RU2495127C2 - RECOMBINANT PLASMID pAd-SM, CODING HUMAN PROTEINS SOX2 AND C-MYC, BEING BASE FOR PRODUCTION OF VIRULENT ADENOVIRUSES DESIGNED FOR PRODUCTION OF INDUCED PLURIPOTENT HUMAN CELLS - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID pAd-SM, CODING HUMAN PROTEINS SOX2 AND C-MYC, BEING BASE FOR PRODUCTION OF VIRULENT ADENOVIRUSES DESIGNED FOR PRODUCTION OF INDUCED PLURIPOTENT HUMAN CELLS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2495127C2 RU2495127C2 RU2012101366/10A RU2012101366A RU2495127C2 RU 2495127 C2 RU2495127 C2 RU 2495127C2 RU 2012101366/10 A RU2012101366/10 A RU 2012101366/10A RU 2012101366 A RU2012101366 A RU 2012101366A RU 2495127 C2 RU2495127 C2 RU 2495127C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- myc
- sox2
- production
- cmv
- human
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 title abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 13
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims abstract description 3
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 claims description 8
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 claims description 8
- 102000009092 Proto-Oncogene Proteins c-myc Human genes 0.000 claims description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 4
- 102000047444 human SOX2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010087705 Proto-Oncogene Proteins c-myc Proteins 0.000 claims description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000585703 Homo sapiens Protein L-Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии и может быть использовано для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.The invention relates to the field of genetic engineering, molecular and cellular biology, biotechnology and can be used to produce induced pluripotent human stem cells.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки - это новый тип плюрипотентных клеток, которые могут быть получены из различных типов соматических клеток путем временной сверхэкспрессии определенного набора генов [1-3]. ИПСК близки по своим свойствам эмбриональным стволовым клеткам. Главным из этих свойств является свойство плюрипотентности. Плюрипотентность - это способность давать после дифференцировки производные всех трех примитивных зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и энтодермы), то есть, практически все типы клеток, из которых состоит тело взрослого человека. Существуют методы направленной дифференцировки ИПСК в такие типы клеток как кардиомиоциты (клетки сердечной мышцы), гепатоциты (клетки печени), клетки продуцирующие инсулин, нейроны и клетки глии [4]. Данные типы клеток, потенциально, могут быть использованы в терапии заболеваний человека. Кроме того, ИПСК могут быть использованы для моделирования наследственных и приобретенных заболеваний человека [5-8].Induced pluripotent stem cells are a new type of pluripotent cells that can be obtained from various types of somatic cells by temporarily overexpressing a specific set of genes [1-3]. IPSCs are close in their properties to embryonic stem cells. The main of these properties is the property of pluripotency. Pluripotency is the ability to produce, after differentiation, derivatives of all three primitive germ layers (ectoderm, mesoderm and endoderm), that is, almost all types of cells that make up the body of an adult. There are methods for the directed differentiation of iPSCs into cell types such as cardiomyocytes (heart muscle cells), hepatocytes (liver cells), insulin producing cells, neurons and glia cells [4]. These cell types can potentially be used in the treatment of human diseases. In addition, iPSCs can be used to model hereditary and acquired human diseases [5-8].
На сегодняшний день известно, что ИПСК человека и животных могут быть успешно получены с использованием таких генов, как OCT4, SOX2, KLF4 и C-MYC [1-2]. Однако, на настоящий момент для доставки кДНК генов в соматические клетки с целью получения ИПСК в основном используются рекомбинантные ретро- и лентивирусы [9]. Использование данных векторов для получения ИПСК сопряжено с проблемой интеграции провирусной ДНК в геномы клеток [10]. Интеграция провирусов ретро- и лентивирусов в геном вызывает инсерционный мутагенез, в результате чего может нарушаться работа функциональных генов . Кроме того, реактивация провирусов в дифференцированных производных ИПСК, способна вызывать злокачественное перерождение клеток. Данная проблема существенно ограничивает применение ИПСК в регенеративной медицине и фармакологии.To date, it is known that human and animal iPSCs can be successfully obtained using genes such as OCT4, SOX2, KLF4, and C-MYC [1-2]. However, at present, recombinant retro- and lentiviruses are mainly used to deliver cDNA genes to somatic cells in order to obtain iPSCs [9]. The use of these vectors to obtain iPSCs is associated with the problem of integrating proviral DNA into cell genomes [10]. The integration of retro- and lentivirus proviruses into the genome causes insertional mutagenesis, as a result of which the functioning of functional genes may be impaired. In addition, the reactivation of proviruses in differentiated derivatives of iPSCs can cause malignant degeneration of cells. This problem significantly limits the use of iPSCs in regenerative medicine and pharmacology.
