RU2490722C1 - Method for experimental establishment of thrombosed vein flow - Google Patents
Method for experimental establishment of thrombosed vein flow Download PDFInfo
- Publication number
- RU2490722C1 RU2490722C1 RU2012116715/14A RU2012116715A RU2490722C1 RU 2490722 C1 RU2490722 C1 RU 2490722C1 RU 2012116715/14 A RU2012116715/14 A RU 2012116715/14A RU 2012116715 A RU2012116715 A RU 2012116715A RU 2490722 C1 RU2490722 C1 RU 2490722C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vein
- cells
- thrombosed
- thrombus
- mesenchymal stem
- Prior art date
Links
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 claims description 20
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 10
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003111 iliac vein Anatomy 0.000 claims description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 4
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 7
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 6
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 5
- -1 1 ng / ml) Proteins 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 210000004977 neurovascular bundle Anatomy 0.000 description 3
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 2
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 229960002593 desoximetasone Drugs 0.000 description 2
- VWVSBHGCDBMOOT-IIEHVVJPSA-N desoximetasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H](C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O VWVSBHGCDBMOOT-IIEHVVJPSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009088 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940076005 apoptosis modulator Drugs 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000000968 medical method and process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для восстановления кровотока в тканях региона тромбированной вены.The invention relates to experimental medicine and can be used to restore blood flow in the tissues of the thrombosed vein region.
Профилактика и лечение сосудистых тромбозов является одной из острейших и наиболее значимых проблем современной медицины во всем мире. При этом истинная частота тромбоза глубоких вен остается неизвестной, поскольку заболевание зачастую протекает бессимптомно. Около 30% пациентов, перенесших тромбоз, погибают в ближайший месяц, а еще у 20% в течение 3 месяцев развивается рецидив заболевания (Шевченко Ю.Л., Стойко Ю.М., Лыткина М.И. Основы клинической флебологии. М: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. 312 с.).Prevention and treatment of vascular thrombosis is one of the most acute and most significant problems of modern medicine worldwide. In this case, the true frequency of deep vein thrombosis remains unknown, since the disease is often asymptomatic. About 30% of patients who have undergone thrombosis die in the coming month, and another 20% develop relapse of the disease within 3 months (Shevchenko Yu.L., Stoyko Yu.M., Lytkina M.I. Fundamentals of clinical phlebology. M: OJSC "Publishing house" Medicine ", 2005. 312 p.).
Реваскуляризация пораженных вследствие сосудистого тромбоза тканей проходит двумя основными путями: развитием коллатерального кровотока и реканализацией тромбированной вены. Оба этих процесса протекают в течение длительного времени, достаточного для некротизирования заинтересованных тканей и, даже, органов и конечностей. Поэтому актуальной задачей является разработка оптимальной технологии стимуляции ангиогенеза для восстановления кровотока в ишемизированной зоне.Revascularization of tissues affected by vascular thrombosis occurs in two main ways: the development of collateral blood flow and the recanalization of a thrombosed vein. Both of these processes occur for a long time, sufficient for necrotizing the tissues and, even, the organs and limbs. Therefore, the urgent task is to develop the optimal technology for stimulating angiogenesis to restore blood flow in the ischemic zone.
Ангиогенез - процесс образования новых кровеносных сосудов за счет ветвления и разрастания предсуществующего кровеносного русла. В ходе образования новых кровеносных сосудов можно выделить несколько этапов: миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток и формирование ими новых капилляров; миграцию и пролиферацию субэндотелиальных клеток (перицитов) и их взаимодействие с эндотелиальными клетками. Взаимодействие перицитов с эндотелиальными клетками необходимо для формирования функционально зрелой и стабильной сосудистой сети, обеспечивающей нормальную трофику окружающих тканей. Все перечисленные этапы находятся под контролем целого ряда факторов, стимулирующих или подавляющих рост и/или стабилизацию сосудов. К таким факторам относятся факторы роста, цитокины, гормоны и их метаболиты, модуляторы апоптоза, а также трансмембранные белки, экспрессирующиеся на поверхности клеток (кадгерины, интегрины и эфрины).Angiogenesis is the process of the formation of new blood vessels due to branching and proliferation of the preexisting bloodstream. During the formation of new blood vessels, several stages can be distinguished: migration and proliferation of endothelial cells and the formation of new capillaries by them; migration and proliferation of subendothelial cells (pericytes) and their interaction with endothelial cells. The interaction of pericytes with endothelial cells is necessary for the formation of a functionally mature and stable vascular network, which ensures normal trophism of the surrounding tissues. All of these steps are under the control of a number of factors that stimulate or inhibit the growth and / or stabilization of blood vessels. Such factors include growth factors, cytokines, hormones and their metabolites, apoptosis modulators, as well as transmembrane proteins expressed on the surface of cells (cadherins, integrins and etherins).
