RU2489176C1 - Method of spinal tissue engineering following anatomical rupture - Google Patents
Method of spinal tissue engineering following anatomical rupture Download PDFInfo
- Publication number
- RU2489176C1 RU2489176C1 RU2012105190/14A RU2012105190A RU2489176C1 RU 2489176 C1 RU2489176 C1 RU 2489176C1 RU 2012105190/14 A RU2012105190/14 A RU 2012105190/14A RU 2012105190 A RU2012105190 A RU 2012105190A RU 2489176 C1 RU2489176 C1 RU 2489176C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- spinal cord
- matrix
- neuronal
- chitosan
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 85
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims abstract description 83
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 66
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims abstract description 35
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 28
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 15
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 8
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims abstract description 6
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims abstract description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 51
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 35
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 23
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000010408 film Substances 0.000 claims description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 3
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 claims description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 2
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 claims 1
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 claims 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 229940000396 hyaluronic acid 10 mg Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract 2
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 abstract 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 abstract 1
- 239000006630 dma medium Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 abstract 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 40
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 34
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 31
- 208000020339 Spinal injury Diseases 0.000 description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 18
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 15
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 13
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 12
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 12
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 11
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 11
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 11
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 11
- 230000009526 moderate injury Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 9
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 9
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 9
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 9
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 9
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 8
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 7
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 7
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 7
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 7
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 7
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 6
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 6
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 6
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 6
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 6
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 6
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 6
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000037152 sensory function Effects 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 5
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000002684 laminectomy Methods 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 5
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 4
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 4
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 4
- 230000007658 neurological function Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007971 neurological deficit Effects 0.000 description 3
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 3
- 210000001711 oxyntic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009101 premedication Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002921 anti-spasmodic effect Effects 0.000 description 2
- 229940124575 antispasmodic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 210000004462 astrocytic glia Anatomy 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 238000007665 sagging Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 2
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 230000035131 DNA demethylation Effects 0.000 description 1
- 241001077885 Gesta Species 0.000 description 1
- 206010061431 Glial scar Diseases 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002033 Myoclonus Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000004397 blinking Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000026058 directional locomotion Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000004776 neurological deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 210000002475 olfactory pathway Anatomy 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000019809 paraffin wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000000272 proprioceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002804 pyramidal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 208000008797 situs inversus Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 1
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 208000014903 transposition of the great arteries Diseases 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии и трансплантологии, клеточной технологии и биоинженерии, и может быть использовано для реконструкции спинного мозга после его анатомического разрыва.The invention relates to medicine, namely to neurosurgery and transplantology, cell technology and bioengineering, and can be used for reconstruction of the spinal cord after its anatomical rupture.
Известны способы восстановления спинного мозга после осложненной спинальной травмы, заключающиеся в пересадке фетальных или взрослых шванновских клеток, способных продуцировать миелин в аксональной регенерации и ряд нейротрофических факторов (BDNF, NGF, реснитчатый фактор) [1-3]. Пересадка таких клеток крысам в спинной мозг при частичной его перерезке может сопровождаться значительным восстановлением функции ЦНС с демоне грацией не только обширной регенерации спинномозговых аксонов ростральное и каудальнее зоны повреждения, но и ограниченного спрутинга (вырастания) аксонов в каудальный конец трансплантата [5, 8]. Ген-модифицированные шванновские клетки при их трансплантации в разрыв спинного мозга в эксперименте способны производить активную ремиелинизацию аксонов, стимулировать их рост и продвижение через зону повреждения [8-11]. Трансплантация сингенным иммунодефицитным крысам человеческих шванновских клеток заметно активизирует аксональный рост и частично восстанавливает функцию конечностей [12]. При этом трансплантация таких клеток в дислокацию разрыва спинного мозга (СМ) у больных сопровождалась частичным восстановлением моторных функций спинного мозга и чувствительности по шкале ASIA [5-7]. Однако проблема указанного способа заключается в недостаточной эффективности использования дифференцированных клеток как по причине их низкой массы, так и по непродолжительной жизнеспособности, большой потери при трансляции с подложек, на которых их культивируют, в дислокацию травмы, поскольку технология предусматривает элюцию клеток с помощью ферментов, а это существенно усиливает процесс запрограммированной клеточной смерти. Трансплантация шванновских клеток опосредованно влияет на регенерацию спинного мозга путем выделения ряда нейротрофических факторов, не образуя новые нейроны и аксоны.Known methods of restoring the spinal cord after a complicated spinal injury, which include transplanting fetal or adult Schwann cells capable of producing myelin in axonal regeneration and a number of neurotrophic factors (BDNF, NGF, ciliary factor) [1-3]. The transplantation of such cells to rats in the spinal cord during partial transection can be accompanied by a significant restoration of the central nervous system function with demonstration not only of extensive regeneration of the spinal axons rostral and caudal to the lesion zone, but also of limited axon sprouting (growth) to the caudal end of the graft [5, 8]. Gene transfected Schwann cells during their transplantation into spinal cord rupture in an experiment are capable of actively axon remyelination, stimulate their growth and advancement through the damage zone [8-11]. Transplantation of syngeneic immunodeficient rats of human Schwann cells markedly activates axonal growth and partially restores limb function [12]. Moreover, transplantation of such cells into the dislocation of spinal cord rupture (SM) in patients was accompanied by a partial restoration of spinal cord motor functions and sensitivity according to the ASIA scale [5-7]. However, the problem of this method lies in the insufficient efficiency of using differentiated cells, both because of their low mass and short viability, a large loss in translation from the substrates on which they are cultured to the location of the injury, since the technology provides for the elution of cells using enzymes, and this greatly enhances the programmed cell death process. Transplantation of Schwann cells indirectly affects the regeneration of the spinal cord by isolating a number of neurotrophic factors without forming new neurons and axons.
Известны способы трансплантации эмбриональных стволовых клеток при спинальной травме. Выделение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) из бластоцисты мыши [13] и трансплантация эмбриональной ткани на модели спинальной травмы [14| показапи возможность ее использования в качестве временного межуточного матрикса для регенерации в ней центральных аксонов. Растущие аксоны регенерировали в эмбриональный трансплантат с формированием связей. Применение трансплантации ЭСК на модели спинальной травмы покачало способность этих клеток встраиваться в поврежденные участки спинного мозга, дифференцироваться согласно молекулярному и клеточному микроокружению, быть длительно жизнеспособными [15-17]. При этом образующиеся из ЭСК олигодендроциты у половозрелых крыс подвергаются миелинизации в области аксонов [18]. Аксональный рост может сопровождаться прорастанием через глиальный рубец в области хирургического пересечения спинного мозга [19]. Ожидаемые морфологические изменения в спинном мозге сопровождаются частичным снижением нейродефицита.Known methods for transplantation of embryonic stem cells in spinal injury. Isolation of embryonic stem cells (ESCs) from mouse blastocysts [13] and transplantation of embryonic tissue in a spinal injury model [14 | show the possibility of its use as a temporary interstitial matrix for the regeneration of central axons in it. Growing axons regenerated into an embryonic graft to form bonds. The use of ESC transplantation on a spinal injury model shook the ability of these cells to integrate into damaged areas of the spinal cord, to differentiate according to molecular and cellular microenvironment, to be long-term viable [15-17]. Moreover, oligodendrocytes formed from ESCs in sexually mature rats undergo myelination in the axon region [18]. Axonal growth may be accompanied by germination through the glial scar in the area of surgical intersection of the spinal cord [19]. The expected morphological changes in the spinal cord are accompanied by a partial decrease in neurodeficiency.
Ряд исследователей с целью реконструкции СМ применяет фетальные ткани, например, суспензию клеток эмбриона до 12 недель гестации и указывает на эффективность восстановления функций СМ [4, 20, 21]. В одних экспериментах такая трансплантация не сопровождается существенным прорастанием аксонов сквозь пересаженную ткань в сторону каудальной части СМ [22-24], в других случаях регистрировался значительный спрутиш аксонов [25].A number of researchers use fetal tissues to reconstruct SM, for example, a suspension of embryonic cells up to 12 weeks of gestation and indicates the effectiveness of restoration of SM functions [4, 20, 21]. In some experiments, such transplantation is not accompanied by significant axon sprouting through the transplanted tissue toward the caudal part of the SM [22-24], in other cases, a significant axon stroma was recorded [25].
Одним из важных источников нейрональных клеток в постнатальном онтогенезе могут служить мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), которые участвуют в поддержании пролиферации прогениторных клеток. Показано, что ММСК могут спонтанно экспрессировать нейрональные маркеры [26]. Широкое использование морфогенных факторов дифференцировки, вызывающих деметилирование ДНК, а также стимуляцию факторов роста (EGF, BDNF) позволяет перепрограммировать геном клетки и добиться дифференцировки ММСК костного мозга в нейроны и глию с формированием аксонального роста и зрелых нейронов. При этом прямая трансплантация такой клеточной массы существенно влияет на снижение неврологического дефицита у экспериментальных животных, в большей степени касающегося сенсорной функции СМ [27-29]. Однако проблема состоит в том, что прямое использование ЭСК или их недифференцированных дериватов приводит к образованию тератом. Метод предусматривает перенос клеток без трехмерной подложки в дислокацию травмы, а это существенно увеличивает степень запрограммированной клеточной гибели, не создает условий адресного переноса ростовых факторов, не предусматривает их введение в готовом виде. Кроме того, трансплантация не сопровождается введением предшественников нейрональных клеток, а предусматривает введение недифференцированных клеток. Эмбриональные стволовые клетки мультипотентны или нолипотентны и могут дифференцироваться в любом направлении, не только в нейрональном.One of the important sources of neuronal cells in postnatal ontogenesis can be multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs), which are involved in maintaining the proliferation of progenitor cells. It has been shown that MMSCs can spontaneously express neuronal markers [26]. The widespread use of morphogenic differentiation factors that cause DNA demethylation, as well as stimulation of growth factors (EGF, BDNF), allows reprogramming the cell genome and differentiating bone marrow MMSC into neurons and glia with the formation of axonal growth and mature neurons. Moreover, direct transplantation of such a cell mass significantly affects the reduction of neurological deficit in experimental animals, which is more related to the sensory function of SM [27-29]. However, the problem is that the direct use of ESCs or their undifferentiated derivatives leads to the formation of teratomas. The method involves the transfer of cells without a three-dimensional substrate to the location of the injury, and this significantly increases the degree of programmed cell death, does not create conditions for targeted transfer of growth factors, does not provide for their introduction in the finished form. In addition, transplantation is not accompanied by the introduction of precursors of neuronal cells, but involves the introduction of undifferentiated cells. Embryonic stem cells are multipotent or nolipotent and can differentiate in any direction, not only neuronal.
Существует метод пересадки эмбриональной клеточной массы головного или спинного мозга от крыс в разрыв спинного мозга новорожденным или взрослым крысам, что приводит в ранние сроки после травмы (до 7 суток) к приживлению и спрутингу пересаженных нейронов, трансляции клеток нейроглии в каудальном направлении за пределы зоны повреждения [30-33]. В зоне травмы спинного мозга трансплантированная ткань активно интегрирует с тканью реципиента [34]. Это подтверждается на модели полной перерезки спинного мозга у новорожденной крысы. Трансплантация эмбриональных клеток в зону перерезки СМ улучшает его функциональные характеристики по сравнению с контролем [35]. Однако при таких пересадках частые неудовлетворительные результаты можно рассматривать как реализацию иммунологического конфликта по причине нарушения гематоэнцефалического барьера при травме спинного мозга [36]. Пересадка эмбриональной клеточной массы без трехмерной подложки приводит к слабой защите пересаженных клеток от реакций хозяина и не создает условий для жизнедеятельности и пролиферации. Кроме того, ткани донора при пересадке могут нести опасность контаминации, также как и применение при предварительном культивировании клеток продуктов животного происхождения, например сывороток крови.There is a method for transplanting the embryonic cell mass of the brain or spinal cord from rats to spinal cord rupture in newborn or adult rats, which leads to the engraftment and sprouting of transplanted neurons in the early stages of injury (up to 7 days), and translation of neuroglia cells in the caudal direction outside the damage zone [30-33]. In the area of the spinal cord injury, the transplanted tissue actively integrates with the recipient's tissue [34]. This is confirmed by the model of a complete transection of the spinal cord in a newborn rat. Transplantation of embryonic cells into the SM transection zone improves its functional characteristics compared to the control [35]. However, with such transplants, frequent unsatisfactory results can be considered as the realization of an immunological conflict due to a violation of the blood-brain barrier in spinal cord injury [36]. Transplantation of embryonic cell mass without a three-dimensional substrate leads to poor protection of the transplanted cells from host reactions and does not create conditions for vital activity and proliferation. In addition, donor tissues during transplantation may carry the risk of contamination, as well as the use of animal products, for example, blood serum, during the preliminary cultivation of cells.