Поиск способов высокоэффективного получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека без генетической модификации их генома является одной из актуальных задач современной клеточной биологии и медицины.The search for ways to highly efficiently produce induced human pluripotent stem cells (iPSCs) without the genetic modification of their genome is one of the urgent tasks of modern cell biology and medicine.
Одним из возможных способов решения проблемы интеграции чужеродной, векторной ДНК в геномы ИПСК является использование так называемых неинтегрирующихся векторов. Одними из таких векторов являются аденовирусы. Аденовирусы - это ДНК-содержащие вирусы с размером генома около 36 т.п.н., представляющим из себя линейную ДНК, фланкированную длинными концевыми повторами. Основе геномов аденовирусов 2 и 5 серотипов созданы вектора, предназначенные для доставки нуклеотидных последовательностей в различные типы эукариотических клеток (http://www.coloncancer.org/adeasy.htm). Для создания векторов из геномов аденовирусов были удалены гены E1, E3 и E4 (вектор pAdEasy-2), либо E1 и E3 (вектор pAdEasy-1). Для формирования и наработки вирусных частиц на основе векторов pAdEasy-2 и pAdEasy-1 используют специальные трансгенные линии эукариотических клеток способные экспрессировать гены E1 и E4 (ген E3 не нужен для сборки вирусных частиц). Аденовирусные векторы имеют ряд преимуществ: препарат рекомбинантного аденовируса с высоким титром может быть получен в относительно короткий срок, аденовирусы могут заражать широкий спектр типов клеток, в которых затем поддерживается высокий уровень экспрессии трансгена, аденовирусная ДНК с очень низкой частотой встраивается в геном и элиминируется в ряду митотических делений клетки.One of the possible ways to solve the problem of integrating foreign, vector DNA into iPSC genomes is to use the so-called non-integrating vectors. One of these vectors are adenoviruses. Adenoviruses are DNA-containing viruses with a genome size of about 36 kb, which is linear DNA flanked by long terminal repeats. Based on the genomes of adenoviruses 2 and 5 of serotypes, vectors have been created for the delivery of nucleotide sequences to various types of eukaryotic cells (http://www.coloncancer.org/adeasy.htm). To create vectors from the adenovirus genomes, the E1, E3, and E4 genes (pAdEasy-2 vector) or E1 and E3 (pAdEasy-1 vector) were removed. For the formation and production of viral particles based on the pAdEasy-2 and pAdEasy-1 vectors, special transgenic eukaryotic cell lines capable of expressing the E1 and E4 genes are used (the E3 gene is not needed for the assembly of viral particles). Adenoviral vectors have several advantages: a recombinant adenovirus drug with a high titer can be obtained in a relatively short time, adenoviruses can infect a wide range of cell types, which then maintain a high level of transgene expression, adenovirus DNA is inserted into the genome with a very low frequency and eliminated in a row mitotic cell divisions.
