RU2490635C1 - Improved method for producing dead cell preparations for fluorescent in situ hybridisation - Google Patents
Improved method for producing dead cell preparations for fluorescent in situ hybridisation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2490635C1 RU2490635C1 RU2012114552/15A RU2012114552A RU2490635C1 RU 2490635 C1 RU2490635 C1 RU 2490635C1 RU 2012114552/15 A RU2012114552/15 A RU 2012114552/15A RU 2012114552 A RU2012114552 A RU 2012114552A RU 2490635 C1 RU2490635 C1 RU 2490635C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- slide
- glass
- fish
- strip
- hybridization
- Prior art date
Links
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title abstract description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 25
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 title abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 claims description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 18
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101000823316 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ABL1 Proteins 0.000 description 8
- 102100022596 Tyrosine-protein kinase ABL1 Human genes 0.000 description 8
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 6
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 4
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 229910010413 TiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к приготовлению препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации нуклеиновых кислот (fluorescent in situ hybridization - FISH), применяемой в научных и клинико-диагностических исследованиях.The invention relates to the preparation of fixed cell preparations for fluorescent in situ hybridization of nucleic acids (fluorescent in situ hybridization - FISH), used in scientific and clinical diagnostic studies.
В основе метода FISH лежит гибридизация in situ между созданным по специальным технологиям ДНК-зондом (нуклеотидная последовательность ограниченного размера) и комплементарным ему участком ДНК мишени в препаратах фиксированных метафазных или интерфазных клеток. ДНК-зонд несет «метку», то есть содержит нуклеотиды, напрямую связанные с флуорохромом или связанные с гаптеном для дальнейшей визуализации антителами, несущими флуорохром. Именно наличие метки позволяет определять место связывания зонда в геноме с помощью флуоресцентного микроскопа. Метод FISH превосходит стандартный цитогенетический подход по способности выявлять как тонкие, так и сложные структурные изменения хромосом. Кроме того, в отличие от стандартного цитогенетического подхода, основанного на анализе исключительно метафазных пластинок, FISH-метод позволяет исследовать интерфазные ядра. Эта способность особенно актуальна при анализе опухолевых клеток, метафазные препараты которых часто обнаруживают плохую морфологию.The FISH method is based on in situ hybridization between a DNA probe created by special technologies (a nucleotide sequence of limited size) and a portion of the target DNA complementary to it in preparations of fixed metaphase or interphase cells. The DNA probe carries a “label”, that is, it contains nucleotides directly linked to the fluorochrome or linked to the hapten for further visualization by antibodies carrying the fluorochrome. It is the presence of the label that allows you to determine the binding site of the probe in the genome using a fluorescence microscope. The FISH method surpasses the standard cytogenetic approach in its ability to detect both subtle and complex structural changes in chromosomes. In addition, in contrast to the standard cytogenetic approach based on the analysis of exclusively metaphase plates, the FISH method allows one to study interphase nuclei. This ability is especially relevant when analyzing tumor cells whose metaphase preparations often exhibit poor morphology.
Для проведения клинико-диагностических исследований целесообразнее применять коммерческие ДНК-зонды, поскольку они стандартизованы и эффективность их использования гарантирована и проконтролирована производящей фирмой. Главным препятствием к более широкому распространению FISH-анализа являются высокие трудоемкость и себестоимость, несмотря на постоянно растущую потребность в данном анализе. Одним из способов устранения отмеченных недостатков является получение препаратов с множественными зонами одновременной гибридизации на одном предметном стекле благодаря миниатюризации отдельной зоны.For clinical diagnostic studies, it is more advisable to use commercial DNA probes, since they are standardized and the effectiveness of their use is guaranteed and monitored by the manufacturing company. The main obstacle to the wider dissemination of FISH analysis is the high complexity and cost, despite the ever-growing need for this analysis. One of the ways to eliminate the noted drawbacks is to obtain preparations with multiple zones of simultaneous hybridization on a single glass slide due to the miniaturization of a separate zone.
Известен способ приготовления препаратов с множественными зонами гибридизации на стекле с тефлоновым покрытием и прозрачными окошками. Недостатком способа является наличие оптической аберрации при микроскопировании, вызванной толщиной указанного покрытия. Такая аберрация ограничивает сферу применения способа. В частности, последний непригоден для FISH-анализа с помощью транслокационных зондов, которые формируют так называемые слитные (сливные) сигналы при наличии соответствующей транслокации в исследуемых клетках (Duongruitai N., Warren A.D, Olli H.T. Microbial Populations Identified by Fluorescence In Situ Hybridization in a Constructed Wetland Treating Acid Coal Mine Drainage. J. ENVIRON. QUAL., vol.35, 2006, p.1329-1337).A known method of preparing preparations with multiple hybridization zones on glass with Teflon coating and transparent windows. The disadvantage of this method is the presence of optical aberration during microscopy caused by the thickness of the specified coating. Such aberration limits the scope of the method. In particular, the latter is unsuitable for FISH analysis using translocation probes, which form the so-called fused (drain) signals in the presence of appropriate translocation in the studied cells (Duongruitai N., Warren AD, Olli HT Microbial Populations Identified by Fluorescence In Situ Hybridization in a Constructed Wetland Treating Acid Coal Mine Drainage. J. ENVIRON. QUAL., Vol. 35, 2006, p.1329-1337).