Возможность регулирования процесса формирования новых кровеносных сосудов открывает большие перспективы при разработке методов лечения и профилактики целого ряда тяжелых патологических состояний человека, в частности ишемических заболеваний сердца и нижних конечностей, которые сегодня являются одной из наиболее распространенных причин потери трудоспособности и смертности населения в развитых странах. Несмотря на внедрение в практику здравоохранения эффективных хирургических и медикаментозных методов лечения такого рода заболеваний для значительной категории больных единственной альтернативой является терапия, направленная на стимуляцию роста новых сосудов в зоне ишемии.The ability to regulate the formation of new blood vessels opens up great prospects in the development of methods of treatment and prevention of a number of severe pathological conditions of a person, in particular ischemic heart and lower limb diseases, which today are one of the most common causes of disability and mortality in developed countries. Despite the introduction of effective surgical and medical methods of treating such diseases into healthcare practice, for a significant category of patients, the only alternative is therapy aimed at stimulating the growth of new vessels in the ischemic zone.
Сравнительно недавно для стимуляции ангиогенеза стали использовать мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (прогениторные клетки). С этой тактикой, получившей название терапевтического ангиогенеза, современная медицина связывает большие надежды, что определяет актуальность новых исследований и разработок в данной области.More recently, bone marrow mesenchymal stem cells (progenitor cells) have been used to stimulate angiogenesis. With this tactic, called therapeutic angiogenesis, modern medicine has high expectations, which determines the relevance of new research and development in this area.
Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (МСК) обладают способностью к дифференцировке в эндотелиоциты и перициты, что позволяет применять такие клетки для ускорения реваскуляризации тканей с нарушенной микроциркуляцией (Modarai B., Burnand K.G., Sawyer B. and Smith A. Endothelial progenitor cells are recruited into resolving venous thrombi. Circulation, 2005, vol. 111, №20, p.2645-2653). Реваскуляризация тромба, быстрая реканализация вены и восстановление кровообращения в ишемизированных в результате тромбоза тканях были достигнуты в экспериментальных моделях с проангиогенными агентами (Santo S.D., Tepper O.M., Ballmoos von M.W. et al. Cell-based therapy facilitates venous thrombus resolution. Thromb. Haemost, 2009, vol. 101, №3, p.460-464).Mesenchymal stem cells of the bone marrow (MSC) have the ability to differentiate into endotheliocytes and pericytes, which allows the use of such cells to accelerate revascularization of tissues with impaired microcirculation (Modarai B., Burnand KG, Sawyer B. and Smith A. Endothelial progenitor cells are recruited into resolving venous thrombi. Circulation, 2005, vol. 111, No. 20, p. 2645-2653). Thrombus revascularization, rapid vein recanalization, and restoration of blood circulation in tissues ischemic as a result of thrombosis were achieved in experimental models with pro-angiogenic agents (Santo SD, Tepper OM, Ballmoos von MW et al. Cell-based therapy facilitates venous thrombus resolution. Thromb. Haemost, 2009 vol. 101, No. 3, p. 460-464).
Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ улучшения кровотока после венозного тромбоза путем регуляции уровня цитокинов, связанных с организацией тромба и его реканализацией, заключающийся в следующем. Предварительно моделируют хронический тромбоз нижней полой вены. Затем в экспериментально индуцированный тромб нижней полой вены доступом через бедренную вену инъекционно вводят эндотелиальные прогениторные клетки, полученные из костного мозга молодых крыс, культивированные с человеческим фибронектином (Sigma) в питательной среде ЕВМ-2 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, рекомбинантным человеческим фактором роста васкулярного эндотелия (VEGF, 1000 нг/мл), рекомбинантным бычьим основным фактором роста фибробластов (bFGF, 1 нг/мл), человеческим эпидермальным фактором роста (EGF, 10 нг/ мл), гидрокортизоном (1 мг / мл) и антибиотиками (Li X.Q., Meng Q.Y. and Wu H.R. Effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cell transplantation on vein microenvi-ronment in a rat model of chronic thrombosis. Chin. Med. J. (Engl), 2007, vol. 120, №24, p.2245-2249). Способ позволяет существенно повысить уровень фактора роста эндотелия сосудов, ангиопоэтина-1, моноцитарного хемотаксического белка-1, мРНК через 28 дней после трансплантации в тканях около тромба.The closest to the claimed method, the prototype, is a method for improving blood flow after venous thrombosis by regulating the level of cytokines associated with the organization of the thrombus and its recanalization, which is as follows. Pre-model chronic thrombosis of the inferior vena cava. Then, endothelial progenitor cells obtained from the bone marrow of young rats cultured with human fibronectin (Sigma) in EBM-2 medium supplemented with 5% fetal calf serum, recombinant human growth factor, are injected into the experimentally induced thrombus of the inferior vena cava by injection through the femoral vein. vascular endothelium (VEGF, 1000 ng / ml), recombinant bovine major fibroblast growth factor (bFGF, 1 ng / ml), human epidermal growth factor (EGF, 10 ng / ml), hydrocort zone (1 mg / ml) and antibiotics (Li XQ, Meng QY and Wu HR Effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cell transplantation on vein microenvi ronment in a rat model of chronic thrombosis. Chin. Med. J. (Engl) , 2007, vol. 120, No. 24, p. 2245-2249). The method allows to significantly increase the level of vascular endothelial growth factor, angiopoietin-1, monocytic chemotactic protein-1, mRNA 28 days after transplantation in tissues near the thrombus.
Недостатками известного способа являются недостаточная эффективность способа (повышение уровня роста цитокинов наблюдается только на 28 день), сложность моделирования хронического тромбоза (доступ к нижней полой вене через брюшную полость), использование только одного класса клеток (предшественников эндотелиоцитов), отсутствие появления новых сосудов в регионе тромбированной вены.The disadvantages of this method are the lack of effectiveness of the method (an increase in the level of cytokine growth is observed only on day 28), the difficulty of modeling chronic thrombosis (access to the inferior vena cava through the abdominal cavity), the use of only one class of cells (precursors of endotheliocytes), the absence of new vessels in the region thrombosed veins.