Наиболее близким техническим решением является метод использования обкладочных клеток слизистой оболочки обонятельного тракта, источником которых служит обонятельная область верхнего носового хода полости носа. Обкладочные клетки поддерживают рост аксонов от обонятельной луковицы [37]. Их наличие в периферической и центральной нервной системе [38], постоянное обновление и спрутинг аксонов в сторону центральной нервной системы (ЦНС) с экспрессией нестина и нейрональных маркеров глии и нейронов в течение пре- и постнатального периода позволяют экспериментаторам проводить с их помощью реконструктивную биоинженерию СМ [39, 40]. Эти клетки мультипотентны и способны дифференцироваться в зависимости от созданного микроокружения [41]. Важными находками следует считать способность этих клеток к дифференцировкс в нейроны и олигодендроциты. прорастанию аксонов в соседние зоны межуточной ткани и ремиелинизации в условиях in vitro [42]. Также как и шванновские клетки, обкладочные клетки миелинизируют аксоны в культуре in vitro [43]. Трехмерную матрицу в качестве трансплантата, содержащего ольфакторные нейрональные клетки (ОНК), ряд авторов помещал в зону одностороннего повреждения пирамидного тракта у взрослых крыс. Результаты указывали на дифференцировку клеточной массы в шванновские клетки и их активизацию взаимодействия с нейрофибробластами. Как известно, такая межклеточная связь провоцирует процесс миелинизации аксонов, появление новых аксонов, их рост и спрутинг в дистальную культю СМ [44-47]. При этом морфологический инжиниринг СМ сопровождается сокращением неврологического дефицита, несмотря на использование модели полного пересечения СМ [48]. Совершенно очевидно, что процесс инжиниринга поддерживается комплексом молекулярного микроокружения, создаваемого клетками СМ. в основе которого лежит взаимодействие нейротрофических факторов [49]. Однако используемая трехмерная матрица представляла собой либо животный коллаген, например, 1 типа, либо коллаген в комплексе с хондроитинсульфатом. Кроме того, очень частые отрицательные результаты такой трансплантации (слабое устранение неврологического дифицита, особенно функции моторных нейронов) обусловлены отсутствием в трансплантате системы адресного переноса нейротрофических факторов, выделяемых пересаженными клетками. Кроме того, предлагаемый способ реконструкции СМ не предусматривает наличие в трансплантате экзогенных нейротрофических факторов, полученных от культивирования эмбриональной нейрональной клеточной массы, а также одновременного присутствия специальных нейрональных добавок, таких как ретиноевая кислота и фактор N2 (neuronal supplement).The closest technical solution is the method of using parietal cells of the mucous membrane of the olfactory tract, the source of which is the olfactory region of the upper nasal passage of the nasal cavity. Parietal cells support axon growth from the olfactory bulb [37]. Their presence in the peripheral and central nervous system [38], constant axon renewal and twisting towards the central nervous system (CNS) with the expression of nestin and neuronal markers of glia and neurons during the pre- and postnatal period allow experimenters to perform reconstructive bioengineering with their help [39, 40]. These cells are multipotent and able to differentiate depending on the created microenvironment [41]. An important finding is the ability of these cells to differentiate into neurons and oligodendrocytes. axon germination in neighboring zones of interstitial tissue and remyelination in vitro [42]. Like Schwann cells, parietal cells myelinate axons in an in vitro culture [43]. A number of authors placed a three-dimensional matrix as a graft containing olfactory neuronal cells (ONC) in the zone of unilateral damage to the pyramidal tract in adult rats. The results indicated the differentiation of cell mass into Schwann cells and their activation of interaction with neurofibroblasts. As is known, such an intercellular connection provokes the process of axonal myelination, the appearance of new axons, their growth and sprouting into the distal stump of the SM [44–47]. Moreover, morphological engineering of SM is accompanied by a reduction in neurological deficit, despite the use of the model of complete intersection of SM [48]. It is obvious that the engineering process is supported by a complex of molecular microenvironment created by SM cells. which is based on the interaction of neurotrophic factors [49]. However, the three-dimensional matrix used was either animal collagen, for example, type 1, or collagen in combination with chondroitin sulfate. In addition, the very frequent negative results of such a transplantation (poor elimination of neurological deficiency, especially the function of motor neurons) are due to the absence in the transplant of a system for targeted transfer of neurotrophic factors secreted by transplanted cells. In addition, the proposed method for the reconstruction of SM does not provide for the presence in the transplant of exogenous neurotrophic factors obtained from culturing the embryonic neuronal cell mass, as well as the simultaneous presence of special neuronal additives, such as retinoic acid and factor N2 (neuronal supplement).
В России, в клинике «Нейровита», проведены около двух десятков оперативных трансплантаций аутологичных ольфакторных нейрональных клеток (ОНК) на основе биодеградируемого геля «Сферогель». Использовалась и собственно клеточная масса, и комбинация аутологичных ОНК с аутологичными гемопоэтическими стволовыми клетками костного мозга. Результаты указывают на 50% частичное регрессирование неврологической симптоматики при наличии послеоперационных осложнений. Недостатками указанного способа является отсутствие в трансплантате условий переноса нейротрофических факторов, выделяемых пересаженными клетками, а также условий для дифференцировки стволовых клеток в нейрональном направлении и их пролиферации в зоне трансплантации.In Russia, at the Neurovita clinic, about two dozen surgical transplantations of autologous olfactory neuronal cells (ONCs) were carried out on the basis of the biodegradable gel Spherogel. Both the actual cell mass and the combination of autologous ONCs with autologous hematopoietic bone marrow stem cells were used. The results indicate a 50% partial regression of neurological symptoms in the presence of postoperative complications. The disadvantages of this method is the absence in the transplant of the conditions for the transfer of neurotrophic factors secreted by the transplanted cells, as well as the conditions for the differentiation of stem cells in the neuronal direction and their proliferation in the transplantation zone.
Задачей предлагаемого способа является полноценное восстановление морфологической и функциональной целостности спинного мозга после его частичного или полного анатомического разрыва при осложненной позвоночно-спинальной травме. Поставленную задачу решают за счет того, что в диастаз спинного мозга имплантируют предшественники нейрональных клеток, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши в составе коллаген-хитозановой трехмерной матрицы, при этом трехмерная матрица содержит кондиционированную комбинированную бесклеточную питательную среду с нейротрофическими факторами, состоящую из двух смешанных сред, полученных от культивирования клеток мозговой ткани эмбриона крысы и от культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши, содержащую животные и неживотные компоненты, или только кондиционированную среду, полученную от культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши, не содержащую животные компоненты, например, нейрональную добавку N2 или B27, ретиноевую кислоту, синтетическую питательную среду, например DMFM/F12, а также коллаген-хитозановая матрица содержит комплекс полисахаридов с нано-микроструктурированными компонентами, включающая аскорбат хитозана с молекулярной массой 695 kDa и степенью дезацетилирования 98% при содержании на 1 г сухого хитозана аскорбиновой кислоты 1,8 г, хондроитинсерной кислоты 20 мг, гиалуроновой кислоты 10 мг и гепарина 5 мг, а также их солевые производные, которая может использоваться в виде губки, пленки, микросфер, геля или волокон.The objective of the proposed method is the full restoration of the morphological and functional integrity of the spinal cord after its partial or complete anatomical rupture with complicated vertebral-spinal injury. The problem is solved due to the fact that precursors of neuronal cells obtained from mouse embryonic stem cells in a collagen-chitosan three-dimensional matrix are implanted in the diastasis of the spinal cord, while the three-dimensional matrix contains an air-conditioned combined cell-free nutrient medium with neurotrophic factors consisting of two mixed media obtained from culturing brain cells of rat embryo tissue and from culturing mouse embryonic stem cells containing animals and non-animal components, or only conditioned medium obtained from culturing mouse embryonic stem cells, not containing animal components, for example, neuronal supplement N2 or B27, retinoic acid, a synthetic nutrient medium, for example DMFM / F12, and also the collagen-chitosan matrix contains a complex polysaccharides with nano-microstructured components, including chitosan ascorbate with a molecular mass of 695 kDa and a degree of deacetylation of 98% with a content of 1.8 g per 1 g of dry chitosan ascorbic acid, ondroitinsernoy acid 20 mg hyaluronic acid 10 mg and 5 mg of heparin, and their salt derivatives which may be used in the form of sponges, films, microspheres, gel or fibers.
Способ осуществляют следующим образом: При получении клеточных матриц-трансплантатов предварительно перед посадкой на них эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) коллаген-хитозановую матрицу в виде губки или пленки или волокон нарезают объемом 1-1,5 мм3 и в стерильных условиях раскладывают по лункам 96-луночного планшета без покрытия их 0,1% раствором желатина. При этом губка, пленка или волокна представляют собой коллаген-хитозановую трехмерную матрицу, содержащую комплекс полисахаридов в виде нано-микроструктурированного аскорбата хитозана с молекулярной массой 695 kDa и степенью дезацетилирования 98%, при содержании на 1 г сухого хитозана аскорбиновой кислоты 1,8 г, солевой анионной формы хондроитинсерной кислоты 20 мг\г, гиалуроната натрия 10 мг\г и гепарина 5 мг\г, кондиционированную питательную среду с нейротрофическими факторами, полученными при культивировании клеток головного мозга 17-20 дневных фетусов беспородных крыс, полученных после диспергирования мозга и обработки 0,5% раствором коллагеназы в течение 30 минут в среде ДМЕМ при 37°C с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1 мМ L-глутамина, в которую дополнительно /добавляют еще 4нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 1 мМ раствора незаменимых аминокислот (Sigma-Aldrieh). При этом наращивание клеточной биомассы для получения кондиционированной среды проводят при 37°C во флаконах, покрытых 0,1% раствором желатина. Кондиционированную среду собирают ежедневно. Одновременно с целью получения второй кондиционированной среды осуществляют пересев эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши с помощью 0,5% раствора коллагеназы в синтетической среде DMEM/F12 в культуральные флаконы, клетки культивируют с добавлением агента нейрональной дифференцировки - N2 компонента (или компонента В27) и ретиноевой кислоты согласно инструкции производителя. Среду также собирают, фильтруют через 0,22 мкм ацетат-целлюлозный фильтр и в дальнейшем используют совместно с первой кондиционированной средой в качестве комбинированной кондиционированной среды или самостоятельно.The method is as follows: Upon receipt of cell transplant matrices, before embryonic stem cells (ESCs) are planted, a collagen-chitosan matrix in the form of a sponge or a film or fibers is cut into a volume of 1-1.5 mm 3 and laid out in sterile conditions 96 -well plate without coating them with 0.1% gelatin solution. In this case, the sponge, film or fibers are a collagen-chitosan three-dimensional matrix containing a complex of polysaccharides in the form of a nano-microstructured chitosan ascorbate with a molecular weight of 695 kDa and a degree of deacetylation of 98%, with a content of 1.8 g of ascorbic acid per 1 g of chitosan, saline anionic form of chondroitin sulfuric acid 20 mg / g, sodium hyaluronate 10 mg / g and heparin 5 mg / g, conditioned medium with neurotrophic factors obtained by culturing brain cells for 17-20 days fetuses of outbred rats obtained after dispersion of the brain and treatment with 0.5% collagenase solution for 30 minutes in DMEM at 37 ° C with the addition of 10% fetal calf serum (ETF), 100 μg / ml kanamycin sulfate, 1 mM L- glutamine, to which an additional 4 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF), 1 mM solution of essential amino acids (Sigma-Aldrieh) is added. In this case, the growth of cell biomass to obtain a conditioned medium is carried out at 37 ° C in vials coated with 0.1% gelatin solution. The conditioned medium is collected daily. At the same time, in order to obtain a second conditioned medium, mouse embryonic stem cells (ESCs) are reseed with a 0.5% solution of collagenase in DMEM / F12 synthetic medium in culture bottles, the cells are cultured with the addition of a neuronal differentiation agent - N2 component (or component B27) and retinoic acid according to the manufacturer's instructions. The medium is also collected, filtered through a 0.22 μm cellulose acetate filter and subsequently used together with the first conditioned medium as a combined conditioned medium or independently.