Известен способ приготовления препаратов для одновременного FISH-анализа большого числа (до 9) пациентов. Авторы способа достигают этого результата благодаря использованию трафарета с размерами 22×22 мм2 и 9 круглыми отверстиями. Чтобы не происходила контаминация между фиксированными образцами от разных пациентов, авторы наносят через каждое отверстие в трафарете крайне малый объем суспензии фиксированных интерфазных клеток - по 0,2 мкл с клеточностью примерно 2500 клеток/мкл. Одним из недостатков способа является то, что ввиду очень малых объемов наносимой суспензии и соответственно малых размеров пятен способ пригоден исключительно для интерфазной FISH. Другой недостаток связан с отсутствием возможности разграничить пятна от различных пациентов визуально без микроскопа (например, с помощью маркера или алмазного карандаша), что не позволяет проводить гибридизацию в разных пятнах с различающимися ДНК-зондами. Данная особенность обуславливает еще один недостаток, а именно: способ не дает возможности варьировать объем наносимой гибридизационной смеси в зависимости от числа пятен. К числу недостатков следует отнести также то, что ввиду исключительно малого объема наносимых суспензий клеток фиксатор быстро испаряется, что, как правило, ухудшает качество гибридизационного сигнала (Lymphoma: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine, Vol.115, Walker JM, series editor) Humana Press; Totowa, NJ 2005, p.93-108).A known method of preparation of drugs for the simultaneous FISH analysis of a large number (up to 9) of patients. The authors of the method achieve this result through the use of a stencil with dimensions of 22 × 22 mm 2 and 9 round holes. To prevent contamination between fixed samples from different patients, the authors put through each hole in the stencil an extremely small volume of a suspension of fixed interphase cells - 0.2 μl with a cellularity of about 2500 cells / μl. One of the disadvantages of the method is that due to the very small volumes of the applied suspension and, accordingly, the small size of the spots, the method is suitable exclusively for interphase FISH. Another drawback is the lack of the ability to distinguish spots from different patients visually without a microscope (for example, using a marker or diamond pencil), which does not allow hybridization in different spots with different DNA probes. This feature causes another drawback, namely: the method does not allow you to vary the volume of the applied hybridization mixture depending on the number of spots. Among the drawbacks is the fact that, due to the extremely small volume of applied cell suspensions, the fixative evaporates quickly, which, as a rule, impairs the quality of the hybridization signal (Lymphoma: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine, Vol. 115, Walker JM, series editor ) Humana Press; Totowa, NJ 2005, p. 93-108).
Известен разработанный на микрофлюидной платформе подход «лаборатории-на-чипе» к минитюаризации FISH-анализа. 1. Sieben, V.J., Debes-Marun C.S., Pilarski, P.M. et al. 2007. FISH and chips: chromosomal analysis on microfluidic platforms. IET Nanobiotechnol. 1: 27-35; 2. Sieben V.J., Debes-Marun C.S., Pilarski L.M., and Backhouse C.J. 2008. An integrated microfluidic chip for chromosome enumeration using fluorescence in situ hybridization. Lab Chip 5:2151-2156). В соответствии с этим подходом на полностью интегрированном микрочипе гемопоэтические клетки нагреванием иммобилизуются внутри ячеек, последующие приготовление препаратов и собственно FISH-анализ проводятся в автоматическом режиме. Недостатками указанного подхода являются отсутствие его широкой доступности из-за сложности и высокой стоимости изготовления микрочипа, а также необходимость дорогостоящего дополнительного оборудования для анализа флуоресцентного сигнала от ячеек микрочипа.A well-known laboratory-on-chip approach to the miniaturization of FISH analysis developed on a microfluidic platform is known. 1. Sieben, V.J., Debes-Marun C.S., Pilarski, P.M. et al. 2007. FISH and chips: chromosomal analysis on microfluidic platforms. IET Nanobiotechnol. 1: 27-35; 2. Sieben V.J., Debes-Marun C.S., Pilarski L.M., and Backhouse C.J. 2008. An integrated microfluidic chip for chromosome enumeration using fluorescence in situ hybridization. Lab Chip 5: 2151-2156). In accordance with this approach, on a fully integrated microchip, hematopoietic cells are immobilized by heating inside the cells, subsequent preparation of the preparations and the actual FISH analysis are carried out automatically. The disadvantages of this approach are the lack of its wide availability due to the complexity and high cost of manufacturing the microchip, as well as the need for expensive additional equipment for the analysis of the fluorescent signal from the cells of the microchip.
