RU2483115C1 - Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для субтипоспецифичной идентификации рнк вируса денге на основе мультиплексной пцр в реальном времени - Google Patents
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для субтипоспецифичной идентификации рнк вируса денге на основе мультиплексной пцр в реальном времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2483115C1 RU2483115C1 RU2012117861/10A RU2012117861A RU2483115C1 RU 2483115 C1 RU2483115 C1 RU 2483115C1 RU 2012117861/10 A RU2012117861/10 A RU 2012117861/10A RU 2012117861 A RU2012117861 A RU 2012117861A RU 2483115 C1 RU2483115 C1 RU 2483115C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dengue virus
- subtype
- rna
- dengue
- primers
- Prior art date
Links
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 title claims abstract description 60
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 30
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 12
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000710844 Dengue virus 4 Species 0.000 description 5
- 241000710829 Dengue virus group Species 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000710827 Dengue virus 1 Species 0.000 description 2
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 2
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 2
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241001336411 unassigned viruses Species 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 101100428022 Arabidopsis thaliana UTR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000710815 Dengue virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000710872 Dengue virus 3 Species 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 101100453133 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ISY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000009714 Severe Dengue Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003616 anti-epidemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 201000002950 dengue hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для субтипоспецифичной идентификации РНК вируса денге на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени. Изобретение может быть использовано в медицине в качестве средства для субтипоспецифичной идентификации РНК вируса денге. 2 ил., 3 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к средствам диагностики РНК субтипов вируса денге и может быть использовано в биотехнологии, в частности в генетической инженерии, а также в медицине для выявления генетического материала (РНК) вируса денге 4-х субтипов в клинических или секционных пробах с целью постановки диагноза или коррекции лечения, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению свойств флавивирусов, созданию диагностических, профилактических или лечебных препаратов против флавивирусов. При помощи набора диагностических праймеров возможно одновременное выявление генетического материала (РНК) вируса денге 4-х субтипов в исследуемом образце с возможностью дифференциации субтипа.
Вирусы денге входят в семейство флавивирусов (Flaviviridae). Семейство Filoviridae в соответствии с последними решениями Международного Таксономического Комитета включает в себя четыре рода: Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus и unassigned viruses (http://www.ictvdb.org/Ictv/fs_flavi.htm#Genus1).
Вирусы денге входят в семейство флавивирусов (Flaviviridae). Семейство Filoviridae в соответствии с последними решениями Международного Таксономического Комитета, включает в себя четыре рода: Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus и unassigned viruses (http://www.ictvdb.org/Ictv/fs_flavi.htm#Genus1).
В род Flavivirus входит dengue virus group, в которую включены:
Вирусы денге
Вирус денге субтип 1 (Dengue virus 1, DENV-1);
Вирус денге субтип 2 (Dengue virus 2, DENV-2);
Вирус денге субтип 3 (Dengue virus 3, DENV-3);
Вирус денге субтип 4 (Dengue virus 4, DENV-4).
Вирус Кедогоу (Kedougou virus, KEDV)
Заболевание лихорадкой денге возникает при заражении одним из 4-х субтипов вируса денге. На ранней стадии инфекции дифференциальная диагностика лихорадки денге затруднительна. Кроме того, на ранней стадии нельзя спрогнозировать тяжесть заболевания и развитие осложнений, поэтому от своевременной диагностики зависит комплекс лечебных, профилактических и противоэпидемических мероприятий [1]. Перенесенное заболевание, вызванное одним из 4-х субтипов вируса денге, не защищает от повторного заражения другим субтипом. Необходимость диагностировать субтипы друг от друга вызвана возникновением тяжелых геморрагических осложнений при повторном заражении другим субтипом [2]. Высокая летальность наблюдается у лиц, повторно заболевших лихорадкой денге, вызванной субтипом 1, раннее переболевших лихорадкой денге, вызванной субтипом 2 [3].