Для получения предшественников нейрональных клеток с целью их трансплантации стволовые клетки с культуральных флаконов снимают 0.5% раствором коллагеназы, трижды отмывают чистой средой от фермента и переносят в лунки с нарезанной матрицей в среде для ЭСК. Клетки культивируют не менее 3-х суток до появления нейрональных маркеров в гумидных условиях при 37°C и атмосфере с 6% содержанием CO2.Количество прикрепленных клеток оценивают путем диспергирования 5-6 кусочков матрицы в растворе фермента с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Каждый будущий нейроимплантат в процессе культивирования содержал порядка 50 тыс. эмбриональных стволовых клеток мыши. Использование в результате смешивания комбинированной кондиционированной среды от эмбриональных стволовых клеток мышей, находящихся в присутствии факторов нейрональной дифференцировки - компонента N2 и ретиноевой кислоты и кондиционированной среды от культивируемых мозговых клеток эмбрионов крыс, или в присутствии только кондиционированной среды от ЭСК мышей, приводит к нейрональной дифференцировке ЭСК мыши. Анализ экспрессии одного из нейрональных маркеров - нейрофиламента показал, что на первые сутки культивирования отсутствуют сигналы флуоресценции по указанному маркеру. На 5-7е сутки при культивировании ЭСК в кондиционированной среде обнаруживается экспрессия нейрофиламента. Аналогичная картина наблюдалась и в случае определения маркеров глиального фибриллярного кислого протеина (GFAP) и нестина (рис.1-3). На рис.1а показаны эмбриональные стволовые клетки мыши при фазово-контрастной микроскопии, культивированные и пассированные на коллаген-хитозановых матрицах в присутствии кондиционированных сред и N2 компонента с формированием в 1-й день клеточных колоний, на рис.1б показано образование предшественников нейронов на 14-й день культивирования. На рис.2а показано отсутствие экспрессии маркера нейрофиламента на 1-е сутки в клетках, культивируемых на коллаген-хитозановом комплексе в присутствии кондиционированных сред и N2 компонента, и наличие такой экспрессии на 7-е сутки (рис.2б) и 14-е сутки (рис.2в) культивирования. На рис.3а при иммуноцитохимическом анализе показаны эмбриональные стволовые клетки мыши, культивированные в кондиционированной среде с добавлением N2 компонента и экспрессирующие маркер нестин. Клетки фиксированы 1% формальдегидом в фосфатном буфере и обработаны антителами против нестина с последующим мечением вторичными антителами и детекцией флуоресценции. На рис.3б показаны эмбриональные стволовые клетки мыши, экспрессирующие в цитоплазме GFAP, культивированные при тех же условиях и обработанные антителами против маркера астроцитов - глиального фибриллярного кислого белка (GFAP).To obtain neuronal cell precursors for the purpose of their transplantation, stem cells from culture bottles are removed with a 0.5% collagenase solution, washed three times with clean medium from the enzyme and transferred to wells with a chopped matrix in an ESC medium. Cells are cultured for at least 3 days before the appearance of neuronal markers in humid conditions at 37 ° C and atmosphere with 6% CO 2 content. The number of attached cells is estimated by dispersing 5-6 pieces of the matrix in the enzyme solution, followed by cell counting in the Goryaev chamber. Each future neuroimplant during cultivation contained about 50 thousand mouse embryonic stem cells. Using as a result of mixing the combined conditioned medium from mouse embryonic stem cells in the presence of neuronal differentiation factors — the N2 component and retinoic acid and the conditioned medium from cultured brain cells of rat embryos, or in the presence of only conditioned medium from mouse ESCs, leads to neuronal differentiation of ESCs the mouse. Analysis of the expression of one of the neuronal markers - the neurofilament showed that on the first day of cultivation there are no fluorescence signals for the indicated marker. On the 5-7th day, when ESCs are cultured in an air-conditioned environment, expression of a neurofilament is detected. A similar picture was observed in the case of determining the markers of glial fibrillar acid protein (GFAP) and nestin (Fig. 1-3). Figure 1a shows mouse embryonic stem cells under phase contrast microscopy cultured and passaged on collagen-chitosan matrices in the presence of conditioned media and the N2 component with the formation of cell colonies on the 1st day, and Fig. 1b shows the formation of neuronal precursors by 14 day of cultivation. Figure 2a shows the absence of expression of a neurofilament marker on the 1st day in cells cultured on the collagen-chitosan complex in the presence of conditioned media and the N2 component, and the presence of such expression on the 7th day (Fig. 2b) and the 14th day (Fig.2c) cultivation. In immunocytochemical analysis, Fig. 3a shows mouse embryonic stem cells cultured in a conditioned medium with the addition of the N2 component and expressing the nestin marker. Cells are fixed with 1% formaldehyde in phosphate buffer and treated with anti-nestin antibodies, followed by secondary antibody labeling and fluorescence detection. Figure 3b shows mouse embryonic stem cells expressing GFAP in the cytoplasm, cultured under the same conditions, and treated with antibodies against the astrocyte marker, glial fibrillar acid protein (GFAP).
Перед имплантацией кусочки коллаген-хитозановой матрицы с помощью глазного пинцета осторожно переносят в микропробирки с питательной средой DMEM/F12 и транспортируют в операционную. После предварительной обработки операционного поля 70% раствором этилового спирта под наркозом производят разрез по средней линии спины крысы на уровне от грудного позвонка Th7 до поясничного позвонка L4 длиной 4-5 см. Гемостаз производят по ходу операции. После рассечения кожи, подкожно-жирового слоя края раны мобилизуют и разводят ранорасширителями Эдсона. Остисто-трапециевидную и широчайшую мышцы отсекают от мест их прикрепления к остистым отросткам Th9-L3. Мышцы глубокого слоя отсепаровывают от позвоночника тупым инструментом и разводят микрохирургическим ранорасширителем. оголяют дужки позвонков Th9-Th12. Производят резекцию дужки Th10. твердую мозговую оболочку рассекают и разводят в стороны в горизонтальной плоскости. При помощи микроскальпеля и микроножниц осуществляют пересечение 1/2 правой боковой порции спинного мозга в поперечном направлении. В образовавшийся дефект нервной ткани размерами около 2 мм3 помещают нейрональный клеточно-матричный имплантат в виде микропористой губки. По окончании трансплантации дефект кости позвонков закрывают полисахаридной гидрогелевой массой «Бол-хит», не содержащей животного коллагена. Рану ушивают послойно: на глубокий слой мышц накладывают П-образные швы шовным материалом Vicril 4-0; мышцы поверхностного слоя ушивают непрерывным обвивным швом нитью Vicril 4-0; на кожу накладывают П-образные швы нитью Polyester 3-0. Швы обрабатывают спиртовым раствором йода.Before implantation, pieces of the collagen-chitosan matrix are carefully transferred using ophthalmic forceps into microtest tubes with DMEM / F12 growth medium and transported to the operating room. After preliminary processing of the surgical field with a 70% solution of ethyl alcohol under anesthesia, an incision is made along the midline of the rat back at the level from the thoracic vertebra Th7 to the lumbar vertebra L4 4-5 cm long. Hemostasis is performed during the operation. After dissection of the skin, subcutaneous fat layer, the edges of the wound are mobilized and diluted with Edson retractors. The spinous-trapezius and latissimus muscles are cut off from their attachment sites to the spinous processes of Th9-L3. The muscles of the deep layer are separated from the spine with a blunt instrument and diluted with a microsurgical retractor. The temples of the vertebrae Th9-Th12 are exposed. Resection of the arch of Th10 is performed. the dura mater is dissected and bred to the sides in a horizontal plane. Using a microscalpel and microscissors, they intersect 1/2 of the right lateral portion of the spinal cord in the transverse direction. A neuronal cell-matrix implant in the form of a microporous sponge is placed in the resulting defect in nerve tissue with a size of about 2 mm 3 . At the end of the transplantation, the vertebral bone defect is closed with a Bol-hit polysaccharide hydrogel mass containing no animal collagen. The wound is sutured in layers: U-shaped sutures are applied to the deep layer of muscles with suture material Vicril 4-0; muscles of the superficial layer are sutured with continuous Vicril 4-0 thread; U-shaped sutures with Polyester 3-0 thread are applied to the skin. Seams are treated with an alcoholic solution of iodine.
В течение 3-5 дней после операции в качестве анальгетика животные получают Sol. Tramadoli 2,5 мг 3 раза в день в/м. Кожные швы снимают на 10-е сутки. В ранний послеоперационный период, в первые 24 часа, - допуск животных к воде. Кормление - на 2-3-и сутки после операции исключительно лечебным питанием «Полипротен-нефро» в течение 4-х недель. Крыс содержат в раздельных клетках с двойным сетчатым дном для активного передвижения, соблюдения гигиены, самостоятельного приема воды и пищи. Лекарственную поддержку осуществляют антибиотиком широкого спектра действия, спазмолитиками, сосудорасширяющими препаратами, глюкокортикоидными гормонами. Для оценки неврологических нарушений и динамики восстановления применяют шкалу оценки выраженности неврологического дефицита (Neurological Severity Scores - NSS) [4] в течение 1-4 недель послеоперационного периода. В схему контроля входят:Within 3-5 days after the operation, animals receive Sol as an analgesic. Tramadoli 2.5 mg 3 times daily IM Skin sutures are removed on the 10th day. In the early postoperative period, in the first 24 hours, animals are allowed access to water. Feeding - on the 2nd-3rd day after the operation, exclusively with Polyproten-Nephro medical nutrition for 4 weeks. Rats are kept in separate cages with a double mesh bottom for active movement, hygiene, self-intake of water and food. Drug support is provided by a broad-spectrum antibiotic, antispasmodics, vasodilator drugs, glucocorticoid hormones. To assess neurological impairment and recovery dynamics, the Neurological Severity Scores (NSS) rating scale [4] is used for 1-4 weeks of the postoperative period. The control scheme includes:
1. Оценка моторной функции (подвешивание крысы за хвост с регистрацией сгибания передней и задней конечностей, отклонения головы более чем на 10 градусов от вертикальной оси в течение 30 сек. помещение крысы на пол с оценкой нормального движения по полу, неспособности сохранять направленное движение, движения по кругу в сторону паретичных конечностей, падения на паретичную сторону.1. Assessment of motor function (suspension of a rat by the tail with registration of flexion of the front and rear limbs, deviation of the head by more than 10 degrees from the vertical axis for 30 sec. Placing the rat on the floor with an estimate of normal movement on the floor, inability to maintain directional movement, movements in a circle in the direction of paretic limbs, falling on the paretic side.
2. Тест «суживающаяся дорожка» заключался в прохождении крысой по дорожке длиной 165 см и шириной в начале пути - 9 см, в конце пути 3 см. Дорожку располагают на высоте 120-130 см над полом, что создает у крыс мотивацию для ее преодоления. Крысы с повреждением спинного мозга при продвижении вперед начинают оступаться (наступают тазовыми конечностями мимо дорожки). В зависимости от степени тяжести травмы спинного мозга в целом, и степени нарушения проприорецепции, в частности крысы могли безошибочно проходить по дорожке различное расстояние. Интактные крысы преодолевают дорожку полностью.2. The tapering track test consisted of a rat walking along a track 165 cm long and 9 cm wide at the beginning of the path, 3 cm at the end of the path. The track is placed at a height of 120-130 cm above the floor, which motivates rats to overcome it . Rats with damage to the spinal cord when moving forward begin to stumble (they advance with the pelvic limbs past the path). Depending on the severity of the injury to the spinal cord as a whole, and the degree of violation of proprioreception, in particular, rats could accurately walk different distances along the track. Intact rats overcome the track completely.
3. Оценка сенсорной функции (укладывание: зрительный и тактильный тесты; проприоцептивный тест (придавливание лапки к краю стола).3. Assessment of sensory function (laying: visual and tactile tests; proprioceptive test (pressing the paws to the edge of the table).
4. Оценка равновесия (сохранение равновесия и стабильное положение тела, захватывание балансира, крепкое сжатие балансира и отвисание одной паретичной конечности вдоль балансира, крепкое сжатие балансира и отвисание двух паретичных конечностей вдоль балансира, или кружение на балансире (более 60 сек), попытка сохранить равновесие на балансире (более 40 сек), но падение с него, попытка сохранить равновесие на балансире (более 40 сек), но падение с него, падение без попытки балансировать или ухватиться за балансир (менее 20 сек).4. Evaluation of equilibrium (maintaining equilibrium and a stable position of the body, grabbing the balance bar, tight compression of the balance bar and sagging of one paretic limb along the balance bar, tight compression of the balance bar and sagging of two paretic limbs along the balance bar, or circling on the balance bar (more than 60 sec), attempt to maintain balance on the balancer (more than 40 sec), but falling from it, an attempt to maintain balance on the balancer (more than 40 sec), but falling from it, falling without trying to balance or grab the balancer (less than 20 sec).
