и Fc иммуноглобулина
Конъюгат имидазоацетил оксинтомодулин-PEG (Lys30) и Fc иммуноглобулина (Hanmi Pharm. Co. Ltd., Корея) подвергали реакции при 4°C в течение 16 часов в молярном отношении 1:10 с общей белковой концентрацией 20 мг/мл. В это время 100 мМ фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 в качестве восстанавливающего агента. После окончания реакции реакционную смесь очищали с использованием колонки SOURCE 15Q при следующих условиях.
Колонка: SOURCE Q
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5) и B (A+1М NaCl); градиент A 0→20%, 100 мин
Хроматограмма, которую получают посредством связывания Lys30-пегилированного CA-оксинтомодулина с Fc иммуноглобулина и очищения конъюгата с использованием SOURCE Q, показана на фиг.14, и результаты SDS-PAGE конъюгата CA-оксинтомодулин (Lys30)-PEG и Fc иммуноглобулина показаны на фиг.15. Как показано на фиг.15, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях и две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.
Пример 14: Получение и выделение конъюгата пегилированный аналог оксинтомодулина (Lys27)
<14-1> Получение конъюгата пегилированный аналог оксинтомодулина (Lys27)
Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG лизина, аналога оксинтомодулина ([20Asp, 24Ala, 28Ser]-оксинтомодулин-[делеция30-37]), PEG и аналог оксинтомодулина (Anygen, Корея) подвергали реакции при 4°C в течение 3,5 часов в молярном отношении 1:15 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ Na-борат буфер (pH 9,0), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 в качестве восстанавливающего агента.
<14-2> Выделение позиционного изомера
Lys27-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). Условия очистки и выделения такие же, как описано в примере 11. В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.16). Селективность лизина очищенных моно-пегилированных аналогов оксинтомодулина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Lys-C (фиг.17). Как показано на фиг.17, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации Lys27.
Пример 15: Получение и выделение конъюгата пегилированный аналог имидазоацетил оксинтомодулина (Lys27)
<15-1> Получение конъюгата пегилированный аналог имидазоацетил оксинтомодулина (Lys27)
Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG Lys27 аналога имидазоацетил оксинтомодулина ([20Asp, 24Ala, 28Ser]-оксинтомодулин-[удаление 30-37]) - аналога имидазоацетил оксинтомодулина (Anygen, Корея) и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 2,5 часов в молярном отношении 1:10 с общей белковой концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.
<15-2> Выделение позиционного изомера
Lys27-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). Условия очистки и выделения были сходными с условиями, описанными в примере 11. В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.18). Селективность лизина очищенных моно-пегилированных аналогов оксинтомодулина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Lys-C (фиг.19). Как показано на фиг.19, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации Lys27.
Пример 16: Получение и выделение конъюгата пегилированный аналог имидазоацетил оксинтомодулина (Lys27) и Fc иммуноглобулина
Lys27-пегилированный аналог имидазоацетил оксинтомодулин-PEG, полученный в примере 15, и Fc иммуноглобулина подвергали реакции при 4°C в течение 16 часов в молярном отношении 1:10 с пептидной концентрацией 20 мг/мл. В это время 100 мМ фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. После окончания реакции реакционную смесь очищали с использованием колонки SOURCE 15Q при следующих условиях.
Колонка: SOURCE Q
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5) и B (A+1М NaCl); градиент A 0→20%, 100 мин
Хроматограмма, которую получают посредством связывания Lys27-пегилированного аналога CA-оксинтомодулина с Fc иммуноглобулина и очищения конъюгата с использованием SOURCE Q, показана на фиг.20, и результаты SDS-PAGE конъюгата аналога CA-оксинтомодулина (Lys27)-PEG и Fc иммуноглобулина показаны на фиг.21. Как показано на фиг.21, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях и две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.
Пример 17: Получение и выделение конъюгата пегилированный GLP-1 (Lys34)
<17-1> Получение конъюгата пегилированный GLP-1 (Lys34)
Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG лизинового остатка GLP-1 GLP-1 и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 3,5 часов в молярном отношении 1:15 с общей белковой концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ Na-бората (pH 9,0), содержащего 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.