Известен набор праймеров для диагностики вируса денге 4 типа (патент CN 101240350, МПК C12N15/11, C12Q1/68, опубл. 13.08.2008 г.)[4]. Primer and probe sequence for detecting dengue virus IV type nucleic acid fragment:
GAAAGGACCCTTACGGATGGT
AGAATCCCTGCTGTTGGTGG
TCATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTCCA
Известен набор праймеров для диагностики вируса денге 4 типа (патент CN 101139638 , МПК C12N15/11, C12Q1/68, опубл. 12.03.2008 г.) [5]. Primer and probe sequence for detecting dengue virus III nucleotides fragment:
GGAAAACCGTCTATCAATATGCTG
TCCTCTTGAGAATCTCTTCGCC
CGCGTGAGAAACCGTGTGTCAACTG
Известен набор праймеров для диагностики вируса денге 4 типа (патент CN 101240349 , МПК C12N15/11, C12Q1/68, опубл. 13.08.2008 г.) [6]. Primer and probe sequence for detecting dengue virus II type nucleic acid fragment:
TTCATGGCCCTGGTGGC
TGATTTTTTRATTGTTCCCCATCT
CGTTTCCTAACAATCCCACCAACAGC
Известен набор праймеров для диагностики вируса денге 4 типа (патент CN 101139637, МПК C12N15/11, C12Q1/68, опубл. 12.03.2008 г.) [7]. Primer and probe sequence for detecting dengue virus 1 nucleotides fragment:
TGTTTTCTTTGCATTTGCTCCA
CGAAYCCAACTATAGAAGAAGGAAGAAC
CCTCTGAGCCATGGTTCCACCATCTT
Однако детальный анализ вышеприведенных аналогов (праймеров и олигонуклеотидных зондов) показал, что в ряде случаев данные наборы могут не обеспечить надежной идентификации вируса денге, поскольку в последние четыре года были выявлены геноварианты вируса, для которых вышеназванные наборы праймеров и зондов не обладают достаточной специфичностью, чтобы обеспечить надежный синтез целевых фрагментов ДНК. В ходе анализа была выявлена недостаточная субтипоспецифичность данных наборов, в ряде случаев возможно возникновение перекрестной реакции на другие субтипы вируса денге, это может привести к неправильной идентификации субтипов вируса денге.
Наиболее близким аналогом (прототипом) являются праймеры и зонды, используемые в однораундовой ПЦР тест-системе для выявления РНК вируса денге методом обратной транскрипции в режиме реального времени. Использованные в данной тест-системе праймеры и зонд рассчитаны на 3'UTR (Huhtamoa E, Hasua E, Uzcateguia N, Errab E, Nikkaric S, Kanteleb A, Vapalahtia O, Piiparinena H. Early diagnosis of dengue in travelers: Comparison of a novel real-time RT-PCR, NS1 antigen detection and serology // J. of Clinical Virol. - 2010. - Vol. 47. - P. 49-53) [8].
Однако данная тест-система не позволяет определить субтип вируса денге. Накопленные данные по геномному разнообразию субтипов вируса денге и детальный анализ этих данных показали, что этот набор праймеров в ряде случаев может не обеспечить надежной идентификации вируса денге, поскольку в последние пять лет были выявлены геноварианты вируса, для которых вышеназванный набор праймеров не обладает достаточной специфичностью, чтобы обеспечить надежный синтез целевых фрагментов ДНК.
Техническим результатом изобретения является создание средства для субтипоспецифичной идентификации РНК вируса денге на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени
Указанный технический результат достигается тем, что создан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для субтипоспецифичной идентификации РНК вируса денге на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени, включающий:
универсальные праймеры на четыре субтипа вируса денге:
5΄→3΄ 5΄ CTAGYGGTTAGAGGAGACCCCT 3΄
3΄←5΄ 5΄ GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT 3΄
специфические зонды на 1 субтип вируса денге:
FAM- AGGGGAAGCTGTACCITGGTGGTAAG - BHQ1
специфические зонды на 2 субтип вируса денге:
ROX- CCCAAGGIGAGATGAAGCTGTAITC - BHQ2
специфические зонды на 3 субтип вируса денге:
RG6- CCGAGCACTGAGGGAAGCTGTACCT - BHQ2
специфические зонды на 4 субтип вируса денге:
Cy5- AGGAGGAAGCTGTACITCTGGTGGAA -BHQ2
На основе заявляемого набора создан лабораторный вариант мультиплекс тест-системы, основанной на методе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, для идентификации генетического материала вируса денге с возможностью дифференциации субтипа в клинических образцах и биологических жидкостях, образцах внешней среды и других вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость и др.).
На фиг. 1 и 2 приведены кривые флуоресценции на четырех оптических каналах амплификатора Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия). Положительные контрольные образцы (кривая 1-4), отрицательный контрольный образец (кривая 5), образец, содержащий генетический материал вируса денге (кривая 6).