Известен способ приготовления препаратов для FISH-анализа, основанный на адгезии полимерной микрофлюидной пластины размерами 20×10×1 мм с прямым микроканалом размерами 10×0,3×0,05 мм к стандартному предметному стеклу, покрытому наноструктурированным оксидом титана (TiO2), обеспечивающему быструю и эффективную иммобилизацию живых и фиксированных гемопоэтических клеток на малой поверхности (3 мм2) - проекции микроканала на указанной пластине. Способ имеет ряд недостатков. Во-первых, способ отличается малой доступностью из-за технологической сложности изготовления микрофлюидной пластины с микроканалом и нанесения покрытия из наноструктурированного TiO2 на предметное стекло, а также дороговизны нанесения покрытия. Другим недостатком способа является сравнительно малое количество зон гибридизации на 1 стекле, а именно: одновременно можно обеспечить всего 3 зоны гибридизации на 1 стекле благодаря использованию 3 микрофлюидных пластин (либо триплексной пластины с 3 каналами). В-третьих, ввиду малого количества клеток (≤3700), сорбируемых на малой поверхности предметного стекла, способ пригоден исключительно для интерфазной FISH.A known method of preparing preparations for FISH analysis, based on the adhesion of a polymer microfluidic plate with dimensions of 20 × 10 × 1 mm with a direct microchannel with dimensions of 10 × 0.3 × 0.05 mm to a standard slide coated with nanostructured titanium oxide (TiO 2 ), providing fast and effective immobilization of living and fixed hematopoietic cells on a small surface (3 mm 2 ) - the projection of the microchannel on the specified plate. The method has several disadvantages. Firstly, the method is characterized by low availability due to the technological complexity of manufacturing a microfluidic plate with a microchannel and coating of nanostructured TiO 2 on a glass slide, as well as the high cost of coating. Another disadvantage of the method is the relatively small number of hybridization zones on 1 glass, namely: at the same time it is possible to provide only 3 hybridization zones on 1 glass due to the use of 3 microfluidic plates (or a triplex plate with 3 channels). Thirdly, due to the small number of cells (≤3700) adsorbed on a small surface of a glass slide, the method is suitable exclusively for interphase FISH.
В качестве прототипа изобретения выбран способ приготовления фиксированных клеток для FISH-анализа, в соответствии с которым наносят 5 мкл суспензии культивированных или некультивированных фиксированных клеток на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично прилепленной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм2 благодаря ее раскатыванию вдоль предметного стекла в течение 3-5 сек с помощью валика на нагревательном столике с температурой 60°C (Способ приготовления препаратов клеток для флуоресцентной in situ гибридизации: пат. RU 2390776 C1: МПК G01N 33/48, G01N 1/28 / Овсепян В.А., заявитель и патентообладатель ФГУ «КНИИГиПК ФМБА России». - №2410663; заявл. 14.09.2009; опубл. 27.01.2011, Бюл. №3. - 7 с.: ил.).As a prototype of the invention, a method for preparing fixed cells for FISH analysis was selected, according to which 5 μl of a suspension of cultured or uncultured fixed cells are applied to the bottom of the wells formed by the surface of a glass slide and 8 round holes with a diameter of 9 mm in a strip of parafilm tightly attached to the glass with dimensions 26 × 56 mm 2 due to its rolling along the slide for 3-5 seconds using a roller on a heating table with a temperature of 60 ° C (Method of preparation cell nuclei for fluorescence in situ hybridization: US Pat. ; published on January 27, 2011, Bull. No. 3. - 7 pp., ill.).
Недостатком способа является то, что после удаления полоски парафильма с предметного стекла остается загрязнение («след») от нагретого и в последующем охлажденного до комнатной температуры парафильма вокруг зон гибридизации. Остающийся «след» затрудняет отмывку зон гибридизации от неспецифически связанного зонда, осложняющего оценку препарата, а также препятствует равномерному распределению контрастирующего красителя DAPI по поверхности отмытого и высушенного предметного стекла после проведения гибридизации. Загрязнение на предметном стекле обычно удаляется с помощью ватных тампонов, намотанных на тонкий (глазной) пинцет и намоченных 96% этиловым спиртом, что занимает в среднем 3-4 мин. Однако данная процедура требует повышенного внимания и аккуратности, чтобы не повредить зоны гибридизации. При этом загрязнение на предметном стекле, как правило, не удается удалить полностью. Поэтому для равномерного распределения контрастирующего красителя DAPI по поверхности стекла требуются дополнительные усилия, направленные на прижимание покровного стекла к предметному. Кроме того, отмеченная процедура связана со значительными затратами времени при проведении больших серий FISH-исследований.The disadvantage of this method is that after removing a strip of parafilm from a glass slide, there remains contamination ("trace") from the heated and subsequently cooled to room temperature parafilm around the hybridization zones. The remaining “trace” makes it difficult to wash the hybridization zones from a non-specifically linked probe, which complicates the evaluation of the preparation, and also prevents the uniform distribution of the DAPI contrasting dye on the surface of the washed and dried glass slides after hybridization. The contamination on a glass slide is usually removed using cotton swabs wound on thin (eye) tweezers and soaked in 96% ethanol, which takes an average of 3-4 minutes. However, this procedure requires increased attention and accuracy so as not to damage the hybridization zones. Moreover, contamination on a glass slide, as a rule, cannot be completely removed. Therefore, for uniform distribution of the DAPI contrasting dye over the glass surface, additional efforts are required to press the coverslip onto the slide. In addition, the noted procedure is associated with a significant investment of time in conducting large series of FISH studies.