<17-2> Выделение позиционного изомера
Lys34-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.22). Селективность лизина очищенных моно-пегилированных аналогов оксинтомодулина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Lys-C (фиг.23).
Колонка: SOURCE S
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 3→40%, 150 мин
Как показано на фиг.23, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации Lys34.
Пример 18: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-1 (Lys34)
<18-1> Получение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-1 (Lys34)
Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG лизинового остатка имидазоацетил GLP-1 имидазоацетил GLP-1 и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 4 часов в молярном отношении 1:10 с общей белковой концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент добавляли в нее.
<18-2> Выделение позиционного изомера
Lys34-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.24). Селективность лизина очищенных моно-пегилированных аналогов оксинтомодулина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Glu-C Lys-C (фиг.25).
Колонка: SOURCE S
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 3→40%, 150 мин
Как показано на фиг.25, часть #4 исчезала посредством PEG-модификации Lys34.
Пример 19: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-1 (Lys34) и Fc иммуноглобулина
Lys34-пегилированный имидазоацетил GLP-1-PEG, полученный в примере 18, и Fc иммуноглобулина подвергали реакции при 4°C в течение 17 часов в молярном отношении 1:8 с пептидной концентрацией 50 мг/мл. В это время 100 мМ фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. После окончания реакции реакционную смесь очищали с использованием колонки SOURCE Phe при следующих условиях.
Колонка: SOURCE Phe
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5) и B (A+2М NaCl); градиент A 100→0%, 100 мин
Хроматограмма, которую получают посредством связывания Lys34-пегилированного изомера CA-GLP-1 с Fc иммуноглобулина и очищения конъюгата с использованием SOURCE Phe, показана на фиг.26, и результаты SDS-PAGE конъюгата CA-GLP-1 (Lys34)-PEG и Fc иммуноглобулина показаны на фиг.27. Как показано на фиг.27, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях и две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.
Пример 20: Получение и выделение конъюгата пегилированный GLP-2 (Lys30)
<20-1> Получение конъюгата пегилированный GLP-2 (Lys30)
Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG лизинового остатка GLP-2 GLP-2 и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 3 часов в молярном отношении 1:12 с общей белковой концентрацией 5 мг/мл. В это время 100 мМ Na-бората (pH 9,0), содержащего 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.
<20-2> Выделение позиционного изомера
Lys30-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.28). Селективность лизина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием трипсиновой протеазы (фиг.29).
Колонка: SOURCE S
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 3→40%, 150 мин
Как показано на фиг.29, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации Lys30.
Пример 21: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-2 (Lys30)
<21-1> Получение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-2 (Lys30)
Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG остатка лизина 30 имидазоацетил GLP-2 (Anygen, Корея) имидазоацетил GLP-2 и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 6 часов в молярном отношении 1:20 с общей белковой концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.
<21-2> Выделение позиционного изомера
Lys30-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.30).
Колонка: SOURCE S
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 3→40%, 150 мин
Пример 22: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-2 (Lys30) и Fc иммуноглобулина
Lys30-пегилированный имидазоацетил GLP-2-PEG, полученный в Примере 21, и Fc иммуноглобулина подвергали реакции при 4°C в течение 16 часов в молярном отношении 1:15 с пептидной концентрацией 20 мг/мл. В это время 100 мМ фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. После окончания реакции реакционную смесь очищали с использованием колонки SOURCE Phe при следующих условиях.
Колонка: SOURCE Phe
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5) и B (A+2М NaCl); градиент A 100→0%, 100 мин
Хроматограмма, которую получают посредством связывания Lys30-пегилированного CA-GLP-2 изомера с Fc иммуноглобулина и очищения конъюгата с использованием SOURCE Phe, показана на фиг.31, и результаты SDS-PAGE конъюгата CA-GLP-2 (Lys30)-PEG и Fc иммуноглобулина показаны на фиг.32. Как показано на фиг.32, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях и две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.