Технической задачей изобретения является сокращение сроков восстановления кровотока в регионе тромбированной вены.An object of the invention is to reduce the restoration of blood flow in the region of a thrombosed vein.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.The problem is achieved by the proposed method, which consists in the following.
Предварительно осуществляют моделирование острого венозного тромбоза стандартным способом. Для этого под общим ингаляционным эфирным наркозом у лабораторных животных по внутренней стороне бедра выполняют разрез кожи от точки, расположенной на 0,5 см выше паховой складки до нижней трети бедра. Затем тупым способом выделяют сосудистый пучок, на бедренную вену ниже на 0,5 см от места впадения ее в глубокую подвздошную вену накладывают лигатуру плетеной нерассасывающейся нитью 4/0. Далее бедренную вену пунктируют на уровне границы средней и нижней трети бедра и вводят 0,03-0,05 мл раствора тромбина (0,5 Ед/мл), а место инъекции придавливают в течение 3 мин. (до формирования тромба), для исключения ретроградного распространения введенного препарата. Затем кожный разрез ушивают непрерывным «П-образным» швом и обрабатывают спиртом.Preliminary modeling of acute venous thrombosis is carried out in a standard way. To do this, under a general inhalation ether anesthesia in laboratory animals, a skin incision is performed on the inner side of the thigh from a point located 0.5 cm above the inguinal fold to the lower third of the thigh. Then, a vascular bundle is isolated in a blunt way, a ligature of 4/0 woven non-absorbable suture is placed on the femoral vein 0.5 cm lower from where it flows into the deep iliac vein. Next, the femoral vein is punctured at the border of the middle and lower third of the thigh and 0.03-0.05 ml of thrombin solution (0.5 U / ml) is injected, and the injection site is pressed for 3 minutes. (before the formation of a blood clot), to exclude the retrograde distribution of the administered drug. Then the skin incision is sutured with a continuous "U-shaped" suture and treated with alcohol.
Для восстановления кровотока в тромбированную вену вводят МСК следующим образом. Выполняют хирургический доступ к тромбированной вене, в тромбированную вену ниже сформированного тромба на 0,5 см вводят суспензию МСК с концентрацией не менее 1×106 клеток/мл в количестве 30-50 мкл. Введение МСК осуществляют в направлении тока крови, от периферии к центру. После процедуры кожу ушивают узловыми швами.To restore blood flow into the thrombosed vein, MSCs are administered as follows. Surgical access to the thrombosed vein is performed, a suspension of MSCs with a concentration of at least 1 × 10 6 cells / ml in an amount of 30-50 μl is injected into the thrombosed vein below the thrombus formed. The introduction of MSCs is carried out in the direction of blood flow, from the periphery to the center. After the procedure, the skin is sutured with interrupted sutures.
Выделение МСК осуществляют стандартным способом посредством вымывания костного мозга из эпифизов бедренных костей, взятых под эфирным наркозом у крыс. Клетки культивируют в стандартных условиях, оптимизированных для успешной экспансии мезенхимальных стволовых клеток (Human mesenchymal related products and protocols // StemCell Technologies - April 2002). В результате получают суспензию МСК в культуральной среде с концентрацией не менее 1×106 клеток/мл. Характеристику полученных клеток проводят по описанным для МСК морфологии, фенотипическим маркерам и функциональным свойствам (Jones E.A., Kinsey S.E., English A. et al. Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells. // Arthritis Rheum. - 2002. - Vol.46. - №12. - P.3349-3360).Isolation of MSCs is carried out in a standard way by washing the bone marrow from the epiphyses of the femurs taken under ether anesthesia in rats. Cells are cultured under standard conditions optimized for the successful expansion of mesenchymal stem cells (Human mesenchymal related products and protocols // StemCell Technologies - April 2002). The result is a suspension of MSCs in a culture medium with a concentration of at least 1 × 10 6 cells / ml The obtained cells are characterized by the morphology, phenotypic markers and functional properties described for MSCs (Jones EA, Kinsey SE, English A. et al. Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells. // Arthritis Rheum. - 2002. - Vol. 46. - No. 12. - P.3349-3360).
Для отслеживания судьбы (перемещения) введенных клеток и для обеспечения точного контроля над их участием в процессах восстановления кровотока, их подвергают трансфекции геном GFP (green fluorescent protein - зеленый светящийся белок). Трансфекцию проводят согласно рекомендациям производителя, по протоколу для трансфекции суспезионных клеток (Fermentas Part of Thermo Fisher Scientific, www.thermoscientific.com/fermentas). Для введения используют, преимущественно, клетки третьего пассажа, содержащие до 1% предшественников эндотелиальных клеток.To track the fate (movement) of the introduced cells and to ensure precise control over their participation in the processes of blood flow restoration, they are transfected with the GFP (green fluorescent protein) gene. Transfection is carried out according to the manufacturer's recommendations, according to the protocol for transfection of suspension cells (Fermentas Part of Thermo Fisher Scientific, www.thermoscientific.com/fermentas). For administration, mainly cells of the third passage are used, containing up to 1% of the precursors of endothelial cells.