Техническая задача изобретения - устранение указанного недостатка.The technical task of the invention is to remedy this drawback.
Технический результат заключается в увеличении производительности труда при выполнении больших серий FISH-исследований и в повышении качества отмывки предметного стекла.The technical result consists in increasing labor productivity when performing large series of FISH studies and in improving the quality of washing a glass slide.
Данный технический результат достигнут тем, что разработан способ предотвращения загрязнения на предметном стекле, остающегося после удаления герметично прилепленной к нему полоски парафильма, который состоит в том, что после нанесения суспензии культивированных или некультивированных фиксированных клеток на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично прилепленной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм2, указанная полоска вместе с предметным стеклом подвергается нагреванию при 95°C в течение 2 мин и затем сразу удаляется со стекла сдиранием.This technical result was achieved in that a method was developed to prevent contamination on a glass slide remaining after removal of a parafilm strip that was hermetically adhered to it, which consists in the fact that after applying a suspension of cultured or uncultured fixed cells to the bottom of the holes formed by the surface of the glass slide and 8 round holes with a diameter of 9 mm in a hermetically adhered to the glass strip of parafilm with dimensions 26 × 56 mm 2 , the specified strip together with a glass slide exposed heating at 95 ° C for 2 min and then immediately removed from the glass by peeling off.
Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что благодаря нагреванию при 95°C в течение 2 мин. удаление полоски парафильма размерами 26×56 мм2 с 8 отверстиями не оставляет загрязнения на предметном стекле.The essence of the alleged invention is that due to heating at 95 ° C for 2 minutes the removal of a parafilm strip with dimensions of 26 × 56 mm 2 with 8 holes does not leave contamination on the slide.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Прилепляют полоску парафильма размерами 26×56 мм2 с 8 отверстиями к предметному стеклу, нагревая стекло с парафильмом при температурой 60°C и одновременной раскатывая валиком в течение 3-5 сек. На дно каждой образовавшейся лунки наносят по 5 мкл суспензии фиксированных клеток, приготовленной стандартным способом из образцов разных пациентов или одного и того же пациента, если FISH-анализ проводится с помощью большого количества различных зондов. Для FISH-анализа используют как свежеприготовленные суспензии фиксированных клеток, так и хранящиеся при -20°C. В последнем случае, если срок хранения превышает 24 час до приготовления препаратов для FISH, клетки предварительно переводят в свежий фиксатор. Это осуществляют следующим образом. Суспензию фиксированных клеток центрифугируют при 200 g в течение 10 мин, удаляют супернатант и суспендируют в свежеприготовленном фиксаторе (смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении, равном 3:1). Указанную процедуру повторяют дважды.A parafilm strip is adhered with dimensions of 26 × 56 mm 2 with 8 holes to the slide, heating the parafilm glass at a temperature of 60 ° C and simultaneously rolling with a roller for 3-5 seconds. At the bottom of each well formed, 5 μl of a fixed cell suspension, prepared in a standard way from samples of different patients or the same patient, is applied if the FISH analysis is carried out using a large number of different probes. For FISH analysis, both freshly prepared suspensions of fixed cells and those stored at -20 ° C are used. In the latter case, if the shelf life exceeds 24 hours before the preparation of preparations for FISH, the cells are previously transferred to a fresh fixative. This is as follows. The suspension of fixed cells is centrifuged at 200 g for 10 min, the supernatant is removed and suspended in a freshly prepared fixative (mixture of methanol and acetic acid in a ratio of 3: 1). The specified procedure is repeated twice.