Задачей данного изобретения является конструирование на основе вектора pAdEasy-1 рекомбинантной плазмиды, которая является основой для получения вирулентных вирусных частиц и несет кДНК генов SOX2 и C-MYC человека под контролем конститутивного промотора CMV, обеспечивающего транскрипцию этих генов в соматических клетках человека. Для создания плазмиды pAd-SM использовался промежуточный вектор pAdTrack-CMV, в который помещали фрагмент ДНК, состоящий из кодирующих частей генов SOX2 и C-MYC человека объединенных нуклеотидной последовательностью 2А-петида. Данный подход позволил создать конструкцию, обеспечивающую одновременную транскрипцию кДНК генов SOX2 и C-MYC в виде одной бицистронной мРНК, с последующей трансляцией двух отдельных белков. Кроме того, pAdTrack-CMV содержит ген флуоресцентного белка EGFP под контролем промотора CMV.The objective of the invention is the construction based on the vector pAdEasy-1 recombinant plasmid, which is the basis for obtaining virulent viral particles and carries cDNA genes SOX2 and C-MYC human under the control of the constitutive CMV promoter, which provides transcription of these genes in human somatic cells. The pAdTrack-CMV intermediate vector was used to create the pAd-SM plasmid, in which a DNA fragment consisting of the coding parts of the SOX2 and C-MYC genes was placed human united by the nucleotide sequence of 2A-petid. This approach allowed us to create a design that provides simultaneous transcription of cDNA genes SOX2 and C-MYC in the form of one bicistronic mRNA, followed by translation of two separate proteins. In addition, pAdTrack-CMV contains the EGFP fluorescent protein gene under the control of the CMV promoter.
Плазмида pAd-SM была получена в результате рекомбинации плазмиды pAdTrack-CMV несущей кДНК генов SOX2 и C-MYC и плазмиды pAdEasy-1 в клетках E.coli AdEasier cells (штамм BJ5183 предтрансформированный плазмидой pAdEasy-1).Plasmid pAd-SM was obtained by recombination of the plasmid pAdTrack-CMV carrying the cDNA of the SOX2 and C-MYC genes and plasmids pAdEasy-1 in E. coli AdEasier cells (strain BJ5183 pre-transformed with plasmid pAdEasy-1).
Реализация изобретения осуществляется следующим образом.The implementation of the invention is as follows.
1. Выделяют РНК из клеток известной линии эмбриональных стволовых клеток человека HUES9 [5], и производят синтез кДНК с помощью олиго-(dT) праймеров. Полученную кДНК используют в качестве матрицы для синтеза фрагментов, кодирующих белки;1. RNA is isolated from cells of the known human embryonic stem cell line HUES9 [5], and cDNA is synthesized using oligo- (dT) primers. The obtained cDNA is used as a matrix for the synthesis of fragments encoding proteins;
2. Синтез фрагмента кДНК гена SOX2 (позиции в мРНК 428-1379) (Homo sapiens SRY (sex determining region Y)-box 2) человека, (регистрационный номер в GeneBank NM_003106.2), размером 1023 пар нуклеотидов, содержащего на 3'-конце последовательность P2A-пептида (SOX2-P2A). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hSOX2 5' XbaI 5'-TTTAGTGTCTAGAATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTG-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Xba I) и hSOX2 P2A 3'5'-TTCTCTTCGACATCCCCTGCTTGTTTCAACAGGGAGAAGTTAGTGGCTCCGCTTCCGGACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATG-3' (обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид P2A);2. Synthesis of the cDNA fragment of the SOX2 gene (position in mRNA 428-1379) (Homo sapiens SRY (sex determining region Y) -box 2) of a person (registration number in GeneBank NM_003106.2), size 1023 nucleotides containing 3 ' -terminal sequence of the P2A peptide (SOX2-P2A). Synthesis was carried out by polymerase chain reaction with primers: hSOX2 5 'XbaI 5'-TTTAGTGTCTAGAATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTG-3' (forward primer contains an artificially introduced restriction endonuclease site Xba I) and hSOX2 P2A 3'5'-TTCTCTTCGACATCCCCTGCTTGTTTCAACAGGGAGAAGTTAGTGGCTCCGCTTCCGGACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATG-3 '(reverse primer, containing a nucleotide sequence encoding a peptide P2A);
