RU2484095C1 - NANOANTIBODIES aMh1, aMh2 BINDING ANTIGEN OF MYCOPLASMA HOMINTS, METHOD OF PRODUCING THEM, METHOD OF TREATING MYCOPLASMA HOMINIS INFECTION - Google Patents
NANOANTIBODIES aMh1, aMh2 BINDING ANTIGEN OF MYCOPLASMA HOMINTS, METHOD OF PRODUCING THEM, METHOD OF TREATING MYCOPLASMA HOMINIS INFECTION Download PDFInfo
- Publication number
- RU2484095C1 RU2484095C1 RU2011154167/10A RU2011154167A RU2484095C1 RU 2484095 C1 RU2484095 C1 RU 2484095C1 RU 2011154167/10 A RU2011154167/10 A RU 2011154167/10A RU 2011154167 A RU2011154167 A RU 2011154167A RU 2484095 C1 RU2484095 C1 RU 2484095C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoantibodies
- mycoplasma
- hominis
- antibodies
- nanoantibody
- Prior art date
Links
- 241000204048 Mycoplasma hominis Species 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 title description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 12
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 3
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 10
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 241000204028 Mycoplasma arginini Species 0.000 description 6
- 241000202894 Mycoplasma orale Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000202952 Mycoplasma fermentans Species 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000202956 Mycoplasma arthritidis Species 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 101800000859 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6, soluble form Proteins 0.000 description 2
- 102400000084 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6, soluble form Human genes 0.000 description 2
- 241000202898 Ureaplasma Species 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 230000003384 trypanolytic effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000000230 African Trypanosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102220486094 Alpha-galactosidase A_W47G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 description 1
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000004145 Endometritis Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000029082 Pelvic Inflammatory Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 208000037063 Thinness Diseases 0.000 description 1
- 241000223105 Trypanosoma brucei Species 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000202921 Ureaplasma urealyticum Species 0.000 description 1
- 208000006374 Uterine Cervicitis Diseases 0.000 description 1
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 1
- 201000008100 Vaginitis Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000003781 beta lactamase inhibitor Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126813 beta-lactamase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 201000006824 bubonic plague Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 206010008323 cervicitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- -1 fe nilalanine Chemical compound 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000029080 human African trypanosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220283785 rs1344101243 Human genes 0.000 description 1
- 102220054109 rs72474224 Human genes 0.000 description 1
- 102220201545 rs886041401 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 201000002612 sleeping sickness Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000013520 translational research Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 206010048828 underweight Diseases 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 208000000143 urethritis Diseases 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техники настоящего изобретенияThe technical field of the present invention
Изобретение относится к области биотехнологии и медицине, в частности к получению и использованию наноантител для блокирования инфекции, вызванной патогенными микроорганизмами, в частности Mycoplasma hominis.The invention relates to the field of biotechnology and medicine, in particular to the production and use of nanoantibodies to block infection caused by pathogenic microorganisms, in particular Mycoplasma hominis.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Микоплазмы (класс Mollicutes) - мельчайшие патогенные бактерии, характерной особенностью которых является отсутствие клеточной стенки. Представители данного семейства являются причиной различных заболеваний респираторного и урогенитального тракта, а также острых и хронических заболеваний суставов у человека и животных [Прозоровский С.В., Раковская И.В., 1995]. Одной из особенностей микоплазм является их способность персистировать in vivo в течение длительного периода без каких-либо клинических проявлений. Такая способность микоплазм обусловлена рядом особенностей, которые позволяют им эффективно «ускользать» от иммунной системы хозяина. Для микоплазм свойственна молекулярная мимикрия и фенотипическая пластичность, которые приводят к тому, что микоплазмы не эффективно распознаются и элиминируются иммунной системой хозяина. Это позволяет микоплазмам сохраняться в организме хозяина в течение длительного времени, что часто может являться причиной хронических заболеваний [Barile М., 1993, Razin S., 1991, 1998]. Другой характерной особенностью микоплазм является их способность к длительному персистированию in vitro - в культурах эукариотических клеток. Являясь облигатными мембранными паразитами, они сохраняются в клеточных культурах в течение десятков лет.Mycoplasmas (class Mollicutes) are the smallest pathogenic bacteria, a characteristic feature of which is the absence of a cell wall. Representatives of this family are the cause of various diseases of the respiratory and urogenital tract, as well as acute and chronic joint diseases in humans and animals [Prozorovsky SV, Rakovskaya IV, 1995]. One of the features of mycoplasmas is their ability to persist in vivo over a long period without any clinical manifestations. This ability of mycoplasmas is due to a number of features that allow them to effectively "escape" from the host's immune system. Mycoplasmas are characterized by molecular mimicry and phenotypic plasticity, which lead to the fact that mycoplasmas are not effectively recognized and eliminated by the host’s immune system. This allows mycoplasmas to persist in the host for a long time, which can often be the cause of chronic diseases [Barile M., 1993, Razin S., 1991, 1998]. Another characteristic feature of mycoplasmas is their ability to prolong persistence in vitro - in cultures of eukaryotic cells. Being obligate membrane parasites, they persist in cell cultures for decades.
В настоящее время показано, что из 14 видов микоплазм, естественным хозяином которых является человек, пять видов (M.hominis, M.pneumoniae, M.genitalium, M.fermentans и U.urealyticum) ассоциированы с различными заболеваниями человека. Борьба с этими инфекциями представляет большие трудности в связи с развивающейся устойчивостью к антибиотикам и особенностями ответных реакций организма [Прозоровский, 1995].Currently, it is shown that out of 14 species of mycoplasmas whose natural host is man, five species (M.hominis, M.pneumoniae, M.genitalium, M.fermentans, and U.urealyticum) are associated with various human diseases. The fight against these infections presents great difficulties in connection with the developing resistance to antibiotics and the characteristics of the body's response [Prozorovsky, 1995].
Клинические проявления микоплазменной инфекции неспецифичны и весьма разнообразны. Во многих случаях микоплазмы вызывают латентную инфекцию. Под влиянием различных провоцирующих факторов латентная инфекция может перейти в хроническую рецидивирующую или острую форму [Прозоровский, 1995]. В настоящее время считается, что патогены, вызывающие хронические заболевания, ассоциированные с хроническим воспалением, являются одним из ключевых факторов, влияющих на опухолевую прогрессию [Coussens L., 2002, DeMarzo А., 2004, 2007, Gupta S., 2004, Karin M., 2006, Nelson W., 2003, Platz E., 2004, Sfanos K., 2008, Sutcliffe S., 2008, Wagenlehner F., 2007].The clinical manifestations of mycoplasma infection are nonspecific and very diverse. In many cases, mycoplasmas cause latent infection. Under the influence of various provoking factors, a latent infection can turn into a chronic recurring or acute form [Prozorovsky, 1995]. Currently, it is believed that pathogens that cause chronic diseases associated with chronic inflammation are one of the key factors affecting tumor progression [Coussens L., 2002, DeMarzo A., 2004, 2007, Gupta S., 2004, Karin M ., 2006, Nelson W., 2003, Platz E., 2004, Sfanos K., 2008, Sutcliffe S., 2008, Wagenlehner F., 2007].
Mycoplasma hominis вызывает около половины негонококковых урогенитальных инфекций. Кроме этого, у 70% больных гонококковыми инфекциями обнаруживается M.hominis. M.hominis ассоциирована с патологиями урогенитального тракта у мужчин и верхней части урогенитального тракта у женщин. Например, M.hominis считается основным возбудителем негонококковых уретритов, урепростатитов, вагинитов, эндометритов, воспалений тазовой области, цервицитов, бесплодия, недостаточного веса новорожденных (Cassell et al. (1991) Clin. Perinatol. 18:241-262; Cassell et al. (1984) Adv. Exp. Med. Biol. 224:93-115; and Cassell et al. (1983) Sex. Transm. Dis. 10:294-302).Mycoplasma hominis causes about half of non-gonococcal urogenital infections. In addition, in 70% of patients with gonococcal infections, M.hominis is detected. M.hominis is associated with pathologies of the urogenital tract in men and the upper part of the urogenital tract in women. For example, M. hominis is considered the main causative agent of non-gonococcal urethritis, urethrostatitis, vaginitis, endometritis, pelvic inflammation, cervicitis, infertility, and underweight infants (Cassell et al. (1991) Clin. Perinatol. 18: 241-262; Cassell et al. (1984) Adv. Exp. Med. Biol. 224: 93-115; and Cassell et al. (1983) Sex. Transm. Dis. 10: 294-302).
M.hominis относится к труднокультивируемым микроорганизмам, что делает ее диагностику бактериологическими методами длительной (от 2 до 6 дней) и дорогостоящей.M.hominis belongs to difficult to cultivate microorganisms, which makes its diagnosis by bacteriological methods long (from 2 to 6 days) and expensive.
Ввиду обозначенных проблем желательно разработать способ лечения микоплазменной инфекции, не связанный с применением антибиотиков, а также способ специфической детекции микоплазм, отличный от классического бактериологического метода.In view of the identified problems, it is desirable to develop a method for the treatment of mycoplasma infection that is not associated with the use of antibiotics, as well as a method for the specific detection of mycoplasmas, different from the classical bacteriological method.
