RU2481113C2 - Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 - Google Patents
Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2481113C2 RU2481113C2 RU2011126310/10A RU2011126310A RU2481113C2 RU 2481113 C2 RU2481113 C2 RU 2481113C2 RU 2011126310/10 A RU2011126310/10 A RU 2011126310/10A RU 2011126310 A RU2011126310 A RU 2011126310A RU 2481113 C2 RU2481113 C2 RU 2481113C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- molecular weight
- substance
- substances
- chromatography
- proliferation
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 45
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 title abstract description 3
- 230000000431 effect on proliferation Effects 0.000 title abstract 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 30
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 18
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 abstract description 2
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 11
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 10
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 10
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000000686 immunotropic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способа получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431. Описанный способ включает измельчение, гомогенизацию кожи, термоденатурацию супернатанта, охлаждение смеси, центрифугирование денатурированного материала, обработку охлажденным ацетоном, отмывку выпавшего осадка, высушивание, растворение осадка в 0,005-0,015 М растворе трис-НСl+0,15 М NaCl и центрифугирование с последующей хроматографией на колонке с сефадексом G-50 и сбором вещества целевого продукта с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливанием и лиофилизацией, при этом при хроматографии одновременно с веществом с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да собирают вещество с молекулярной массой более 15000 Да, рехроматографируют вещество с молекулярной массой более 15000 Да на колонке с сефадексом G-50 и после рехроматографии собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да и второе с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, оба вещества обессоливают и лиофилизируют и вещество с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, полученное после рехроматографии, объединяют с веществом с той же молекулярной массой, полученным после первой хроматографии. Представленное изобретение может быть использовано при получении препаратов для лечения заболеваний кожи, а также средств иммунокоррекции. 2 ил., 4 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, биологии, фармакологии, иммунологии, медицинской биотехнологии и фармацевтической промышленности и может найти применение при получении препаратов для лечения заболеваний кожи, а также средств иммунокоррекции.
Известен способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи (1). Вещества, полученные этим способом, влияют как на В-, так и на Т-системы иммунитета. Помимо этого, они ингибируют пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 (2). Однако этот способ сложен. Активность веществ небольшая.
В качестве прототипа взят наиболее близкий к настоящему изобретению способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека (3), путем измельчения кожи, гомогенизации в растворе хлористого натрия, центрифугирования, термоденатурации, центрифугирования, обработки охлажденным ацетоном, высушивания при комнатной температуре, хроматографии на колонке с сефадексом G-50, обессоливания и лиофилизации. Однако применяя этот метод, получают только вещество с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, влияющее на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека и обладающее иммунотропными свойствами (4). Выход вещества небольшой.
Цель изобретения - получение двух активных веществ: одного с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да и другого с молекулрной массой более 15000 Да, с одновременным существенным увеличением выхода вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да и увеличением активности обоих получаемых веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431.
Эта цель достигается тем, что в способ, взятый в качестве прототипа, на последней стадии вводится этап рехроматографии на том же сефадексе. До стадии рехроматографии этапы методов совпадают: кожу свиньи измельчают, гомогенизируют в растворе хлористого натрия, центрифугируют, подвергают термоденатурации при 75-85°С в течение 10-20 мин, центрифугируют при 5000-15000 g в течение 10-30 мин, обрабатывают охлажденным до -20°С (или ниже) ацетоном в соотношении 1:6-1:8, высушивают осадок при комнатной температуре, растворяют в 0,005-0,015 М растворе трис-HCl+0,15 М NaCl, pH 6,0-8,0; хроматографируют на колонке с сефадексом G-50. Далее вводятся следующие этапы: собирают не одно, а два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да и другое с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют. Затем вводится этап рехроматографии: вещество с молекулярной массой более 15000 Да рехроматографируют на колонке с сефадексом G-50 в 0,005-0,015 М растворе трис-HCl+0,15 М NaCl, pH 6,0-8,0, собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да и второе с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют. Вещество с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, полученное после рехроматографии, объединяют с тем же веществом, полученным после первой хроматографии.