После нанесения суспензий клеток оставляют препараты сохнуть на воздухе. Затем на обратной стороне предметных стекол обводят отверстия в полоске парафильма нефлуоресцирующим маркером. Проверяют плотность клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. Нагревают предметное стекло с полоской парафильма при 95°C в течение 2 мин в термостате и быстро сдирают указанную полоску со стекла. После удаления полоски парафильма на стекле не остается никакого загрязнения. Само удаление занимает в среднем 2-3 сек.After applying cell suspensions, the preparations are allowed to air dry. Then, the holes in the parafilm strip are surrounded by a non-fluorescent marker on the back of the slides. Check cell density using phase contrast microscopy. Heat a slide with a parafilm strip at 95 ° C for 2 min in a thermostat and quickly strip the strip off the glass. After removing the parafilm strip, no contamination remains on the glass. Removal itself takes an average of 2-3 seconds.
На каждое клеточное пятно наносят по 1,2-1,4 мкл свежеприготовленной гибридизационной смеси, содержащей ингредиенты в пропорциях, рекомендуемой фирмой-производителем ДНК-зонда. Накрывают каждое пятно круглым покровным стеклом диаметром 9-10 мм и наносят по его краям резиновый клей для герметизации. Дальнейшие процедуры одновременной денатурации ДНК-зонда и ДНК мишени, гибридизации, отмывки и визуализации проводят стандартным способом в соответствии с протоколом фирмы-производителя зонда (зондов). Этап одновременной денатурации ДНК-зонда и ДНК мишени, а также их последующую гибридизацию проводится в гибридайзере «HY-Brite» (кампания «Vysis-Abbott Laboratories»). Постгибридизационную отмывку выполняют в так называемых сосудах Коплина.1.2-1.4 μl of a freshly prepared hybridization mixture containing the ingredients in the proportions recommended by the manufacturer of the DNA probe is applied to each cell stain. Each spot is covered with a round coverslip with a diameter of 9-10 mm and rubber glue is applied along its edges for sealing. Further procedures for the simultaneous denaturation of the DNA probe and target DNA, hybridization, washing and visualization are carried out in a standard way in accordance with the protocol of the manufacturer of the probe (probes). The stage of simultaneous denaturation of the DNA probe and target DNA, as well as their subsequent hybridization, is carried out in the HY-Brite hybridizer (Vysis-Abbott Laboratories campaign). Posthybridization washing is performed in the so-called Koplin vessels.
При приготовлении 1 предметного стекла с 8 зонами гибридизации на процедуры удаления полоски парафильма (2-3 сек.) и предварительного нагревания при 95°C (2 мин.) суммарно расходуется в 1,5-2 раза меньше времени по сравнению с удалением пара-фильма с последующей чисткой предметного стекла с помощью ватного тампона, намоченного 96% этиловым спиртом: 122-123 (2 мин.*60 сек. + 2-3 сек.) сек. в случае подхода с предварительным нагреванием против 180-240 сек. при использовании тампона. Указанное различие становится особенно разительным с увеличением количества приготовляемых предметных стекол для гибридизации. Так, при приготовлении 5 стекол с 8 зонами гибридизации суммарное время предварительного нагревания при 95°C и удаления полоски парафильма составляет не более 135 сек (2 мин*60 сек + 5 стекла*3 сек), в то время как при использовании ватного тампона не менее 900 (5 стекла*3 мин*60 сек) сек. В этом случае указанные подходы могут различаться по времени выполнения не менее чем в 6,7 раза. Кроме того, процедура удаления полоски парафильма с применением предварительного нагревания при 95°C в отличие от таковой без нагревания, но с последующей очисткой ватным тампоном, намоченным 96% этиловым спиртом, полностью предотвращает загрязнение предметного стекла и тем самым не вызывает повышения уровня неспецифически связанного зонда, обусловленного неполным удалением загрязнения, а также обеспечивает без дополнительных усилий равномерное распределение контрастирующего красителя DAPI по поверхности стекла. Еще одним достоинством предварительного нагревания при 95°C - это способствование ускоренному «старению» (обезвоживанию) свежеприготовленных препаратов благодаря инкубации при 95°C.When preparing 1 glass slide with 8 hybridization zones, the procedures for removing a parafilm strip (2-3 sec.) And preheating at 95 ° C (2 min.) In total spend 1.5-2 times less time compared to removing para- film followed by cleaning a glass slide with a cotton swab moistened with 96% ethyl alcohol: 122-123 (2 min. * 60 sec. + 2-3 sec.) sec. in the case of an approach with preheating against 180-240 sec. when using a swab. This difference becomes especially striking with an increase in the number of prepared slide glasses for hybridization. So, when preparing 5 glasses with 8 hybridization zones, the total preheating time at 95 ° C and removing the parafilm strip is no more than 135 sec (2 min * 60 sec + 5 glass * 3 sec), while using a cotton swab does not less than 900 (5 glasses * 3 min * 60 sec) sec. In this case, these approaches may differ in execution time by no less than 6.7 times. In addition, the procedure for removing a parafilm strip using preheating at 95 ° C, in contrast to that without heating, but followed by cleaning with a cotton swab moistened with 96% ethanol, completely prevents contamination of the slide and does not cause an increase in the level of a non-specifically bound probe due to incomplete removal of contamination, and also provides without additional effort the uniform distribution of the contrasting dye DAPI on the glass surface. Another advantage of preheating at 95 ° C is the facilitation of accelerated “aging” (dehydration) of freshly prepared products through incubation at 95 ° C.
