RU2483114C1 - СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ, ДЕТЕРМИНИРУЮЩИХ АДГЕЗИНЫ, ГЕМОЛИЗИНЫ, МАННОЗА-РЕЗИСТЕНТНЫЕ ГЕМАГГЛЮТИНИНЫ У ГЕНИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ Escherichia coli - Google Patents
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ, ДЕТЕРМИНИРУЮЩИХ АДГЕЗИНЫ, ГЕМОЛИЗИНЫ, МАННОЗА-РЕЗИСТЕНТНЫЕ ГЕМАГГЛЮТИНИНЫ У ГЕНИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ Escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- RU2483114C1 RU2483114C1 RU2012117652/10A RU2012117652A RU2483114C1 RU 2483114 C1 RU2483114 C1 RU 2483114C1 RU 2012117652/10 A RU2012117652/10 A RU 2012117652/10A RU 2012117652 A RU2012117652 A RU 2012117652A RU 2483114 C1 RU2483114 C1 RU 2483114C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- escherichia coli
- genes
- amplification
- biomaterial
- strains
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 title claims description 7
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 title claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims abstract description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 6
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 abstract description 14
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 abstract description 12
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 abstract description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 19
- 101150024289 hly gene Proteins 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 3
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 206010046901 vaginal discharge Diseases 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010037833 Bacterial Adhesins Proteins 0.000 description 1
- 241000726107 Blastocystis hominis Species 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010069584 Type III Secretion Systems Proteins 0.000 description 1
- 206010048709 Urosepsis Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 108010014562 cytotoxic necrotizing factor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологии, генетической инженерии и биотехнологии. Предложен способ, предусматривающий отбор биоматериала, выделение бактериальной ДНК, амплификацию фрагментов ДНК исследуемого штамма методом ПЦР с использованием уникального набора олигонуклеотидных праймеров, где продукты амплификации разделяют методом электрофореза в агарозном геле. Результаты ПЦР определяют одновременно все три гена, которые учитывают визуализируя окрашиванием бромистым этидием. Наличие в исследуемом биоматериале генов патогенности у штаммов Escherichia coli определяют по размерам образовавшихся фрагментов ДНК: fim A - 248 п.о., hly A, В, С - 233 п.о., рар С - 251 п.о. Изобретение может быть использовано в медицине для обнаружения методом молекулярной гибридизации генитальных кишечных палочек, обладающих факторами патогенности. 2 табл., 3 ил.
Description
Изобретение относится к микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть использовано для обнаружения методом молекулярной гибридизации генитальных кишечных палочек, обладающих факторами патогенности, - адгезины, гемолизины, манноза-резистентные гемагглютинины.
В последние десятилетия Escherichia coli стала распространенным нозокомиальным патогеном. Escherichia coli, как представитель условно-патогенной микрофлоры, является причиной развития воспалительных заболеваний урогенитального тракта.
Усиление вирулентности среди гетерогенных популяций потенциально патогенных энтеробактерий в настоящее время является важным объектом исследований различных отраслей биологической и медицинской наук. Наиболее существенными для изменения патогенности условно-патогенных энтеробактерий, ввиду «скачкообразного» характера и кардинальности происходящих превращений микроорганизма, рассматривают генетические рекомбинации, которые определяют геномную пластичность микробов, реализуемую через несколько конкретных механизмов, связанных, в частности, с «островами» и «островками» патогенности, ассоциированных с фрагментами ДНК, включающими дискретные гены вирулентности [1]; [2].
В частности, среди патогенных для человека сероваров Escherichia coli обнаружены «острова патогенности», детерминирующие ключевые этапы взаимодействия любого патогена с макроорганизмом, включая адгезию, продукцию токсинов, способность противостоять факторам неспецифической резистентности [3].