Температура термоденатурации (75-85°С) и время термоденатурации подобраны таким образом, что нужное вещество остается в растворе, в то время как часть неактивного материала денатурирует. Центрифугирование при 5000-15000 g течение 10-30 мин подобрано так, что в течение этого времени денатурированные белки удаляются. При центрифугировании ниже 5000 g и менее 10 мин часть денатурированного неактивного материала остается в супернатанте, что загрязняет препарат. Увеличивать скорость центрифугирования более 15000 g и время более 30 мин не имеет смысла, так как при этих условиях денатурированный материал полностью осаждается. Применение ацетона с температурой выше -20°С приводит к денатурации активного материала. Снижение соотношения супернатант:ацетон ниже 1:6 приводит к потере активного вещества. Увеличение соотношения выше 1:8 приводит к выпадению в осадок неактивного материала. Выбор концентрации буфера (0,005-0,015 М) и его рН (6,0-8,0) обусловлен тем, что в нем не происходит потери активности получаемого вещества, в то же время препарат хорошо разделяется по молекулярным массам на сефадексе G-50. Хлористый натрий до концентрации 0,15 М добавляют к буферу для того, чтобы можно было определять активность веществ в пробах сразу после разделения на сефадексе.
Влияние веществ на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 в культуре определяли флуоресцентным методом. Выращивали линию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 на среде DMEM с сывороткой эмбрионов коров и стандартным набором антибиотиков в стандартных условиях (5). Определение количества клеток в процессе культивирования проводили в камере Горяева по стандартной методике с красителем трипановым синим для одновременного подсчета процента жизнеспособных клеток. Аликвоты суспензии клеток разливали в 24-луночный планшет с покровными стеклами по 300 мкл в лунку. Клетки инкубировали в течение 7 часов для полного прикрепления к поверхности стекла. Лиофилизированные вещества растворяли в среде DMEM и добавляли в лунки с клетками до конечной концентрации 100 мкг/мл. В контрольные образцы добавляли аликвоту среды DMEM без веществ. Инкубировали клетки с фракциями в течение 48 часов. Стекла с клетками дважды отмывали PBS и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 16 часов. Окраску осуществляли йодидом пропидия. Съемку образцов проводили на конфокальном флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse E800. Определяли количество клеток в образцах в программе ImageJ. В контроле проанализировано 4 образца, в каждом опыте - по 2 образца. В каждом образце оценено в среднем около 3 тысяч клеток. Рассчитывали среднее значение количества клеток в опытных пробах и контрольных пробах. Результаты выражали как процент выросших клеток по отношению к контролю по формуле
где А - процент выросших клеток по отношению к контролю;
Ко - средняя арифметическая количества клеток в присутствии вещества (опыт);
Кк - средняя арифметическая количества клеток в отсутствии вещества (контроль).
Для вещества с молекулярной массой более 15000 Да рассчитывали процент ингибирования пролиферации по формуле:
Б=100-А
где Б - процент ингибирования пролиферации;
А - процент выросших клеток по отношению к контролю.
В табл.1 представлено сравнение влияния вещества с молекулярной массой более 15000 Да, полученного по прототипу и заявляемому способу, на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431. Как видно из этих данных, вещество с молекулярной массой более 15000 Да, получаемое по прототипу, ингибирует пролиферацию на 39%, в то время как вещество, получаемое по заявляемому способу, ингибирует пролиферацию на 49%.
Таким образом, заявляемый способ позволяет увеличить активность вещества с молекулярной массой более 15000 Да на 10%.
В табл.2 представлены выход и активность вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, полученного по прототипу и заявляемому способу. Как видно из представленных данных, вес вещества, получаемого по прототипу, составляет 18 мг, в то время как вес вещества, получаемого по заявляемому способу, составляет 26 мг, при этом активность вещества увеличилась на 8%.
Таким образом, введение этапа рехроматографии позволило увеличить выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да в 1,4 раза, при этом активность вещества увеличилась на 8%. Суммируя результаты, можно сказать, что заявляемый способ позволяет увеличить выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да в 1,4 раза и увеличить активность обоих веществ.