5. Отсутствие рефлексов или патологическая двигательная активность (рефлекс с ушной раковины при дотрагивании до слухового бугорка - тряска головой, роговичный рефлекс при дотрагивании до роговицы кусочком ваты - мигание, рефлекс испуга (двигательный ответ на короткий шум при щелкании зажима для бумаги), судороги, миоклонус, миодистония. Один балл соответствует невозможности выполнять задание или отсутствие тестируемого рефлекса; 13-18 баллов выраженное повреждение; 7-12 баллов - повреждение средней степени тяжести: 1-6 баллов - умеренное повреждение.5. Lack of reflexes or pathological motor activity (reflex from the auricle when touching the auditory tubercle - shaking the head, corneal reflex when touching the cornea with a piece of cotton - blinking, reflex of fright (motor response to a short noise when the paper clip is clicked), convulsions, myoclonus, myodystonia. One point corresponds to the inability to complete the task or the absence of the test reflex; 13-18 points severe damage; 7-12 points - moderate damage: 1-6 points - moderate damage REPRESENTATIONS.
Результаты имплантации. Анализ неврологических нарушений после моделирования спинальной травмы и имплантации в диастаз спинного мозга трехмерных матриц показал положительную динамику сенсорного и моторного восстановления спинного мозга. После имплантации клеточной матрицы с ЭСК - предшественниками нейрональных клеток происходит существенное улучшение неврологических показателей, таких как моторная и сенсорная активность задних конечностей, отсутствие патологической двигательной активности, восстановление состояния равновесия, улучшение выполнения тестов на горизонтальной поверхности и передвижений по суживающей дорожке. Через 1 неделю после частичной транссекции спинного мозга интегральная сумма баллов составляет 8-9, что соответствует средней степени тяжести спинальной травмы. Животные в тесте «беговая суживающая дорожка» проходили за лимитное время в среднем 13 см. Через 2 недели после нанесения спинальной травмы интегральная сумма баллов при оценке неврологических функций экспериментального животного составляет 7-7,5, что указывает на снижение тяжести нарушений и приближение ее к границе умеренного повреждения. Через 3 недели после экспериментальной травмы спинного мозга интегральная сумма нарушений составляет 6,0-6,5 балла. Эта величина соответствуют умеренной силе повреждения. Динамика снижения тяжести неврологических нарушений сохраняется к 4 неделе послеоперационного периода и составляет 5-6 баллов. При этом в тесте «беговая суживающая дорожка» крысы наращивают каждую неделю расстояние пробега от 10 см через 1 неделю до 50 см через 4 недели.Implantation results. An analysis of neurological abnormalities after modeling spinal injury and implantation of three-dimensional matrices into the diastasis of the spinal cord showed positive dynamics in sensory and motor restoration of the spinal cord. After implantation of the cell matrix with ESC - the precursors of neuronal cells, there is a significant improvement in neurological indicators, such as motor and sensory activity of the hind limbs, the absence of pathological motor activity, the restoration of equilibrium, the improvement of tests on a horizontal surface and movements along a narrowing path. After 1 week after partial transection of the spinal cord, the total score is 8–9, which corresponds to the moderate severity of the spinal injury. Animals in the test “treadmill treadmill” passed an average time of 13 cm for a limited time. 2 weeks after applying a spinal injury, the total score for assessing the neurological functions of an experimental animal is 7–7.5, which indicates a decrease in the severity of disturbances and its approximation border of moderate damage. 3 weeks after the experimental spinal cord injury, the total amount of impairment is 6.0-6.5 points. This value corresponds to moderate damage. The dynamics of reducing the severity of neurological disorders persists by the 4th week of the postoperative period and is 5-6 points. At the same time, in the test “tapering narrowing track”, rats increase the distance of run from 10 cm after 1 week to 50 cm after 4 weeks.
Таким образом, исследования неврологического статуса у взрослых крыс после экспериментального частичного пересечения спинного мозга и прямой трансплантации коллаген-хитозановой губки, содержащей нейрональное микроокружение в виде комбинированной кондиционированной среды и предшественники нейрональных клеток мыши, подтверждает положительную неврологическую динамику в тестах Neurological Severity Scores - NSS в течение 1-4 недель после операции, восстанавливая сенсорную и двигательную функции спинного мозга.Thus, studies of the neurological status in adult rats after experimental partial intersection of the spinal cord and direct transplantation of a collagen-chitosan sponge containing a neuronal microenvironment in the form of a combined conditioned medium and mouse neuronal cell precursors confirms the positive neurological dynamics in Neurological Severity Scores - NSS tests during 1-4 weeks after surgery, restoring the sensory and motor functions of the spinal cord.
Результаты детекции флюоресценции в образцах спинного мозга методом проточной цитометрии в сроки 1-4 недель показывают, что прямая трансплантация предшественников нейрональных клеток, полученных путем культивирования и создания нейронального микроокружения с помощью кондиционированных сред и нейрональной добавки N2 компонента сохраняет предшественники нейронов жизнеспособными, которые пролиферируют в течение 4-х недель. Относительное количество клеток, экспрессирующих фактор GFP, не изменяется на протяжении двух недель.The results of fluorescence detection in spinal cord samples by flow cytometry for 1-4 weeks show that direct transplantation of neuronal cell precursors obtained by culturing and creating a neuronal microenvironment using conditioned media and a neural supplement of the N2 component keeps neuronal precursors viable that proliferate for 4 weeks. The relative number of cells expressing GFP factor does not change for two weeks.
В имплантированной матрице с эмбриональными стволовыми клетками мыши (ЭСКм) с увеличением длительности срока имплантации отмечается более выраженное рассасывание ее волокон. К 28-м суткам большая часть стволовых клеток мигрирует на периферию матрицы. Анализ препаратов показывает, что клетки в матрицах не только выживают, а, заполняя всю ее структуру, мигрируют по направлению к материнской нервной ткани.In the implanted matrix with mouse embryonic stem cells (ESCm), with a longer implantation period, a more pronounced resorption of its fibers is noted. By the 28th day, most of the stem cells migrate to the periphery of the matrix. An analysis of the preparations shows that the cells in the matrices not only survive, but, filling its entire structure, migrate towards the maternal nerve tissue.
Более того, уменьшение количества волокон биополимера свидетельствует о высокой метаболической активности клеток в зоне репарации. Вокруг зоны травмы в обоих случаях (при наличии и отсутствии ЭСКм в матрице) выявляется большое количество макрофагов, цитоплазма которых заполнена фагоцитированным детритом. Количество этих клеток увеличивается в течение 7-14-и суток после травмы и имплантации и уменьшается в течение 21-28-и суток.Moreover, a decrease in the number of biopolymer fibers indicates a high metabolic activity of cells in the repair zone. Around the injury zone in both cases (in the presence and absence of ESCm in the matrix), a large number of macrophages are detected, the cytoplasm of which is filled with phagocytized detritus. The number of these cells increases within 7-14 days after trauma and implantation and decreases within 21-28 days.
При имплантации матрицы с ЭСКм отмечается увеличение всех клеток макроглии (астроциты, олигодендроциты). При использовании матрицы без ЭСКм наблюдается увеличение клеток олигодендроглии и уменьшение клеток астроцитарной глии.Upon implantation of the matrix with ESCm, an increase in all macroglia cells (astrocytes, oligodendrocytes) is noted. When using a matrix without ESCm, an increase in oligodendroglia cells and a decrease in astrocytic glia cells are observed.
Количество нейронов в сером веществе спинного мозга при имплантации матрицы с ЭСКм сохраняется примерно на одном уровне, с небольшим пиком на 2-3 неделях. Кроме того, на 28-е сутки вокруг зоны имплантации матрицы с ЭСКм отмечается появление большого количества клеток-предшественников нейрональной популяции. При отсутствии в матрице ЭСКм количество нейронов с течением времени уменьшается. Таким образом, результаты исследований показывают признаки полноценного восстановления структуры поврежденного спинного мозга. Трансплантация клеток на матрице приводит к более полноценному и быстрому восстановлению гистологической целостности ткани после повреждения.The number of neurons in the gray matter of the spinal cord during implantation of the matrix with ESCm remains at approximately the same level, with a small peak at 2-3 weeks. In addition, on the 28th day, the appearance of a large number of neuronal population precursor cells was observed around the implantation zone of the matrix with ESCm. If there is no ESCm in the matrix, the number of neurons decreases over time. Thus, the research results show signs of a full restoration of the structure of the damaged spinal cord. Cell transplantation on the matrix leads to a more complete and faster restoration of the histological integrity of the tissue after damage.
При иммуногистохимическом анализе фиксированных ЭСКм препаратов спинного мозга клетки предварительно обрабатывали антителами против нейрофиламента, с последующим мечением вторичными антителами и детекцией флуоресценции. Результаты анализа гистопрепаратов показывают, что введение в матрицу имплантата предшественников нейрональных клепок приводит к приживлению и миграции их в раневой зоне с последующей дифференцировкой в нейрональном направлении в течение 1-4 недель. У животных во все сроки наблюдения отмечается присутствие трансплантированных клеток, дифференцирующихся в клетки нейронального типа. При дифференцировке клеток в нейрональном направлении в продольном срезе спинного мозга имеется наличие в клеточных тяжах нейрофиламента, фермента енолазы. образование синапсов и GFP к глиальному белку. При выполнении анализа наличия енолазы в препаратах спинного мозга после обработки клеток антителами против енолазы и последующего мечения вторичными антителами с детекцией флуоресценции обнаруживается специфический белок нейрона. При обработке антителами против глиального кислого белка указанный белок также обнаруживается в клеточной массе трансплантированных клеток.In the immunohistochemical analysis of fixed ESCm preparations of the spinal cord, the cells were pretreated with antibodies against a neurofilament, followed by labeling with secondary antibodies and detection of fluorescence. The results of the analysis of histological preparations show that the introduction of neuronal rivets precursors into the implant matrix leads to engraftment and migration in the wound zone, followed by differentiation in the neuronal direction for 1-4 weeks. In animals, the presence of transplanted cells differentiating into neuronal type cells is observed at all observation times. With the differentiation of cells in the neuronal direction in the longitudinal section of the spinal cord, there is the presence of a neurofilament, the enzyme enolase, in the cell strands. the formation of synapses and GFP to the glial protein. When analyzing the presence of enolase in the preparations of the spinal cord after treatment of cells with antibodies against enolase and subsequent labeling with secondary antibodies with fluorescence detection, a specific neuron protein is detected. When treated with antibodies against a glial acidic protein, the protein is also found in the cell mass of the transplanted cells.
Обработка срезов спинного мозга растворами антител к олигодендроцитам обнаруживает в зоне прямой трансплантации клетки этого типа.Treatment of sections of the spinal cord with solutions of antibodies to oligodendrocytes reveals cells of this type in the zone of direct transplantation.
Таким образом, анализ морфологии спинного мозга крыс указывает, что способ имплантации матриц в спинной мозг и их состав обеспечивают стабильность губчатой конструкции в течение 4-х недель. В образцах СМ в зоне его повреждения на 3-й и 4-й неделе после трансплантации присутствуют клетки со стабильной экспрессией GFP, что подтверждает способность трансплантированных клеток к хоумингу в зоне повреждения и их жизнеспособность. Трансплантированные клетки экспрессируют маркеры олигодендроцитов, нестина, нейрональной енолазы и нейрофиламента, образуя межсинаптические связи. Трансплантация не сопровождается выраженной воспалительной реакцией. Предложенный способ тканевой инженерии СМ приводит к полноценному восстановлению морфологической и функциональной целостности спинного мозга после его частичного анатомического разрыва при осложненной позвоночно-спинальной травме.Thus, an analysis of the morphology of rat spinal cord indicates that the method of implantation of matrices in the spinal cord and their composition ensure the stability of the spongy structure for 4 weeks. Cells with stable GFP expression are present in the SM samples in the lesion zone at the 3rd and 4th week after transplantation, which confirms the ability of the transplanted cells to homing in the lesion zone and their viability. Transplanted cells express markers of oligodendrocytes, nestin, neuronal enolase and neurofilament, forming intersynaptic bonds. Transplantation is not accompanied by a pronounced inflammatory reaction. The proposed method of tissue engineering of SM leads to the full restoration of the morphological and functional integrity of the spinal cord after its partial anatomical rupture in complicated vertebral-spinal injury.