Пример. Для верификации диагноза хронический миелолейкоз (ХМЛ) или оценки эффективности его терапии с помощью FISH-анализа были использованы свежеприготовленные или хранящиеся при -20°C суспензии фиксированных клеток (на самом деле, это уже не клетки, а их ядра, но чтобы сохранить терминологическую преемственность, будем и далее употреблять термин «клетки»), полученных стандартным способом из образцов костного мозга или периферической крови соответственно 9 и 12 больных. Клетки костного мозга у всех больных были предварительно культивированы в течение 24-48 час в соответствии с общепринятой методикой. Во всех случаях, когда срок хранения при -20°C превышал 24 час до приготовления препаратов для FISH-анализа, клетки переводили в свежий фиксатор. Для получения препаратов фиксированных клеток приготовили 3 стекла с парафильмово-бумажным покрытием и 8 круглыми окошками диаметром 9 мм. Внесли по 5 мкл суспензии фиксированных клеток от каждого больного в отдельную лунку. На 2 предметных стекла было нанесено по 8 образцов суспензии, а на третье - 5. После высыхания препаратов проверили плотность клеток на дне лунок с помощью фазово-контрастной микроскопии. Обвели нефлуоресцирующим маркером отверстия с обратной стороны предметных стекол. Подвергли все 3 предметных стекла с нанесенными суспензиями клеток термической обработке при 95°C в течение 2 мин. После этого сразу удалили полоски парафильма с них. На указанную процедуру потратили 6 сек (по 2 сек на каждое стекло). Приготовили гибридизационную смесь объемом 25,2 мкл, включающую 2,5 мкл транслокационного двухцветного зонда LSI BCR7ABL с двойным слиянием («Vysis-Abbott Diagnostics»), 17,6 мкл гибридизационного буфера и 5,0 мкл дистиллированной воды (пропорции ингредиентов гибридизационной смеси соответствуют рекомендациям фирмы-производителя зонда и буфера). Внесли по 1,2 мкл гибридизационной смеси в каждую лунку. Накрыли каждую смесь круглым покровным стеклом диаметром 10 мм и герметизировали его края резиновым клеем. Поставили все 3 предметных стекла на нагревательный столик гибридайзера «HYBrite». Все дальнейшие процедуры денатурации, гибридизации, отмывки и визуализации (с помощью контрастирующего красителя DAPI) выполняли в соответствии с рекомендациями фирмы «Vysis-Abbott Laboratories» и инструкциями к гибридайзеру. Проводили гибридизацию в течение 18 час. После отмывки и последующей сушки наносили 25 мкл контрастирующего красителя DAPI и накрывали каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×60 мм2.Example. To verify the diagnosis of chronic myelogenous leukemia (CML) or to evaluate the effectiveness of its therapy using FISH analysis, we used freshly prepared or stored at -20 ° C suspensions of fixed cells (in fact, these are not cells, but their nuclei, but in order to maintain terminological continuity , we will continue to use the term "cells") obtained in a standard way from samples of bone marrow or peripheral blood, respectively of 9 and 12 patients. Bone marrow cells in all patients were pre-cultured for 24-48 hours in accordance with generally accepted methods. In all cases, when the shelf life at -20 ° C exceeded 24 hours before preparation of the preparations for FISH analysis, the cells were transferred to a fresh fixative. To obtain fixed cell preparations, 3 glasses with a parafilm-paper coating and 8 round windows with a diameter of 9 mm were prepared. 5 μl of a suspension of fixed cells from each patient were added to a separate well. Eight suspension samples were applied to 2 slides, and five to a third. After drying of the preparations, the cell density at the bottom of the wells was checked using phase contrast microscopy. The non-fluorescent marker was circled around the holes on the back of the slides. All 3 slides coated with cell suspensions were heat treated at 95 ° C for 2 minutes. After that, strips of parafilm were immediately removed from them. They spent 6 seconds on this procedure (2 seconds for each glass). A 25.2 μl hybridization mixture was prepared, including 2.5 μl LSI BCR7ABL double-fusion translocation probe with double fusion (Vysis-Abbott Diagnostics), 17.6 μl of hybridization buffer and 5.0 μl of distilled water (the proportions of the ingredients of the hybridization mixture correspond to recommendations of the manufacturer of the probe and buffer). 1.2 μl of the hybridization mixture was added to each well. Each mixture was covered with a round coverslip with a diameter of 10 mm and sealed its edges with rubber glue. We put all 3 glass slides on the heating table of the HYBrite hybridizer. All further denaturation, hybridization, washing and imaging procedures (using a DAPI contrasting dye) were performed in accordance with the recommendations of Vysis-Abbott Laboratories and the instructions for the hybridizer. Hybridization was performed for 18 hours. After washing and subsequent drying was applied 25 ul of a contrasting dye DAPI and each slide covered with a coverslip size 24 × 60 mm 2.