МСК сразу после введения начинают создавать новые сосуды взамен тромбированных или облитерированных или встраиваются в сосуды, растущие из собственных клеток, что обеспечивает ускорение и улучшение реваскуляризация и восстановление адекватного кровотока в регионе тромбированной вены. Введение МСК в тромбированную вену стимулирует ангиогенез, экономит время на миграцию собственных МСК, обеспечивает более быстрый рост и функционирование сосудов. Со временем клетки и структуры, сформированные из введенных извне МСК, постепенно замещаются соответствующими клетками и структурами организма-реципиента.MSCs immediately after administration begin to create new vessels to replace thrombosed or obliterated ones or integrate into vessels growing from their own cells, which provides acceleration and improvement of revascularization and restoration of adequate blood flow in the region of a thrombosed vein. The introduction of MSCs into a thrombosed vein stimulates angiogenesis, saves time for the migration of their own MSCs, and ensures faster growth and functioning of blood vessels. Over time, cells and structures formed from MSCs introduced from outside are gradually replaced by the corresponding cells and structures of the recipient organism.
Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа, являются:The defining differences of the proposed method from the prototype are:
1. Моделируют острый венозный тромбоз путем перевязки бедренной вены ниже на 0,5 см от места впадения ее в глубокую подвздошную вену, введения в вену на уровне границы средней и нижней трети бедра раствора тромбина с последующим придавливанием места инъекции в течение 3 минут, что позволяет быстро сформировать тромб и исключить элиминацию введенного препарата (в прототипе моделируют хронический венозный тромбоз нижней полой вены).1. Acute venous thrombosis is modeled by ligating the femoral vein 0.5 cm lower from where it enters the deep iliac vein, injecting thrombin solution into the vein at the level of the border of the middle and lower third of the thigh, followed by pressing the injection site for 3 minutes, which allows quickly form a blood clot and eliminate the elimination of the administered drug (chronic venous thrombosis of the inferior vena cava is simulated in the prototype).
2. В просвет тромбированной вены, на 0,5 см ниже тромба, вводят суспензию МСК с концентрацией не менее 1×106 клеток/мл в количестве 30-50 мкл, при этом введение суспензии МСК осуществляют в направлении тока крови, от периферии к центру, что позволяет сократить срок восстановления кровотока в регионе тромбированной вены за счет образования новых сосудов из введенных МСК и реканализации при участии МСК тромбированных мелких вен, впадающих в бедренную вену.2. Into the lumen of the thrombosed vein, 0.5 cm below the thrombus, a suspension of MSC is injected with a concentration of at least 1 × 10 6 cells / ml in an amount of 30-50 μl, while the introduction of a suspension of MSC is carried out in the direction of blood flow, from the periphery to to the center, which allows to shorten the period of restoration of blood flow in the thrombosed vein region due to the formation of new vessels from the inserted MSCs and recanalization with the participation of MSCs of thrombosed small veins flowing into the femoral vein.
4. Используют МСК, трансфицированные геном светящегося зеленого белка (GFP, green fluorescent protein), что позволяет сделать более наглядной доказательную базу участия введенных МСК в образовании новых сосудов и реканализации тромбированных вен, а также обеспечить точный контроль над их участием в процессах восстановления кровотока, (светящийся зеленый белок в препаратах тканей региона тромбированной вены доказывает непосредственное участие введенных клеток в образовании новых сосудов и реканализации тромбированных вен).4. Use MSCs transfected with the gene of a luminous green protein (GFP, green fluorescent protein), which makes it possible to make the evidence-based participation of introduced MSCs in the formation of new blood vessels and recanalization of thrombosed veins more visual and to provide precise control over their participation in the processes of blood flow restoration, (the luminous green protein in the tissue preparations of the thrombosed vein region proves the direct participation of the introduced cells in the formation of new vessels and the recanalization of thrombosed veins).
3. Преимущественно используют МСК третьего пассажа, 1% которых представлен предшественниками эндотелиальных клеток, что позволяет дополнительно стимулировать ангиогенез.3. MSCs of the third passage are predominantly used, 1% of which is represented by the precursors of endothelial cells, which allows additional stimulation of angiogenesis.
Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения способа.The invention is illustrated by the following example of a specific implementation of the method.