Пример эксперимента 1. У четырех белых беспородных крыс-самок массой 250 г с использованием операционного микроскопа воспроизводили модель спинальной травмы на уровне IX-X грудных позвонков с 50% боковым пересечением спинного мозга после предварительно выполненной ламинэктомии. В дефект спинного мозга помещали коллаген-хитозановую трехмерную матрицу в виде губки, содержащую биомассу из 50 тысяч линии эмбриональных стволовых клеток мыши, комбинированную кондиционированную среду, полученную от культивирования мозговых клеток 17-20 дневных фетусов крысы и эмбриональных стволовых клеток мыши, содержащую полную питательную среду с добавлением нейронального фактора N2. Животные составили опытную группу №1.Experimental example 1. In four white mongrel female rats weighing 250 g using an operating microscope, a spinal injury model was reproduced at the level of IX-X thoracic vertebrae with 50% lateral intersection of the spinal cord after a preliminary laminectomy. A sponge collagen-chitosan three-dimensional matrix was placed in the spinal cord defect containing a biomass of 50 thousand mouse embryonic stem cell lines, a combined conditioned medium obtained from culturing brain cells of rats 17-20 day old fetuses and mouse embryonic stem cells containing a complete nutrient medium with the addition of neuronal factor N2. Animals made up experimental group No. 1.
В ходе операции проводили премедикацию: за 30 мин до операции - Sol. Tramadoli 2,5 мкг/мл; Sol. Atropini sulfatis 0,1% - 0,1 мкг/мл; Sol. Dimedroli 0,1% - 0,1 мкг/мл. Анестезия: наркоз парами диэтилового эфира. После предварительной обработки операционного поля 70% раствором этилового спирта под наркозом производили разрез по средней линии спины животного на уровне от грудного позвонка Th7 до поясничного позвонка L4 длиной 4-5 см. Гемостаз производили по ходу операции. После рассечения кожи, подкожно-жирового слоя края раны мобилизовали и разводили ранорасширителями Эдсона. Остисто-трапециевидную и широчайшую мышцы отсекали от мест их прикрепления к остистым отросткам позвонков Th9-L3. Мышцы глубокого слоя отсепаровывали от позвоночника тупым инструментом и разводили микрохирургическим ранорасширителем. скелетировали дужки грудных позвонков Th8-Th10. Производили резекцию дужки грудного позвонка Th9. твердую мозговую оболочку рассекали и разводили в стороны в горизонтальной плоскости. При помощи микроскальпеля и микроножниц осуществляли 50% боковое пересечение спинного мозга в поперечном направлении. При помощи микрохирургического зонда с оливой производили контроль пересечения путем проведения инструмента по передней стенке позвоночного канала. В образовавшийся диастаз нервной ткани размерами около 1,5 мм помещали нейрональный клеточно-матричный имплантат указанного состава. Костную рану закрывали полисахаридной гидрогелевой массой «Бол-хит», не содержащей животного коллагена. Рану ушивали послойно: на глубокий слой мышц накладывали П-образные швы шовным материалом Vicril 4-0; мышцы поверхностного слоя ушивали непрерывным обвивным швом нитью Vicril 4-0; на кожу накладывали П-образные швы нитью Polyester 3-0. Швы обрабатывали спиртовым раствором йода.During the operation, premedication was performed: 30 minutes before the operation, Sol. Tramadoli 2.5 μg / ml; Sol. Atropini sulfatis 0.1% - 0.1 μg / ml; Sol. Dimedroli 0.1% - 0.1 μg / ml. Anesthesia: anesthesia with diethyl ether vapor. After preliminary treatment of the surgical field with a 70% solution of ethyl alcohol under anesthesia, an incision was made along the midline of the back of the animal at the level from the thoracic vertebra Th7 to the lumbar vertebra L4 4-5 cm long. Hemostasis was performed during the operation. After dissection of the skin, subcutaneous fat layer, the edges of the wound were mobilized and diluted with Edson retractors. The spinous-trapezius and latissimus muscles were cut off from their attachment sites to the spinous processes of the vertebrae Th9-L3. The deep layer muscles were separated from the spine with a blunt instrument and diluted with a microsurgical retractor. skeletal arches of the thoracic vertebrae Th8-Th10. Resection of the arch of the thoracic vertebra Th9 was performed. the dura mater was dissected and bred to the sides in a horizontal plane. Using a microscalpel and micro scissors, 50% lateral intersection of the spinal cord in the transverse direction was carried out. Using a microsurgical probe with olive, the intersection was controlled by holding the instrument along the front wall of the spinal canal. A neuronal cell-matrix implant of the indicated composition was placed in the resulting nerve tissue diastasis with dimensions of about 1.5 mm. The bone wound was closed with a Bol-Hit polysaccharide hydrogel mass containing no animal collagen. The wound was sutured in layers: U-shaped sutures were sutured with a Vicril 4-0 suture on the deep muscle layer; muscles of the superficial layer were sutured with continuous Vicril 4-0 suture; U-shaped sutures with Polyester 3-0 thread were applied to the skin. The seams were treated with an alcoholic solution of iodine.
Послеоперационный уход. В течение 3-5 дней после операции в качестве анальгетика животные получали Sol. Tramadoli по 2,5 мг 3 раза в день в/м. Швы снимали на 10-е сутки. В ранний послеоперационный период, в первые 24 часа осуществляли допуск животных к воде. Кормление проводили на 2-3-и сутки после операции исключительно смесью лечебного питания «Полипротен-нефро» в течение 1-4 недель. Крыс содержали в раздельных клетках. Лекарственную поддержку осуществляли антибиотиком широкого спектра действия, спазмолитиками, сосудорасширяющими препаратами.Postoperative Care Within 3-5 days after surgery, animals received Sol as an analgesic. Tramadoli 2.5 mg 3 times a day / m. Sutures were removed on the 10th day. In the early postoperative period, in the first 24 hours, animals were allowed access to water. Feeding was carried out on the 2nd-3rd day after the operation exclusively with the Polyproten-Nephro therapeutic nutritional mixture for 1-4 weeks. Rats were kept in separate cages. Drug support was provided by a broad-spectrum antibiotic, antispasmodics, and vasodilator drugs.
Динамический неврологический контроль. Для оценки неврологических нарушений и динамики восстановления применяли шкалу оценки выраженности неврологического дефицита (Neurological Severity Scores - NSS) в течение 1-4 недель послеоперационного периода.Dynamic neurological control. To assess neurological impairment and recovery dynamics, a Neurological Severity Scores (NSS) scale was used for 1-4 weeks of the postoperative period.
Анализ морфологического материала. В указанные периоды времени после операции имплантации клеточной матрицы забирали морфологический материал для приготовления гистологических парафино-восковых срезов тканей спинного мозга. Для этого препараты спинного мозга получали путем тщательного и осторожного выделения ткани из позвоночного канала. Далее осуществляли классическую гистологическую проводку ткани на оборудовании фирмы Leica (Германия), часть поперечных серийных гистологических срезов спинного мозга окрашивали гематоксилин-эозином с целью обзорного анализа ткани в месте дислокации имплантата и в его непосредственном окружении. При обзорной микроскопии гистологических срезов оценивали степень глиальной реакции в зоне травмы, окружающей ткани, состояние нейронов серого вещества спинного мозга, состояние межу точного пространства белого и серого вещества спинного мозга в 5-ти полях зрения каждого среза. Подсчитывали количество клеток макроглии: астроциты, олигодендроциты; микроглии: макрофаги и количество клеток нейронального ряда.Analysis of morphological material. In the indicated time periods after the implantation of the cell matrix, morphological material was taken to prepare histological paraffin-wax sections of the spinal cord tissue. For this, preparations of the spinal cord were obtained by carefully and carefully isolating tissue from the spinal canal. Then, classical histological tissue was performed using Leica equipment (Germany); part of the transverse serial histological sections of the spinal cord were stained with hematoxylin-eosin for the purpose of a review of the tissue at the implant's dislocation site and its immediate surroundings. Survey microscopy of histological sections evaluated the degree of glial reaction in the trauma zone surrounding the tissue, the state of the neurons of the gray matter of the spinal cord, and the state of the interstitial space of the white and gray matter of the spinal cord in 5 fields of view of each section. The number of macroglia cells was counted: astrocytes, oligodendrocytes; microglia: macrophages and the number of cells in the neuronal series.
Часть гистологических срезов подвергали иммуногистохимической обработке на предмет выявления состояния имплантированной клеточной массы: обнаружение трансплантированных клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок GFP на флуоресцентном микроскопе «0lympus BX-51» с применением программных продуктов «AppliedSpectralImaging» (USA).Part of the histological sections was subjected to immunohistochemical processing to determine the state of the implanted cell mass: detection of transplanted cells expressing the green fluorescent GFP protein using a 0lympus BX-51 fluorescence microscope using AppliedSpectralImaging software products (USA).
Результаты. Анализ неврологических нарушений после моделирования спинальной травмы и имплантации в диастаз спинного мозга трехмерных матриц показал положительную динамику сенсорного и моторного восстановления спинного мозга. После имплантации клеточной матрицы с предшественниками нейрональных клеток, полученных в результате дифференцировки ЭСК мыши, происходит существенное улучшение неврологических показателей, таких как моторная и сенсорная активность задних конечностей, отсутствие патологической двигательной активности, восстановление состояния равновесия, улучшение выполнения тестов на горизонтальной поверхности и передвижений по суживающей дорожке. Через 1 неделю после частичной транссекции спинного мозга интегральная сумма баллов составила 8.94. что соответствует средней степени тяжести спинальной травмы. Животные в тесте «беговая суживающая дорожка» проходили за лимитное время в среднем 13,8 см. Через 2 недели после нанесения спинальной травмы интегральная сумма баллов при оценке неврологических функций экспериментального животного составила 7,46, что указывает на снижение тяжести нарушений и приближение ее к границе умеренною повреждения. Через 3 недели после экспериментальной травмы спинного мозга интегральная сумма нарушений составила 6,12 балла. Эта величина соответствуют умеренной силе повреждения. Динамика снижения тяжести неврологических нарушений сохраняется к 4-й неделе послеоперационного периода и составляет 5,6 балла. При этом в тесте «беговая суживающая дорожка» крысы наращивают каждую неделю расстояние пробега от 13,8 см через 1 неделю до 47,5 см через 4 недели.Results. An analysis of neurological abnormalities after modeling spinal injury and implantation of three-dimensional matrices into the diastasis of the spinal cord showed positive dynamics in sensory and motor restoration of the spinal cord. After implantation of the cell matrix with the precursors of neuronal cells obtained as a result of differentiation of mouse ESCs, there is a significant improvement in neurological indicators, such as motor and sensory activity of the hind limbs, the absence of pathological motor activity, the restoration of equilibrium, the improvement of horizontal tests and movements along the narrowing track. One week after partial transplantation of the spinal cord, the total score was 8.94. which corresponds to a moderate severity of spinal injury. Animals in the treadmill treadmill test passed an average time of 13.8 cm for a limited time. 2 weeks after the spinal injury, the total score for evaluating the neurological functions of the experimental animal was 7.46, which indicates a decrease in the severity of disturbances and its approximation border of moderate damage. 3 weeks after the experimental spinal cord injury, the total amount of impairment was 6.12 points. This value corresponds to moderate damage. The dynamics of reducing the severity of neurological disorders persists by the 4th week of the postoperative period and is 5.6 points. At the same time, in the test “tapering narrowing track”, rats increase the distance of run from 13.8 cm in 1 week to 47.5 cm in 4 weeks every week.
Таким образом, исследования неврологическою статуса у взрослых крыс после экспериментального частичного пересечения спинного мозга и прямой трансплантации коллаген-хитозановой губки. содержащей нейрональное микроокружение и предшественники нейрональных клеток мыши. подтверждает положительную неврологическую динамику в тестах Neurological Severity Scores - NSS в течение 1-4 недель после операции, восстанавливая сенсорную и двигательную функции спинного мозга.Thus, studies of the neurological status in adult rats after experimental partial intersection of the spinal cord and direct transplantation of collagen-chitosan sponge. containing the neuronal microenvironment and the precursors of mouse neuronal cells. confirms the positive neurological dynamics in the Neurological Severity Scores - NSS tests within 1-4 weeks after surgery, restoring the sensory and motor functions of the spinal cord.