Уропатогенные кишечные палочки, UPEC-uropathogenic E.coli, могут включать гены, контролирующие синтез фимбриальных адгезинов (Р и S), α-гемолизина (hly) и цитотоксического некротизирующего фактора-1 (cnf-1), сайтами интеграции которых являются локусы генов селеноцистеиновой (sel), фенилаланин (phe)-специфичной tRNA [3]. Известны «островки патогенности», контролирующие синтез белков, связанных с поглощением ионов железа, необходимого для размножения возбудителя в ткани, а также гены системы секреции III-го типа, ответственной за одноэтапный транспорт эффекторных молекул из бактериальной клетки в цитоплазму эукариотной клетки с последующей модификацией цитоплазматических белков поражаемых мишеней [4].
В связи с этим в ряде случаев обнаружение генетических детерминант, дополненное фенотипической характеристикой экспрессируемого фактора патогенности, позволяет объективно судить об этиологическом агенте заболевания, имеющем значение в лабораторной диагностике патологий урогенитального тракта.
В настоящее время наиболее перспективными считаются молекулярные методы, основанные на обнаружении ДНК возбудителей в исследуемом материале, в частности методы, основанные на технологии ПЦР. Эти методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью и позволяют обнаруживать присутствие очень малого количества копий генетических последовательностей микроорганизмов в микроколичествах исследуемого материала и за короткое время. Кроме того, современные модификации полимеразной цепной реакции, проводимой в режиме реального времени, также позволяют определять количественные значения микроорганизмов.
Известен способ определения частоты встречаемости генетических детерминант вирулентности среди штаммов E.coli, выделенных у детей с инфекцией мочевой системы [2]. Данный способ позволил установить факт, что клиническая форма инфекции мочевой системы прямо зависит от частоты встречаемости маркеров уропатогенности hly A, cnf-1, pap С, sfa G.
Однако описанный способ рекомендован авторами только для выявления возбудителя в моче и не предназначен для обнаружения E.coli в других видах биологического материала (отделяемое влагалища, цервикального канала).
Существует способ выявления генетических детерминант факторов патогенности эшерихий, обеспечивающих адгезию и токсинообразование, в условиях ассоциативного симбиотического взаимодействия E.coli с B.hominis in vitro [5]. В результате данного исследования отмечена высокая частота встречаемости комбинаций генов pap С, pap Н, sfa A, hly В и рар С, fim А, ehx, что свидетельствует об их значимости в процессах адаптации к изменившимся условиям. Описанный способ рекомендован авторами для выявления возбудителя в фекалиях при кишечных инфекциях на фоне бластоцистной инвазии.
Недостатком данного способа является определение участков ДНК, ответственных за факторы вирулентности, не в системе «мультиплекс», т.е. не одновременно.
Известен способ определения мутантного термолабильного энтеротоксина E.coli [6]. Этот способ раскрывает выделенный полипептид, включающий мутантную А субъединицу термолабильного энтеротоксина Escherichia coli (LT), которая имеет только один мутированный остаток, представляющий собой K, R, Н или Y, по сравнению с термолабильным энтеротоксином дикого типа, содержащим определенную аминокислотную последовательность. Полипептид по способу может быть использован в качестве адъюванта.
В данном способе описано выделение только одного фактора патогенности - термолабильного энтеротоксина.
Задачей изобретения является создание способа выявления генов, детерминирующих адгезины, гемолизины, манноза-резистентные гемагглютинины у генитальных штаммов Escherichia coli, обеспечивающего получение технического результата, состоящего в повышении эффективности обнаружения упомянутых генов патогенности, возможности одновременного выявления всех трех генов патогенности за счет унифицикации программы амплификации путем подбора праймеров с одинаковой температурой отжига.