ПримерExample
Для моделирования острого венозного тромбоза в условиях чистой операционной, при соблюдении правил асептики и антисептики, под общим ингаляционным эфирным наркозом после тщательного состригания волос и обработки кожи спиртом, у лабораторных животных - крыс-самцов инбредной линии Wag, - по внутренней стороне бедра выполняли разрез кожи скальпелем от точки на 0,5 см выше паховой складки до нижней трети бедра. Затем тупым способом выделяли сосудистый пучок, на бедренную вену ниже на 0,5 см от места впадения ее в глубокую подвздошную вену накладывали лигатуру плетеной нерассасывающейся нитью 4/0. Далее вену на уровне границы средней и нижней трети бедра пунктировали и вводили 0,03-0,05 мл раствора тромбина (0,5 Ед/мл), а место инъекции придавливали в течение 3 мин. Затем кожный разрез ушивали непрерывным «П-образным» швом и обрабатывали спиртом.To simulate acute venous thrombosis in a clean operating room, subject to aseptic and antiseptic rules, under general inhaled ether anesthesia after thoroughly cutting the hair and treating the skin with alcohol, in laboratory animals - male rats of the Wag inbred line - a skin incision was performed on the inner thigh with a scalpel from a point 0.5 cm above the inguinal fold to the lower third of the thigh. Then a vascular bundle was isolated in a blunt way, a ligature of 4/0 woven non-absorbable suture was placed on the femoral vein 0.5 cm lower from the place of its entry into the deep iliac vein. Next, a vein was punctured at the level of the border of the middle and lower third of the thigh and 0.03-0.05 ml of a thrombin solution (0.5 U / ml) was injected, and the injection site was pressed for 3 minutes. Then, the skin incision was sutured with a continuous “U-shaped” suture and treated with alcohol.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных костей, взятых под эфирным наркозом у самцов крыс инбредной линии Wag. Для получения культуры МСК, полученную суспензию клеток помещали в культуральные пластиковые флаконы («Nunk», Дания), через 48 часов после эксплантации костного мозга удаляли неприкрепившиеся клетки. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде α-МЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Biolot», Россия) при 37°C в CO2-инкубаторе с 5% CO2 в условиях насыщенной влажности. Среду меняли каждые три дня. При субкультивировании монослойную культуру рассевали в плотности 2500 клеток/см2, используя стандартные растворы Версена и трипсина. Таким образом, клетки культивировали в условиях, оптимизированных для успешной экспансии мезенхимальных стволовых клеток.Mesenchymal stem cells (MSCs) were isolated by washing the bone marrow from the epiphyses of the femur taken under ether anesthesia in male rats of the inbred Wag line. To obtain an MSC culture, the resulting cell suspension was placed in plastic culture bottles (Nunk, Denmark), 48 hours after explantation of the bone marrow, non-adherent cells were removed. Attached cells were cultured in α-MEM medium supplemented with 10% fetal calf serum (Biolot, Russia) at 37 ° C in a CO 2 incubator with 5% CO 2 under saturated humidity. The environment was changed every three days. When subcultured, the monolayer culture was dispersed at a density of 2500 cells / cm 2 using standard Versen and trypsin solutions. Thus, the cells were cultured under conditions optimized for the successful expansion of mesenchymal stem cells.
Характеристику полученных клеток проводили по описанным для МСК морфологии, фенотипическим маркерам и функциональным свойствам (Jones E.A., Kinsey S.E., English A. et al. Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells. // Arthritis Rheum. - 2002. - Vol.46. - №12. - P.3349-3360).The obtained cells were characterized by the morphology described for MSCs, phenotypic markers, and functional properties (Jones EA, Kinsey SE, English A. et al. Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells. // Arthritis Rheum. - 2002. - Vol. 46. - No. 12. - P.3349-3360).
Методами световой и флуоресцентной микроскопии и цитологическими методами окрашивания показали, что культивируемые клетки костного мозга крысы 3-го пассажа при культивировании in vitro прикреплялись к поверхности пластика культивирования, имели фибробластоподобную морфологию, которую сохраняли во время культивирования, поддерживались в культуре при субкультивировании, формировали колонии фибробластоподобных клеток при посеве в низкой плотности, имели фенотип CD90+, CD106+, CD45-, в присутствии линейно-специфичных факторов дифференцировались в клетки костной ткани, жировой и хрящевой ткани.Using light and fluorescence microscopy and cytological staining methods, it was shown that cultured rat bone marrow cells of the 3rd passage were attached to the surface of the cultivation plastic during in vitro cultivation, had fibroblast-like morphology, which was maintained during cultivation, maintained in the culture during subcultivation, and fibroblast-like colonies were formed cells when sowing in low density, had the phenotype CD90 +, CD106 +, CD45-, differentiated in the presence of linearly specific factors in cells of bone tissue, adipose and cartilage.
Для индукции остеогенной дифференцировки использовали дезоксиметазон, аскорбиновую кислоту и β-глицерофосфата («Sigma», США). Остеогенную дифференцировку определяли по 2 маркерам: по активности щелочной фосфатазы и минерализации межклеточного матрикса ионами кальция. Цитохимическое выявление щелочной фосфатазы проводили с использованием нитротетразолиевого синего в присутствии субстрата щелочной фосфатазы 5-бромо-4-хлоро-3-индолила («Sigma», США). Накопление кальция в межклеточном матриксе регистрировали по окрашиванию Ализарином красным («Sigma», США).To induce osteogenic differentiation, deoxymethasone, ascorbic acid, and β-glycerophosphate (Sigma, USA) were used. Osteogenic differentiation was determined by 2 markers: alkaline phosphatase activity and intercellular matrix mineralization by calcium ions. Cytochemical detection of alkaline phosphatase was carried out using nitrotetrazolium blue in the presence of a substrate of alkaline phosphatase 5-bromo-4-chloro-3-indolyl (Sigma, USA). The accumulation of calcium in the intercellular matrix was recorded by staining with Alizarin red (Sigma, USA).