Результаты детекции флуоресценции в образцах спинного мозга методом проточной цитометрии в сроки 1-4 недель показали, что прямая трансплантация предшественников нейрональных клеток, полученных путем культивирования и создания нейронального микроокружения с помощью кондиционированной среды и нейрональной добавки N2 компонента сохраняет предшественники нейронов жизнеспособными, которые пролиферируют в течение 4-х недель (рис.4). На рис.4 с помощью проточной цитофлуориметрии диспергатов спинного мозга и детекции зеленой флуоресценции (в красной-зеленой области) показано относительное количество клеток, экспрессирующих фактор GFP, которое не изменяется на протяжении двух недель и составляет около 34%: рис.4а - контроль (без клеток): рис.4б - 3-я неделя после имплантации матрицы с клетками; рис.4в - 4-я неделя после имплантации матрицы с клепками.The results of fluorescence detection in spinal cord samples by flow cytometry in terms of 1-4 weeks showed that direct transplantation of neuronal cell precursors obtained by culturing and creating a neuronal microenvironment using a conditioned medium and neuronal supplement of the N2 component keeps neuron precursors viable that proliferate for 4 weeks (Fig. 4). Fig. 4, using flow cytofluorimetry of spinal cord dispersions and detection of green fluorescence (in the red-green region), shows the relative number of cells expressing GFP factor, which has not changed for two weeks and is about 34%: Fig. 4a - control ( without cells): Fig. 4b - 3rd week after implantation of a matrix with cells; Fig.4c - 4th week after implantation of a matrix with rivets.
В имплантированной матрице с предшественниками нейрональных клеток мыши с увеличением длительности срока имплантации отмечалось более выраженное резорбирование ее волокон. К 28-м суткам большая часть предшественников нейрональных клеток мигрировала на периферию матрицы. Анализ препаратов показывает, что клетки в матрицах не только выживают, а, заполняя всю ее структуру, мигрируют по направлению к материнской нервной ткани (рис.5). На рис.5а показана гистограмма имплантированной коллаген-хитозановой матрицы в зоне спинальной травмы, не содержащей предшественников нейрональных клеток мыши. На рис.5б показана гистограмма имплантированной матрицы, содержащей бывшие эмбриональные стволовые клетки мыши - предшественники нейрональных клеток (окраска среза азур-эозином).In the implanted matrix with the precursors of mouse neuronal cells, with a longer implantation period, a more pronounced resorption of its fibers was noted. By the 28th day, most of the precursors of neuronal cells migrated to the periphery of the matrix. An analysis of the preparations shows that the cells in the matrices not only survive, but, filling its entire structure, migrate towards the maternal nerve tissue (Fig. 5). Figure 5a shows a histogram of an implanted collagen-chitosan matrix in the spinal injury zone, which does not contain the precursors of mouse neuronal cells. Figure 5b shows a histogram of the implanted matrix containing the former mouse embryonic stem cells - the precursors of neuronal cells (section staining with azure-eosin).
Более того, уменьшение количества волокон биополимера свидетельствует о высокой метаболической активности клеток в зоне репарации. Вокруг зоны травмы в обоих случаях (при наличии и отсутствии предшественников нейрональных клеток в матрице) выявлено большое количество макрофагов. цитоплазма которых заполнена фагоцитированным детритом (рис.6). Гистограмма на рис.6 указывает на выраженную макрофагальную реакцию в зоне спинальной травмы на 7-е сутки после имплантации клеточной матрицы. Количество макрофагальных клеток увеличивалось на 7-14-е сутки и уменьшалось на 21-28-е сутки (окраска среза азур-эозином).Moreover, a decrease in the number of biopolymer fibers indicates a high metabolic activity of cells in the repair zone. Around the injury zone in both cases (in the presence and absence of neuronal cell precursors in the matrix), a large number of macrophages were detected. whose cytoplasm is filled with phagocytized detritus (Fig. 6). The histogram in Fig. 6 indicates a pronounced macrophage reaction in the spinal injury zone on the 7th day after implantation of the cell matrix. The number of macrophage cells increased on the 7-14th day and decreased on the 21-28th day (staining of the section with azure-eosin).
При имплантации матрицы с предшественниками нейрональных клеток мыши отмечалось увеличение всех клеток макроглии (астроциты. олигодендроциты). При использовании матрицы без предшественников нейрональных клеток наблюдалось увеличение клеток олигодендроглии и уменьшение клеток астроцитарной глии.Upon implantation of a matrix with precursors of mouse neuronal cells, an increase in all macroglia cells (astrocytes, oligodendrocytes) was noted. When using a matrix without precursors of neuronal cells, an increase in oligodendroglia cells and a decrease in astrocytic glia cells were observed.
Количество нейронов в сером веществе спинного мозга при имплантации матрицы с предшественниками нейрональных клеток сохранялось примерно на одном уровне, с небольшим пиком на 2-3 неделях. Кроме того, на 28-е сутки вокруг зоны имплантации матрицы отмечено появление большого количества клеток-предшественников нейрональной популяции (рис.7). На рис.7 показаны малодифференцированные нейрональные клетки-предшественники в зоне имплантации матрицы на 28-е сутки после операции имплантации.The number of neurons in the gray matter of the spinal cord during matrix implantation with neuronal cell precursors remained at approximately the same level, with a small peak at 2-3 weeks. In addition, on the 28th day, the appearance of a large number of neuronal population precursor cells was noted around the matrix implantation zone (Fig. 7). Fig. 7 shows poorly differentiated neuronal precursor cells in the matrix implantation zone on the 28th day after the implantation operation.
При отсутствии в матрице предшественников нейрональных клеток количество нейронов с течением времени уменьшалось. Таким образом, результаты исследований показали признаки полноценного восстановления структуры поврежденного спинного мозга. Трансплантация клеток на матрице приводит к более полноценному и быстрому восстановлению гистологической целостности ткани после повреждения.In the absence of neuronal cell precursors in the matrix, the number of neurons decreased over time. Thus, the research results showed signs of a complete restoration of the structure of the damaged spinal cord. Cell transplantation on the matrix leads to a more complete and faster restoration of the histological integrity of the tissue after damage.
При иммуногистохимическом анализе фиксированных препаратов спинного мозга клетки предварительно обрабатывали антителами против нейрофиламента, с последующим мечением вторичными антителами и детекцией флуоресценции. Результаты анализа гистопрепаратов показали, что добавление в матрицу имплантата предшественников нейрональных клеток ведет к приживлению и миграции их в раневой зоне с последующей дифференцировкой в нейроиальном направлении в течение 1-4 недель. У животных как в ранние сроки, так и в поздний период наблюдалось наличие трансплантированных клеток, дифференцирующихся в тканеспецифические типы. При дифференцировке клеток по нейрональному направлению в продольном срезе спинного мозга имеется натичие нейрофиламента в клеточных тяжах, фермента енолазы, образование синапсов и GFP к глиальному белку (рис.8). На рис.8а при иммуногистологическом анализе показана экспрессия нейрофиламента через 2 недели после пересадки матрицы в спинной мозг с предшественниками нейронатьных клеток. Рис.8б демонстрирует экспрессию маркера нейронов енолазы через 2 недели после имплантации. На рис.8в указывается наличие синапсов на аксональных окончаниях пересаженных клеток с экспрессией зеленого флуоресцирующего протеина (GFP). На рис.8г определяется наличие GFP к глиальному белку.In an immunohistochemical analysis of fixed spinal cord preparations, cells were pretreated with antibodies against a neurofilament, followed by labeling with secondary antibodies and detection of fluorescence. The results of the analysis of histological preparations showed that the addition of neuronal cell precursors to the implant matrix leads to engraftment and migration in the wound zone, followed by differentiation in the neuroial direction for 1-4 weeks. In animals, both in the early stages and in the late period, the presence of transplanted cells was observed, differentiating into tissue-specific types. With the differentiation of cells along the neuronal direction in the longitudinal section of the spinal cord, there is a nerve filament in the cell strands, the enzyme enolase, the formation of synapses and GFP to the glial protein (Fig. 8). In immunohistological analysis, Fig. 8a shows the expression of a neurofilament 2 weeks after transplantation of the matrix into the spinal cord with the precursors of neuron cells. Fig. 8b shows the expression of the enolase neuron marker 2 weeks after implantation. Figure 8c shows the presence of synapses at the axonal ends of the transplanted cells with expression of green fluorescent protein (GFP). In Fig. 8d, the presence of GFP to the glial protein is determined.
При выполнении анализа наличия енолазы в препаратах спинного мозга после обработки клеток антителами против енолазы и последующего мечения вторичными антителами с детекцией флуоресценции обнаруживается специфический белок нейрона. При обработке антителами против глиального кислого белка последний также обнаруживается в клеточной массе трансплантированных клеток.When analyzing the presence of enolase in the preparations of the spinal cord after treatment of cells with antibodies against enolase and subsequent labeling with secondary antibodies with fluorescence detection, a specific neuron protein is detected. When treated with antibodies against glial acidic protein, the latter is also found in the cell mass of transplanted cells.
При наличии в трансплантате предшественников нейрональных клеток мыши в препаратах спинного мозга, обработанных антителами против олигодендроцитов, с последующим мечением вторичными антителами и детекцией флуоресценции последние обнаруживаются в зоне прямой трансплантации.In the presence of precursors of mouse neuronal cells in the spinal cord preparations treated with antibodies against oligodendrocytes, followed by labeling with secondary antibodies and detection of fluorescence, the latter are found in the direct transplantation zone.
Анализ молекулярного маркера ингибитора передачи нервного сигнала трансплантированными клетками - гамма-аминомаеляной кислоты (ГАМК) показал признаки его появления в цитоплазме уже через 1 неделю послеоперационного периода (рис.9-12). На рис.9 при детекции флуоресценции показан вид клеточной матрицы через 1 неделю после имплантации предшественников нейрональных клеток. Зеленое свечение указывает на наличие трансплантированных GFP-клеток. Рис.10 демонстрирует формирование структуры нейронов на коллаген-хитозановой губчатой сетке, экспрессирующих зеленый маркер GFP. с началом экспрессии маркера ГАМК (красные включения) через 1 неделю после операции частичного анатомического разрыва спинного мозга. На рис.11а показана зона имплантации клеточной матрицы при частичном анатомическом разрыве спинного мозга через 2 недели после операции с наличием в матрице жизнеспособных предшественников нейрональных клеток, экспрессирующих зеленый белок GFP, наличием кровеносных сосудов, заполненных форменными элементами крови (естественная флуоресценция эритроцитов). Рис.11б демонстрирует через 2 недели после операции экспрессию ГАМК нейрональными клетками. На рис.12 показано, что имплантированные жизнеспособные GFP-нейроны (зеленое свечение) экспрессируют ГАМК-маркер (красное свечение) через 4 недели после операции.Analysis of the molecular marker of the inhibitor of nerve signal transmission by transplanted cells - gamma-aminomeric acid (GABA) showed signs of its appearance in the cytoplasm after 1 week of the postoperative period (Fig. 9-12). Figure 9 shows the appearance of the cell matrix during fluorescence detection 1 week after implantation of neuronal cell precursors. A green glow indicates the presence of transplanted GFP cells. Fig. 10 shows the formation of the structure of neurons on the collagen-chitosan spongiform network expressing the green marker GFP. with the beginning of the expression of the GABA marker (red inclusions) 1 week after the operation of partial anatomical rupture of the spinal cord. Figure 11a shows the implantation zone of the cell matrix with partial anatomical rupture of the spinal cord 2 weeks after surgery with the presence of viable neuronal cell precursors expressing the green GFP protein in the matrix and the presence of blood vessels filled with blood cells (natural erythrocyte fluorescence). Figure 11b shows 2 weeks after surgery the expression of GABA by neuronal cells. Figure 12 shows that implanted viable GFP neurons (green glow) express a GABA marker (red glow) 4 weeks after surgery.
Таким образом, анализ морфологии спинного мозга крыс указывает, что способ имплантации матриц в спинной мозг и их состав обеспечивают стабильность губчатой конструкции в течение 4-х недель. В образцах СМ в зоне его повреждения на 3 и 4 неделе после трансплантации присутствуют клетки со стабильной экспрессией GFP, что подтверждает способность трансплантированных клеток к хоумингу в зоне повреждения и их жизнеспособность. Трансплантированные клетки экспрессируют маркеры олигодендроцитов, нестина, нейрональной енолазы и нейрофиламента, образуя межсинаптические связи. Трансплантация не сопровождается выраженной воспалительной реакцией в месте имплантации. Предложенный способ тканевой инженерии СМ приводит к полноценному восстановлению морфологической и функциональной целостности спинного мозга после его частичного анатомического разрыва при осложненной позвоночно-спиналыюй травме.Thus, an analysis of the morphology of rat spinal cord indicates that the method of implantation of matrices in the spinal cord and their composition ensure the stability of the spongy structure for 4 weeks. Cells with stable GFP expression are present in SM samples in the lesion zone at 3 and 4 weeks after transplantation, which confirms the ability of the transplanted cells to homing in the lesion zone and their viability. Transplanted cells express markers of oligodendrocytes, nestin, neuronal enolase and neurofilament, forming intersynaptic bonds. Transplantation is not accompanied by a pronounced inflammatory reaction at the implantation site. The proposed method of tissue engineering of SM leads to the full restoration of the morphological and functional integrity of the spinal cord after its partial anatomical rupture in case of a complicated vertebral-spinal injury.