Технический результат достигается тем, что осуществляют отбор биоматериала, выделение бактериальной ДНК, амплификацию фрагментов ДНК исследуемого штамма методом полимеразной цепной реакции с использованием уникального набора олигонуклеотидных праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности:
5'-TGG-CTG-CCG-CAC-TAT-TCG-CC-3',
5'-TAT-TGG-GAC-CAC-GCG-TGS-CG-3',
5'-ACG-CCG-GCC-TTA-ACA-GTG-GC-3',
которые обладают высокой специфичностью взаимодействия с фрагментами ДНК, причем продукты амплификации разделяют методом электрофореза в агарозном геле, а результаты ПЦР выявляют все три гена одновременно и учитывают визуализируя окрашиванием бромистым этидием; при этом при наличии в исследуемом биоматериале генов, детерминирующих адгезины, гемолизины, манноза-резистентные гемагглютинины у генитальных штаммов Escherichia coli, образуются фрагменты ДНК fim А размером - 248 п.о., hly А, В, С - 233 п.о., рар С - 251 п.о.
Изобретение иллюстрируется электрофореграммами ампликонов исследуемого штамма с маркерами молекулярного веса.
Результаты анализа представлены на фиг.1-3.
На фиг.1 приведена электрофореграмма продуктов амплификации, полученых при ПЦР-анализе фрагмента ДНК штамма Escherichia coli для гена fim А, где 1-10 - штаммы Escherichia coli, выделенные из клинического материала; 11 - маркер молекулярного веса.
На фиг.2 приведена электрофореграмма продуктов амплификации, полученных при ПЦР-анализе фрагмента ДНК Escherichia coli для гена hly А, В, С, где 1-10 - штаммы Escherichia coli, выделенные из клинического материала; 11 - маркер молекулярного веса.
На фиг.3 приведена электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК Escherichia coli для гена рар С, где 1-13 - штаммы Escherichia coli, выделенные из клинического материала; 14 - отрицательный контроль; 15 - маркер молекулярного веса.
Способ осуществляют следующим образом.
Отбор биоматериала (отделяемое влагалища, цервикального канала) осуществляют следующим образом. Влагалищное отделяемое забирают стерильной ложечкой Фолькмана из заднебоковых сводов влагалища при осмотре в зеркалах. Материал из цервикального канала, содержащий эпителиальные клетки, получают с помощью специального урогенитального зонда со щеточкой после предварительного удаления видимой слизи с шейки матки стерильным марлевым тампоном. Проводят культуральное исследование содержимого заднего и боковых сводов влагалища, и цервикального канала на энтеробактерии. Исследуемый биоматериал засевают на питательные среды Эндо или Левина. Посевы помещают в термостат на 24-48 часов при температуре 37°С. На среде Эндо лактозоположительные Escherichia coli растут в виде плоско-выпуклых колоний темно-красного цвета с металлическим блеском. На среде Левина колонии Escherichia coli темно-синие, с металлическим блеском, иногда розоватые. Лактозаотрицательные колонии бесцветны. После инкубации производят идентификацию на основании морфологических, тинкториальных (отрицательная окраска по Граму) свойств.
Далее проводят выделение бактериальной ДНК по стандартной методике с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК из биопроб - «Проба ГС» (набор №1).
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации в ПЦР фрагментов генов fim A, hly А, В, С, рар С, подобраны на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у штамма Escherichia coli, представленных в базе данных GenBank NCBI (CШA), EMBL (Европейская молекулярно-биологическая библиотека) и DDBJ (Японская база данных нуклеотидных последовательностей), а также в результате секвенирования аналогичного участка у штаммов, выделенных на территории Российской Федерации.
В результате выравнивания нуклеотидных последовательностей генов fim А, hly А, В, С, рар С Escherichia coli (GenBank NCBI: CP001509.1, CP000819.1, CP001665.1, AM946981.1; M10133.1, CP000247.1, AM690760.1; CP001509.1) и штаммов Escherichia coli, выделенных на территории Российской Федерации, была подобрана их консенсусная последовательность и получен уникальный набор олигонуклеотидных праймеров на гены fim А, hly А, В, С, рар С, обладающих высокой специфичностью взаимодействия с фрагментами ДНК:
Олигонуклеотиды праймеров и зонда были синтезированы амидофосфитным методом (ЗАО «Синтол», г. Москва; паспорт №3873).