Описание конструирования диагностических праймеров и флуоресцентно-меченых зондов.
На консервативную область 3'UTR; конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pCR 2.1 (TOPO), несущей специфический для каждого из субтипов вируса денге участок ДНК-матрицы; оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПЦР.
На начальном этапе был проведен поиск и определение наиболее консервативных участков генома вируса денге по известным нуклеотидным последовательностям штаммов четырех субтипов вируса денге, представленным в базе данных NCBI Mega BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). В качестве мишени для диагностических праймеров был выбран нетранслируемый регион UTR3 вирусной РНК.
Последовательности праймеров и зондов, температуры их отжига и размеры продуктов амплификации представлены в таблице 1 и 2.
Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программного обеспечения Vector NTI 9.0.0 (InforMax).
Таблица 1
Праймеры для детекции вируса денге.
| Вирус денге | Зонды | Структура олигонуклеотидной последовательности | Т отжига (0 С) | Размер ампликона |
| Субтип 1-4 | F10552 | CTAGYGGTTAGAGGAGACCCCT | 54,8 | 170 |
| R10722 | GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT | 54,8 |
Таблица 2
Зонды для детекции 4-х субтипов вируса денге.
| Вирус денге | Зонды | Структура олигонуклеотидной последовательности | Т отжига (0 С) |
| Субтип 1 | Z10617 | FAM - AGGGGAAGCTGTACCITGGTGGTAAG - BHQ1 | 64,9 |
| Субтип 2 | Z1607 | ROX - CCCAAGGIGAGATGAAGCTGTAITC - BHQ2 | 63,1 |
| Субтип 3 | Z10609 | RG6 - CCGAGCACTGAGGGAAGCTGTACCT - BHQ2 | 64,1 |
| Субтип 4 | Z10616 | Cy5 - AGGAGGAAGCTGTACITCTGGTGGAA -BHQ2 | 61,4 |
Пример 1. Проверка аналитической чувствительности набора праймеров и зондов.
Для контроля амплификации были получены положительные контрольные образцы, представляющие собой рекомбинантные плазмиды, несущие вирусспецифические вставки, являющиеся матрицей для амплификации вирусспецефических ДНК-фрагментов.
Для проведения ПЦР в режиме реального времени в качестве анализируемых образцов использовали рекомбинантную плазмидную ДНК, включающую вставку ДНК, соответствующую детектируемым участкам геномов каждого субтипа вируса денге.
Условия проведения амплификации оптимизировались по следующим параметрам: концентрация ионов магния в реакционной смеси; концентрация праймеров и зондов в реакционной смеси; температура отжига праймеров.
Для определения чувствительности набора из концентрированного раствора плазмидной ДНК были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК в разведениях при исследовании чувствительности праймеров осуществляли при помощи флуориметра QUBIT (Invitrogen, США) и наборов реагентов производителя.
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) по каналам Green (470 nm / 510 nm) для субтипа 1 вируса денге, Orange (585 nm / 620 nm) для субтипа 2 вируса денге, Yellow (530 nm / 555 nm) для субтипа 3 вируса денге и Red (640 nm / 670 nm) для субтипа 4 вируса денге.
В результате выполненных экспериментов была определена аналитическая чувствительность тест-системы в формате мультиплекс. Она составила 30 - 40 геномных эквивалентов (плазмидной ДНК, содержащей вирусспецифическую вставку каждого субтипа вируса денге) на 30 мкл реакционной смеси.
Для определения аналитической чувствительности моновариантов систем «праймеры-зонд» для детекции каждого субтипа вируса денге из концентрированных растворов положительных контрольных образцов были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК в разведениях при исследовании чувствительности праймеров осуществляли при помощи коммерческого набора «Quant-iT dsDNA, HS» («Invitrogen», США) и флуориметра QUBIT («Invitrogen», США). Минимальное количество ДНК-матриц, детектируемое с применением наших праймеров и зондов после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах) в 30 мкл реакционной смеси, представлено в таблице 3.
Таблица 3.
Аналитическая чувствительность моновариантов систем «праймеры-зонд»
| Вирус денге | Аналитическая чувствительность (ГЭ) |
| Субтип 1 | 20 |
| Субтип 2 | 30 |
| Субтип 3 | 30 |
| Субтип 4 | 40 |
Пример 2. Определение РНК вируса денге в клиническом образце.