В качестве ближайших аналогов технического решения, составляющих основу настоящего изобретения, можно привести:As the closest analogues of the technical solutions that make up the basis of the present invention, we can cite:
1) человеческие моноклональные антитела против бактериальных токсинов, описанные в патенте ("Human Monoclonal Antibodies Against Bacterial Toxins - US Patent 4689299"). Патент посвящен получению и продукции гибридных клеточных линий, секретирующих моноклональные антитела против бактериальных токсинов, и методу использования полученных моноклональных антител для защиты от бактериальных (дифтерийного и столбнячного) токсинов;1) human monoclonal antibodies against bacterial toxins described in the patent ("Human Monoclonal Antibodies Against Bacterial Toxins - US Patent 4,689,299"). The patent is devoted to the production and production of hybrid cell lines secreting monoclonal antibodies against bacterial toxins, and to the method of using the obtained monoclonal antibodies to protect against bacterial (diphtheria and tetanus) toxins;
2) моноклональные антитела против Mycoplasma pneumoniae (Monoclonal antibodies against Mycoplasma pneumoniae, hybridomas producing these, methods for the preparation thereof, and the use thereof - US Patent 5641638). В патент описаны моноклональные антитела способные специфически связывать антиген Р2 микоплазмы M.pneumoniae, а также клетки гибридомы, продуцирующие эти моноклональные антитела.2) monoclonal antibodies against Mycoplasma pneumoniae (Monoclonal antibodies against Mycoplasma pneumoniae, hybridomas producing these, methods for the preparation thereof, and the use thereof - US Patent 5641638). The patent describes monoclonal antibodies capable of specifically binding M.pneumoniae mycoplasma P2 antigen, as well as hybridoma cells producing these monoclonal antibodies.
Данные технические решения как наиболее близкие к заявляемому по составу действующего вещества фармацевтической композиции и способу его использования выбраны авторами настоящего изобретения за прототип.These technical solutions as closest to the claimed by the composition of the active substance of the pharmaceutical composition and the method of its use are selected by the authors of the present invention for the prototype.
Недостатками прототипа являются:The disadvantages of the prototype are:
1) отсутствие высокоэффективного способа генерирования и селекции антител;1) the lack of a highly effective method for generating and selecting antibodies;
2) большой размер, что влечет за собой пониженную проницаемость;2) large size, which entails reduced permeability;
3) структурные особенности не позволяют выявлять «скрытые» эпитопы антигенов;3) structural features do not allow the detection of “hidden” epitopes of antigens;
4) ограниченность генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.4) the limitations of genetic engineering manipulations, adaptation for specific tasks, the ability to create multivalent and multifunctional derivatives.
Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке эффективных специфичных антител против микоплазмы хоминис (M.hominis).Thus, in the prior art there is an urgent need to develop effective specific antibodies against mycoplasma hominis (M.hominis).
Задачей настоящего изобретения явилось создание новых антител, способных эффективно связывать антигены микоплазмы M.hominis и блокировать размножение этой бактерии.The present invention was the creation of new antibodies that can efficiently bind M.hominis mycoplasma antigens and block the multiplication of this bacterium.
Поставленая задача решается за счет того, что создают наноантитело, специфически связывающее липид-ассоциированный антиген M.hominis и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Создают также наноантитело, специфически связывающее липид-ассоциированный антиген M.hominis и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. При этом наноантитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, подавляет инфекцию, вызванную микоплазмой M.hominis, и также наноантитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, подавляет инфекцию, вызванную микоплазмой M.hominis. Способ лечения инфекции млекопитающего, вызванной микоплазмой M.hominis, заключается во введении указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества наноантитела, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Способ лечения инфекции млекопитающего, вызванной микоплазмой M.hominis, заключается во введении указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества наноантитела, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.The problem is solved due to the fact that they create a nanoantibody that specifically binds the lipid-associated antigen of M.hominis and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A nanoantibody is also created that specifically binds the lipid-associated M. hominis antigen and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Moreover, a nanoantibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 inhibits the infection caused by M.hominis mycoplasma, and also a nanoantibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 inhibits the infection caused by M.hominis mycoplasma. A method of treating a mammalian infection caused by M. hominis mycoplasma is to administer to said mammal a therapeutically effective amount of a nanoantibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A method of treating a mammalian infection caused by M. hominis mycoplasma is to administer to said mammal a therapeutically effective amount of a nanoantibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
В основе настоящего изобретения находятся не классические бивалентные антитела, которые рассматриваются в качестве прототипа, а малые наноантитела, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими моноклональными антителами для практического применения в области терапии заболеваний. Поскольку наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител, они приобретают ряд новых положительных качеств, имеющих практическую значимость. Существует эффективные способы получения (и селекции) таких антител в отношении различных (в том числе низкоиммуногенных) антигенов микоплазм, а благодаря своей низкой иммуногенности наноантитела могут применятся для лечения инфекций, вызванных патогенами данной группы.The basis of the present invention are not classical bivalent antibodies, which are considered as a prototype, but small nanoantibodies, which have several advantages compared to classical monoclonal antibodies for practical use in the treatment of diseases. Since nanoantibodies (molecular weight of about 12-15 kDa) are an order of magnitude smaller in size of traditional antibodies, they acquire a number of new positive qualities of practical importance. There are effective ways to obtain (and select) such antibodies against various (including low immunogenic) mycoplasma antigens, and due to their low immunogenicity, nanoantibodies can be used to treat infections caused by pathogens of this group.
Полным эквивалентом термина "наноантитела" для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», введенное фирмой ABLYNX (NANOBODYTM), а также «однодоменное мини-антитело» и «однодоменное наноантитело».The full equivalent of the term "nanoantibodies" for the purposes of the present invention is the widely used designation "nanobody", introduced by ABLYNX (NANOBODYTM), as well as "single-domain mini-antibody" and "single-domain nanoantibody".
Рекомбинантные наноантитела получают на основе особых неканонических одноцепочечных антител, существующих в норме наряду с классическими антителами у животных семейства верблюдовых (и у некоторых видов хрящевых рыб). Эти особые антитела состоят из димера только одной укороченной (без первого константного района СН1) тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен (VHH, «наноантитело», «nanobody» или однодоменное наноантитело) этого антитела. Организация вариабельных доменов (VHH) неканонических антител в значительной степени подобна той, что у вариабельных доменов (VH) классических антител (у человека VH-домены иммуноглобулинов подкласса IgG3 имеют особо выраженную гомологию с VH и VHH верблюдовых). В обоих случаях V-домены состоят из четырех консервативных каркасных участков (FR, «framework regions»), окружающих три гипервариабельных участка (определяющие комплементарность, CDR, от «complementarity determining regions»). В обоих случаях домены формируют типичную для V-домена иммуноглобулина пространственную структуру из двух бета-слоев (-листов), один - из четырех аминокислотных цепочек, и второй - из пяти [Padlan Е.А. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem. 1996; 49: 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains./ «Узнавание антигенов фрагментами однодоменных антител: избыточная роскошь спаренных доменов». TIBS 2001; 26: 230-235]. В этой структуре все три гипервариабельных участка кластеризуются с одной стороны V-домена (где они участвуют в узнавании антигена) и располагаются в петлях, соединяющих бета-структуры. Однако имеются и важные отличия, связанные с функционированием VHH в формате одного домена. Так, гипервариабельные участки CDR1 и CDR3 заметно увеличены в случае VHH. Часто в гипервариабельных участках VHH обнаруживаются цистеиновые остатки, причем присутствующие сразу в двух участках (чаще всего в CDR1 и CDR3, реже - в CDR2 и CDR3). При исследовании кристаллических структур VHH было показано, что эти цистеиновые остатки формируют дисульфидные связи, что приводит к дополнительной стабилизации структуры петель данного антигена. Наиболее явным и воспроизводимым отличительным признаком VHH являются четыре замены гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные во втором каркасном участке (Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly, согласно нумерации Кабат). Этот каркасный участок в случае VH домена является высококонсервативным, обогащен гидрофобными аминокислотными остатками и особо важен для образования связи с вариабельным доменом VL легкой цепи. VHH-домен в этом плане сильно отличается: указанные замены гидрофобных аминокислот на гидрофильные делают невозможной ассоциацию VHH и VL. Эти замены также объясняют высокую растворимость VHH, наноантитела, когда его получают в виде рекомбинантного белка [Тиллиб С.В. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85].Recombinant nanoantibodies are obtained on the basis of specific noncanonical single chain antibodies that exist normally along with classical antibodies in animals of the camelid family (and in some species of cartilaginous fish). These specific antibodies consist of a dimer of only one shortened (without the first constant region CH1) immunoglobulin heavy chain and are fully functional in the absence of an immunoglobulin light chain. For the specific recognition and binding of antigen proper, only one variable domain (VHH, "nanoantibody", "nanobody" or single domain nanoantibody) of this antibody is necessary and sufficient. The organization of the variable domains (VHH) of noncanonical antibodies is substantially similar to that of the variable domains (VH) of classical antibodies (in humans, the VH domains of immunoglobulins of the IgG3 subclass have a particularly pronounced homology with camelid VH and VHH). In both cases, V-domains consist of four conservative framework regions (FR, “framework regions”) surrounding three hypervariable regions (determining complementarity, CDR, from “complementarity determining regions”). In both cases, the domains form a spatial structure typical of the immunoglobulin V domain of two beta layers (sheets), one of four amino acid chains, and the second of five [Padlan E.A. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem. 1996; 49: 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains./ "Recognition of antigens by fragments of single-domain antibodies: excessive luxury of paired domains." TIBS 2001; 26: 230-235]. In this structure, all three hypervariable regions are clustered on one side of the V domain (where they are involved in antigen recognition) and are located in loops connecting the beta structures. However, there are important differences associated with the functioning of VHH in a single domain format. Thus, the hypervariable regions of CDR1 and CDR3 are markedly increased in the case of VHH. Often, cysteine residues are found in the hypervariable regions of VHH, moreover, they are present in two regions at once (most often in CDR1 and CDR3, less often in CDR2 and CDR3). When studying the crystal structures of VHH, it was shown that these cysteine residues form disulfide bonds, which leads to additional stabilization of the loop structure of this antigen. The most obvious and reproducible hallmark of VHH are four hydrophobic amino acid residues replaced by hydrophilic ones in the second frame region (Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly, according to Kabat numbering). In the case of the VH domain, this framework region is highly conserved, enriched with hydrophobic amino acid residues, and is especially important for linking to the variable domain of the VL light chain. The VHH domain in this regard is very different: the indicated substitutions of hydrophobic amino acids for hydrophilic ones make the association of VHH and VL impossible. These substitutions also explain the high solubility of VHH, a nanoantibody, when it is obtained as a recombinant protein [Tillib S.V. “Camel Nanoantibodies” is an effective tool for research, diagnosis and therapy. Molecular Biology 2011; 45 (1): 77-85].