3. Синтез фрагмента кДНК гена c-MYC (позиции в мРНК 571-1891) (Homo sapiens v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)) (регистрационный номер в GeneBank NM_002467.4) размером 1397 пар нуклеотидов, содержащего на 5'-конце последовательность P2A-пептида (P2A-c-MYC). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hcMYC P2A 5'5'- GCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAAC-3' (прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид P2A) и hcMYC 3' SalI 5'- TTTAGCAGTGGTACGTCGACTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTC-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Sal I);3. Synthesis of c-MYC gene cDNA fragment (position in mRNA 571-1891) (Homo sapiens v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)) (registration number in GeneBank NM_002467.4) 1397 pairs of nucleotides containing 5'- end of the sequence of the P2A peptide (P2A-c-MYC). Synthesis was carried out by polymerase chain reaction with primers: hcMYC P2A 5'5'- GCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAAC-3 '(forward primer comprising a nucleotide sequence encoding a peptide P2A) hcMYC and 3' SalI 5'- TTTAGCAGTGGTACGTCGACTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTC-3 '(forward primer comprises artificially the introduced restriction endonuclease site Sal I);
4. Объединение фрагментов SOX2-P2A и P2A-c-MYC осуществляют методом полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матриц перекрывающихся фрагментов SOX2-P2A и P2A-c-MYC, а также праймеров hSOX2 5'XbaI и hcMYC 3' SalI. В результате получают фрагмент SOX2-P2A-c-MYC, размером 2373 пар нуклеотидов;4. The combination of SOX2-P2A and P2A-c-MYC fragments is carried out by polymerase chain reaction using overlapping SOX2-P2A and P2A-c-MYC fragments as well as hSOX2 5'XbaI and hcMYC 3 'SalI primers as matrices. The result is a fragment of SOX2-P2A-c-MYC, the size of 2373 pairs of nucleotides;
5. Фрагмент ДНК SOX2-P2A-c-MYC клонируют с помощью набора реагентов pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) и штамма E.coli XL-10 Gold;5. The DNA fragment SOX2-P2A-c-MYC was cloned using the pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) reagent kit and E. coli XL-10 Gold strain;
6. Клоны плазмиды pGEM-T Easy со встройками (pGEM-SOX2-P2A-c-MYC) последовательности выделяют стандартным методом щелочного лизиса (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory Press);6. Clones of the pGEM-T Easy plasmid with the insertions (pGEM-SOX2-P2A-c-MYC) of the sequence are isolated using the standard alkaline lysis method (Maniatis, T., Fritsch, EF and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual , Cold Sping Harbor Laboratory Press);
7. Фрагмент SOX2-P2A-c-MYC вырезают из плазмиды pGEM-SOX2-P2A-c-MYC с помощью эндонуклеазы рестрикции Not I и лигируют с плазмидой pAdTrack-CMV гидролизованной той же нуклеазой рестрикции. В результате получют плазмиду pAdTrack-CMV-SM (SM=SOX2, C-MYC). С помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования по Сенгеру определяют ориентацию встройки в плазмиде.7. The SOX2-P2A-c-MYC fragment is excised from the plasmid pGEM-SOX2-P2A-c-MYC using the Not I restriction endonuclease and ligated with the plasmid pAdTrack-CMV hydrolyzed with the same restriction nuclease. The result is the plasmid pAdTrack-CMV-SM (SM = SOX2, C-MYC). Using the polymerase chain reaction and sequencing according to Senger determine the orientation of the insert in the plasmid.