Оценивали не менее 5 метафазных клеток или не менее 200 интерфазных ядер с помощью люминесцентного микроскопа. У 5 диагностических больных присутствовали метафазные пластинки в приготовленных препаратах. У 4 больных была выявлена специфическая для ХМЛ t(9;22): ish t(9;22)(ABL1+,BCR+;BCR+,ABL1+) [5]. У 5-го диагностического больного в исследованных метафазных клетках не было обнаружено t(9;22): ish 9q34(ABL1×2),22q11.2(BCR×2) [11]. У 16 больных был проведен интерфазный FISH-анализ. У 9 из них картина флуоресцентных гибридизационных сигналов соответствовало норме: nuc ish(ABL1,BCR)×2[400]. У 7 больных обнаружили аберрантные клетки: nuc ish(ABL1,BCR)×3(ABL1 con BCR×2)[194/200] и nuc ish(ABL1,BCR)×3(ABL1 con BCR×2)[198/200].At least 5 metaphase cells or at least 200 interphase nuclei were evaluated using a luminescent microscope. Five diagnostic patients had metaphase plates in the prepared preparations. In 4 patients, CML-specific t (9; 22) was revealed: ish t (9; 22) (ABL1 +, BCR +; BCR +, ABL1 +) [5]. In the 5th diagnostic patient, t (9; 22) was not found in the metaphase cells studied: ish 9q34 (ABL1 × 2), 22q11.2 (BCR × 2) [11]. In 16 patients, an interphase FISH analysis was performed. In 9 of them, the pattern of fluorescent hybridization signals corresponded to the norm: nuc ish (ABL1, BCR) × 2 [400]. Aberrant cells were found in 7 patients: nuc ish (ABL1, BCR) × 3 (ABL1 con BCR × 2) [194/200] and nuc ish (ABL1, BCR) × 3 (ABL1 con BCR × 2) [198/200] .
При проведении вышеописанной серии диагностических исследований применение разработанного способа приготовления препаратов клеток для FISH-анализа с дополнительным этапом нагревания при 95°C в течение 2 мин. позволило сэкономить время на этапе очистки загрязнения, вызванного удалением полоски парафильма, не менее чем в 2,8 (3 стекла*2 мин*60 сек/2 мин*60 сек+6 сек) раза. Кроме того, данный способ в отличие от ранее запатентованного способа «Способ приготовления препаратов клеток для флуоресцентной in situ гибридизации: пат. RU 2390776 C1: МПК G01N 33/48, G01N 1/28 / Овсепян В.А., заявитель и патентообладатель ФГУ «КНИИГиПК ФМБА России». - №2410663; заявл. 14.09.2009; опубл. 27.01.2011, Бюл. №3. - 7 с.: ил.» полностью предотвращает загрязнение предметного стекла, не вызывает увеличения уровня неспецифически связанного зонда, обусловленного неполным удалением загрязнения, обеспечивает без дополнительных усилий равномерное распределение контрастирующего красителя DAPI по поверхности стекла и, кроме того, благодаря инкубации при 95°C способствует ускоренному «старению» свежеприготовленных препаратов.When conducting the above series of diagnostic studies, the use of the developed method for preparing cell preparations for FISH analysis with an additional heating step at 95 ° C for 2 min. allowed to save time at the stage of purification of pollution caused by the removal of a strip of parafilm, not less than 2.8 (3 glasses * 2 min * 60 sec / 2 min * 60 sec + 6 sec) times. In addition, this method, in contrast to the previously patented method "Method for the preparation of cell preparations for fluorescent in situ hybridization: US Pat. RU 2390776 C1: IPC G01N 33/48, G01N 1/28 / Hovsepyan V.A., Applicant and patent holder of the Federal State Institution “KNIIGiPK FMBA of Russia”. - No. 2410663; declared 09/14/2009; publ. 01/27/2011, Bull. Number 3. - 7 p.: Ill. ”Completely prevents contamination of the slide, does not increase the level of a non-specifically connected probe due to incomplete removal of contamination, ensures even distribution of the contrasting dye DAPI on the glass surface without additional efforts, and also thanks to incubation at 95 ° C promotes accelerated "aging" of freshly prepared drugs.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012114552/15A RU2490635C1 (en) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | Improved method for producing dead cell preparations for fluorescent in situ hybridisation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012114552/15A RU2490635C1 (en) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | Improved method for producing dead cell preparations for fluorescent in situ hybridisation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2490635C1 true RU2490635C1 (en) | 2013-08-20 |
Family
ID=49162943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012114552/15A RU2490635C1 (en) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | Improved method for producing dead cell preparations for fluorescent in situ hybridisation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2490635C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2706220C1 (en) * | 2019-07-16 | 2019-11-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Method of producing cytogenetic epithelial cell preparations for carrying out a fluorescent in situ hybridisation reaction |