Для индукции хондрогенной дифференцировки использовали среду культивирования с высоким содержанием глюкозы дезоксиметазон, аскорбиновую кислоту, трансформирующий фактора роста 1 («Sigma», США). Хондрогенную дифференцировку определяли по 3 маркерам: накопление внеклеточных протеогликанов, сульфатированных глюкозоаминов и синтезу коллагена II типа («Sigma», США). Цитохимическое выявление внеклеточных протеогликанов, сульфатированных глюкозоаминов проводили с использованием Алцианового голубого и толуидинового синего («Sigma», США), соответственно. Для выявления коллагена 2 типа использовали специфичные коллагену 2 типа антитела (Abeam, USA).To induce chondrogenic differentiation, a cultivation medium with a high glucose content, deoxymethasone, ascorbic acid, transforming growth factor 1 (Sigma, USA) was used. Chondrogenic differentiation was determined by 3 markers: accumulation of extracellular proteoglycans, sulfated glucose amines, and type II collagen synthesis (Sigma, USA). Cytochemical detection of extracellular proteoglycans, sulfated glucose amines was carried out using Alcian blue and toluidine blue (Sigma, USA), respectively. To detect type 2 collagen, antibodies specific to collagen type 2 were used (Abeam, USA).
Для индукции адипогенной дифференцировки использовали индометацин, изобутил-метилксантин, гидрокортизон («Sigma», США). Адипогенную дифференцировку определяли по накоплению липидных капель в клетках. Цитохимическое выявление липидных капель во внутриклеточных вакуолях проводили с использованием красителя нейтрального жира Oil Red («Sigma», США). (Pittenger. M.F. Mackay A.M., Beck S.C. 1999. Multi-lineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Sciense. 284, 143-147).Indomethacin, isobutyl-methylxanthine, and hydrocortisone (Sigma, USA) were used to induce adipogenic differentiation. Adipogenic differentiation was determined by the accumulation of lipid drops in cells. Cytochemical detection of lipid droplets in intracellular vacuoles was carried out using a neutral fat dye Oil Red (Sigma, USA). (Pittenger. M.F. Mackay A.M., Beck S.C. 1999. Multi-lineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Sciense. 284, 143-147).
Для исследования присутствия предшественников эндотелиальных клеток в культуре клеток третьего пассажа, клетки культивировали в присутствии DIL-AC-LDL (BTI, MA, USA), FITC-Lectin-ulex europaeus agglutinin (UEA)-1 (Sigma, USA). Часть культивируемых клеток (1%) расщепляла ацилированный липопротеин низкой плотности, меченный Dil (iCLDLDil), вызывающий внутриклеточное окрашивание, и клеточная поверхность, которых взаимодействовала с Лектином, приводящим к окрашиванию поверхности клетки. Двойное окрашивание клеток свидетельствовало о присутствии в культуре мезенхимальных стволовых клеток - предшественников эндотелиальных клеток (Chinese Medical Journal 2007; 120(24): 2245-2249).To investigate the presence of endothelial cell precursors in the third passage cell culture, cells were cultured in the presence of DIL-AC-LDL (BTI, MA, USA), FITC-Lectin-ulex europaeus agglutinin (UEA) -1 (Sigma, USA). Part of the cultured cells (1%) cleaved acylated low-density lipoprotein labeled with Dil (iCLDLDil), causing intracellular staining, and the cell surface, which interacted with Lectin, leading to staining of the cell surface. Double staining of cells indicated the presence of mesenchymal stem cells, the precursors of endothelial cells, in the culture (Chinese Medical Journal 2007; 120 (24): 2245-2249).
Для обеспечения возможности точного контроля над участием МСК в процессах восстановления кровотока, последние были трансфицированы геном GFP (green fluorescent protein - зеленый светящийся белок). Трансфекцию проводили согласно рекомендациям производителя, по протоколу для трансфекции суспезионных клеток (Fermentas Part of Thermo Fisher Scientific, www.thermoscientific.com/fermentas). Клетки с геном GFP светятся зеленым цветом при облучении ультрафиолетовым светом. Ген GFP неизменным передается дочерним клеткам, и они также начинают светиться при соответствующих условиях.To enable precise control over the participation of MSCs in the processes of blood flow restoration, the latter were transfected with the GFP gene (green fluorescent protein). Transfection was performed according to the manufacturer's recommendations, according to the protocol for transfection of suspension cells (Fermentas Part of Thermo Fisher Scientific, www.thermoscientific.com/fermentas). Cells with the GFP gene glow green when exposed to ultraviolet light. The GFP gene is invariably transmitted to daughter cells, and they also begin to glow under appropriate conditions.
Введение мезенхимальных стволовых клеток осуществляли следующим образом.The introduction of mesenchymal stem cells was carried out as follows.
После состригания волосяного покрова и обработки кожи спиртом производили хирургический доступ к тромбированной вене, далее в тромбированную вену, на 0,5 см ниже сформированного тромба, вводили внутривенно суспензию МСК с концентрацией не менее 1×106 клеток/мл в количестве 30-50 мкл. Введение МСК осуществляли в направлении тока крови, от периферии к центру. После процедуры кожу ушивали узловыми швами с помощью нити викрил «3-0».After cutting the hair and treating the skin with alcohol, surgical access was made to the thrombosed vein, then to the thrombosed vein, 0.5 cm below the thrombus formed, an MSC suspension was injected intravenously with a concentration of at least 1 × 10 6 cells / ml in an amount of 30-50 μl . The introduction of MSCs was carried out in the direction of blood flow, from the periphery to the center. After the procedure, the skin was sutured with interrupted sutures using a 3-0 vikril thread.