8. Плазмиду pAdTrack-CMV-SM гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Pme I, в результате чего образуется линейная молекула. В реакцию берут 4 мкг плазмиды pAdTrack-CMV-SM и 30 ед. эндонуклеазы рестрикции Pme I (New England Biolabs, США), реакцию проводят в объеме 100 мкл, 2 ч, при 37°C. После прохождения реакции Pme I инактивируют нагреванием 65°C, 20 мин. Гидролизованную плазмиду осаждают добавлением 0,1 объема ацетата натрия и 2 объемов 96% этилового спирта с последующем центрифугированием при 10000×g, 15 мин. Осадок дважды промывают 70% этиловым спиртом (с центрифугированием после добавления спирта при 10000×g, 5 мин) и растворяют в 8 мкл бидистиллированной воды.8. The plasmid pAdTrack-CMV-SM is hydrolyzed with the restriction endonuclease Pme I, resulting in the formation of a linear molecule. 4 μg of the plasmid pAdTrack-CMV-SM and 30 units are taken in the reaction. restriction endonucleases Pme I (New England Biolabs, USA), the reaction is carried out in a volume of 100 μl, 2 hours, at 37 ° C. After completion of the reaction, Pme I was inactivated by heating 65 ° C, 20 min. The hydrolyzed plasmid is precipitated by adding 0.1 volumes of sodium acetate and 2 volumes of 96% ethanol, followed by centrifugation at 10,000 × g, 15 min. The precipitate is washed twice with 70% ethanol (centrifuged after adding alcohol at 10,000 × g, 5 min) and dissolved in 8 μl bidistilled water.
9. Проводят электропорацию плазмиды pAdTrack-CMV-SM гидролизованной Pme I в электрокомпетентные клетки AdEasier cells (штамм BJ5183 предтрансформированный плазмидой pAdEasy-1), в которых происходит гомологичная рекомбинация между pAdTrack-CMV-SM и pAdEasy-1. Клетки высаживают на агаризованную среду LB содержащую 25 мкг/мл канамицина. Отбирают 10-15 самых мелких колонии, наращивают их в жидкой среде LB содержащей 25 мкг/мл канамицина и выделяют плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Плазмидную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Pac I. В результате гидролиза должно получаться два фрагмента, один размером более 30 т.п.н., а другой 3 или 4,5 т.п.н. (оба варианта являются пригодными).9. Electroporation of the plasmid pAdTrack-CMV-SM of hydrolyzed Pme I is carried out into electrocompetent AdEasier cells (strain BJ5183 pre-transformed with plasmid pAdEasy-1), in which homologous recombination between pAdTrack-CMV-SM and pAdEasy-1 occurs. Cells are plated on LB agar medium containing 25 μg / ml kanamycin. Select 10-15 the smallest colonies, grow them in LB liquid medium containing 25 μg / ml kanamycin, and plasmid DNA is isolated by alkaline lysis. Plasmid DNA is hydrolyzed with Pac I restriction endonuclease. As a result of hydrolysis, two fragments must be obtained, one larger than 30 kb, and the other 3 or 4.5 kb. (both options are suitable).
10. Один из клонов, дающих правильную картину рестрикции, отбирают и нарабатывают в большом объеме для дальнейшей работы по получению аденовирусных частиц.10. One of the clones giving the correct picture of restriction is selected and produced in large volume for further work on obtaining adenoviral particles.
На Фиг.1 изображена схема вектора pAd-SM.Figure 1 shows a diagram of the vector pAd-SM.
Фрагмент ДНК кодирующий белки SOX2 и C-MYC помещен между сайтами Not I. pCMV - промотор цитомегаловируса, pA - сайт полиаденилирования, EGFP - ген кодирующий флуоресцентный белок EGFP, LITR -левый концевой повтор, RITR -правый концевой повтор, Kan-r -ген устойчивости к канамицину, Ori - бактериальный ориджин репликации, Ad5d1,3 - геном аденовируса. серотипа 5 с удаленными генами E1 и E3.A DNA fragment encoding SOX2 and C-MYC proteins is located between the Not I. sites. PCMV is the cytomegalovirus promoter, pA is the polyadenylation site, EGFP is the gene encoding the fluorescent protein EGFP, LITR is the left terminal repeat, RITR is the right terminal repeat, Kan-r gene resistance to kanamycin, Ori - bacterial origin of replication, Ad5d1,3 - adenovirus genome. serotype 5 with deleted genes E1 and E3.