Было определено содержание белка по методу Лоури (6) и биуретовым методом (7), углеводов с антроновым реактивом (8) и РНК по методу Шмидта и Таннгаузера (9) в веществе №1 (В1) с молекулярной массой более 15 кДа и веществе №2 (В2) с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученных по прототипу и заявляемому способу. Данные представлены в табл.3 и 4.
Как видно из данных, представленных в табл.3, содержание белка, определенного как методом Лоури, так и биуретовым методом, содержание углеводов и РНК в веществе №1 с молекулярной массой более 15 кДа, полученном как по прототипу, так и по заявляемому способу, достоверно не отличается между собой (Р<0,95 для всех веществ).
Как видно из данных, представленных в табл.4, содержание белка, определяемого как методом Лоури, так и биуретовым методом, содержание углеводов и РНК в веществе №2 с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученном как по прототипу, так и по заявляемому способу, достоверно не отличается между собой (Р<0,95 для всех веществ).
Вещества анализировались методом вертикального двуступенчатого электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) по Лэммли (10). После проведения электрофореза гель окрашивался красителем Кумасси голубым R-350 на белок. Данные представлены на рис.1 и рис.2.
Как видно из данных, представленных на рис.1, после ДСН-электрофореза в 6-15% ПААГ и окраски на белок в веществе №1 с молекулярной массой более 15 кДа, полученном как по прототипу (В1П), так и по заявляемому методу (В1З), выявляется один мажорный белок с молекулярной массой 58 кДа и до 8 минорных белков с м.м. от 20 до 200 кДа.
Как видно из данных, представленных на рис.2, после ДСН-электрофореза в 6-20% ПААГ и окраски на белок в веществе №2 с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученном как по прототипу (В2П), так и по заявляемому методу (В2З), выявляются пять мажорных белков с м.м. 6,9; 8,4; 11; 12 и 61 кДа и до 7 минорных белков с м.м. от 14 до 130 кДа.
Таким образом, можно заключить, что вещества №1 с молекулярной массой более 15 кДа, полученные как по прототипу, так и по заявляемому способу, не отличаются между собой по содержанию белка, углеводов, РНК и по данным ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле. Однако, как следует из результатов изобретения, вещество №1, полученное по заявляемому способу, ингибирует пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 на 49%, что на 10% больше по сравнению с прототипом.
Вещества №2 с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученные как по прототипу, так и по заявляемому способу, также не отличаются между собой по содержанию белка, углеводов, РНК и по данным ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле. Однако, как следует из результатов изобретения, под действием вещества №2, полученного по заявляемому способу, процент выросших клеток составляет 178%, что на 8% больше по сравнению с прототипом. Кроме того, выход вещества №2 составляет 26 мг. Это в 1,4 раза больше по сравнению с прототипом.
Пример 1 (прототип)
Кожу свиньи измельчают ножницами и гомогенизируют в 0,14 М растворе NaCl pH 7,0 при 4°С (1094 Homogenizer, Tecator, Sweden). На 120 г кожи берут 720 мл 0,14 М раствора NaCl (соотношение вес кожи:объем раствора - 1:6). Гомогенат центрифугируют при 2500g в течение 30 мин при 4°С (центрифуга J-6M/E, ротор 4.2, Beckman, Великобритания). Осадок отбрасывают, а супернатант в объеме 710 мл подвергают термоденатурации при 75°С в течение 20 мин на водяной бане при постоянном перемешивании, смесь охлаждают до 4°С. Денатурированный материал осаждают центрифугированием при 10000g в течение 20 мин при +4°С (центрифуга J2-21М, ротор JA-14, Beckman, США), а супернатант в объме 700 мл прикапывают к ацетону, охлажденному до -20°С. Выпавший осадок отмывают ацетоном путем центрифугирования при 2500g в течение 15 мин при 4°С и высушивают под тягой при комнатной температуре. В результате получают 300 мг порошка (300±30 мг), который растворяют в 30 мл 0,01 М раствора трис-HCl буфера + 0,15 М NaCl рН 8,0 при комнатной температуре. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием при 4000g в течение 30 мин при 4°С, а супернатант наносят на колонку 2,5×80 см с Сефадексом G-50, уравновешенную тем же буфером. Собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да, а другое с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют.