| RU2755392C1 (en) * | 2021-02-25 | 2021-09-15 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Method for fluorescent hybridization in situ using the fgfr1 dna probe in different mammalian species on cytological preparations |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008031228A1 (en) * | 2006-09-15 | 2008-03-20 | The Governors Of The University Of Alberta | Automated fish analysis, circulating microfluidic chip, and method for immobilizing cells to a microfluidic chip |
| RU2346279C2 (en) * | 2007-04-16 | 2009-02-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | METHOD OF CATALYTIC TELOMERASE SUBUNIT (hTERT) ANALYSIS FOR mRNA LEVEL |
| RU2410663C1 (en) * | 2009-09-14 | 2011-01-27 | Федеральное государственное учреждение "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method of preparing cell preparations for fluorescent in situ hybridisation |
-
2012
- 2012-04-12 RU RU2012114552/15A patent/RU2490635C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008031228A1 (en) * | 2006-09-15 | 2008-03-20 | The Governors Of The University Of Alberta | Automated fish analysis, circulating microfluidic chip, and method for immobilizing cells to a microfluidic chip |
| RU2346279C2 (en) * | 2007-04-16 | 2009-02-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | METHOD OF CATALYTIC TELOMERASE SUBUNIT (hTERT) ANALYSIS FOR mRNA LEVEL |
| RU2410663C1 (en) * | 2009-09-14 | 2011-01-27 | Федеральное государственное учреждение "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method of preparing cell preparations for fluorescent in situ hybridisation |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BAYANI J. et al. Fluorescence in situ Hybridization (FISH). Curr. Protoc. Cell Biol. 2004. Chapter 22:Unit 22.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2204s23. KAMMORI M. et al. Demonstration of human telomerase reverse transcriptase in human colorectal carcinomas by in situ hybridization. International Journal of Oncology. 2002, vol.20, p.15-21. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2706220C1 (en) * | 2019-07-16 | 2019-11-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Method of producing cytogenetic epithelial cell preparations for carrying out a fluorescent in situ hybridisation reaction |
| RU2755392C1 (en) * | 2021-02-25 | 2021-09-15 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Method for fluorescent hybridization in situ using the fgfr1 dna probe in different mammalian species on cytological preparations |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP4524261A2 (en) | Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample | |
| Ventura et al. | FISH analysis for the detection of lymphoma-associated chromosomal abnormalities in routine paraffin-embedded tissue | |
| CN114127562B (en) | Detection method of tumor cell surface marker molecule PD-L1 | |
| JP2021502069A5 (en) | ||
| JP2019013228A (en) | Cell preparations and cell supports, and their use in theranosis | |
| RU2490635C1 (en) | Improved method for producing dead cell preparations for fluorescent in situ hybridisation | |
| CN105063194B (en) | The diagnosis marker of Parkinson a kind of and its application | |
| CN106970224A (en) | A kind of kit of application CD45 immunofluorescences joint CEP probe identification circulating tumor cells and its application | |
| RU2410663C1 (en) | Method of preparing cell preparations for fluorescent in situ hybridisation | |
| CN111004838A (en) | Application of bone marrow smear fluorescence in situ hybridization technology in multiple myeloma | |
| Arceneaux et al. | Multiparameter quantitative analyses of diagnostic cells in brain tissues from tuberous sclerosis complex | |
| JP2025096350A (en) | How to Test for Prostate Cancer | |
| CN105755135B (en) | A kind of No. 17 chromosome centromere probe reagent boxes of people and its preparation method and application | |
| CN110923323B (en) | Twist gene expression detection kit | |
| CA2438406A1 (en) | Materials and methods for the induction of premature chromosome condensation | |
| CN105483246B (en) | Application of the differential expression of gene in carcinoma of mouth diagnosis | |
| CN119034834A (en) | Micro-fluidic chip based on CRISPR-Cas12a and immunofluorescence visualization dual-mode joint detection | |
| CN110959110B (en) | Method for fixing biological samples for analytical purposes | |
| RU2471871C2 (en) | Method and device for determining chromosome structure | |
| Harris et al. | Quest for the ideal cancer biomarker: an update on progress in capture and characterization of circulating tumor cells | |
| JP2007178193A (en) | Method for examining floating cells | |
| CN208562415U (en) | A real-time fluorescent PCR detection kit for hepcidin gene | |
| TW202223390A (en) | Method of detecting an nucleic acid and oligonucleotide probe | |
| Wager et al. | A fence barrier method of leading edge cell capture for explorative biochemical research | |
| JP2002142797A (en) | Microorganism testing method for solid surface and kit therefor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140413 |