По сравнению с традиционными и чисто рекомбинантными антителами верблюжьи наноантитела обладают рядом преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний.In comparison with traditional and purely recombinant antibodies, camel nanoantibodies have several advantages, which suggests a great potential for their future use in various studies and in the creation of new biotechnological devices, as well as for clinical purposes for the diagnosis and treatment of diseases.
Характерными особенностями наноантител, определяющими большой потенциал их использования для самых разнообразных практических приложений в иммунобиотехнологии, являются следующие [см. обзор: Тиллиб С.В. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85]:The characteristic features of nanoantibodies that determine the great potential for their use for a wide variety of practical applications in immunobiotechnology are the following [see Review: Tillib S.V. “Camel Nanoantibodies” is an effective tool for research, diagnosis and therapy. Molecular Biology 2011; 45 (1): 77-85]:
1) наличие высокоэффективного способа генерирования и селекции наноантител;1) the presence of a highly efficient method for the generation and selection of nanoantibodies;
2) малый размер, ~2×4 нм, 13-15 кДа (улучшенная проницаемость клеток);2) small size, ~ 2 × 4 nm, 13-15 kDa (improved cell permeability);
3) структурные особенности (способность образовывать необычные для классических антител паратопы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков); могут использоваться для выявления «скрытых» эпитопов или эпитопов, которые не могут быть узнаны существенно более крупными обычными антителами;3) structural features (the ability to form paratopes unusual for classical antibodies, which allow them to bind to recesses and active centers of proteins); can be used to identify “hidden” epitopes or epitopes that cannot be recognized by significantly larger conventional antibodies;
4) высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах. Обычно наноантитела нарабатывают в периплазме бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры). Продемонстрирована возможность их эффективной наработки в дрожжах, растениях и клетках-млекопитающих;4) high expression yield, cost-effective production in large quantities. Typically, nanoantibodies are produced in the periplasm of E. coli bacteria (in an amount of 1-10 mg from 1 liter of culture). The possibility of their effective production in yeast, plants and mammalian cells has been demonstrated;
5) простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных;5) the simplicity of all kinds of genetic engineering manipulations, adaptation for specific tasks, the ability to create multivalent and multifunctional derivatives;
6) низкая иммуногенность; возможность экономично «гуманизировать» антитела без заметной потери их специфической активности.6) low immunogenicity; the ability to economically "humanize" antibodies without a noticeable loss of their specific activity.
Возможность получения рекомбинантных наноантител с заданной специфичностью определяется существованием у представителей семейства Camelidae функциональных и обладающих достаточно широким спектром узнавания неканонических антител. Неканонические антитела состоят из димера только одной укороченной тяжелой цепи иммуноглобулина (без легких цепей), специфичность узнавания которых определяется лишь одним вариабельным доменом [Hamers-Casterman C, Atarhouch Т, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains./ «Существующие в природе антитела без легких цепей». Nature 1993; 363:446-448]. Техническая реализация отбора наноантител, являющихся генно-инженерными производными антиген-распознающих доменов одноцепочечных антител верблюда, основана на высокоэффективной процедуре селекции антиген-узнающих полипептидов, экспонированных на поверхности частицы нитчатого фага («фаговый дисплей»).The possibility of obtaining recombinant nanoantibodies with a given specificity is determined by the existence of functional and possessing a fairly wide recognition spectrum of noncanonical antibodies in representatives of the Camelidae family. Non-canonical antibodies consist of a dimer of only one shortened immunoglobulin heavy chain (without light chains), the recognition specificity of which is determined by only one variable domain [Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains./ "Existing antibodies without light chains." Nature 1993; 363: 446-448]. The technical implementation of the selection of nanoantibodies, which are genetically engineered derivatives of antigen-recognizing domains of single-chain camel antibodies, is based on a highly efficient selection procedure for antigen-recognizing polypeptides exposed on the surface of a filamentous phage particle (“phage display”).
Метод фагового дисплея является весьма эффективной и широко используемой технологией для функционального отбора из больших рекомбинантных библиотек последовательностей ДНК, кодирующих пептиды и белки, обладающие заданными свойствами и экспрессирующиеся в составе поверхностного белка нитчатых фагов [Brissette R & Goldstein NI. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. /«Использование пептидных фагово-дисплейных библиотек для фундаметальных исследований и исследований трансляции». Methods Mol Biol. 2007; 383:203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces./ «Фаговый дисплей для конструирования и анализа взаимодействий белковых доменов». Curr Opin Struct Biol. 2007; 17:481-7]. Одно из особо важных приложений этой технологии - генерирование специфических рекомбинантных антител для самых различных антигенов [Hoogenboom HR. Selecting and screening recombinant antibody libraries. / «Селекция и анализ библиотек рекомбинантных антител». Nat Biotechnol. 2005; 23:1105-16]. Обычно вместо больших целых молекул классических антител для экспонирования на поверхности фага используют гибридные рекомбинантные одноцепочечные белки, представляющие собой случайные комбинации клонированных последовательностей вариабельных районов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, соединенные короткой серин/глицин-богатой линкерной последовательностью. Такая химерная молекула, в случае правильного сочетания доменов, способна сохранять специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на введенные по сравнению с нативной молекулой антител изменения. Одной из проблем традиционных рекомбинантных технологий является необходимость работы с очень большими библиотеками рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены всевозможные комбинации двух случайных вариабельных районов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов), соединенных линкерной последовательностью. Помимо проблемы представленности здесь также очевидна и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, а также проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к агрегации. Упомянутых проблем можно избежать при использовании наноантител, так как практически каждый клонированный вариабельный домен одноцепочечных антител будет в этом случае обладать определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного, и можно эффективно проводить селекцию из относительно небольших библиотек таких доменов.The phage display method is a very effective and widely used technology for the functional selection from large recombinant libraries of DNA sequences encoding peptides and proteins that have the desired properties and are expressed as part of the surface protein of filamentous phages [Brissette R & Goldstein NI. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. / "The use of peptide phage-display libraries for basic research and translation research." Methods Mol Biol. 2007; 383: 203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces./ "Phage display for the construction and analysis of protein domain interactions." Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 481-7]. One of the most important applications of this technology is the generation of specific recombinant antibodies for a wide variety of antigens [Hoogenboom HR. Selecting and screening recombinant antibody libraries. / "Selection and analysis of recombinant antibody libraries." Nat Biotechnol. 2005; 23: 1105-16]. Usually, instead of large whole molecules of classical antibodies, hybrid recombinant single-stranded proteins are used to display on the phage surface, which are random combinations of cloned sequences of the variable regions of the heavy and light chains of immunoglobulins connected by a short serine / glycine-rich linker sequence. Such a chimeric molecule, in the case of the correct combination of domains, is able to maintain the specificity of the initial immunoglobulin, despite the changes introduced in comparison with the native antibody molecule. One of the problems of traditional recombinant technologies is the need to work with very large libraries of recombinant antibodies, in which all possible combinations of two random variable regions (heavy and light chains of immunoglobulins) connected by a linker sequence should be presented. In addition to the problem of representation, the problem of the formation of the correct relative conformation of these two domains is also obvious, as well as the solubility of individual variable domains, which often tend to aggregate. The mentioned problems can be avoided by using nanoantibodies, since almost every cloned variable domain of single-chain antibodies in this case will have a certain antigen-recognizing specificity corresponding to one of the antibodies of the immunized animal, and selection from relatively small libraries of such domains can be effectively performed.