Вещество с молекулярной массой более 15000 Да ингибирует пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 на 39% (табл.1). Выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да составляет 18 мг, процент выросших клеток составляет 170% (табл.2).
Пример 2 (по предлагаемому методу)
Кожу свиньи измельчают ножницами и и гомогенизируют в 0,14 М растворе NaCl рН 7,0 при 4°С (1094 Homogenizer, Tecator, Sweden). На 120 г кожи берут 720 мл 0,14 М раствора NaCl (соотношение вес кожи:объем раствора - 1:6). Гомогенат центрифугируют при 2500g в течение 30 мин при 4°С (центрифуга J-6M/E, ротор 4.2, Beckman, Великобритания). Осадок отбрасывают, а супернатант в объеме 710 мл подвергают термоденатурации при 75°С в течение 20 мин на водяной бане при постоянном перемешивании, смесь охлаждают до 4°С. Денатурированный материал осаждают центрифугированием при 10000g в течение 20 мин при +4°С (центрифуга J2-21М, ротор JA-14, Beckman, США), а супернатант в объеме 700 мл прикапывают к ацетону, охлажденному до -20°С. Выпавший осадок отмывают ацетоном путем центрифугирования при 2500g в течение 15 мин при 4°С и высушивают под тягой при комнатной температуре. В результате получают 300 мг порошка (300±30 мг), который растворяют в 30 мл 0,01 М раствора трис-HCl буфера +0,15 М NaCl pH 8,0 при комнатной температуре. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием при 4000g в течение 30 мин при 4°С, а супернатант наносят на колонку 2,5×80 см с Сефадексом G-50, уравновешенную тем же буфером. Собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да, а другое с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют.
Затем вещество с молекулярной массой более 15000 Да растворяют в 30 мл 0,01 М раствора трис-HCl буфера +0,15 М NaCl pH 8,0 при комнатной температуре и наносят на колонку 2,5×80 см с Сефадексом G-50, уравновешенную тем же буфером. Собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да, а другое с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливают и лиофилизируют. Вещество с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да объединяют с веществом с той же молекулярной массой, полученным после первой хроматографии.
Вещество с молекулярной массой более 15000 Да ингибирует пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 на 49%. Это на 10% больше по сравнению с прототипом (табл.1). Выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да составляет 26 мг. Это в 1,4 раза больше по сравнению с прототипом. Процент выросших клеток составляет 178%, это на 8% больше по сравнению с прототипом (табл.2).
| Таблица 1 | ||
| Влияние вещества с молекулярной массой более 15000 Да на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 | ||
| % выросших клеток (М±m) | % ингибирования пролиферации | |
| Прототип | 61±5,1 | 39 |
| Заявляемый метод | 51±4,2 | 49 |
| М - средняя арифметическая; m - стандартная ошибка средней арифметической | ||
| Таблица 2 | ||
| Выход вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да и его влияние на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 | ||
| Вес вещества в мг (М±m) | % выросших клеток (M±m) | |
| Прототип | 18±4,2 | 170±4,2 |
| Заявляемый метод | 26±7,4 | 178±5,5 |
| M - средняя арифметическая; m - стандартная ошибка средней арифметической | ||
| Таблица 3 | ||
| Процентное содержание белка, углеводов и РНК в веществе №1 (В1) с молекулярной массой более 15 кДа, полученном по прототипу и заявляемому способу (М±m) | ||
| % (М±m) | ||
| Прототип | Заявляемый способ | |
| Белок (метод Лоури) | 91±2,9 | 93±4,1 |
| Белок (биуретовый метод) | 87±7,3 | 89±6,8 |
| Углеводы | 0,74±0,30 | 0,81±0,42 |
| РНК | 2,0±0,4 | 2,2±0,5 |
| М - средняя арифметическая; m - стандартная ошибка средней арифметической | ||
| Таблица 4 | ||
| Процентное содержание белка, углеводов и РНК в веществе №2 (В2) с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа, полученном по прототипу и заявляемому способу (М±m) | ||
| % (М±m) | ||
| Прототип | Заявляемый способ | |
| Белок (метод Лоури) | 51±3,2 | 53±5,3 |
| Белок (биуретовый метод) | 56±6,0 | 55±7,2 |
| Углеводы | 8,0±1,4 | 8,3±1,7 |
| РНК | 5,4±1,0 | 5,1±1,8 |
| М - средняя арифметическая; m - стандартная ошибка средней арифметической | ||
Литература
1. Белова О.В., Арион В.Я., Зимина И.В., Сысоева О.Б., Луканидина Т.А. Способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи. Патент №2203070. Зарегистрирован 27.04.2003 г. БИ №12, 2003.