Характеристика олигонуклеотидных праймеров к участкам fim А, hly А, В, С, рар С представлена в табл.1.
| Таблица 1 | |
| Параметр | Характеристика |
| Ген fim А | |
| Прямой праймер (f) 5'-3' | TGG-CTG-CCG-CAC-TAT-TCG-CC |
| Обратный праймер (r) 5'-3' | TGC-AAC-GGC-AGC-ATT-AGC-GG |
| Расчетная температура плавления прямого праймера | +60,0°С |
| Расчетная температура плавления обратного праймера | +60,0°С |
| Теоретическая специфичность | Все доступные для изучения штамма Е. coli |
| Длина амплифицируемого участка (п.о.) | 248 |
| Ген hly А, В, С | |
| Прямой праймер (f) 5'-3' | TAT-TGG-GAC-CAC-GCG-TGS-CG |
| Обратный праймер (r) 5'-3' | CGC-CAT-CTC-CGC-CGT-TCA-GG |
| Расчетная температура плавления прямого праймера | +60,0°С |
| Расчетная температура плавления обратного праймера | +60,0°С |
| Теоретическая специфичность | Все, доступные для изучения штаммы Е. coli |
| Длина амплифицируемого участка (п.о.) | 233 |
| Ген pap С | |
| Прямой праймер (f) 5'-3' | ACG-CCG-GCC-TTA-ACA-GTG-GC |
| Обратный праймер (r) 5'-3' | СA G-TCA-CCA-CGC-CCG-ТТС-СС |
| Расчетная температура плавления прямого праймера | +60,0°С |
| Расчетная температура плавления обратного праймера | +60,0°С |
| Теоретическая специфичность | Все доступные для изучения штаммы Е. coli |
| Длина амплифицируемого участка (п.о.) | 251 |
Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной технологии.
Подобраны оптимальные параметры реакции амплификации с олигонуклеотидными праймерами и зондом. В частности, реакционная смесь имеет следующий состав: 0,5 мМ трис-Cl буфера, рН 8.6; 0,5 М KCl; 15 мМ MgCl2; 2,5 мМ дезоксинуклеотидтрифосфаты; по 0,2 мМ прямой и обратный праймеры; Taq ДНК-полимераза - 50 мкл.
ПЦР может быть проведена, например, в приборе «Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Россия) с использованием программы, указанной в табл.2.
| Таблица 2 | ||||
| Для амплификаторов с активным регулированием (по раствору в пробирке): «Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Россия) | ||||
| № цикла | Шаг | Температура | Длительность | Количество повторов |
| 1 | 1 | 95°С | 5 мин | 1 |
| 2 | 1 | 95°С | 10 сек | |
| 2 | 60°С | 20 сек | 35 | |
| 3 | 72°С | 20 сек | ||
| 3 | 1 | 72°С | 2 мин | 1 |
Значения пороговых циклов определяются автоматически прибором.
Регистрацию результатов ПЦР осуществляют путем электрофореза продуктов амплификации на окрашенном бромистым этидием агарозном геле, для чего используют готовые агарозные гели, содержащие 2-3% агарозы и бромистого этидия. Анализ электрофореграмм проводят с помощью видеосистемы Gel Imager и программного обеспечения Gel Analyzer.
Результаты ПЦР определяют одновременно все три гена патогенности и учитывают визуализируя окрашиванием бромистым этидием ПЦР в ультрафиолетовом свете.