Пример эксперимента №2. Пяти белым беспородным крысам-самкам массой 250 г с использованием операционного микроскопа воспроизводилась модель спинальной травмы на уровне IX-X грудных позвонков с частичным пересечением спинного мозга после предварительно выполненной ламинэктомии. В дефект спинною мозга помещали коллаген-хитозановую трехмерную матрицу в виде губки, содержащую комбинированную кондиционированную среду, полученную от культивирования мозговых клеток 17-20 дневных фетусов крысы и эмбриональных стволовых клеток мыши, содержащую полную питательную среду с добавлением нейронатьного фактора N2, но не содержащую предшественники нейрональных клеток, полученные в результате дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши. Животные составили контрольную группу №2. У животных в послеоперационном периоде в течение 4-х недель наблюдалась слабая положительная динамика в неврологическом статусе сенсорных и моторных зон иннервации в области нижних конечностей, таза, нижней половины туловища. Положительный эффект при имплантации матрицы без клеток при отсутствии воспалительных процессов связан с достаточным набором нейротрофических факторов, в составе кондиционированной среды, необходимых для стимуляции миграции собственных клеток, участвующих в регенерации. Анализ флуоресцентной иммуногистохимии тканевых срезов спинного мозга контрольных животных №2 показал отсутствие признаков экспрессии флуоресцирующего зеленого белка GFP в месте дислокации спинальной травмы и имплантации контрольной матрицы (рис.13). Рис.13 демонстрирует отсутствие в контроле зеленого свечения вокруг синих ядер материнских мозговых клеток в зоне дислокации травмы.Example experiment No. 2. Using a surgical microscope, five white outbred female rats weighing 250 g reproduced a model of spinal injury at the level of IX-X thoracic vertebrae with partial intersection of the spinal cord after a preliminary laminectomy. A sponge collagen-chitosan three-dimensional matrix was placed in the spinal cord defect, containing a combined conditioned medium obtained from culturing brain cells of 17-20 day old rat fetuses and mouse embryonic stem cells, containing a complete nutrient medium supplemented with neuron factor N2, but not containing precursors neuronal cells obtained by differentiation of mouse embryonic stem cells. Animals made up control group No. 2. In animals in the postoperative period for 4 weeks, there was a weak positive dynamics in the neurological status of the sensory and motor zones of innervation in the region of the lower extremities, pelvis, lower half of the body. The positive effect upon implantation of a matrix without cells in the absence of inflammatory processes is associated with a sufficient set of neurotrophic factors in the conditioned medium necessary to stimulate the migration of their own cells involved in regeneration. An analysis of fluorescence immunohistochemistry of tissue sections of the spinal cord of control animals No. 2 showed the absence of signs of expression of the fluorescent green GFP protein at the site of spinal injury dislocation and implantation of the control matrix (Fig. 13). Fig. 13 shows the absence of a green glow in the control around the blue nuclei of the maternal brain cells in the trauma dislocation zone.
Пример эксперимента №3. Трем белым беспородным крысам-самкам массой 250 г с использованием операционного микроскопа воспроизводили модель спинальной травмы на уровне IX-X грудных позвонков с частичным пересечением спинного мозга после предварительно выполненной ламинэктомии. Частичный анатомический разрыв спинного мозга ничем не заполняли. Животные составили контрольную группу №3. У животных в послеоперационном периоде без лечения в течение 4-х недель имелось стойкое выпадение определенных сенсорных и моторных зон иннервации в области нижних конечностей, таза, нижней половины туловища с развитием картины атрофии мягких тканей.Example experiment No. 3. Using a surgical microscope, three white outbred female rats weighing 250 g reproduced a model of spinal injury at the level of IX-X thoracic vertebrae with partial intersection of the spinal cord after a preliminary laminectomy. The partial anatomical rupture of the spinal cord was not filled with anything. Animals made up control group No. 3. In animals in the postoperative period without treatment for 4 weeks there was persistent loss of certain sensory and motor zones of innervation in the region of the lower extremities, pelvis, lower half of the body with the development of a picture of atrophy of soft tissues.
Пример эксперимента №4. Четырем белым беспородным крысам-самкам массой 250 г с использованием операционного микроскопа воспроизводили модель спинальной травмы на уровне IX-X грудных позвонков с полным пересечением спинного мозга после предварительно выполненной ламинэктомии. Полный анатомический разрыв спинного мозга заполняли коллаген-хитозановой трехмерной матрицей в виде губки, содержащей биомассу из 50 тысяч линии эмбриональных стволовых клеток мыши, дифференцирующихся в предшественники нейрональных клеток, комбинированную кондиционированную среду, полученную от культивирования мозговых клеток 17-20 дневных фетусов крысы и эмбриональных стволовых клеток мыши в присутствии нейронального фактора N2, полную питательную среду DMEM/F12, не содержащую животных компонентов. Животные составили опытную группу №4.Example experiment No. 4. Using a surgical microscope, four white outbred female rats weighing 250 g reproduced a model of spinal injury at the level of IX-X thoracic vertebrae with complete intersection of the spinal cord after a preliminary laminectomy. A complete anatomical rupture of the spinal cord was filled with a collagen-chitosan three-dimensional matrix in the form of a sponge containing a biomass of 50 thousand mouse embryonic stem cell lines differentiating into neuronal cell precursors, a combined conditioned medium obtained from culturing brain cells of 17-20 day old rat fetuses and embryonic stem cells mouse cells in the presence of neuronal factor N2, complete nutrient medium DMEM / F12, not containing animal components. Animals made up experimental group No. 4.
В ходе операции проводили премедикацию, основную анестезию и оперативный доступ к спинному мозгу идентично как у групп животных предыдущих экспериментов. При помощи микроскальпеля и микроножниц осуществляли полное пересечение спинного мозга в поперечном направлении. При помощи микрохирургического зонда с оливой производили контроль полного пересечения путем проведения инструмента по передней стенке позвоночного канала. В образовавшийся диастаз нервной ткани размерами около 1,5-2 мм помещали нейрональный клеточно-матричный имплантат указанного состава. Костную рану закрывали по технологии, указанной как в примерах предыдущих групп животных. Послеоперационный уход за крысами проводили идентично представленному у других групп животных.During the operation, premedication, basic anesthesia and operative access to the spinal cord were identical as in groups of animals from previous experiments. Using a microscalpel and microscissors, a complete intersection of the spinal cord in the transverse direction was carried out. Using a microsurgical probe with olive, the complete intersection was controlled by holding the instrument along the front wall of the spinal canal. A neuronal cell-matrix implant of the indicated composition was placed in the resulting nerve tissue diastasis with dimensions of about 1.5-2 mm. The bone wound was closed according to the technology indicated as in the examples of previous groups of animals. Postoperative care of rats was carried out identically to that presented in other groups of animals.
Результаты динамического неврологического контроля у опытной группы животных №4. После имплантации клеточной матрицы с предшественниками нейрональных клеток происходит существенное улучшение неврологических показателей, таких как моторная и сенсорная активность задних конечностей, отсутствие патологической двигательной активности, восстановление состояния равновесия, улучшение выполнения тестов на горизонтальной поверхности и передвижений в тесте по суживающей дорожке. Динамика восстановления моторной функции с 1,71 балла через 1 неделю до 0,5 баллов через 8 недель эксперимента. Полное восстановление сенсорной функции с 2 баллов через 1 неделю до 0 баллов уже через 6 недель эксперимента, восстановление равновесия с 6 баллов через 1 неделю до 2,5 баллов через 8 недель. Исчезновение патологической двигательной активности происходит уже через 4 недели после операции имплантации продукта. Интегральная сумма баллов после полной транссекции спинного мозга через 1 неделю составила 13,1, что соответствует тяжелой степени спинальной травмы. Животные в тесте «беговая суживающая дорожка» проходили за лимитное время в среднем 0,71 см. Через 2 недели после нанесения спинальной травмы интегральная сумма баллов при оценке неврологических функций экспериментального животного составила 11,1, что указывает на снижение тяжести нарушений и приближение ее к границе повреждения средней степени тяжести. Через 3 недели после экспериментальной травмы спинного мозга интегральная сумма нарушений составила 10 баллов. Эта величина соответствует повреждению средней степени тяжести. Динамика снижения тяжести неврологических нарушений сохраняется к концу 4-й недели послеоперационного периода и составляет 5,75 балла, что соответствует умеренному повреждению. Через 5 недель эта величина соответствует 5 баллам, а через 6 недель послеоперационного периода - 4,5 балла, что соответствует умеренной степени повреждения спинного мозга. Через 7 недель послеоперационного периода этот показатель составляет уже 4 балла, через 8 недель - 3,5 балла, что свидетельствует о снижении тяжести неврологических нарушений и соответствует умеренной степени повреждения. При этом в тесте «беговая суживающая дорожка» крысы наращивают каждую неделю расстояние пробега от 0,71 см через 1 неделю до 46,25 см через 8 недель.The results of dynamic neurological control in the experimental group of animals No. 4. After implantation of the cell matrix with neuronal cell precursors, there is a significant improvement in neurological indicators, such as motor and sensory activity of the hind limbs, the absence of pathological motor activity, restoration of the equilibrium state, improvement in the performance of tests on a horizontal surface and movement in the test along a narrowing path. Dynamics of restoration of motor function from 1.71 points after 1 week to 0.5 points after 8 weeks of the experiment. Full restoration of sensory function from 2 points after 1 week to 0 points after 6 weeks of the experiment, restoration of equilibrium from 6 points after 1 week to 2.5 points after 8 weeks. The disappearance of pathological motor activity occurs already 4 weeks after the product implantation operation. The total score after a complete transposition of the spinal cord after 1 week was 13.1, which corresponds to a severe degree of spinal injury. Animals in the treadmill treadmill test passed an average time limit of 0.71 cm. 2 weeks after applying a spinal injury, the total score for evaluating the neurological functions of the experimental animal was 11.1, which indicates a decrease in the severity of disturbances and its approximation the boundary of moderate damage. 3 weeks after the experimental spinal cord injury, the total amount of impairment was 10 points. This value corresponds to moderate damage. The dynamics of reducing the severity of neurological disorders persists towards the end of the 4th week of the postoperative period and is 5.75 points, which corresponds to moderate damage. After 5 weeks, this value corresponds to 5 points, and after 6 weeks of the postoperative period - 4.5 points, which corresponds to a moderate degree of damage to the spinal cord. After 7 weeks of the postoperative period, this indicator is already 4 points, after 8 weeks - 3.5 points, which indicates a decrease in the severity of neurological disorders and corresponds to a moderate degree of damage. At the same time, in the test “treadmill treadmill” the rats increase each week the mileage from 0.71 cm after 1 week to 46.25 cm after 8 weeks.
Пример эксперимента №5. Пяти белым беспородным крысам-самкам массой 250 г с использованием операционного микроскопа воспроизводили модель спинальной травмы на уровне IX-X грудных позвонков с полным пересечением спинного мозга после предварительно выполненной ламинэктомии. Полный анатомический разрыв спинного мозга заполняли коллаген-хитозановой трехмерной матрицей в виде губки, содержащей, комбинированную кондиционированную среду, полученную от культивирования мозговых клеток 17-20 дневных фетусов крысы и эмбриональных стволовых клеток мыши в присутствии нейронального фактора N2, полную питательную среду DMEM/F12 без добавления животных компонентов. Матрица не содержала клеточную массу. Животные составили контрольную группу №5.Example experiment No. 5. Five white mongrel female rats weighing 250 g using an operating microscope reproduced a model of spinal injury at the level of IX-X thoracic vertebrae with complete intersection of the spinal cord after a preliminary laminectomy. A complete anatomical rupture of the spinal cord was filled with a collagen-chitosan three-dimensional matrix in the form of a sponge containing a combined conditioned medium obtained from culturing brain cells of 17-20 day old rat fetuses and mouse embryonic stem cells in the presence of neuronal factor N2, complete DMEM / F12 nutrient medium without adding animal components. The matrix did not contain cell mass. Animals made up control group No. 5.
В ходе операции проводили премедикацию, основную анестезию и оперативный доступ к спинному мозгу идентично как у групп животных предыдущих экспериментов. При помощи микроскальпеля и микроножниц осуществляли полное пересечение спинного мозга в поперечном направлении. При помощи микрохирургического зонда с оливой производили контроль полного пересечения путем проведения инструмента по передней стенке костномозгового канала. В образовавшийся диастаз нервной ткани размерами около 1,5-2 мм помещали матричный имплантат указанного состава. Костную рану закрывали по технологии, указанной как в примерах предыдущих групп животных. Послеоперационный уход за крысами проводили идентично представленному у других групп животных.During the operation, premedication, basic anesthesia and operative access to the spinal cord were identical as in groups of animals from previous experiments. Using a microscalpel and microscissors, a complete intersection of the spinal cord in the transverse direction was carried out. Using a microsurgical probe with olive, the complete intersection was monitored by holding an instrument along the anterior wall of the medullary canal. A matrix implant of the indicated composition was placed in the resulting nerve tissue diastasis with dimensions of about 1.5-2 mm. The bone wound was closed according to the technology indicated as in the examples of previous groups of animals. Postoperative care of rats was carried out identically to that presented in other groups of animals.
Результаты динамического неврологического контроля у контрольной группы животных №5. После имплантации коллаген-хитозановой трехмерной матрицей с указанным выше перечнем нейротрофических факторов происходит медленное улучшение неврологических показателей, вероятно, за счет имплантированного с матрицей коктейля из нейротрофических факторов и взаимодействия с микроокруженисм материнского спинного мозга. Моторная функция задних конечностей животных составила через 1 неделю эксперимента 2,33 балла, показатель улучшился через 8 недель и составил 1,0 балл. Тест на горизонтальной поверхности через 1 неделю составил 2,7 балла, а через 8 недель 1,6 балла. Сенсорная функция спинного мозга осталась очень низкой без положительной динамики в печение всего периода наблюдения и составила 2,0 балла. Величина оценки в тесте равновесия практически не изменилась в течение всего срока наблюдения и составила от 6,0 до 5,0 балла. Положительная динамика устранения в тесте патологической двигательной активности животных характерна как для контроля, так и для опыта и проявляется через 3 недели послеоперационного периода, полное исчезновение патологической активности происходит через 4 недели эксперимента. Интегральная сумма баллов после полной транссекции спинного мозга через 1 неделю в контроле составила 14,2, что соответствует тяжелой степени спинальной травмы. Через 2 недели после нанесения спинальной травмы интегральная сумма баллов при оценке неврологических функций экспериментального животного составила 12,6, что указывает на снижение тяжести нарушений и приближение ее к границе повреждения средней степени тяжести. Через 3 недели после экспериментальной травмы спинного мозга интегральная сумма нарушений составила 11,6 баллов, через 4 недели - 10,8 баллов. Последующая динамика восстановления неврологического дефицита указывает на приостановление процесса реконструкции СМ: так, через 5 недель послеоперационного периода, также как и через 6 недель интегральная сумма составила 10 баллов, а через 7 и 8 недель эксперимента - только 9,6 баллов. Эти показатели свидетельствуют о средней степени тяжести повреждения спинного мозга. При этом в тесте «беговая суживающая дорожка» крысы каждую неделю медленно наращивают расстояние пробега от 1,6 см через 1 неделю до 24 см через 8 недель послеоперационного периода.The results of dynamic neurological control in the control group of animals No. 5. After implantation with a collagen-chitosan three-dimensional matrix with the above list of neurotrophic factors, a slow improvement in neurological parameters occurs, probably due to a cocktail of neurotrophic factors implanted with the matrix and interaction with the microenvironment of the maternal spinal cord. The motor function of the hind limbs of animals was 2.33 points after 1 week of the experiment, the indicator improved after 8 weeks and amounted to 1.0 point. The test on a horizontal surface after 1 week was 2.7 points, and after 8 weeks 1.6 points. The sensory function of the spinal cord remained very low without positive dynamics in the course of the entire observation period and amounted to 2.0 points. The value of the assessment in the equilibrium test practically did not change during the entire observation period and ranged from 6.0 to 5.0 points. The positive dynamics of eliminating the pathological motor activity of animals in the test is characteristic of both control and experiment, and manifests itself after 3 weeks of the postoperative period, the complete disappearance of pathological activity occurs after 4 weeks of the experiment. The total score after complete transplantation of the spinal cord after 1 week in the control was 14.2, which corresponds to a severe degree of spinal injury. 2 weeks after the spinal injury, the total score for assessing the neurological functions of the experimental animal was 12.6, which indicates a decrease in the severity of the disorders and its approximation to the border of moderate damage. 3 weeks after the experimental spinal cord injury, the total amount of violations was 11.6 points, after 4 weeks - 10.8 points. The subsequent dynamics of the restoration of neurological deficit indicates a suspension of the reconstruction of the SM: so, after 5 weeks of the postoperative period, as well as after 6 weeks, the integral amount was 10 points, and after 7 and 8 weeks of the experiment, only 9.6 points. These indicators indicate a moderate severity of spinal cord injury. At the same time, in the test “tapering narrowing track”, rats slowly increase the mileage from 1.6 cm after 1 week to 24 cm after 8 weeks of the postoperative period.
Таким образом, предлагаемый способ тканевой инженерии спинного мозга после его анатомического разрыва приводит к восстановлению анатомической и функциональной его целостности. Результаты анализа показали, что в присутствии матрицы с предшественниками нейрональных клеток и комбинированной кондиционированной средой, полученной от культивирования мозговых клеток 17-20 дневных фетусов крысы и эмбриональных стволовых клеток мыши в полной питательной среде с добавлением нейронального фактора N2, происходит существенное улучшение неврологических показателей, таких как моторная и сенсорная активность задних конечностей, отсутствие патологической двигательной активности, восстановление состояния равновесия, улучшение выполнения гестов на горизонтальной поверхности и передвижений по суживающей дорожке. Способ позволяет достигать полноценное восстановление морфологической и функциональной целостности спинного мозга после его частичного или полного анатомического разрыва при осложненной позвоночно-спинальной травме.Thus, the proposed method of tissue engineering of the spinal cord after its anatomical rupture leads to the restoration of its anatomical and functional integrity. The results of the analysis showed that in the presence of a matrix with neuronal cell precursors and a combined conditioned medium obtained from culturing brain cells of rats 17-20 day old fetuses and mouse embryonic stem cells in a complete nutrient medium with the addition of neuronal factor N2, a significant improvement in neurological indices, such as motor and sensory activity of the hind limbs, lack of pathological motor activity, restoration of equilibrium, improving solution of the implementation of gesta on a horizontal surface and movement along a narrowing path. The method allows to achieve a full restoration of the morphological and functional integrity of the spinal cord after its partial or complete anatomical rupture with complicated vertebral-spinal injury.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012105190/14A RU2489176C1 (en) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | Method of spinal tissue engineering following anatomical rupture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012105190/14A RU2489176C1 (en) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | Method of spinal tissue engineering following anatomical rupture |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2489176C1 true RU2489176C1 (en) | 2013-08-10 |
Family
ID=49159399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012105190/14A RU2489176C1 (en) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | Method of spinal tissue engineering following anatomical rupture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2489176C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2644278C1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-02-08 | Федеральное государственное автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н.Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАУ "НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н.Бурденко" Минздрава России | Method for microscurgeric reconstruction of the spinal cord on an animal model by using polyvinyl alcohol biodegradated hydrogel |
| RU2803525C1 (en) * | 2023-01-25 | 2023-09-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of coating a hernio-implant using ascorbic acid |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040047843A1 (en) * | 2002-02-12 | 2004-03-11 | Uab Research Foundation | Method for spinal cord reconnection |
| RU2252787C1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-05-27 | ГОУ ВПО "Красноярская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения РФ | Method for obtaining artificial skin matrix |
| RU2391399C2 (en) * | 2008-07-31 | 2010-06-10 | Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства Здравоохранения И Социального Развития Российской Федерации" (Гоу Впо Красгму Им.Проф.В.Ф.Войно-Ясенецкого) | Method of preparing skin cell matrix |
| EP2292091A1 (en) * | 2002-02-13 | 2011-03-09 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta and uses and methods of treatment using said cells |
-
2012
- 2012-02-14 RU RU2012105190/14A patent/RU2489176C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040047843A1 (en) * | 2002-02-12 | 2004-03-11 | Uab Research Foundation | Method for spinal cord reconnection |
| EP2292091A1 (en) * | 2002-02-13 | 2011-03-09 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta and uses and methods of treatment using said cells |
| RU2252787C1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-05-27 | ГОУ ВПО "Красноярская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения РФ | Method for obtaining artificial skin matrix |
| RU2391399C2 (en) * | 2008-07-31 | 2010-06-10 | Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства Здравоохранения И Социального Развития Российской Федерации" (Гоу Впо Красгму Им.Проф.В.Ф.Войно-Ясенецкого) | Method of preparing skin cell matrix |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| WISE YOUNG Исследования по проблеме повреждения спинного мозга: достижения и перспективы декабрь 2003, Найдено в Интернет 11.09.2012 http://sci-ras.com/for_patients/Bases_for_Hope.htm. * |
| ЕРЕМЕЕВ А.В. и др. Функции культивируемых эмбриональных клеток на коллаген-хитозановой матрице. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2009, т.4, №2, с.55-62. RISHI S. et al. Stem cell-based therapies for spinal cord injury. J Spinal Cord Med., 2009, 32(2), 105-114. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2644278C1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-02-08 | Федеральное государственное автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н.Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАУ "НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н.Бурденко" Минздрава России | Method for microscurgeric reconstruction of the spinal cord on an animal model by using polyvinyl alcohol biodegradated hydrogel |
| RU2803525C1 (en) * | 2023-01-25 | 2023-09-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of coating a hernio-implant using ascorbic acid |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Geissler et al. | Biomimetic hydrogels direct spinal progenitor cell differentiation and promote functional recovery after spinal cord injury | |
| EP3517144B1 (en) | Composition for cartilage regeneration and preparation method therefor | |
| JP2003521910A (en) | Isolation and transplantation of retinal stem cells | |
| EP2446892A2 (en) | Isolated adult pluripotent stem cells and method for isolating and cultivating same | |
| US12042576B2 (en) | Cell sheet construct for neurovascular reconstruction and manufacture thereof | |
| EP3093340B1 (en) | Stem cells derived from basal portion of chorionic trophoblast layer and cell therapy comprising same | |
| DE69530409T2 (en) | BIOMATERIAL CONTAINING EPITHELIC CELLS AND THEIR USE AS A TRANSPLANT | |
| DE112008001609T5 (en) | Repair and treatment of bone defects using drug-induced cells made from chondrocytes capable of hypertrophication and a scaffold | |
| Hu et al. | Tissue culture of adult human retinal ganglion cells | |
| CN103127494B (en) | Nerve regeneration biogum and preparation method and application thereof | |
| US20050233450A1 (en) | Methods of inducing hair growth | |
| RU2489176C1 (en) | Method of spinal tissue engineering following anatomical rupture | |
| EP2864474B1 (en) | Method for producing functional fusion tissue from human chondrocytes | |
| EP1337624B1 (en) | Cell constructs which can be obtained from mesenschymal stem cells and cells derivable therefrom and the use thereof | |
| US20150152388A1 (en) | Preparation of parental cell bank from foetal tissue | |
| DE102006012162A1 (en) | Bone repair material using a cartilage cell with the potential for hypertrophy and a scaffold | |
| WO2008121331A1 (en) | Materials and methods for treating nerve damage and promoting nerve repair and regeneration | |
| DE112008001641T5 (en) | Repair and treatment of bone defect using a drug and scaffold prepared by hypertrophic chondrocytes | |
| JP7510709B2 (en) | Stem cells derived from chorionic plate adjacent villi and cell therapy agent for tissue regeneration containing the same | |
| Persinal-Medina et al. | Xeno-free approach for the expansion of human adipose derived mesenchymal stem cells for ocular therapies | |
| KR20130102506A (en) | Use of tissue and cell derived from mature cystic teratoma | |
| Nikolaevich et al. | Experimental Partial Transection of Spinal Cord and Its Bioengineering Reconstruction | |
| PL212052B1 (en) | Method for the acquirement of gley smell cells and their applications | |
| RU125073U1 (en) | CELL IMPLANT FOR CLOSING DEFECTS AND RESTORING INNERVATION IN TISSUES AND BODIES | |
| Dimpfel | [19] Mammalian nerve cell culture |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20141118 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180215 |