2. Белова О.В., Арион В.Я., Орлова В.Ф., Лопухин Ю.М., Капитанов А.Б., Короткова М.Н., Бондарева Е.В. Иммунотропные препараты из кожи влияют на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы А431. Иммунопатология аллергол. инфектол. 2003, №1, с.28-32.
3. Арион В.Я., Белова О.В., Орлова В.Ф., Капитанов А.Б., Лопухин Ю.М. Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека. Патент №2038087. Зарегистрирован 27.06.1995. БИ №18. С.24, 1995.
4. Арион В.Я., Белова О.В., Луканидина Т.А., Сысоева О.Б.,. Дворцова В.В., Бреусов Ю.Н. Иммунологические свойства препаратов из кожи. // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2000. - Т.129. - №2. - С.194-197.
5. Beretta GL, Gatti L, Tinelli S, Corna E, Colangelo D, Zunino F, Perego P. Cellular pharmacology of cisplatin in relation to the expression of human copper transporter CTR1 in different pairs of cisplatin-sensitive and -resistant cells. Biochem Pharmacol. 2004 Jul 15; 68(2):283-91.
6. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951. - Vol.193. - P.265-275.
7. Gornall A.C., Bardawill C.J., David M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. Biol. Chem. - 1949. - Vol.177. - P.751-766.
8. Seifter S. A method for the detection of carbo-hydrates by the anthrone reagent. Arch. Biochem. 1950. - Vol.25. - P.191-193.
9. Schmidt G., Tannhauser S.J. A method for the detection of desoxyribonucleic acid, ribonucleic acid and phosphoproteins in animal tissues. J. Biol. Chem. 1945. - Vol.161. - P.83-89.
10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; Vol.227: 680-5.
Claims (1)
- Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431, включающий измельчение, гомогенизацию кожи в растворе хлористого натрия, ценгрифугирование, термоденатурацию сунернатанта при 75-85°С в течение 10-20 мин, охлаждение смеси до 4°С, центрифугирование денатурированного материала при 5000-15000 g в течение 10-30 мин, обработку охлажденным до -20°С или ниже ацетоном в соотношении 1:6-1:8, отмывку выпавшего осадка охлажденным ацетоном, высушивание при комнатной температуре, растворение осадка в 0,005-0,015 М растворе трис-НСl+0,15 М NaCl, pH 6,0-8,0 и центрифугирование, с последующей хроматографией на колонке с сефадексом G-50 и сбором вещества целевого продукта с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, обессоливанием и лиофилизацией, отличающийся тем, что при хроматографии на колонке с сефадексом G-50 одновременно с веществом с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да собирают вещество с молекулярной массой более 15000 Да, рехроматографируют вещество с молекулярной массой более 15000 Да на колонке с сефадексом G-50, после рехроматографии собирают два вещества: одно с молекулярной массой более 15000 Да и второе - с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, оба вещества обессоливают и лиофилизируют и вещество с молекулярной массой от 1400 до 15000 Да, полученное после рехроматографии, объединяют с веществом с той же молекулярной массой, полученным после первой хроматографии.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011126310/10A RU2481113C2 (ru) | 2011-06-28 | 2011-06-28 | Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011126310/10A RU2481113C2 (ru) | 2011-06-28 | 2011-06-28 | Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011126310A RU2011126310A (ru) | 2013-01-10 |
| RU2481113C2 true RU2481113C2 (ru) | 2013-05-10 |
Family
ID=48789646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011126310/10A RU2481113C2 (ru) | 2011-06-28 | 2011-06-28 | Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2481113C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022169383A1 (ru) * | 2021-02-04 | 2022-08-11 | ГОРДЕЙЧУК, Владимир Евгеньевич | Способ выделения микровезикул из растений семейства амарантовых |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2038087C1 (ru) * | 1992-07-29 | 1995-06-27 | Арион Виталий Яковлевич | Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека |
| RU2326944C2 (ru) * | 2006-08-14 | 2008-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора | Способ получения и препарат аналога рекомбинантного интерферона гамма человека |
| US20100240605A1 (en) * | 2007-07-27 | 2010-09-23 | Katholieke Universiteit Leuven K.U. Leuven R&D | Novel immunotherapy strategy |
-
2011
- 2011-06-28 RU RU2011126310/10A patent/RU2481113C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2038087C1 (ru) * | 1992-07-29 | 1995-06-27 | Арион Виталий Яковлевич | Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека |
| RU2326944C2 (ru) * | 2006-08-14 | 2008-06-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора | Способ получения и препарат аналога рекомбинантного интерферона гамма человека |
| US20100240605A1 (en) * | 2007-07-27 | 2010-09-23 | Katholieke Universiteit Leuven K.U. Leuven R&D | Novel immunotherapy strategy |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022169383A1 (ru) * | 2021-02-04 | 2022-08-11 | ГОРДЕЙЧУК, Владимир Евгеньевич | Способ выделения микровезикул из растений семейства амарантовых |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011126310A (ru) | 2013-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hall et al. | Insights into blood feeding by schistosomes from a proteomic analysis of worm vomitus | |
| AU2001270540B2 (en) | Cosmetic composition comprising human serum albumin obtained from transgenic non-human animals | |
| US20070010430A1 (en) | Proteoglycan isolated from cartilaginous fish and process for producing the same | |
| EP1240202A2 (en) | Inhibitors of complement activation, their preparation and use | |
| Russell et al. | Identification, cloning and tissue localization of a rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) intelectin-like protein that binds bacteria and chitin | |
| RU2481113C2 (ru) | Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 | |
| AU2019250651B2 (en) | Immunological extract and method of production | |
| RU2132688C1 (ru) | Способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей | |
| Smith et al. | The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. VI: an extracellular immunising aggressin isolated from exudates of infected guinea-pigs | |
| RU2041715C1 (ru) | Биологически активное средство, способ его получения, препарат, содержащий указанное средство, и способ использования препарата | |
| CA2328134A1 (en) | The induction of antibiotic proteins and peptides by lait/scd14-protein | |
| CN109419789B (zh) | 治疗和/或预防免疫紊乱疾病的化合物及其应用 | |
| Huntley et al. | Quantitative recovery of isolated mucosal mast cells and globule leucocytes from parasitised sheep | |
| CN106879884B (zh) | 一种提高蜂王浆性能的方法 | |
| JP2013247927A (ja) | 米糠由来の細胞増殖促進剤 | |
| Yugis et al. | Comparison of methods for the purification of goat lactoferrin and antiviral activity to human papillomavirus | |
| JP2892300B2 (ja) | Ｈｓｐ４７合成抑制剤 | |
| Wen et al. | Characterization of the trehalase function of Haemonchus contortus and its immunomodulatory effect on host PBMCs | |
| WO2007111534A1 (en) | Method for producing an interleukin-2 preparation and the thus obtainable preparation | |
| Seyedian et al. | An in vitro Comparative study upon the Hemolytic, Thrombogenic, Coagulation parameters and Stability properties of the Hemiscorpiuslepturus Venom | |
| CN106822864A (zh) | 一种抑制前蛋白转化酶枯草溶菌素9表达的方法 | |
| EP1970381B1 (en) | Anti-cancer immune-modulating agent | |
| Popova et al. | Technological aspects of deproteinized calf blood hemoderivative preparation | |
| RU2038087C1 (ru) | Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека | |
| RU2295963C1 (ru) | Способ получения иммуностимулятора |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160629 |