В случае положительной реакции на Escherichia coli в электрофорезе появляется фрагмент ДНК fim А размером 248 п.о., hly А, В, С - размером 233 п.о., рар С - размером 251 п.о. При внесении в реакцию ДНК других видов микроорганизмов специфических полос на том уровне, где расположена полоса маркера с соответствующей длиной амплифицируемого участка, в ходе проведения ПЦР не наблюдалось.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Для апробации предлагаемого способа использовали препараты тотальной ДНК, выделенной из клинических образцов биоматериала (отделяемое влагалища, цервикального канала), взятого у женщин репродуктивного возраста с различными воспалительными заболеваниями. Всего было подготовлено 13 образцов.
Выделение ДНК из 100,0 мкл подготовленного материала проводили с помощью набора №1. Предварительно проверяли однородность и прозрачность всех растворов. В лизирующем и промывочном растворе №1 допускается выпадение кристаллов, так как весь комплект реагентов хранится при 2-8°С. Перед началом работы кристаллы необходимо растворить нагреванием флаконов в течение 12-20 минут при 50°С.
Пробирки с пробами, содержащими анализируемый материал в 0,5 мл стерильного физиологического раствора, центрифугировали в течение 10 минут при 13000 об/мин для получения осадка. Супернатант удаляли с помощью колбы-ловушки, оставляя около 100 мкл над осадком.
Одновременно с выделением ДНК из биологического материала проводили подготовку отрицательного контрольного образца. Для этого в отдельную пластиковую пробирку объемом 1,5 мл вносили 100 мкл стерильного физиологического раствора.
Для обработки нескольких образцов с учетом отрицательного контроля смешивали в отдельной пробирке по 150 мкл на пробу лизирующего раствора и 20 мкл на пробу предварительно рассуспендированного сорбента. Затем добавляли по 170 мкл полученной смеси в каждую пробирку с образцом и в пробирку с отрицательным контролем и встряхивали все пробирки на вортексе в течение 3-5 сек для получения равномерной взвеси осадка с лизирующей смесью. После этого пробирки помещались в твердотельный термостат на 20 минут при 50°С.
После термостатирования пробирки центрифугировали в течение 1 минуты при 13000 об/мин. С помощью колбы-ловушки полностью удаляли надосадочную жидкость, стараясь не задеть при этом осадок. Затем добавляли к осадку по 200 мкл промывочного раствора №1, встряхивали пробирки на вортексе в течение 3-5 сек и центрифугировали в течение 1 мин при 13000 об/мин. После этого удаляли надосадочную жидкость из каждой пробирки, добавляли по 200 мкл промывочного раствора №2, интенсивно встряхивали пробирки на вортексе в течение 3-5 сек и центрифугировали в течение 1 минуты при 13000 об/мин.
После центрифугирования с помощью колбы-ловушки удаляли надосадочную жидкость и добавляли в каждую пробирку по 200 мкл промывочного раствора №3. Встряхивали пробирки на вортексе в течение 3-5 сек и центрифугировали в течение 1 минуты при 13000 об/мин. Удаляли надосадочную жидкость и термостатировали все пробирки с открытыми крышками в течение 5 минут при 50°С для подсушивания осадка.
После того как под визуальным контролем осадок становился сухим, добавляли по 100 мкл элюирующего раствора и встряхивали пробирки на вортексе в течение 5-10 сек.
После получения однородной взвеси термостатировали пробирки в течение 5 минут при 50°С.
По окончании инкубации пробирки центрифугировали в течение 1 минуты при 13000 об/мин. Если образец необходимо было длительно сохранить, то часть надосадочной жидкости, содержащей ДНК, отбиралась в новую пробирку с соответствующей маркировкой. Остальная часть была готова к внесению в реакционную смесь для амплификации.
Постановка реакции амплификации ДНК
Комплект реагентов для проведения реакции амплификации предварительно размораживался при комнатной температуре.
В штативе «рабочее место» располагали микропробирки объемом 0,5 мл и маркировали их в соответствии с протоколом исследования. Затем в отдельной пробирке из расчета на 1 пробу готовилась реакционная смесь.