Пример 23: Получение и выделение конъюгата пегилированный инсулин (B1Phe) человека
<23-1> Получение конъюгата пегилированный инсулин (B1Phe) человека
Для пегилирования 5K PropionALD(1) метоксиPEG (PEG, содержащий одну пропиональдегидную группу, NOF., Япония) на N-конце фенилаланина, который представляет собой первую аминокислоту B цепи в инсулине человека (Sigma), PEG и инсулин человека подвергали реакции при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:2 с пептидной концентрацией 2,3 мг/мл. В это время 100 мМ буфера фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.
<23-2> Выделение позиционного изомера
Позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.33). Моно-пегилирование элюированных пиков подтверждали посредством анализа SDS-PAGE, и селективность лизина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Glu-C (фиг.36).
Колонка: SOURCE S
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 2,0+60% этанол) и B (A+0,5М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 0→50%, 80 мин
Как показано на фиг.36, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации B1F.
Пример 24: Получение и выделение конъюгата пегилированный инсулин ((A1Gly) человека
<24-1> Получение конъюгата пегилированный инсулин (A1Gly) человека
Для пегилирования 5K метоксиPEG-сукцинимидил бутаноат(1) (PEG, содержащий одну реакционноспособную группу SBA, NOF., Япония) на N-конце глицина, который представляет собой первую аминокислоту A цепи в инсулине человека (Sigma), PEG и инсулин человека подвергали реакции при 25°C в течение 3 часов в молярном отношении 1:4 с пептидной концентрацией 2 мг/мл. В это время 100 мМ Na-боратного буфера (pH 9,0), содержащего 35% изопропанола, использовали в качестве реакционной среды.
<24-2> Выделение позиционного изомера
Позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). Процедура очистки была сходна с процедурой очистки, описанной в примере 23. В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.34). Моно-пегилирование элюированных пиков подтверждали посредством анализа SDS-PAGE, и селективность лизина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Glu-C (фиг.36).
Как показано на фиг.36, часть #1 исчезала посредством PEG-модификации A1G.
Пример 25: Получение и выделение конъюгата пегилированный инсулин (B29Lys) человека
<25-1> Получение конъюгата пегилированный инсулин (B29Lys) человека
Для пегилирования 5K метоксиPEG-сукцинимидил бутаноата(1) лизинового остатка, который представляет собой 29-ю аминокислоту B цепи в инсулине человека (Sigma), PEG и инсулин человека подвергали реакции при 25°C в течение 1 часа в молярном отношении 1:2 с пептидной концентрацией 2 мг/мл. В это время 100 мМ Na-боратного буфера (pH 9,0), содержащего 45% изопропанола, использовали в качестве реакционной среды.
<25-2> Выделение позиционного изомера
Позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). Процедура очистки была сходна с процедурой очистки, описанной в примере 23. В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.35). Моно-пегилирование элюированных пиков подтверждали посредством анализа SDS-PAGE, и селективность лизина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Glu-C (фиг.36).
Как показано на фиг.36, часть #4 исчезала посредством PEG-модификации B29K.
Хотя изобретение было описано в отношении вышеупомянутых специфических вариантов осуществления изобретения, следует признать, что различные модификации и изменения могут быть сделаны по изобретению специалистами в данной области, которые также входят в объем изобретения как определенные прилагаемой формулой изобретения.

Claims (15)

1. Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера, включающий стадии:
i) определения количества спирта и значения рН, дающих возможность непептидильному полимеру связываться с целевым сайтом физиологически активного полипептида;
ii) обработки физиологически активного полипептида непептидильным полимером в реакционной среде, которая содержит количество спирта и имеет рН, дающие возможность непептидильному полимеру связаться с целевым сайтом физиологически активного полипептида; и
iii) выделения и очистки физиологически активного полипептидного конъюгата из реакционной смеси стадии (ii) посредством ионообменной хроматографии с использованием спирта.
2. Способ по п.1, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из инсулинотропного пептида, фактора крови, пищеварительного гормона, адренокортикотропного гормона, гормона щитовидной железы, кишечного гормона, цитокина, фермента, фактора роста, нейропептида, гипофизеотропного гормона, гипофизиотропного гормона, пептида против ожирения, противовирусного пептида и неприродного пептидного производного, сохраняющего физиологически активное свойство.