Инактивацию образцов и выделение РНК проводили в условиях, регламентированных Методическими указаниями МУ 1.3. 2569 -09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности».
Процедуру выделения РНК из исследуемого материала проводили с использованием набора реагентов «Рибо-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.
ПЦР в режиме реального времени проводили с праймерами F10552 и R10722, фланкирующими участок ДНК в 170 п.н., в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):
| кДНК | 2 мкл |
| 10×Taq буфер без Mg2+ | 3 мкл |
| 100 mM раствор MgCl2 | 1 мкл |
| 5 mM раствор dNTP | 1 мкл |
Смесь праймеров
| (концентрация каждого 10-15 мкмол/л) | 2 мкл |
| Зонд (концентрация 5-10 мкмол/л) | 1 мкл |
| Hot Start Taq DNA-Полимераза 5 ед/ мкл | 0,3 мкл |
| Вода для ПЦР | 16,7 мкл |
__________________________________________
| Общий объем | 30 мкл |
В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли ТЕ-буфер.
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) по следующей программе:
| Температура (0С) | Время (минуты:секунды) | Количество циклов |
| 95 | 05:00 | 1 |
| 95 | 00:15 | 45 |
| 55 | 00:20 | |
| 72 | 00:15 |
Измерение флуоресценции проводили на приборе “Rotor Gene 6000” по каналам Green (470 nm / 510 nm) для субтипа 1 вируса денге, Orange (585 nm / 620 nm) для субтипа 2 вируса денге, Yellow (530 nm / 555 nm) для субтипа 3 вируса денге и Red (640 nm / 670 nm) для субтипа 4 вируса денге, при температуре 55 °С.
Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию. При этом значение Ct для данного образца было не больше 40 (Фиг. 1 и 2).
Таким образом, на основе приведенных выше примеров подтвержден заявленный технический результат.
Источники научно-технической и патентной информации
1. WHO. Dengue and dengue haemorrhagic fever // Factsheet No 117, revised May 2008. Geneva. World Health Organization, 2008 (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs117/en/).
2. World Health Organization. Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control - New edition // WHO/HTM/NTD/DEN - 2009.1.
3. Sierra B, Kouri G, Guzman MG. Race: a risk factor for dengue hemorrhagic fever // Arch. Virol. - 2007. - Vol. 152. - P. 533-542.
4. Патент CN,101240350, МПК C12N15/11, C12Q1/68, опубл. 13.08.2008 г.
5. Патент CN 101139638 , МПК C12N15/11, C12Q1/68, опубл. 12.03.2008 г.
6. Патент CN 101240349 , МПК C12N15/11, C12Q1/68, опубл. 13.08.2008 г.
7. Патент CN 101139637, МПК C12N15/11, C12Q1/68, опубл. 12.03.2008 г.
8. Huhtamoa E, Hasua E, Uzcateguia N, Errab E, Nikkaric S, Kanteleb A, Vapalahtia O, Piiparinena H. Early diagnosis of dengue in travelers: Comparison of a novel real-time RT-PCR, NS1 antigen detection and serology // J. of Clinical Virol. - 2010. - Vol. 47. - P. 49-53.
Приложение
Перечень последовательностей
универсальные праймеры на четыре субтипа вируса денге:
5΄→3΄ 5΄ CTAGYGGTTAGAGGAGACCCCT 3΄
3΄←5΄ 5΄ GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT 3΄
специфические зонды на 1 субтип вируса денге:
FAM- AGGGGAAGCTGTACCITGGTGGTAAG - BHQ1
специфические зонды на 2 субтип вируса денге:
ROX- CCCAAGGIGAGATGAAGCTGTAITC - BHQ2
специфические зонды на 3 субтип вируса денге:
RG6- CCGAGCACTGAGGGAAGCTGTACCT - BHQ2
специфические зонды на 4 субтип вируса денге:
Cy5- AGGAGGAAGCTGTACITCTGGTGGAA -BHQ2.