В частности, реакционная смесь имеет следующий состав: 0,5 мМ трис-Cl буфера, рН 8.6; 0,5 М KCl; 15 мМ MgCl2; 2,5 мМ дезоксинуклеотидтрифосфаты; по 0,2 мМ прямой и обратный праймеры; Taq ДНК-полимераза - 50 мкл.
Сверху на реакционную смесь наносили по 1 капле минерального масла для предотвращения высыхания. Затем под слой масла вносили по 5 мкл раствора ДНК проб, подготовленных на этапе пробоподготовки. Сначала вносили отрицательный контрольный образец, а затем пробы в соответствии с протоколом. Подобраны оптимальные параметры реакции амплификации с олигонуклеотидными праймерами и зондом (табл.2).
После окончания реакции (в день проведения исследования или после хранения утром следующего дня) переставляли пробирки в штатив для детекционных пробирок и доставляли в помещение для анализа продуктов ПЦР, который проводился методом горизонтального электрофоретического разделения фрагментов ДНК в агарозном геле.
Электрофоретический анализ продуктов ПЦР
Содержимое пакета «Буфер трис-борат для электрофореза» (набора №3) помещалось в мерный цилиндр на 1000 мл, добавлялась дистиллированная вода в количестве 700 мл и тщательно перемешивалось до полного растворения. Затем общий объем буфера доводился до 1000 мл. Готовый буфер хранился в емкости с плотно закрывающейся крышкой при комнатной температуре и использовался в течение 1 недели.
После приготовления буфера готовили камеру для электрофореза к работе: заполняли ее буфером и помещали пластину с агарозным гелем между отсеками так, чтобы слой буфера покрывал пластину на 3-5 мм. Затем осторожно вносили в соответствующие лунки геля по 7,0 мкл продукта амплификации из каждой пробирки. В отдельную лунку вносили маркер молекулярного веса для определения размера амплификата. Затем на камеру устанавливали крышку, подсоединяли электроды и включали источник постоянного тока. Проводили электрофорез в направлении от катода (-) к аноду (+) в течение 15 минут при напряженности электрического поля 10-20 В/см (при ширине камеры 10 см напряжение составляет 200 В).
После окончания электрофореза отключали источник постоянного тока, снимали крышку с камеры, осторожно вынимали пластину с агарозным гелем и помещали ее на стекло трансиллюминатора.
Устанавливали защитный экран, включали трансиллюминатор и анализировали полученные результаты. Продукт амплификации был виден в ультрафиолетовом свете (длина волны 230-260 нм) в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета.
Для документирования гель регистрировали с помощью видеосистемы, соединенной с персональным компьютером, оснащенным соответствующей программой Gel Explorer. Учет результатов проводили согласно расчетным величинам длин продуктов амплификации генов fim А, hly А, В, С, рар С. С помощью программы Gel Analizer был проведен компьютерный анализ полученных электрофореграмм с целью более точной оценки размеров ампликонов с учетом калибровки по маркеру молекулярного веса. Все гены, детерминирующие факторы патогенности, fim А, hly А, В, С, рар С определяют одновременно.
Регистрацию результатов ПЦР осуществляют путем электрофоретического разделения продуктов амплификации на окрашенном бромистым этидием агарозном геле.
Определяют размеры образовавшихся фрагментов генов при помощи систем праймеров fim А, hly А, В, С, рар С. Они составляют 248 п.о., 233 п.о., 251 п.о., что соответствует размерам фрагментов генов у генитальных штаммов Escherichia coli. Положительными считаются пробы, содержащие специфическую полосу на том уровне, где расположена полоса маркера с соответствующей длиной амплифицируемого участка.
Таким образом, заявляемый способ позволяет быстро, эффективно и надежно выявлять гены, детерминирующие адгезины, гемолизины, манноза-резистентные гемагглютинины генитальных штаммов Escherichia coli при помощи систем праймеров fim A, hly А, В, С, рар С в образцах биологического материала.