Через 1 неделю после внутривенного введения МСК в межфасцикулярных пространствах поперечно-полосатой мышечной ткани бедра, где проходят сосудисто-нервные пучки, обнаружено присутствие множества кровеносных сосудов с облитерированным просветом. О поражении мелких сосудов при тромбозе магистральной вены свидетельствует наличие в мышечной ткани варикозно измененных сосудов (фиг.1).1 week after the intravenous administration of MSCs in the interfascial spaces of the striated muscle tissue of the thigh, where the neurovascular bundles pass, the presence of many blood vessels with obliterated lumen was detected. The damage of small vessels with thrombosis of the main vein is indicated by the presence of varicose vessels in the muscle tissue (Fig. 1).
Через 2 недели после введения МСК в тромбированую вену между пучками поперечно-полосатой мышечной ткани бедра были найдены сосуды с широким просветом, в котором находились остатки тромба с макрофагами, также в таких сосудисто-нервных пучках присутствовали сосуды с полностью облитерированным просветом (остатки сосудов) (фиг.2). В массиве мышц бедра были найдены сосуды венозного типа с ярким свечением в стенке. Число таких сосудов со специфическим свечением значительно возросло, они встречались практически у каждого животного и неоднократно (фиг.3).2 weeks after the introduction of MSCs into the thrombosed vein between the bundles of the striated muscle tissue of the thigh, vessels with a wide lumen were found, in which there were remnants of a thrombus with macrophages, also vessels with a completely obliterated lumen (vascular remains) were present in such neurovascular bundles ( figure 2). Venous vessels with bright glow in the wall were found in the thigh muscle mass. The number of such vessels with specific glow increased significantly, they were found in almost every animal and repeatedly (Fig. 3).
Учитывая появление значительного числа таких сосудов, можно заключить, что восстановление кровотока в регионе тромбированной вены, в мелких ее ветвях, также тромбированных, максимально происходит в течение 2 недель после введения МСК в просвет магистральной вены с тромбозом.Considering the appearance of a significant number of such vessels, we can conclude that the restoration of blood flow in the region of the thrombosed vein, in its small branches, also thrombosed, occurs maximally within 2 weeks after the introduction of MSCs into the lumen of the main vein with thrombosis.
На 3 неделе в мышечной ткани по ходу сосудисто-нервных пучков были обнаружены значительные прослойки плотной волокнистой соединительной ткани с фрагментами облитерированных сосудов (фиг.4) - результат склеротической трансформации тромбированных мелких ветвей магистральной вены. На этот срок уже отсутствовали сосуды со специфическим свечением в стенке, расположенные в мышечном массиве бедра, но эти сосуды имели признаки варикозных изменений: очень широкий растянутый просвет и на гистологическом срезе представлены в виде цепочки (поперечный срез через извитой сосуд). Остаточных признаков тромбоза в сосудах уже найдено не было.At 3 weeks in the muscle tissue along the neurovascular bundles were found significant layers of dense fibrous connective tissue with fragments of obliterated vessels (figure 4) - the result of sclerotic transformation of thrombosed small branches of the main vein. For this period, there were no vessels with specific glow in the wall located in the muscle mass of the thigh, but these vessels had signs of varicose changes: a very wide elongated lumen and on the histological section are presented in the form of a chain (transverse section through a convoluted vessel). There were no residual signs of thrombosis in the vessels.
В более отдаленные сроки (4-5 недель) сосуды, проходящие в мышечной ткани, не имели значительных патологических изменений и в большинстве случаев не содержали в стенке светящихся объектов.In a more distant period (4-5 weeks), the vessels passing in the muscle tissue did not have significant pathological changes and in most cases did not contain luminous objects in the wall.
Таким образом, восстановление кровотока в регионе тромбированной вены, в мелких ее ветвях, также тромбированных, завершается через две недели после введения МСК в просвет такого сосуда.Thus, the restoration of blood flow in the region of a thrombosed vein, in its small branches, also thrombosed, is completed two weeks after the introduction of MSCs into the lumen of such a vessel.
Исчезновение свечения в стенке сосудов объясняется тем, что сначала сосуды образуются с участием введенных МСК, трансфицированных геном GFP, затем МСК (и клетки, в которые дифференцировались введенные МСК), постепенно замещаются собственными клетками, не несущими ген GFP.The disappearance of the luminescence in the vessel wall is explained by the fact that at first the vessels are formed with the introduction of MSCs transfected with the GFP gene, then MSCs (and cells into which the introduced MSCs differentiated) are gradually replaced by their own cells that do not carry the GFP gene.