Наноантитела с заданной специфичностью или их производные могут использоваться, как и классические антитела, в различных приложениях, включающих в себя, но не ограниченных, детекцию антигенов (как в исследовательских, так и в диагностических целях), блокирование активности белка-антигена, специфическую доставку за счет связывания с антигеном желаемых молекул, конъюгированных с антителом. Также наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов [Conrath KE, Lauwereys М, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. / «Верблюжьи однодоменные антитела в качестве модулярныйх строительных единиц в биспецифичных и бивалентных конструкциях антител». J Biol Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. / «Пентамеризация однодоменных антител из фаговых библиотек: новая стратегия быстрого получения реагентов антител с высокой авидностью». J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (1): 49-56; Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. / «Эффективная раковая терапия конъюгатами на основе нанотел». Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Baral TN, Magez S, Stijlemans B, Conrath K, Vanhollebeke B, Pays E, Muyldermans S, De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor. / «Экспериментальная терапия африканской трипаносомии с помощью человеческого трипанолитического фактора, конъюгиованного с нанотелом». Nat. Med. 2006 May; 12 (5): 580-4; Coppieters K, Dreier T, Silence K, Haard HD, Lauwereys M, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. / «Форматированные анти-TNFalpha VHH-белков, выделенные из верблюдовых, демонстрируют высокое сродство к воспаленным суставам в мышиной модели коллаген-индуцированного артрита». Arthritis Rheum. 2006 Jun; 54 (6): 1856-66]; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы [Harbury Р.В., Zhang Т., Kim P.S., et al. A switch between two-, three- and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. / «Перключение между двух-, трех- и четырех-цепочечными спиральными структурами в мутантах GCN-«лейциновой молнии»». Science, 1993, 262:1401-1407; Shirashi T., Suzuyama k., Okamoto H. et al. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. / «Усиленная цитотоксичность растворимого Fas-лиганда вследствие его соединения с мотивом «изолейциновой молнии»». Biochem. Biophys. Res. Communic. 2004, 322: 197-202; Chenchik A., Gudkov A., Komarov A., Natarajan V. Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides. / «Реагенты и методы для получения биоактивных секретируемых пептидов». 2010. US Patent Application 20100305002] или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы [Deyev SM, Waibel R, Lebedenko EN, Schubiger AP, Plückthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module. / «Дизайн мультивалентных комплексов используя модуль барназа-барстар». Nat Biotechnol. 2003, 21(12):1486-92].Nanoantibodies with a given specificity or their derivatives can be used, like classical antibodies, in various applications, including, but not limited to, antigen detection (both for research and diagnostic purposes), blocking antigen protein activity, specific delivery for by binding to the antigen of the desired molecules conjugated to the antibody. Nanoantibodies can also be the source modules (blocks) of more complex multimodule preparations. It is possible to combine in one multivalent derivative two, three or more monovalent primary nanoantibodies. These nanoantibodies combined into one construct can bind to the same epitope of the target antigen, as well as to its different epitopes or even to different target antigens. It is also possible to combine in one design nanoantibodies and other molecules or drugs to obtain multifunctional drugs [Conrath KE, Lauwereys M, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. / "Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs." J Biol Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. / "Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a new strategy for the rapid production of antibody reagents with high avidity." J Mol Biol. 2004
Также было показано [Vincke C., Loris R., Saerens D., et al. // J. Biol. Chem. 2009. V.284. №5. P.3273-3284], что можно «гуманизировать» такие верблюжьи наноантитела без заметной потери их специфической активности, проведя небольшое число точечных замен аминокислот. Это открывает потенциальную возможность широкого использования наноантител в качестве средств пассивной иммунизации для предотвращения развития различных опасных инфекционных заболеваний [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. / «Однодоменные антитела: многообещающие экспериментльные и терапевтические инструменты в области инфекции и иммунитета». Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174].It has also been shown [Vincke C., Loris R., Saerens D., et al. // J. Biol. Chem. 2009. V.284. No. 5. P.3273-3284] that it is possible to “humanize” such camel nanoantibodies without a noticeable loss of their specific activity by making a small number of point substitutions of amino acids. This opens up the potential for widespread use of nanoantibodies as passive immunization agents to prevent the development of various dangerous infectious diseases [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. / "Single-domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in the field of infection and immunity." Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174].
Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention
Способ получения наноантител, связывающих антигены микоплазмы M.hominis, проводят на основании селекции методом фагового дисплея, генно-инженерных модификаций кодирующих эти антитела последовательностей и использования в качестве продуцента действующего вещества (антитела) бактерии E.coli. Наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител и являются полнофункциональными антиген-узнающими единицами, обладающими рядом новых положительных качеств практической значимости. Наноантитело представляет собой однодоменный белок, который хорошо растворим и обладает повышенной стабильностью (в широком диапазоне температур и pH). Это позволяет избегать проблем с растворимостью и правильным сворачиванием молекул антител при продукции прокариотическими клетками и ведет к существенному снижению затрат на их производство по сравнению с традиционными способами получения терапевтических моноклональных антител в эукариотических системах экспрессии. Существенно облегчается также процедура сохранения и транспортировки антител по сравнению с заметно менее стабильными традиционными антителами. В силу меньшего размера наноантитела характеризуются лучшей способностью проникать в ткани. Наконец, наноантитела позволяют легко проводить генно-инженерные манипуляции с целью последующей продукции биспецифических наноантител или химер, в состав которых помимо наноантитела входит другой белок с желаемыми свойствами.The method of producing nanoantibodies that bind M.hominis mycoplasma antigens is carried out on the basis of phage display selection, genetic engineering modifications of the sequences encoding these antibodies, and the use of E.coli bacteria as the producer of the active substance (antibody). Nanoantibodies (molecular weight of about 12-15 kDa) are an order of magnitude smaller in size of traditional antibodies and are fully functional antigen-recognizing units with a number of new positive qualities of practical importance. Nanoantibody is a single domain protein that is highly soluble and has increased stability (over a wide range of temperatures and pH). This avoids problems with the solubility and correct folding of antibody molecules during production by prokaryotic cells and leads to a significant reduction in the cost of their production compared to traditional methods for producing therapeutic monoclonal antibodies in eukaryotic expression systems. The procedure for storing and transporting antibodies is also significantly facilitated compared to markedly less stable traditional antibodies. Due to their smaller size, nanoantibodies are characterized by better ability to penetrate tissues. Finally, nanoantibodies make it easy to carry out genetic engineering manipulations for the purpose of subsequent production of bispecific nanoantibodies or chimeras, which in addition to the nanoantibodies include another protein with the desired properties.
Несмотря на то что, главным образом, в иллюстративных целях авторами настоящего изобретения делается акцент на продукции антител с использованием бактерии E.coli, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают и другие варианты систем реализации настоящего изобретения, прямо не заявленные в настоящем документе. Например, в качестве эукариотического продуцента могут быть использованы дрожжевые культуры или любые другие системы, очевидные в данной области техники.Although, mainly for illustrative purposes, the authors of the present invention focuses on the production of antibodies using the E. coli bacterium, it will be obvious to a person skilled in the art that other embodiments of the present invention are directly covered by the scope of the present invention, directly not claimed in this document. For example, yeast cultures or any other systems obvious in the art can be used as a eukaryotic producer.
Способ получения наноантител описан в примерах 1 и 2. Выбор путей реализации с целью получения наноантител с заявляемыми свойствами из прокариотической системы экспрессии в соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения обусловлен следующими факторами:The method of producing nanoantibodies is described in examples 1 and 2. The choice of implementation paths in order to obtain nanoantibodies with the claimed properties from a prokaryotic expression system in accordance with one preferred embodiment of the present invention is due to the following factors:
1) высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах, обеспечивающиеся экспрессией наноантител в периплазму бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры);1) high expression yield, economical production in large quantities, provided by the expression of nanoantibodies in the periplasm of E. coli bacteria (in an amount of 1-10 mg from 1 liter of culture);
2) простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных;2) the simplicity of all kinds of genetic engineering manipulations, adaptation for specific tasks, the ability to create multivalent and multifunctional derivatives;
3) высокая экономическая рентабельность производства. Авторы настоящего изобретения исходят из того, что, как известно среднему специалисту в данной области техники, первичные, исходно получаемые последовательности наноантител могут быть затем адаптированы или «форматированы» различным образом для последующего практического использования.3) high economic profitability of production. The authors of the present invention proceed from the fact that, as is well known to the average person skilled in the art, the primary, initially obtained sequences of nanoantibodies can then be adapted or "formatted" in various ways for subsequent practical use.