Полученная генетическая конструкция pAd-SM построенная путем гомологичной рекомбинации вектора pAdEasy-1, содержащего основную часть генома аденовируса и плазмиды pAdTrack-CMV, в которую помещены фрагменты кДНК генов SOX2 и C-MYC человека, соединенные нуклеотидной последовательностью кодирующей P2A-пептид. Полученная в результате гомологичной рекомбинации плазмида pAd-SM содержит фрагмент SOX2-P2A-c-MYC под контролем конститутивного промотора CMV, что позволяет получать аденовирусные частицы для одновременной доставки генов и экспрессии белков SOX2 и C-MYC в клетках человека. Кроме того, pAd-SM содержит ген кодирующий флуоресцентный белок EGFP, под контролем промотора CMV, что позволяет отслеживать трансдукцию клеток и элиминацию вирусной ДНК из клетки.The resulting pAd-SM genetic construct constructed by homologous recombination of the pAdEasy-1 vector containing the main part of the adenovirus genome and the pAdTrack-CMV plasmid, in which cDNA fragments of the human SOX2 and C-MYC genes are connected, connected by a nucleotide sequence encoding a P2A peptide. The pAd-SM plasmid obtained as a result of homologous recombination contains the SOX2-P2A-c-MYC fragment under the control of the constitutive CMV promoter, which makes it possible to obtain adenoviral particles for the simultaneous gene delivery and expression of SOX2 and C-MYC proteins in human cells. In addition, pAd-SM contains the gene encoding the EGFP fluorescent protein, under the control of the CMV promoter, which allows tracking of cell transduction and elimination of viral DNA from the cell.
Список использованной литературыList of references
1. Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126(4): p.663-76.1. Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006.126 (4): p.663-76.
2. Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007. 131(5): p.861-72.2. Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007. 131 (5): p. 861-72.
3. Yu, J., et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318(5858): p.1917-20.3. Yu, J., et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318 (5858): p. 1917-20.
4. Wu, S.M. and K. Hochedlinger, Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat Cell Biol, 2011. 13(5): p.497-505.4. Wu, S.M. and K. Hochedlinger, Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat Cell Biol, 2011.13 (5): p. 497-505.
5. Park, I.H., et al., Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell, 2008. 134(5): p.877-86.5. Park, I. H., et al., Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell, 2008. 134 (5): p. 877-86.
6. Soldner, F., et al., Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell, 2009. 136(5): p.964-77.6. Soldner, F., et al., Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell, 2009 136 (5): p. 964-77.
7. Ebert, A.D., et al., Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature, 2009. 457(7227): p.277-80.7. Ebert, A.D., et al., Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature, 2009.457 (7227): p. 277-80.
8. Dimos, J.T., et al., Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science, 2008. 321(5893): p.1218-21.8. Dimos, J.T., et al., Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science, 2008. 321 (5893): p. 1218-21.
9. Yamanaka, S., A fresh look at iPS cells. Cell, 2009. 137(1): p.13-7.9. Yamanaka, S., A fresh look at iPS cells. Cell, 2009.137 (1): p.13-7.
10. Carey, B.W., et al., Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(1): p.157-62.10. Carey, B.W., et al., Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009.106 (1): p. 157-62.