Кроме того, определение указанных участков генов протекает в системе «мультиплекс», т.е. одновременно, что достигается за счет подбора праймеров с одинаковой температурой отжига 60°С и позволяет унифицировать программу амплификации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Johson J.R. Extended virulence genotypes of Escherichia coli strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny and host compromise // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol.181. - P.261-272.
2. Бондаренко B.M., Халиуллина СВ., Фиалкина С.В. и др. Маркеры уропатогенности Е. coli у детей с инфекцией мочеполовой системы // Детские инфекции. - №3. - 2004. - С.21-23.
3. Мавзютов А.Р., Фиалкина С.В., Бондаренко В.М. «Острова» патогенности условно-патогенных энтеробактерий // ЖМЭИ. - №6. - 2002. - С.5-9.
4. Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий // Журн. микробиол. - №4. - 2001. - С.67-74.
5. Красноперова Ю.Ю. Характеристика изменений патогенного потенциала микроорганизмов-симбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях: Монография. - Москва: Флинта. - 2010.
6. Патент РФ №2441879, опубл. 10.02.2012.
Claims (1)
- Способ выявления генов, детерминирующих адгезины, гемолизины, манноза-резистентные гемагглютинины у генитальных штаммов Escherichia coli, включающий отбор биоматериала, выделение бактериальной ДНК, амплификацию фрагментов ДНК исследуемого штамма методом ПЦР с использованием уникального набора олигонуклеотидных праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности:
5'-TGG-CTG-CCG-CAC-TAT-TCG-CC-3',
5'-TAT-TGG-GAC-CAC-GCG-TGS-CG-3',
5'-ACG-CCG-GCC-TTA-ACA-GTG-GC-3',
которые обладают высокой специфичностью взаимодействия с фрагментами ДНК, причем продукты амплификации разделяют методом электрофореза в агарозном геле, а результаты ПЦР определяют одновременно все три гена и которые учитывают визуализируя окрашиванием бромистым этидием; при этом при наличии в исследуемом биоматериале у генитальных штаммов Escherichia coli генов, детерминирующих адгезины, гемолизины, манноза-резистентные гемагглютинины, образуются фрагменты ДНК fim А размером - 248 п.о., hly А,В,С - 233 п.о., рар С - 251 п.о.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012117652/10A RU2483114C1 (ru) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ, ДЕТЕРМИНИРУЮЩИХ АДГЕЗИНЫ, ГЕМОЛИЗИНЫ, МАННОЗА-РЕЗИСТЕНТНЫЕ ГЕМАГГЛЮТИНИНЫ У ГЕНИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ Escherichia coli |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012117652/10A RU2483114C1 (ru) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ, ДЕТЕРМИНИРУЮЩИХ АДГЕЗИНЫ, ГЕМОЛИЗИНЫ, МАННОЗА-РЕЗИСТЕНТНЫЕ ГЕМАГГЛЮТИНИНЫ У ГЕНИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ Escherichia coli |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2483114C1 true RU2483114C1 (ru) | 2013-05-27 |
Family
ID=48791901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012117652/10A RU2483114C1 (ru) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ, ДЕТЕРМИНИРУЮЩИХ АДГЕЗИНЫ, ГЕМОЛИЗИНЫ, МАННОЗА-РЕЗИСТЕНТНЫЕ ГЕМАГГЛЮТИНИНЫ У ГЕНИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ Escherichia coli |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2483114C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6455323B1 (en) * | 1997-07-03 | 2002-09-24 | Pharmacia & Upjohn Company | Anti-bacterial methods and materials |
| US7424370B2 (en) * | 2004-02-06 | 2008-09-09 | Council Of Scientific And Industrial Research | Computational method for identifying adhesin and adhesin-like proteins of therapeutic potential |