3. Способ по п.1, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из эритропоэтина, GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов), амилина, глюкагона, инсулина, соматостатина, PYY (пептид YY), NPY (нейропептид Y), GLP-1, GLP-2, эксендина-4, оксинтомодулина, грелина, ангиотензина, брадикинина, кальцитонина, кортикотропина, эледоисина, гастрина, лептина, окситоцина, вазопрессина, LH (лютеинизирующий гормон), пролактина, FSH (фолликулостимулирующий гормон), РТН (паратиреоидный гормон), секретина, серморелина, hGH (гормон роста человека), высвобождающего гормон роста пептида, G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), интерферонов, интерлейкинов, высвобождающего пролактин пептида, орексина, пептида тиролиберина, холецистокинина, ингибирующего гастрин пептида, кальмодулина, высвобождающего гастрин пептида, мотилина, вазоактивного кишечного пептида, ANP (предсердный натрийуретический пептид), BNP (натрийуретический пептид головного мозга), CNP (натрийуретический пептид С-типа), нейрокинина А, нейромедина, ренина, эндотелина, пептида сарафотоксина, пептида карсоморфина, дерморфина, динорфина, эндорфина, энкефалина, Т-клеточного фактора, фактора некроза опухоли, рецептора фактора некроза опухоли, урокиназного рецептора, опухоль ингибирующего фактора, коллагеназного ингибитора, тимопоэтина, тимулина, тимопентина, тимозина, гуморального фактора тимуса, адреномодуллина, аллатостатина, фрагмента белка бета-амилоида, противомикробного пептида, антиоксидантного пептида, бомбезина, остеокальцина, CART пептида, Е-селектина, ICAM-1, VCAM-1, лейкокина, kringle-5, ламинина, ингибина, галанина, фибронектина, панкреастатина и фузеона.
4. Способ по п.1, где физиологически активный полипептид представляет собой эксендин, инсулин, GLP-1, GLP-2, оксинтомодулин, грелин, кальцитонин или одно из их производных.
5. Способ по п.4, где производное имеет любую структуру, выбранную из формул (I)-(IV):
Figure 00000005

Figure 00000006

Figure 00000007

Figure 00000008
6. Способ по п.1, где непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и полипропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биодеградируемых полимеров, таких как PLA (поли(молочная кислота)) и PLGA (полимолочная-гликолевая кислота), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций.
7. Способ по п.1, где спирт, используемый на стадиях (ii) и (iii), представляет собой первичный, вторичный или третичный спирт, имеющий число атомов углерода от одного до десяти.
8. Способ по п.7, где спирт представляет собой этанол или изопропанол.
9. Способ по п.1, где спирт присутствует в реакционной среде в количестве от 35% до 60% по объему в расчете на общее количество реакционной среды.
10. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 7,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой эксендин-4 или его производное.
11. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 7,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой оксинтомодулин или его производное.
12. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 4,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой инсулин человека или его производное.
13. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 7,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой GLP-1 или его производное.
14. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 7,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой GLP-2 или его производное.
15. Способ по п.1, где сайт-специфический физиологически активный полипептидный конъюгат представляет собой конъюгат эксендина-4, в котором PEG связан с Lys27, конъюгат кальцитонина, в котором PEG связан с N-концом, конъюгат оксинтомодулина, в котором PEG связан с Lys27 или Lys30, конъюгат инсулина человека, в котором PEG связан с N-концом Gly1 в А цепи или связан с Lys29 в В-цепи, конъюгат GLP-1 или GLP-2, в котором PEG связан с Lys34 или Lys30, или их аналоги.