11. Okita, K., et al., Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008. 322(5903): p.949-53.11. Okita, K., et al., Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008. 322 (5903): p. 949-53.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012101366/10A RU2495127C2 (en) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | RECOMBINANT PLASMID pAd-SM, CODING HUMAN PROTEINS SOX2 AND C-MYC, BEING BASE FOR PRODUCTION OF VIRULENT ADENOVIRUSES DESIGNED FOR PRODUCTION OF INDUCED PLURIPOTENT HUMAN CELLS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012101366/10A RU2495127C2 (en) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | RECOMBINANT PLASMID pAd-SM, CODING HUMAN PROTEINS SOX2 AND C-MYC, BEING BASE FOR PRODUCTION OF VIRULENT ADENOVIRUSES DESIGNED FOR PRODUCTION OF INDUCED PLURIPOTENT HUMAN CELLS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2495127C2 true RU2495127C2 (en) | 2013-10-10 |
Family
ID=49303134
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012101366/10A RU2495127C2 (en) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | RECOMBINANT PLASMID pAd-SM, CODING HUMAN PROTEINS SOX2 AND C-MYC, BEING BASE FOR PRODUCTION OF VIRULENT ADENOVIRUSES DESIGNED FOR PRODUCTION OF INDUCED PLURIPOTENT HUMAN CELLS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2495127C2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110044895A1 (en) * | 2007-07-12 | 2011-02-24 | Berry David A | Methods and compositions for reducing stemness in oncogenesis |
| US20110143397A1 (en) * | 2005-08-23 | 2011-06-16 | Katalin Kariko | Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells |
-
2012
- 2012-01-13 RU RU2012101366/10A patent/RU2495127C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110143397A1 (en) * | 2005-08-23 | 2011-06-16 | Katalin Kariko | Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells |
| US20110044895A1 (en) * | 2007-07-12 | 2011-02-24 | Berry David A | Methods and compositions for reducing stemness in oncogenesis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3456821B1 (en) | Non-integrating dna vectors for the genetic modification of cells | |
| CN102741405B (en) | System for increasing gene expression, and vector supporting said system | |
| KR100379569B1 (en) | Adenoviral vectors of animal origin and use thereof in gene therapy | |
| US20240139319A1 (en) | Gene silencing | |
| EP2669381A1 (en) | Method for expression of heterologous proteins using a recombinant negative-strand RNA virus vector comprising a mutated P protein | |
| JP2008545406A5 (en) | ||
| WO2014007120A1 (en) | Cell capable of producing adeno-associated virus vector | |
| WO2019057774A1 (en) | Non-integrating dna vectors for the genetic modification of cells | |
| KR20180105670A (en) | Methods and vectors for producing vector-free inducible pluripotent stem cells | |
| US8642045B2 (en) | Recombinant virus vector originating in HHV-6 or HHV-7, method of producing the same, method of transforming host cell using the same, host cell transformed thereby and gene therapy method using the same | |
| JPWO2019246486A5 (en) | ||
| RU2495127C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID pAd-SM, CODING HUMAN PROTEINS SOX2 AND C-MYC, BEING BASE FOR PRODUCTION OF VIRULENT ADENOVIRUSES DESIGNED FOR PRODUCTION OF INDUCED PLURIPOTENT HUMAN CELLS | |
| CN114163508B (en) | Amino acid sequence capable of destroying cells, related nucleotide sequence and related application | |
| CN113058041B (en) | Product for treating pompe disease | |
| CN115066499A (en) | Culture system for efficient production of gene transfer vectors | |
| RU2477314C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID pSM-ZsGreen, CODING HUMAN PROTEINS SOX2 AND C-MYC AND FLUORESCENT PROTEIN ZsGreen, INTENDED TO PRODUCE INDUCED PLURIPOTENT HUMAN STEM CELLS | |
| WO2025036482A1 (en) | Type ii cas protein, crispr-cas system and uses thereof | |
| CN114941012B (en) | Recombinant mesenchymal stem cells and uses thereof | |
| CN114736902B (en) | sgRNA sequence for NNT gene demethylation, construction method of editing system and its application | |
| RU2495124C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID pSN-ZsGreen, CODING SOX2 AND NANOG HUMAN PROTEINS AND FLUORESCENT PROTEIN ZsGreen, DESIGNED TO PRODUCE INDUCED PLURIPOTENT HUMAN STEM CELLS | |
| CN113652428A (en) | Application of nuclear membrane protein knockdown in stem cell transplantation | |
| Yu | Modified mRNA for In Vitro Reprogramming | |
| RU2495125C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID pOK-DsRed2, CODING OCT4 AND KLF4 HUMAN PROTEINS AND FLUORESCENT PROTEIN DsRed2, DESIGNED TO PRODUCE INDUCED PLURIPOTENT HUMAN STEM CELLS | |
| CN117050935A (en) | Inducer for inducing pig pluripotent cells, construction method and application thereof | |
| RU2495126C2 (en) | Recombinant plasmid pol-dsred2, coding oct4 and lin28 human proteins and fluorescent protein dsred2, designed to produce induced pluripotent human stem cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200114 |