| US20090180987A1 (en) * | 2006-07-11 | 2009-07-16 | Jochen Harald Stritzker | Methods and compositions for detection of microorganisms and cells and treatment of diseases and disorders |
-
2012
- 2012-04-27 RU RU2012117652/10A patent/RU2483114C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6455323B1 (en) * | 1997-07-03 | 2002-09-24 | Pharmacia & Upjohn Company | Anti-bacterial methods and materials |
| US7424370B2 (en) * | 2004-02-06 | 2008-09-09 | Council Of Scientific And Industrial Research | Computational method for identifying adhesin and adhesin-like proteins of therapeutic potential |
| US20090180987A1 (en) * | 2006-07-11 | 2009-07-16 | Jochen Harald Stritzker | Methods and compositions for detection of microorganisms and cells and treatment of diseases and disorders |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Relationship of biofilm formation and gelE gene expression in Enterococcus faecalis recovered from root canals in patients requiring endodontic retreatment | |
| Al-Tekreeti et al. | Molecular identification of clinical Candida isolates by simple and randomly amplified polymorphic DNA-PCR | |
| KR20100044736A (ko) | 눈과 중앙 신경조직의 세균성, 균성, 기생성 및 바이러스성 감염을 동시에 검출 및 판별하기 위한 신규한 방법 | |
| EP0336412A2 (en) | Synthetic oligonucleotides useful for the determination of Chlamydia trachomatis in a biological sample | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| RU2360972C1 (ru) | Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления | |
| KR20080020475A (ko) | 다중-중합효소연쇄반응에 의한 성전파질환 원인균 검출을위한 신규한 유형 특이적 프라이머와 이를 이용한 검출방법 | |
| US7381547B2 (en) | Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR | |
| US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| KR20120117098A (ko) | 마이코플라즈마 하이오뉴모니에를 검출하기 위한 프라이머, 상기 프라이머를 이용한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 검출키트 및 방법, 및 상기 프라이머를 이용한 돼지 유행성 폐렴 진단키트 및 방법 | |
| CN109706257B (zh) | 一种快速检测奶牛子宫内膜炎中病原菌的方法 | |
| Jung et al. | In-situ hybridization for the detection of Haemophilus parasuis in naturally infected pigs | |
| CN105969765A (zh) | 金黄色葡萄球菌基因组dna快速提取试剂盒及提取方法 | |
| Yamazaki et al. | Distribution of Chlamydia trachomatis serovars among female prostitutes and non-prostitutes in Thailand, and non-prostitutes in Japan during the mid-90s | |
| US11649513B2 (en) | Kit for detecting silent sexually transmitted diseases (SSTDS) in a urine sample | |
| CN101586157A (zh) | 一种鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒及检测方法 | |
| RU2483114C1 (ru) | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ, ДЕТЕРМИНИРУЮЩИХ АДГЕЗИНЫ, ГЕМОЛИЗИНЫ, МАННОЗА-РЕЗИСТЕНТНЫЕ ГЕМАГГЛЮТИНИНЫ У ГЕНИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ Escherichia coli | |
| KR101279395B1 (ko) | 마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 하이오라이니스 검출키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용한 돼지 유행성 폐렴 진단키트 | |
| US20240382458A1 (en) | Method for detecting bacteria of genus fusobacterium in order to diagnose endometriosis | |
| KR101742016B1 (ko) | 클라미디아 트라코마티스 및/또는 나이세리아 고노로이에 탐지용 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트 | |
| SALEHI et al. | Isolation of Brucella abortus using PCR-RFLP analysis | |
| Al-Talib et al. | A quadriplex PCR assay for rapid detection of diarrhoea-causing parasitic protozoa from spiked stool samples. | |
| RU2289627C2 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК БАКТЕРИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЛАЙМСКОГО БОРРЕЛИОЗА-Borrelia burgdorferi | |
| Kaliamoorthy et al. | Exploring the presence of Treponema Denticola in oral squamous cell carcinoma | |
| Liu et al. | Development of a cyclic voltammetry method for the detection of Clostridium novyi in black |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160428 |