Так, наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы, или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы. Для модулирования свойств препарата наноантитела, например увеличения времени жизни или совершенствования способа очистки, в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности. Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами наноантител. Таким образом, авторы настоящего изобретения понимают под термином "наноантитела" как первичные, исходно получаемые, "минимальные" аминокислотные последовательности наноантител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптаций или «форматирования» и их варианты. Термин «вариант антитела» для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например как минимум 10% от активности исходного наноантитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно, от 1 до 15, и наиболее предпочтительно, от 1 до 5 изменений в последовательности исходного наноантитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно, не менее 80%, более предпочтительно, не менее 90%, и наиболее предпочтительно, не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности исходного наноантитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.So, nanoantibodies can be the original modules (blocks) of more complex multimodule preparations. It is possible to combine in one multivalent derivative two, three or more monovalent primary nanoantibodies. These nanoantibodies combined into one construct can bind to the same epitope of the target antigen, as well as to its different epitopes or even to different target antigens. It is also possible combined combination in one design of nanoantibodies and other molecules or drugs to obtain multifunctional drugs; multimerization by introducing additional amino acid sequences, interacting protein domains, such as leucine zippers, or sequences of small proteins that form stable complexes. To modulate the properties of the preparation of nanoantibodies, for example, to increase the lifetime or to improve the purification method, additional amino acid sequences can be introduced into the final compound. It will be apparent to one of ordinary skill in the art that such modifications and other antibody variants that underlie the present invention fall within the scope of the present invention as they are structural and functional variants of nanoantibodies. Thus, the authors of the present invention understand the term "nanoantibodies" as primary, initially obtained, "minimal" amino acid sequences of nanoantibodies, and their modifications resulting from the above adaptations or "formatting" and their variants. The term "antibody variant" for the purposes of the present invention means a polypeptide that contains changes in the amino acid sequence, namely, deletion, insertion, addition or replacement of amino acids, provided that this maintains the necessary level of protein activity, for example at least 10% of the activity of the original nanoantibodies. A number of changes in the variant of the protein depends on the position or type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. The number of changes can be, for example, from 1 to 30, more preferably from 1 to 15, and most preferably, from 1 to 5 changes in the sequence of the original nanoantibody. These changes can occur in areas of the polypeptide that are not critical to its function. This is possible due to the fact that some amino acids have high homology with each other, and therefore the tertiary structure or activity of the protein is not violated by such a change. Therefore, as a variant of the protein can be a protein that is characterized by a homology of at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% with respect to the amino acid sequence of the original nanoantibody, provided that polypeptide activity. Homology between amino acid sequences can be established using well-known methods, for example, using sequence alignment in the BLAST 2.0 computer program, which calculates three parameters: count, identity, and similarity.
Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутацей(ями) является консервативная замена(ы). "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Поскольку гипервариабельные районы наноантител определяют их специфическое взаимодействие с антигеном, то именно гомологичные замены аминокислот в этих участках могут приводить к получению несколько различающихся по последовательности наноантител, которые обладают идентичными или близкими свойствами. Таким образом, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают не только указанные в приложении последовательности наноантител, но и те, которые могут быть получены путем замен аминокислот в гипервариабельных участках (указанных в перечне последовательностей как CDR) на другие, но очень близкие по свойствам, аминокислоты (консервативных замен).Substitution, deletion, insertion, addition or replacement of one or more amino acid residues will be a conservative mutation or conservative mutations, provided that the protein activity is maintained. An example of a conservative mutation (s) is conservative substitution (s). A “conservative amino acid substitution” is a substitution in which an amino acid residue is replaced by an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acids having similar side chains are defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g. tyrosine , fe nilalanine, tryptophan, histidine). Since the hypervariable regions of nanoantibodies determine their specific interaction with the antigen, it is precisely the homologous substitutions of amino acids in these regions that can lead to the production of nanoantibodies slightly different in sequence, which have identical or similar properties. Thus, it will be apparent to one of ordinary skill in the art that the scope of the present invention includes not only the nanoantibody sequences indicated in the appendix, but also those that can be obtained by substituting amino acids in the hypervariable regions (indicated in the sequence listing as CDRs) with other , but very similar in properties, amino acids (conservative substitutions).
Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, кодирующего исходное наноантитело, например посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.DNA fragments that encode essentially the same functional polypeptide can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of a DNA fragment encoding the original nanoantibody, for example, using the site-directed mutagenesis method, so that one or more amino acid residues at a particular site are deleted replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be obtained using traditional processing methods to obtain mutations.
Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид исходного наноантитела, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, и установления активности экспрессируемого продукта.DNA fragments that encode essentially the same functional polypeptide of the parent nanoantibody can be obtained by expressing DNA fragments having the mutation described above and establishing the activity of the expressed product.
Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, описанных выше, также включают мутации, которые имеют место в природе и, например, обусловлены изменчивостью.Substitution, deletion, insertion or addition of nucleotides described above also includes mutations that occur in nature and, for example, are due to variability.
Полипептиды наноантител согласно настоящему изобретению могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более чем одним триплетным нуклеотидным кодоном. Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав кассет, экспрессирующих антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением и подпадающие под объем настоящего изобретения.The nanoantibody polypeptides of the present invention can be encoded by a large number of nucleic acid molecules, which is the result of the degeneracy of the genetic code well known in the art. The essence of the phenomenon is that any amino acid (with the exception of tryptophan and methionine) that is part of natural peptides can be encoded by more than one triplet nucleotide codon. Any of these degenerate coding nucleic acid molecules may be included in cassettes expressing antibodies of the invention and within the scope of the invention.
Получение функционально-активных наноантител, распознающих антигены M.hominis, показано в примерах 3, 4, 5.The preparation of functionally active nanoantibodies recognizing M. hominis antigens is shown in Examples 3, 4, 5.
Эффективность лечения микоплазменной инфекции выбранным фармацевтически активным количеством антител доказана в примере 6.The effectiveness of the treatment of mycoplasma infection with a selected pharmaceutically active amount of antibodies is proved in example 6.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На фиг.1 представлены нуклеотидные и аминокислотные последовательности двух отобранных наноантител, aMh1 и aMh2, полученные параллельно одним и тем же способом и обладающие искомыми свойствами: способностью специфически связывать Mycoplasma hominis. Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующие два отобранных наноантитела, были определены (для aMh1 - SEQ ID NO: 1; для aMh2 - SEQ ID NO: 3), и из них были выведены соответствующие аминокислотные последовательности отобранных наноантител (для aMh1 - SEQ ID NO: 2; для aMh2 - SEQ ID NO: 4). В указанных последовательностях подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к С-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 антигенузнающих последовательностей отобранных наноантител.Figure 1 shows the nucleotide and amino acid sequences of two selected nanoantibodies, aMh1 and aMh2, obtained in parallel with the same method and having the desired properties: the ability to specifically bind Mycoplasma hominis. The cDNA nucleotide sequences encoding two selected nanoantibodies were determined (for aMh1 - SEQ ID NO: 1; for aMh2 - SEQ ID NO: 3), and the corresponding amino acid sequences of the selected nanoantibodies were deduced (for aMh1 - SEQ ID NO: 2 ; for aMh2 - SEQ ID NO: 4). In these sequences, the hypervariable regions of the CDR1, CDR2 and CDR3 antigen-recognizing sequences of the selected nanoantibodies are underlined respectively (from left to right, from the N- to the C-terminus).
На фиг.2 представлена элелекторофореграмма полиакриламидного геля с антигенным материалом белков микоплазмы хоминис (M.hominis) штамм Н-34, использованным для иммунизации верблюда.Figure 2 presents the electrophotogram of a polyacrylamide gel with antigenic material of mycoplasma hominis proteins (M.hominis) strain H-34 used to immunize a camel.
На фиг.3 и 4 представлены результаты иммуноферментного анализа узнавания отобранными наноантителами aMh1, aMh2 иммобилизованных в лунках иммунологической плашки липид-ассоциированных мембранных белков микоплазм. В качестве контрольных использовали ячейки с иммобилизованным белком овальбумином кур. Видно, что антитела специфически связываются с антигенами микоплазмы хоминис M.hominis, и, с меньшей аффинностью (фиг.4), микоплазмы орале M.orale и микоплазмы аргинини M.arginini и не взаимодействуют с липид-ассоциированными мембранными белками других видов микоплазм.Figures 3 and 4 show the results of an enzyme-linked immunosorbent assay for the recognition of selected aMh1, aMh2 nanoantibodies immobilized in the wells of the immunological plate of lipid-associated membrane proteins of mycoplasmas. Cells with immobilized chicken ovalbumin protein were used as controls. It can be seen that antibodies specifically bind to M. hominis hominis mycoplasma antigens, and, with less affinity (Fig. 4), M.orale oral mycoplasma and M.arginini arginine mycoplasma and do not interact with lipid-associated membrane proteins of other mycoplasma species.