RU2011142332/04A 2009-03-20 2010-03-18 Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера RU2495881C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2009-0023953 2009-03-20
KR20090023953 2009-03-20
PCT/KR2010/001674 WO2010107256A2 (en) 2009-03-20 2010-03-18 Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011142332A RU2011142332A (ru) 2013-04-27
RU2495881C2 true RU2495881C2 (ru) 2013-10-20

Family

ID=42740133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011142332/04A RU2495881C2 (ru) 2009-03-20 2010-03-18 Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера

Country Status (24)

Country Link
US (1) US8895281B2 (ru)
EP (1) EP2408800B1 (ru)
JP (2) JP5759976B2 (ru)
KR (1) KR101164453B1 (ru)
CN (1) CN102369209B (ru)
AR (1) AR075913A1 (ru)
AU (1) AU2010225523B2 (ru)
BR (1) BRPI1013626B8 (ru)
CA (1) CA2755395C (ru)
DK (1) DK2408800T3 (ru)
ES (1) ES2587397T3 (ru)
HR (1) HRP20161055T1 (ru)
HU (1) HUE030373T2 (ru)
IL (1) IL215165A (ru)
MX (1) MX2011009803A (ru)
MY (1) MY150536A (ru)
NZ (1) NZ595848A (ru)
PL (1) PL2408800T3 (ru)
PT (1) PT2408800T (ru)
RU (1) RU2495881C2 (ru)
SG (1) SG174320A1 (ru)
TW (1) TWI472342B (ru)
WO (1) WO2010107256A2 (ru)
ZA (1) ZA201107658B (ru)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9278146B2 (en) 2010-10-08 2016-03-08 Kyoto University Peptide derivative and use of the same
EP2660249B1 (en) * 2010-10-08 2019-07-10 Kyoto University Peptide derivative and use thereof
CN102675452B (zh) * 2011-03-17 2015-09-16 重庆富进生物医药有限公司 具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物
CN102718868A (zh) * 2011-03-30 2012-10-10 上海华谊生物技术有限公司 定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物及其制备方法
EA201391764A1 (ru) * 2011-06-02 2014-07-30 Пролор Байотек Инк. Агонисты рецептора glp-1/глюкагона длительного действия
US10166295B2 (en) 2011-06-02 2019-01-01 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
SG10201604564XA (en) 2011-06-10 2016-07-28 Hanmi Science Co Ltd Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
HRP20190265T1 (hr) 2011-06-17 2019-04-05 Hanmi Science Co., Ltd. Konjugat koji sadrži oksintomodulin i fragment imunoglobulina i njegova uporaba
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
EP2854838B1 (en) 2012-06-04 2018-10-17 OPKO Biologics Ltd. Pegylated oxm variants
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
KR101993393B1 (ko) * 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
TWI816739B (zh) 2012-11-06 2023-10-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含調酸素及免疫球蛋白片段之蛋白質接合物的液態製劑
KR20140088837A (ko) * 2013-01-03 2014-07-11 한미약품 주식회사 Ｎ-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체
PT2963055T (pt) * 2013-02-26 2019-07-25 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conugado de insulina específico ao local
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
CN103804483A (zh) * 2014-03-13 2014-05-21 中国人民解放军第四军医大学 Orexin-A聚乙二醇化修饰物及其制备方法
KR20150140177A (ko) * 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
TWI802396B (zh) 2014-09-16 2023-05-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
KR102418477B1 (ko) 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
CN108026143B (zh) * 2015-07-24 2022-05-27 韩美药品株式会社 制备生理活性多肽缀合物的方法
EP4534107A3 (en) * 2015-09-24 2025-12-10 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Protein complex by use of a specific site of an immunoglobulin fragment for linkage
KR101974305B1 (ko) * 2018-02-14 2019-04-30 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
US12441776B2 (en) 2018-11-30 2025-10-14 Eirgen Pharma Ltd. Oxyntomodulin peptide analog formulations
CN109678930B (zh) * 2018-12-05 2022-04-29 西北工业大学 聚乙二醇修饰的npff及其用途