Claims (1)
- Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для субтипоспецифичной идентификации РНК вируса денге на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени, включающий:
универсальные праймеры на четыре субтипа вируса денге:
5'→3' 5' CTAGYGGTTAGAGGAGACCCCT 3'
3'←5' 5' GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT 3'
специфические зонды на 1 субтип вируса денге:
FAM- AGGGGAAGCTGTACCITGGTGGTAAG - BHQ1
специфические зонды на 2 субтип вируса денге:
ROX- CCCAAGGIGAGATGAAGCTGTAITC - BHQ2
специфические зонды на 3 субтип вируса денге:
RG6- CCGAGCACTGAGGGAAGCTGTACCT - BHQ2
специфические зонды на 4 субтип вируса денге:
Су5- AGGAGGAAGCTGTACITCTGGTGGAA -BHQ2
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012117861/10A RU2483115C1 (ru) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для субтипоспецифичной идентификации рнк вируса денге на основе мультиплексной пцр в реальном времени |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012117861/10A RU2483115C1 (ru) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для субтипоспецифичной идентификации рнк вируса денге на основе мультиплексной пцр в реальном времени |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2483115C1 true RU2483115C1 (ru) | 2013-05-27 |
Family
ID=48791902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012117861/10A RU2483115C1 (ru) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для субтипоспецифичной идентификации рнк вируса денге на основе мультиплексной пцр в реальном времени |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2483115C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110714096A (zh) * | 2019-10-17 | 2020-01-21 | 深圳市疾病预防控制中心 | 一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2057811C1 (ru) * | 1990-12-17 | 1996-04-10 | Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора РФ | Набор для идентификации флавивирусов |
| US20020155435A1 (en) * | 2001-03-01 | 2002-10-24 | Wei-Kung Wang | Detection of dengue virus |
-
2012
- 2012-04-27 RU RU2012117861/10A patent/RU2483115C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2057811C1 (ru) * | 1990-12-17 | 1996-04-10 | Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора РФ | Набор для идентификации флавивирусов |
| US20020155435A1 (en) * | 2001-03-01 | 2002-10-24 | Wei-Kung Wang | Detection of dengue virus |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110714096A (zh) * | 2019-10-17 | 2020-01-21 | 深圳市疾病预防控制中心 | 一种用于同时检测4种登革热病毒分型的试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111321249A (zh) | 一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及方法 | |
| RU2506317C2 (ru) | Способ выявления кишечных вирусов в клинических образцах и воде методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления | |
| RU2504585C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом | |
| EP2707496A1 (en) | Procedure for rapid determination of viruses using nucleic acid-based molecular diagnostics, and a kit for this purpose | |
| CN103255232B (zh) | 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| RU2473702C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации рнк коронавирусов видов 229е, nl63, ос43, hku1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции | |
| Hakhverdyan et al. | Development of a real-time PCR assay based on primer-probe energy transfer for the detection of swine vesicular disease virus | |
| US20180127836A1 (en) | Improved compositions and methods for detection of viruses | |
| CN101487064A (zh) | 检测五种人兽共患病病毒的方法及专用试剂盒 | |
| Rojas et al. | Molecular typing of adenovirus circulating in a Colombian paediatric population with acute respiratory infection | |
| Haegeman et al. | Characterisation of the discrepancy between PCR and virus isolation in relation to classical swine fever virus detection | |
| RU2483115C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для субтипоспецифичной идентификации рнк вируса денге на основе мультиплексной пцр в реальном времени | |
| JP2012143185A (ja) | 口蹄疫ウィルスの包括的検出方法 | |
| CN113817870A (zh) | 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 | |
| RU2511440C2 (ru) | Способ количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма "москва 3253" | |
| CN102605103B (zh) | 一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法 | |
| EP3017068B1 (en) | Primers and methods for detecting human hepatitis c virus (hcv) variants in an isolated sample | |
| KR101755037B1 (ko) | 핵산 염색제를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｃｖ 검출방법 | |
| RU2715625C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 1 генотипа | |
| CN109022621A (zh) | 尼帕病毒检测试剂盒及其专用引物 | |
| Xu et al. | A new accurate assay for Coxsackievirus A 16 by fluorescence detection of isothermal RNA amplification | |
| RU2487167C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации вируса эбола-судан методом полимеразной цепной реакции | |
| Jaianand et al. | Development of a new method for diagnosis of Group B Coxsackie genome by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification | |
| KR102870862B1 (ko) | 필로바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 필로바이러스의 검출방법 | |
| Nikpey et al. | Nanomolecular magnetic probe for colorimetric RT-LAMP of Viral RNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140428 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20150710 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180428 |