Цифрами от 1 до 8 обозначены столбцы, соответствующие различным видам микоплазм и отрицательному контролю эксперимента:The numbers from 1 to 8 denote the columns corresponding to various types of mycoplasmas and the negative control of the experiment:
1 - Mycoplasma hominis (микоплазма хоминис),1 - Mycoplasma hominis (mycoplasma hominis),
2 - Mycoplasma orale (микоплазма орале),2 - Mycoplasma orale (mycoplasma orale),
3 - Mycoplasma arginini (микоплазма аргинини),3 - Mycoplasma arginini (mycoplasma arginini),
4 - Mycoplasma arthritidis (микоплазма артритидис),4 - Mycoplasma arthritidis (mycoplasma arthritis),
5 - Mycoplasma pneumoniae (микоплазма пневмониа),5 - Mycoplasma pneumoniae (mycoplasma pneumoniae),
6 - Mycoplasma fermentans (микоплазма ферментанс),6 - Mycoplasma fermentans (mycoplasma fermentans),
7 - Ureaplasma urealiticum (уреаплазма уреалитикум),7 - Ureaplasma urealiticum (ureaplasma urealiticum),
8 - отрицательный контроль, цифрами 1 и 2 обозначены соответственно наноантитела aMh1, aMh2.8 - negative control, the
На фиг.5 проиллюстрированы результаты иммуноферментного анализа узнавания отобранными наноантителами aMh1, aMh2 M.hominis в фиксированной параформальдегидом зараженной культуре клеток. Видно, что антитела специфически связываются с M.hominis в зараженной культуре и не взаимодействуют с контрольными незараженными клетками. Цифрами 1 и 2 обозначены соответственно наноантитела aMh1, aMh2, цифре 3 соответствует отрицательный контроль, цифрами от 1 до 3 обозначены столбцы, соответстветствующие зараженным клеткам, незараженным клеткам и неинкубированным с антителами клеткам.Figure 5 illustrates the results of an enzyme-linked immunosorbent assay for recognition of selected aMh1, aMh2 M.hominis nanoantibodies in a paraformaldehyde-fixed infected cell culture. It can be seen that antibodies specifically bind to M. hominis in the infected culture and do not interact with control uninfected cells. The
Примеры осуществления настоящего изобретенияExamples of the implementation of the present invention
Пример 1Example 1
Получение библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антителObtaining a library of variable domains of single-chain antibodies
ИммунизацияImmunization
Двугорбого верблюда Camelus bactrianus последовательно иммунизировали 5 раз путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом полного (при первой инъекции) или неполного (при остальных инъекциях) адъюванта Фрейнда. В качестве антигена использовали препарат липид-ассоциированных белков микоплазмы хоминис (M.hominis), штамм Н-34 (фиг.2), выделенных стандартым методом фракционирования белков в ТХ-114 (Bordier C. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution., J Biol Chem. 1981 Feb 25; 256(4): 1604-7). Вторую иммунизацию проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в две недели проводили еще три иммунизации. Взятие крови (150 мл) проводили через 5 дней после последней инъекции. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 50 мл стандартного солевого раствора (PBS), содержащего гепарин (100 ед./мл) и ЭДТА (3 мМ).Bactrian camel Camelus bactrianus was subsequently immunized 5 times by subcutaneous administration of antigenic material mixed with an equal volume of Freund's adjuvant (with the first injection) or incomplete (with the remaining injections). As an antigen, the preparation of lipid-associated proteins of mycoplasma hominis (M.hominis), strain H-34 (Fig. 2) isolated using the standard method of fractionation of proteins in TX-114 (Bordier C. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X- 114 solution., J Biol Chem. 1981 Feb 25; 256 (4): 1604-7). The second immunization was carried out 3 weeks after the first, then three more immunizations were carried out with an interval of two weeks. Blood sampling (150 ml) was performed 5 days after the last injection. To prevent coagulation of the taken blood, 50 ml of standard saline solution (PBS) containing heparin (100 units / ml) and EDTA (3 mM) was added.
Кровь разводили в 2 раза стандартным солевым раствором (PBS), содержащим 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку специальной среды (Histopaque-1077, Sigma) с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800×g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА.Blood was diluted 2 times with standard saline (PBS) containing 1 mm EDTA. 35 ml of a diluted blood solution was layered on a step of a special medium (Histopaque-1077, Sigma) with a density of 1.077 g / ml and a volume of 15 ml and centrifugation was performed for 20 min at 800 × g. Mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) were selected from the plasma / Histopaque interphase, and then washed with a PBS solution containing 1 mM EDTA.
Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen). Затем, на колонке с олиго(dT)-целлюлозой из тотальной РНК очищали поли(А)-содержащую РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (Eppendorf) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.Total RNA from B lymphocytes was isolated using TRIzol reagent (Invitrogen). Then, on a column of oligo (dT) cellulose from total RNA, poly (A) -containing RNA was purified. RNA concentration was determined using a biophotometer (Eppendorf) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1.5% formaldehyde agarose gel.
Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу [Sambrook et al., 1989] с использованием обратной транскриптазы H-M-MuLV и праймера олиго(dT)15 в качестве затравки.The reverse transcription reaction was carried out according to the standard protocol [Sambrook et al., 1989] using reverse transcriptase H - M-MuLV and oligo primer (dT) 15 as a seed.
Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции и полученные продукты амплификации клонировали по сайтам Ncol(Pstl) и Notl в фагмидный вектор, как описано ранее [Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006]. Процедедуру селекции проводили также аналогично тем, что в указанных работах. Она базировалась на методе фагового дисплея, в которой в качестве фага-помощника использовали бактериофаг M13KO7 (New England Biolabs, США).Reverse transcription products were used as templates in a two-step polymerase chain reaction, and the resulting amplification products were cloned at the Ncol (Pstl) and Notl sites into a phagemid vector as previously described [Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006]. The selection procedure was also carried out similarly to those in the indicated works. It was based on the phage display method, in which the bacteriophage M13KO7 (New England Biolabs, USA) was used as an assistant phage.
Пример 2Example 2
Селекция наноантител, специфически узнающих M.hominisSelection of nanoantibodies that specifically recognize M.hominis
Селекцию наноантител проводили методом фагового дисплея с использованием препарата липид-ассоциированных белков M.hominis, штамм Н-34, иммобилизованного на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические плашки с высокой сорбцией MICROLON 600 (Greiner Bio-One). Для блокировки использовали 1% БСА (Sigma-Aldrich, США) и/или 1% обезжиренное молоко (Bio-Rad, США) в PBS. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц (содержащих ген наноантитела внутри, а экспрессирующееся наноантитело - в составе поверхностного фагового белка pIII) повторяли, как правило, последовательно три раза. Все манипуляции проводили, как описано в публикациях Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. 2010. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 2010; 2 (3): 100-108; Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S. et al. Nature 1993; 363: 446-448.; Nguyen V.K., Desmyter A., Muyldermans S. Adv. Immunol. 2001; 79: 261-296; Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972; Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889].Nanoantibodies were selected by phage display using a preparation of lipid-associated proteins M.hominis, strain H-34, immobilized on the bottom of the wells of a 96-well ELISA plate. Used polystyrene immunological plates with high sorption MICROLON 600 (Greiner Bio-One). For blocking, 1% BSA (Sigma-Aldrich, USA) and / or 1% skim milk (Bio-Rad, USA) in PBS were used. The selection and subsequent amplification of the selected phage particles (containing the nanoantibody gene inside, and the expressed nanoantibody as a part of the surface phage protein pIII) was repeated, as a rule, three times in succession. All manipulations were performed as described in publications Tillib S.V., Ivanova T.I., Vasiliev L.A. 2010. Fingerprint analysis of the selection of "nanoantibodies" by the phage display method using two variants of assistant phages. Acta Naturae 2010; 2 (3): 100-108; Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S. et al. Nature 1993; 363: 446-448 .; Nguyen V.K., Desmyter A., Muyldermans S. Adv. Immunol. 2001; 79: 261-296; Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972; Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889].
Последовательности клонов отобранных наноантител группировали согласно схожести их фингерпринтов, получаемых при электрофоретическом разделении продуктов гидролиза амплифицированных последовательностей наноантител параллельно тремя частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (Hinfl, Mspl, Rsal). Последовательности кДНК наноантител (SEQ ID NO: 1 и 3) были определены (фиг.1). В указанных последовательностях подчеркнуты соответственно (слева направо) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 антиген-узнающих последовательностей отобранных наноантител.The clone sequences of the selected nanoantibodies were grouped according to the similarity of their fingerprints obtained by electrophoretic separation of the hydrolysis products of amplified nanoantibody sequences in parallel with three frequently digested restriction endonucleases (Hinfl, Mspl, Rsal). The cDNA sequences of nanoantibodies (SEQ ID NOs: 1 and 3) were determined (FIG. 1). In the indicated sequences, hypervariable regions of CDR1, CDR2 and CDR3 of antigen-recognizing sequences of selected nanoantibodies are underlined respectively (from left to right).
Продукция нанонтителNanoConductor Products
Последовательности кДНК отобранного наноантитела, переклонировали в экспрессионный плазмидный вектор - модифицированный вектор pHEN6 [Conrath KE, Lauwereys M, Gallenj M, Matagne A, Frère JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. / «Бэта-лактомазные ингибиторы, происходящие из фрагментов однодоменных антител, индуцированных у Верблюдовых». Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45:2807-12], позволяющий присоединение к С-концу наноантитела (His)6-эпитопа (сразу вслед за НА-эпитопом, кодируемым в векторе pHEN6). Благодаря наличию на N-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (peIB) нарабатываемый рекомбинантный белок (наноантитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию наноантител проводили в Е.coli (штамм BL21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-D-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 часов при 37°C или в течение ночи при 29°C. Наноантитело выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе с использованием системы для очистки QIAExpressionist (QIAGEN, США).The cDNA sequences of the selected nanoantibody were cloned into an expression plasmid vector — a modified pHEN6 vector [Conrath KE, Lauwereys M, Gallenj M, Matagne A, Frère JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. / "Beta-lactase inhibitors derived from fragments of single-domain antibodies induced in Camelids." Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45: 2807-12], allowing the attachment of the 6-epitope to the C-terminus of the (His) nanoantibody (immediately after the HA epitope encoded in the pHEN6 vector). Due to the presence of a signal peptide sequence (peIB) at the N-terminus of the expressed sequence, the produced recombinant protein (nanoantibody) accumulates in the periplasm of bacteria, which allows it to be efficiently isolated by the osmotic shock method without destroying the bacterial cells themselves. The production of nanoantibodies was carried out in E. coli (strain BL21). Expression was induced by adding 1 mM indolyl-beta-D-galactopyranoside and the cells were incubated with vigorous stirring for 7 hours at 37 ° C or overnight at 29 ° C. Nanoantibodies were isolated from the periplasmic extract using affinity chromatography on Ni-NTA agarose using the QIAExpressionist purification system (QIAGEN, USA).
Пример 3Example 3
Детекция специфических антигенов с использованием наноантител, специфически узнающих M.hominis.Detection of specific antigens using nanoantibodies that specifically recognize M. hominis.
Демонстрация связывания наноантител с липид-ассоциированными белками M.hominisDemonstration of the binding of nanoantibodies to lipid-associated proteins of M.hominis
Способность наноантител связывать липид-ассоциированные белки M.hominis проверяли с использованием метода иммуноферментного анализа с иммобилизованными липид-ассоциированными белками M.hominis, по стандартному протоколу. В качестве контроля использовали лунки с иммобилизованным белком овальбумином кур или бычьим сывороточным альбумином (неспецифические белки). Детекцию связавшихся aMh1 и aMh2 проводили с помощью анти-НА антител мыши, вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена, и хромогенного субстрата ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma).The ability of nanoantibodies to bind M.hominis lipid-associated proteins was tested using enzyme-linked immunosorbent assay with immobilized M.hominis lipid-associated proteins, according to the standard protocol. As a control, wells with immobilized chicken ovalbumin protein or bovine serum albumin (non-specific proteins) were used. The binding of aMh1 and aMh2 was detected using mouse anti-HA antibodies, secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase, and the TMB chromogenic substrate (3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine, Sigma).
На фиг.3 представлены результаты анализа, из которых следует, что наноантитела специфически связываются с иммобилизованными липид-ассоциированными белками M.hominis, но не связываются с овальбумином, использованным в качестве блокирующего агента.Figure 3 presents the results of the analysis, from which it follows that nanoantibodies specifically bind to immobilized lipid-associated proteins of M.hominis, but do not bind to ovalbumin, used as a blocking agent.
Пример 4Example 4
Демонстрация специфичности связывания наноантител с липид-ассоциированными белками M.hominis, M.pneumoniae, M.orale и M.argininiDemonstration of the specificity of binding of nanoantibodies to lipid-associated proteins M. hominis, M. pneumoniae, M.orale and M.arginini
Способность наноантител связывать липид-ассоциированные белки М.hominis проверяли с использованием метода иммуноферментного анализа с иммобилизованными липид-ассоциированными белками M.hominis, M.arginini, M.arthritidis, M.orale, M.fermentans, M.pneumoniae, U.urealiticum по стандартному протоколу. В качестве контроля использовали лунки с иммобилизованным белком овальбумином кур или бычьим сывороточным альбумином (неспецифические белки). Детекцию связавшихся aMh2, aMh1 проводили с помощью анти-НА антител мыши, вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена, и хромогенного субстрата ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma).The ability of nanoantibodies to bind M. hominis lipid-associated proteins was tested using enzyme-linked immunosorbent assay with immobilized lipid-associated proteins M. hominis, M.arginini, M.arthritidis, M.orale, M.fermentans, M. pneumoniae, U.urealiticum standard protocol. As a control, wells with immobilized chicken ovalbumin protein or bovine serum albumin (non-specific proteins) were used. The binding of aMh2, aMh1 was detected using mouse anti-HA antibodies, secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase, and the TMB chromogenic substrate (3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine, Sigma).
На фиг.3 и 4 представлены результаты анализа, из которых следует, что наноантитела специфически связываются с иммобилизованными липид-ассоциированными белками микоплазмы хоминис (M.hominis) и, с меньшей афинностью, микоплазмы пневмонии (M.pneumoniae), микоплазмы орале (M.orale) и микоплазмы аргинини (M.arginini), но не связываются с липид-ассоциированными белками других видов микоплазм.Figures 3 and 4 show the results of the analysis, from which it follows that nanoantibodies specifically bind to immobilized lipid-associated proteins of mycoplasma hominis (M.hominis) and, with less affinity, mycoplasma pneumoniae (M.pneumoniae), mycoplasma oral (M. orale) and mycoplasmas of arginini (M.arginini), but do not bind to lipid-associated proteins of other types of mycoplasmas.
Пример 5Example 5
Демонстрация связывания наноантител эукариотическими клетками, инфицированными микоплазмой хоминис (M.hominis), in vitroDemonstration of the binding of nanoantibodies to eukaryotic cells infected with mycoplasma hominis (M.hominis), in vitro
Эукариотическая культура клеток MCF7 была заражена M.hominis путем добавления культуры M.hominis в культуральную среду и инкубацией клеток MCF7 на этой среде. Затем клетки высевали на культуральный планшет и фиксировали 0,8% параформальдегидом по стандартному протоколу. Способность наноантител aMh3, aMh1 связываться с M.hominis, персистирующей на поверхности эукариотических клеток, проверяли с использованием метода иммуноферментного анализа по стандартному протоколу. В качестве контроля использовали лунки с фиксированными незараженными клетками. Детекцию связавшихся aMh1, aMh2 проводили с помощью анти-НА антител мыши, вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена, и хромогенного субстрата ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, Sigma).The eukaryotic culture of MCF7 cells was infected with M.hominis by adding M.hominis culture to the culture medium and incubating MCF7 cells in this medium. Then the cells were plated on a culture plate and fixed with 0.8% paraformaldehyde according to the standard protocol. The ability of nanoantibodies aMh3, aMh1 to bind to M. hominis, which persists on the surface of eukaryotic cells, was tested using enzyme-linked immunosorbent assay according to a standard protocol. Wells with fixed, uninfected cells were used as a control. The binding of aMh1, aMh2 was detected using mouse anti-HA antibodies, secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase, and the TMB chromogenic substrate (3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine, Sigma).
На фиг.5 представлены результаты анализа, из которых следует, что наноантитела специфически связываются с M.hominis, персистирующей на поверхности эукариотических клеток, но не связываются с незараженными клетками.Figure 5 presents the results of the analysis, from which it follows that nanoantibodies specifically bind to M. hominis, which persists on the surface of eukaryotic cells, but does not bind to uninfected cells.
Таким образом, заявленные в соответствии с настоящим изобретением фармацевтические композиции доказали свою применимость для детекции M.hominis in vitro.Thus, the pharmaceutical compositions claimed in accordance with the present invention have proven to be useful for in vitro detection of M. hominis.
Пример 6Example 6
Для демонстрации эффективности терапевтического действия наноантител для лечения микоплазменной инфекции мыши линии BALB/C (18-20 g) с синхронизированным овуляционным циклом были заражены внутривагинально M.hominis линии MY17386, в дозе 1*10^7 на мышь, как описано ранее (Taylor-Robinson D, Furr РМ. Further observations on the murine model of Mycoplasma hominis infection. / «Дальнейшие наблюдения на мышиной модели инфекции Mycoplasma hominis». J Med Microbiol. 2010 Aug; 59 (Pt 8):970-5. Epub 2010 May 6). Спустя неделю после заражения мыши получали ежедневные внутривагинальные спринцевания объемом 100 мкл ФБР с наноантителами aMh1, 2 в количестве 70 мкг/мышь/день (минимально активное количество антител, способных блокировать микоплазменную инфекцию) в течение 5 дней, доза наноантител была выбрана в соответствии с литературными данными, согласно которым в терапевтических целях антитела используют в дозах от 30 до 100 мкг на мышь (Xiao X, Zhu Z et al. Human anti-plague monoclonal antibodies protect mice from Yersinia pestis in a bubonic plague model.PLoS One. 2010 Oct 13; 5(10):e13047; Chen Z, Moayeri M, Purcell Monoclonal Antibody Therapies against Anthrax. RToxins (Basel). 2011 Aug; 3(8): 1004-19. Epub 2011 Aug 15). Контрольным группам мышей спринцевание проводили 100 мкл ФБР. Спустя 2 дня после последнего спринцевания органы половой системы мышей были гомогенизированы с использованием гомогенизатора с принципом бисерной мельницы, гомогенаты использованы для определения титра микоплазм методом культурального высева.To demonstrate the effectiveness of the therapeutic effect of nanoantibodies for the treatment of mycoplasma infections of mice of the BALB / C line (18-20 g) with a synchronized ovulation cycle, they were infected intravaginally with M.hominis line MY17386, at a dose of 1 * 10 ^ 7 per mouse, as described previously (Taylor- Robinson D, Furr PM. Further observations on the murine model of Mycoplasma hominis infection. / "Further observations on the mouse model of Mycoplasma hominis infection." J Med Microbiol. 2010 Aug; 59 (Pt 8): 970-5. Epub 2010 May 6 ) A week after infection, the mice received daily intravaginal douching with a volume of 100 μl PBS with aMh1,2 nanoantibodies in the amount of 70 μg / mouse / day (the minimum active number of antibodies capable of blocking mycoplasma infection) for 5 days, the dose of nanoantibodies was selected in accordance with the literature data according to which, for therapeutic purposes, antibodies are used in doses of 30 to 100 micrograms per mouse (Xiao X, Zhu Z et al. Human anti-plague monoclonal antibodies protect mice from Yersinia pestis in a bubonic plague model.PLoS One. 2010 Oct 13 ; 5 (10): e13047; Chen Z, Moayeri M, Purcell Monoclonal Antibody Therapies agai nst Anthrax. RToxins (Basel. 2011 Aug; 3 (8): 1004-19. Epub 2011 Aug 15). The control groups of mice were douched with 100 μl PBS. 2 days after the last douching, the organs of the reproductive system of mice were homogenized using a homogenizer with the principle of a bead mill, homogenates were used to determine the titer of mycoplasmas by culture seeding.
В табл.1 и 2 представлены результаты культуральных высевов M.hominis из гомогенатов половых органов мышей. Из представленных результатов следует, что наноантитела aMh1 и aMh2 оказывают достоверное ингибирующее действие на микоплазменную внутривагинальную инфекцию, что приводит к снижению титра микоплазм в гомогенатах органов половой системы. Таким образом, продемонстрирована эффективность терапии микоплазменной инфекции с использованием наноантител aMh1, 2. В таблице 1 представлена демонстация эффективности применения наноантитела aMh1 для лечения микоплазменной инфекции, вызванной M.hominis.Tables 1 and 2 show the results of culture of M. hominis from homogenates of the genital organs of mice. From the presented results it follows that the nanoantibodies aMh1 and aMh2 have a significant inhibitory effect on mycoplasma intravaginal infection, which leads to a decrease in the titer of mycoplasmas in the homogenates of the organs of the reproductive system. Thus, the effectiveness of the treatment of mycoplasma infection using aMh1 nanoantibodies was demonstrated. Table 1 shows the demonstration of the effectiveness of the use of aMh1 nanoantibodies for the treatment of mycoplasma infection caused by M.hominis.
В таблице 2 представлена демонстация эффективности применения наноантитела aMh2 для лечения микоплазменной инфекции, вызванной M.hominis.Table 2 presents a demonstration of the effectiveness of the use of aMh2 nanoantibody for the treatment of mycoplasma infection caused by M.hominis.
Таким образом, в указанных примерах раскрыто: создание новых антител, способных эффективно связывать антигены микоплазмы M.hominis; способ их получения; способ лечения урогенитального микоплазмоза, вызванного у млекопитающего микоплазмой M.hominis, из чего очевидно, что поставленная задача достигнута.Thus, the following examples are disclosed: the creation of new antibodies capable of efficiently binding M.hominis mycoplasma antigens; method for their preparation; a method of treating urogenital mycoplasmosis caused in a mammal by M. hominis mycoplasma, from which it is obvious that the task is achieved.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011154167/10A RU2484095C1 (en) | 2011-12-30 | 2011-12-30 | NANOANTIBODIES aMh1, aMh2 BINDING ANTIGEN OF MYCOPLASMA HOMINTS, METHOD OF PRODUCING THEM, METHOD OF TREATING MYCOPLASMA HOMINIS INFECTION |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011154167/10A RU2484095C1 (en) | 2011-12-30 | 2011-12-30 | NANOANTIBODIES aMh1, aMh2 BINDING ANTIGEN OF MYCOPLASMA HOMINTS, METHOD OF PRODUCING THEM, METHOD OF TREATING MYCOPLASMA HOMINIS INFECTION |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2484095C1 true RU2484095C1 (en) | 2013-06-10 |
Family
ID=48785614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011154167/10A RU2484095C1 (en) | 2011-12-30 | 2011-12-30 | NANOANTIBODIES aMh1, aMh2 BINDING ANTIGEN OF MYCOPLASMA HOMINTS, METHOD OF PRODUCING THEM, METHOD OF TREATING MYCOPLASMA HOMINIS INFECTION |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2484095C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2562158C2 (en) * | 2013-12-02 | 2015-09-10 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России) | Recombinant pseudo adenoviral particle producing modified nanoantibodies recognising mycoplasm mhominis, based pharmaceutical composition and method for using it for mycoplasmosis therapy |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995006123A1 (en) * | 1993-08-25 | 1995-03-02 | Research Corporation Technologies, Inc. | Detection and prevention of mycoplasma hominis infection |
| RU97100116A (en) * | 1994-06-03 | 1999-05-10 | Сейкагаку Корпорейшн | NEW GLYCOGLYCEROPHOSPHOLIPID, ANTIBODY AGAINST THIS SUBSTANCE AND METHOD FOR DETECTING MYCOPLASM |
| US6376203B1 (en) * | 1994-06-03 | 2002-04-23 | Seikagaku Corporation | Glycoglycerophospholipid, antibody thereagainst, and method for detecting mycoplasma |
| EP2048239A1 (en) * | 2006-06-14 | 2009-04-15 | M Bio Technology Inc. | Glyceroglycolipid antigen of mycoplasma pneumoniae |
-
2011
- 2011-12-30 RU RU2011154167/10A patent/RU2484095C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995006123A1 (en) * | 1993-08-25 | 1995-03-02 | Research Corporation Technologies, Inc. | Detection and prevention of mycoplasma hominis infection |
| RU97100116A (en) * | 1994-06-03 | 1999-05-10 | Сейкагаку Корпорейшн | NEW GLYCOGLYCEROPHOSPHOLIPID, ANTIBODY AGAINST THIS SUBSTANCE AND METHOD FOR DETECTING MYCOPLASM |
| US6376203B1 (en) * | 1994-06-03 | 2002-04-23 | Seikagaku Corporation | Glycoglycerophospholipid, antibody thereagainst, and method for detecting mycoplasma |
| EP2048239A1 (en) * | 2006-06-14 | 2009-04-15 | M Bio Technology Inc. | Glyceroglycolipid antigen of mycoplasma pneumoniae |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MORRISON-PLUMMER J et al. Biological effects of anti-lipid and anti-protein monoclonal antibodies on Mycoplasma pneumoniae// Infect Immun. (1986); 53(2):398-403. * |
| RAZIN S et al. Immunogenicity of Mycoplasma pneumoniae glycolipids: a novel approach to the production of antisera to membrane lipids// Proc Natl Acad Sci USA (1970); 67(2):590-7. * |
| ТИЛЛИБ С.В. Верблюжьи Наноантитела" - Эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии"// Молекулярная Биология. - 2011, том 45, No.1, с.77-85. * |
| ТИЛЛИБ С.В. Верблюжьи Наноантитела" - Эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии"// Молекулярная Биология. - 2011, том 45, №1, с.77-85. MORRISON-PLUMMER J et al. Biological effects of anti-lipid and anti-protein monoclonal antibodies on Mycoplasma pneumoniae// Infect Immun. (1986); 53(2):398-403. RAZIN S et al. Immunogenicity of Mycoplasma pneumoniae glycolipids: a novel approach to the production of antisera to membrane lipids// Proc Natl Acad Sci USA (1970); 67(2):590-7. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2562158C2 (en) * | 2013-12-02 | 2015-09-10 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России) | Recombinant pseudo adenoviral particle producing modified nanoantibodies recognising mycoplasm mhominis, based pharmaceutical composition and method for using it for mycoplasmosis therapy |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110366560B (en) | anti-B7-H4 antibody, antigen binding fragment thereof and medical application thereof | |
| KR102662387B1 (en) | B7-H3 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical uses thereof | |
| CN105143261B (en) | C5 antibodies and methods for preventing and treating complement-related diseases | |
| EP3712170A1 (en) | Cd96 antibody, antigen-binding fragment and pharmaceutical use thereof | |
| US9914767B2 (en) | Cross-reactive Staphylococcus aureus antibody | |
| US20200369774A1 (en) | Il-6r antibody and antigen binding fragment thereof and medical use | |
| KR20160119196A (en) | IgA multi-specific binding molecules | |
| CN119176871A (en) | Antibodies against staphylococcus aureus clotting factor a (CLFA) | |
| CN111704672A (en) | Anti-plasma kallikrein antibody | |
| TW201831512A (en) | Tim-3 antibody, antigen-binding fragments and pharmaceutical use thereof | |
| KR20220128332A (en) | Single-Domain Antibodies Against LILRB2 | |
| TWI714895B (en) | Anti-csf-1r antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof | |
| KR102709785B1 (en) | ＩＬ５ antibody, antigen-binding fragment thereof and medical applications thereof | |
| CN113444172A (en) | Staphylococcus aureus alpha-toxin specific antibody and application thereof | |
| CN110114370A (en) | Antibody or antigen-binding fragment thereof capable of binding to human interleukin-6 receptor | |
| RU2484095C1 (en) | NANOANTIBODIES aMh1, aMh2 BINDING ANTIGEN OF MYCOPLASMA HOMINTS, METHOD OF PRODUCING THEM, METHOD OF TREATING MYCOPLASMA HOMINIS INFECTION | |
| US20240391982A1 (en) | Anti-etec adhesin protein antibodies and methods of use | |
| RU2493165C1 (en) | Nanoantibody specifically binding muc1 protein, method of muc1 protein detection by nanoantibodies | |
| WO2021209066A1 (en) | Specific antigen binding molecule, and preparation method and pharmaceutical use therefor | |
| RU2484096C1 (en) | SINGLE-DOMAIN ANTIBODY aMts1 SPECIFICALLY BINDING PROTEIN S100A4/Mts1, METHOD FOR PREPARING AND USING FOR DETECTION OF THIS PROTEIN | |
| RU2487724C1 (en) | Nanoantibodies binding chlamydia trachomatis antigen, method of inhibiting infection caused by chlamydia trachomatis | |
| RU2846901C1 (en) | Anti-trop-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof and medical applications thereof | |
| CN115724960A (en) | Alpaca source nano antibody N112 and application thereof | |
| WO2024150074A2 (en) | Coronavirus antibodies and therapeutic uses thereof | |
| HK40045557A (en) | An anti-ox40 antibody, antigen-binding fragment thereof, and the pharmaceutical use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20190904 |