Использование предлагаемого способа позволит существенно (в два раза) ускорить реваскуляризацию тромба и восстановить адекватный кровоток в тканях, находящихся в регионе тромбированной вены.Using the proposed method will significantly (twice) accelerate the thrombus revascularization and restore adequate blood flow in tissues located in the region of the thrombosed vein.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012116715/14A RU2490722C1 (en) | 2012-04-24 | 2012-04-24 | Method for experimental establishment of thrombosed vein flow |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012116715/14A RU2490722C1 (en) | 2012-04-24 | 2012-04-24 | Method for experimental establishment of thrombosed vein flow |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2490722C1 true RU2490722C1 (en) | 2013-08-20 |
Family
ID=49162988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012116715/14A RU2490722C1 (en) | 2012-04-24 | 2012-04-24 | Method for experimental establishment of thrombosed vein flow |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2490722C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2645407C1 (en) * | 2017-04-04 | 2018-02-21 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный университет" | Method of modelling blood flow disturbance on main artery |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6268337B1 (en) * | 1997-03-24 | 2001-07-31 | Eli Lilly And Company | Methods for treating vascular disorders using activated protein C |
| RU2323252C1 (en) * | 2006-10-25 | 2008-04-27 | Антонина Ивановна Колесникова | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo |
| RU2361529C2 (en) * | 2005-09-12 | 2009-07-20 | Областное Государственное Учреждение Здравоохранения Центр Организации Специализированной Медицинской Помощи "Челябинский Государственный Институт Лазерной Хирургии" | Method of surgical treatment of heart diseases of ischemic genesis |
-
2012
- 2012-04-24 RU RU2012116715/14A patent/RU2490722C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6268337B1 (en) * | 1997-03-24 | 2001-07-31 | Eli Lilly And Company | Methods for treating vascular disorders using activated protein C |
| RU2361529C2 (en) * | 2005-09-12 | 2009-07-20 | Областное Государственное Учреждение Здравоохранения Центр Организации Специализированной Медицинской Помощи "Челябинский Государственный Институт Лазерной Хирургии" | Method of surgical treatment of heart diseases of ischemic genesis |
| RU2323252C1 (en) * | 2006-10-25 | 2008-04-27 | Антонина Ивановна Колесникова | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LI XQ et al. Effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cell transplantation on vein microenvironment in a rat model of chronic thrombosis. Chin. Med. J. (Engl). 2007 Dec. 20; 120(24): 2245-9. * |
| ШЕВЧЕНКО E.К. Стимуляция ангиогенеза с помощью генетически модифицированных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, гиперэкспрессирующих фактор роста эндотелия сосудов. Реферат. 2011. Найдено в Интернет 10.01.2013 http://webcache.googleusercontent.com/search?q. MODARAI B. et al. Endothelial progenitor cells are recruited into resolving venous thrombi. Circulation. 2005 May 24; 111(20): 2645-53. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2645407C1 (en) * | 2017-04-04 | 2018-02-21 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный университет" | Method of modelling blood flow disturbance on main artery |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Mechanosensitive Piezo1 in endothelial cells promotes angiogenesis to support bone fracture repair | |
| Gu et al. | Application of marrow mesenchymal stem cell‐derived extracellular matrix in peripheral nerve tissue engineering | |
| Nie et al. | Targeted delivery of adipose‐derived stem cells via acellular dermal matrix enhances wound repair in diabetic rats | |
| JP6286689B2 (en) | Cosmetic or skin regeneration promoter using non-human stem cell culture supernatant as raw material, and protein iontophoresis method | |
| Kober et al. | Generation of a fibrin based three‐layered skin substitute | |
| Cho et al. | Regulation of endothelial cell activation and angiogenesis by injectable peptide nanofibers | |
| Sheng et al. | Adipose tissue‐derived stem cells (ADSC s) transplantation promotes regeneration of expanded skin using a tissue expansion model | |
| CN109666629A (en) | The excretion body in human pluripotent stem cells source, preparation and purposes based on the excretion body | |
| Xiao et al. | Promotion of hair growth by conditioned medium from extracellular matrix/stromal vascular fraction gel in C57BL/6 mice | |
| Landau et al. | Proposed methods to improve the survival of adipose tissue in autologous fat grafting | |
| US20140294780A1 (en) | Compositions and methods for induction and modulation of angiogenesis and methods and assays for identifying angiogenesis modulators | |
| Xing et al. | Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering | |
| Tang et al. | The enhancement of endothelial cell therapy for angiogenesis in hindlimb ischemia using hyaluronan | |
| CN104324053A (en) | Dog stem cell excreted factor repair liquid capable of quickly healing dog wound tissue | |
| Montes-Medina et al. | Effect of bone marrow stromal cells in combination with biomaterials in early phases of distraction osteogenesis: An experimental study in a rabbit femur model | |
| KR20210021165A (en) | The pharmaceutical composition for wound healing comprising conditioned medium containing cell spheroid derived from adipose-derived stem cell | |
| Zhang et al. | Bioprinted dermis with human adipose tissue‐derived microvascular fragments promotes wound healing | |
| Yao et al. | Intermittent hydrostatic pressure promotes cartilage repair in an inflammatory environment through hippo‐YAP signaling in vitro and in vivo | |
| RU2490722C1 (en) | Method for experimental establishment of thrombosed vein flow | |
| Kwon et al. | Regeneration of Chronic Rotator Cuff Tear in a Rabbit Model: Synergetic Benefits of Human Umbilical Cord Blood‐Derived Mesenchymal Stem Cells, Polydeoxyribonucleotides, and Microcurrent Therapy | |
| CN118845837A (en) | A drug for promoting skin wound healing | |
| KR101816964B1 (en) | Pharmaceutical adjuvant composition for treating damages of skin or blood vessel tissue | |
| CN1837169A (en) | Compound capable of inhibiting zinc ion metalloproteinases | |
| KR101518651B1 (en) | Method for co-culture of stem cells | |
| Shih et al. | 3D-Printed proangiogenic patches of photo-crosslinked gelatin and polyurethane hydrogels laden with vascular cells for treating vascular ischemic diseases |