CN109535244B (zh) * 2018-12-11 2020-12-01 上海景峰制药有限公司 一种重组人脑利钠肽的纯化方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002028437A1 (en) * 2000-10-05 2002-04-11 Ares Trading S.A. Regioselective liquid phase pegylation
WO2008051383A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Amgen Inc. Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
RU2007121517A (ru) * 2004-11-12 2008-12-20 БАЙЕР ХЕЛСКЕА ЛЛСи (US) Сайт-направления модификация fviii

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996041813A2 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Offord Robin E Functionalized polymers for site-specific attachment
EP0922446A1 (en) 1997-12-03 1999-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
NZ514916A (en) 1999-04-30 2004-06-25 Amylin Pharmaceuticals Inc Exendins and exendin agonists linked to polyethylene glycol polymers
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20040180054A1 (en) 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US8423976B2 (en) * 2003-03-13 2013-04-16 Northrop Grumman Corporation Extreme pipeline and optimized reordering technology
EA009366B1 (ru) * 2003-03-19 2007-12-28 Эли Лилли Энд Компани Связанные с полиэтиленгликолем соединения гпп-1
KR100507796B1 (ko) 2003-04-03 2005-08-17 한미약품 주식회사 생체내 반감기가 증가된 ｐｅｇ-생리활성 폴리펩티드 동종이량체 결합체 및 이의 제조방법
CN1777440A (zh) * 2003-04-11 2006-05-24 Pr药品有限公司 位点特异性蛋白质偶联物的制备方法
EP1664108B1 (en) 2003-08-21 2009-10-14 Novo Nordisk A/S Separation of polypeptides comprising a racemized amino acid
US20080207505A1 (en) 2005-01-12 2008-08-28 James Kenneth D Bna Conjugates and Methods of Use
US8168592B2 (en) * 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
JP2009019027A (ja) * 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002028437A1 (en) * 2000-10-05 2002-04-11 Ares Trading S.A. Regioselective liquid phase pegylation
RU2007121517A (ru) * 2004-11-12 2008-12-20 БАЙЕР ХЕЛСКЕА ЛЛСи (US) Сайт-направления модификация fviii
WO2008051383A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Amgen Inc. Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015127330A (ja) 2015-07-09
US8895281B2 (en) 2014-11-25
HK1163120A1 (en) 2012-09-07
WO2010107256A2 (en) 2010-09-23
DK2408800T3 (en) 2016-08-29
CA2755395A1 (en) 2010-09-23
PL2408800T3 (pl) 2016-11-30
BRPI1013626A2 (pt) 2016-04-19
EP2408800A4 (en) 2012-12-05
BRPI1013626B1 (pt) 2021-05-11
TWI472342B (zh) 2015-02-11
IL215165A0 (en) 2011-12-29
PT2408800T (pt) 2016-08-23
RU2011142332A (ru) 2013-04-27
TW201036640A (en) 2010-10-16
KR20100105494A (ko) 2010-09-29
AU2010225523B2 (en) 2012-05-24
MY150536A (en) 2014-01-30
ES2587397T3 (es) 2016-10-24
JP5759976B2 (ja) 2015-08-05
JP2012520873A (ja) 2012-09-10
HUE030373T2 (en) 2017-05-29
KR101164453B1 (ko) 2012-07-11
SG174320A1 (en) 2011-10-28
WO2010107256A3 (en) 2011-03-17
AR075913A1 (es) 2011-05-04
US20120003712A1 (en) 2012-01-05
IL215165A (en) 2016-11-30
BRPI1013626B8 (pt) 2021-05-25
NZ595848A (en) 2014-04-30
CN102369209A (zh) 2012-03-07
ZA201107658B (en) 2012-12-27
MX2011009803A (es) 2011-09-30
CN102369209B (zh) 2015-06-10
EP2408800A2 (en) 2012-01-25
EP2408800B1 (en) 2016-05-25
AU2010225523A1 (en) 2011-11-10
HRP20161055T1 (hr) 2016-11-04
CA2755395C (en) 2015-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2495881C2 (ru) Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
CN101646451B (zh) 使用免疫球蛋白片段的促胰岛素缀合物
KR101352225B1 (ko) 신규한 엑센딘 변형 및 이들의 콘쥬게이트
KR20200018526A (ko) 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 약물 결합체
EP3354664A1 (en) Protein conjugate comprising multiple bioactive polypeptides and immunoglobulin fc regions
KR102438056B1 (ko) 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법
TWI617569B (zh) 製備生理活性多肽複合物之方法
JP2014088384A (ja) Ｐｅｇ修飾エキセンジンまたはエキセンジン類似体およびそれらの組成物および使用
HK1163120B (en) Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner