RU2480525C2 - METHOD FOR FLUORESCENT LABELLING OF cDNA VIRUS OF FLU, TYPE A - Google Patents
METHOD FOR FLUORESCENT LABELLING OF cDNA VIRUS OF FLU, TYPE A Download PDFInfo
- Publication number
- RU2480525C2 RU2480525C2 RU2011129731/10A RU2011129731A RU2480525C2 RU 2480525 C2 RU2480525 C2 RU 2480525C2 RU 2011129731/10 A RU2011129731/10 A RU 2011129731/10A RU 2011129731 A RU2011129731 A RU 2011129731A RU 2480525 C2 RU2480525 C2 RU 2480525C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cdna
- virus
- reaction
- influenza
- pcr
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 12
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims description 17
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 title claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 9
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 4
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 4
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 claims 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 abstract 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 19
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 18
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 17
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 17
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 17
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101900159346 Influenza A virus Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и вирусологии и касается способа флуоресцентного мечения вирусной кДНК всех возможных подтипов вируса гриппа типа А с помощью единственной пары универсальных праймеров, в процессе реакции мультисегментной обратной транскрипции, совмещенной с реакцией амплификации, ПЦР (М-ОТ-ПЦР).The invention relates to the field of molecular biology and virology and relates to a method for fluorescence labeling of viral cDNA of all possible subtypes of type A influenza virus using a single pair of universal primers, in the course of a multi-segment reverse transcription reaction combined with an amplification reaction, PCR (M-RT-PCR).
Вирусы гриппа типа А (ВГА) относятся к важным респираторным патогенам человека и животных, вызывающим как сезонные вспышки гриппа, так и периодические мировые пандемии (Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci., 2001) [1]. ВГА отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). На основе комбинации вариантов (подтипов) гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) определяется подтип вируса гриппа А. В настоящее время описано 16 подтипов НА и 9 подтипов NA. В популяции человека в основном циркулирует только 3 подтипа НА (H1, H2, Н3) и 2 подтипа NA (N1, N2), однако в последнее время все чаще выявляют случаи инфицирования людей новыми высокопатогенными штаммами ВГА, такими как H5N1, H7N7 и H9N2. Кроме того, реассортация вирусных сегментов может приводить к появлению совершенно новых вирусных вариантов, таких как, например, vH1N1 в 2009 году. Этим обусловлена постоянная необходимость в усовершенствовании методов быстрой диагностики существующих, а также появляющихся новых, подтипов ВГА для эффективного глобального надзора за гриппом. В настоящее время наиболее часто используемыми методами диагностики вируса гриппа являются ПЦР методы (методы на основе полимеразной цепной реакции): метод ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и метод ОТ-ПЦР в режиме реального времени. В общем, ПЦР методы остаются основным диагностическим инструментом вследствие несложной постановки и надежности, но используемые в настоящее время методы субтипирования ВГА на основе ПЦР в основном являются узко специфическими и не дают информацию о других подтипах ВГА. В связи с этим в последние годы появился целый ряд работ по субтипированию ВГА на основе 16 подтипов НА и 9 подтипов NA ВГА с использованием диагностических биочипов. Технология биочипов показала хорошие результаты в области идентификации и типирования вирусов: биочипы позволяют одновременно выявлять большое количество нуклеотидных последовательностей. Основная проблема в использовании технологии биочипов связана с выбором метода получения меченой вирусной кДНК: для создания диагностического биочипа, позволяющего идентификацию и субтипирование всех известных на данный момент подтипов ВГА, необходима, в том числе, разработка унифицированного метода мечения кДНК генома любого из известных подтипов ВГА. В большинстве случаев для мечения используется флуоресцентная метка (Journal of Microbiological Methods, 2006) [2] или биотин (J Clin Microbiol. 2004; JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 2009) [3, 4]. Это могут быть нуклеотиды, конъюгированные с меткой (например, флуоресцентным красителем, частицами золота, биотином и т.д.), которые встраиваются в ДНК последовательность, например, в процессе амплификации, или же метка может ковалентно связываться непосредственно с ДНК последовательностью химическими методами. Помимо флуоресцентных меток иногда используются радиоактивные метки. Так, встраивание 33Р или 35S-меченных нуклеотидов в кДНК проходит более эффективно и обеспечивает большую чувствительность, чем флуоресцентные метки. Однако методические сложности работы с радиоактивным материалом сильно ограничивают применимость таких методик (Microarray analysis Handbook) [5].Type A influenza viruses (HAV) are important respiratory pathogens in humans and animals that cause both seasonal outbreaks of the flu and periodic global pandemics (Philos Trans R Soc Lond In Biol Sci., 2001) [1]. HAV is characterized by a high degree of variability, especially for the surface glycoproteins of the virion: hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). Based on the combination of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) variants (subtypes), influenza A virus subtype is determined. Currently, 16 subtypes of HA and 9 subtypes of NA are described. In the human population, mainly only 3 subtypes of HA (H1, H2, H3) and 2 subtypes of NA (N1, N2) circulate, however, recently cases of infection of people with new highly pathogenic strains of the HAV, such as H5N1, H7N7 and H9N2, have been increasingly detected. In addition, reassortment of viral segments can lead to the emergence of completely new viral variants, such as, for example, vH1N1 in 2009. This necessitates the continuous improvement of methods for the rapid diagnosis of existing, as well as emerging new, subtypes of HAV for effective global influenza surveillance. Currently, the most commonly used methods for diagnosing the influenza virus are PCR methods (methods based on the polymerase chain reaction): PCR method with reverse transcription (RT-PCR) and RT-PCR in real time. In general, PCR methods remain the main diagnostic tool due to their simple formulation and reliability, but currently used methods for subtyping HAV based on PCR are mainly narrowly specific and do not provide information about other subtypes of HAV. In this regard, in recent years, a number of studies have been published on the subtyping of CAA based on 16 subtypes of HA and 9 subtypes of NA CAA using diagnostic biochips. Biochip technology has shown good results in the field of identification and typing of viruses: biochips can simultaneously detect a large number of nucleotide sequences. The main problem in using biochip technology is related to the choice of a method for producing labeled viral cDNA: to create a diagnostic biochip that allows the identification and subtyping of all currently known subtypes of HAV, it is necessary, including the development of a unified method for labeling the cDNA genome of any known subtype of HAV. In most cases, a fluorescent label (Journal of Microbiological Methods, 2006) [2] or biotin (J Clin Microbiol. 2004; JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 2009) [3, 4] is used for labeling. These can be nucleotides conjugated to a label (e.g., fluorescent dye, gold particles, biotin, etc.), which are inserted into the DNA sequence, for example, during amplification, or the label can be covalently bound directly to the DNA sequence by chemical methods. In addition to fluorescent tags, radioactive tags are sometimes used. Thus, the incorporation of 33 P or 35 S-labeled nucleotides into cDNA is more efficient and provides greater sensitivity than fluorescent labels. However, the methodological difficulties of working with radioactive material severely limit the applicability of such techniques (Microarray analysis Handbook) [5].
В патенте RU 2361924 [6] («Способ обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1») описан, в том числе, способ амплификации кДНК вируса гриппа типа А. Указанный способ амплификации предусматривает проведение реакции обратной транскрипции с РНК вируса, совмещенной с реакцией амплификации на два гена (гемагглютинина и нейраминидазы) и анализ реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле. Способ позволяет осуществлять одностадийную экспресс-идентификацию вируса гриппа А подтипа H5N1 с помощью совмещенной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) участков вирусного гена гемагглютинина и нейраминидазы. Способ включает в себя две основные реакции. Первая - это первая ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к участку гена гемагглютинина вируса гриппа А. Матрицей для этой реакции служит одноцепочечная РНК вируса гриппа, а затравкой - праймеры F-H5, состоящий из 20 звеньев: ACAAGGTCCGACTACAGCTT, и R-H5, состоящий из 22 звеньев: ATTGATTCCAATTTTACTCCAC. Вторая реакция - вторая ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к участку гена нейраминидазы. Матрицей для этой реакции служит одноцепочечная РНК вируса гриппа, а затравкой - праймеры F-N1, состоящий из 22 звеньев: CAGAACATTAATGAGTTGTCCT, и R-N1, состоящий из 22 звеньев: TCTCAGTATGTTGTTCCTCCAA. Реакции могут проводиться либо в двух ПЦР, либо в единой мультиплексной ПЦР, с идентификацией двух генных участков в одной реакции.Patent RU 2361924 [6] (“Method for detecting influenza A virus of subtype H5N1”) describes, inter alia, a method for amplifying type A influenza virus cDNA. This amplification method involves performing a reverse transcription reaction with virus RNA combined with an amplification reaction of two gene (hemagglutinin and neuraminidase) and analysis of the reaction mixture by agarose gel electrophoresis. The method allows for one-step rapid identification of influenza A virus subtype H5N1 using a combined reverse transcription reaction and polymerase chain reaction (RT-PCR) of the hemagglutinin and neuraminidase viral gene sections. The method includes two main reactions. The first is the first RT-PCR with primers specific for the region of the influenza A virus hemagglutinin gene. The matrix for this reaction is the single-stranded RNA of the influenza virus, and the primers are primers F-H5, consisting of 20 units: ACAAGGTCCGACTACAGCTT, and R-H5, consisting of of 22 links: ATTGATTCCAATTTTACTCCAC. The second reaction is the second RT-PCR with primers specific for the region of the neuraminidase gene. The matrix for this reaction is single-stranded RNA of the influenza virus, and the primers are primers F-N1, consisting of 22 units: CAGAACATTAATGAGTTGTCCT, and R-N1, consisting of 22 units: TCTCAGTATGTTGTTCCTCCAA. Reactions can be carried out either in two PCRs or in a single multiplex PCR, with the identification of two gene regions in one reaction.
Данный способ методически близок к заявляемому, но его результатом является амплификация сегментов генома ВГА строго одного подтипа - H5N1 и не предусмотрено флуоресцентного мечения кДНК ВГА. Таким образом, вышеописанный способ является узко специфичным, позволяет обнаруживать только один подтип ВГА H5N1, при этом отсутствует информация о других подтипах ВГА.This method is methodologically close to the claimed one, but its result is the amplification of segments of the HAV genome of strictly one subtype - H5N1 and no fluorescence labeling of the HAV cDNA is provided. Thus, the above method is narrowly specific, it allows you to detect only one subtype of HAV H5N1, while there is no information about other subtypes of HAV.
Наиболее близким к заявляемому является способ флуоресцентного мечения кДНК ВГА, описанный в статье "Universal Oligonucleotide Microarray for Sub-Typing of Influenza A Virus", PLoS ONE, 2011 [7].Closest to the claimed is a method for fluorescent labeling of HAV cDNA described in the article "Universal Oligonucleotide Microarray for Sub-Typing of Influenza A Virus", PLoS ONE, 2011 [7].
Способ заключается в следующем. Флуоресцентное мечение кДНК ВГА методом обратной транскрипцией и амплификации кДНК (ПЦР) осуществляется в несколько этапов: на первом этапе для получения кДНК гена нейраминидазы или гемагглютинина проводилась обратная транскрипция на матрице одноцепочечной вирусной РНК с использованием праймера GACTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGG и обратной транскриптазы TermoScript (Invitrogen, Carlsbad, CA), перед добавлением фермента реакционная смесь прогревалась 10 минут при 60°С, затем добавлялась обратная транскриптаза, и смесь инкубировалась 5 минут при 55°С и 55 минут при 60°С. На следующем этапе, чтобы амплифицировать полноразмерные гены, проводилась реакция ПЦР с использованием Taq- полимеразы (QIAgen Hot Start Taq-polymerase) и следующих праймеров: NA_F1 и NA_R2 - для нейраминидазы, HA_F1 и HA_R2 - для гемагглютинина [7]. В качестве матрицы в реакцию добавляли кДНК, полученную на первом этапе. Дальнейшую амплификацию фрагментов кДНК с одновременным введением флуоресцентной метки осуществляли на заключительной стадии с использованием праймеров, специфичных для внутренней области гена нейраминидазы или гемагглютинина: NA_F1, NA_R1 и NA_F2, NA_R2 - для нейраминидазы, HA_F1, HA_R1 и HA_F2, HA_R2 - для гемагглютинина. В результате последовательного прохождения всех вышеуказанных этапов способа получали флуоресцентно меченные фрагменты кДНК гена нейраминидазы или гемагглютинина ВГА. Достоинством способа является то, что он позволяет субтипирование всех 16 известных подтипов НА или 9 подтипов NA ви руса гриппа типа А с использованием диагностического биочипа.The method is as follows. HAV cDNA fluorescence labeling by reverse transcription and cDNA amplification (PCR) is carried out in several stages: at the first stage, reverse transcription was performed on a single-stranded viral RNA template using the GACTAATACGACTCACTATAGGAGtag and TAGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCAGTAGtagTAGCAGTAGCAGTAGCAGTAGCagTAGCagTAGCagTAGCAGTAGs and reverse transcripts of cDNA gene ), before adding the enzyme, the reaction mixture was heated for 10 minutes at 60 ° C, then reverse transcriptase was added, and the mixture was incubated for 5 minutes at 55 ° C and 55 minutes at 60 ° C. At the next stage, in order to amplify the full-sized genes, a PCR reaction was performed using Taq polymerase (QIAgen Hot Start Taq polymerase) and the following primers: NA_F1 and NA_R2 for neuraminidase, HA_F1 and HA_R2 for hemagglutinin [7]. As a matrix, cDNA obtained in the first step was added to the reaction. Further amplification of cDNA fragments with the simultaneous introduction of a fluorescent label was carried out at the final stage using primers specific for the inner region of the neuraminidase or hemagglutinin gene: NA_F1, NA_R1 and NA_F2, NA_R2 - for neuraminidase, HA_F1, HA_R1gini and HA1gini and HA1Gini and HA1Gini and HA1Gini and HA1Gini and HA2G1NiR2 and HA2G1NiR2G2 and HA2G1NiR2G2N2 and N2N2N2. As a result of the sequential passage of all the above steps of the method, fluorescently labeled cDNA fragments of the neuraminidase or HAV hemagglutinin gene were obtained. The advantage of this method is that it allows the subtyping of all 16 known subtypes of HA or 9 subtypes of NA virus of type A influenza using a diagnostic biochip.
Данный способ обеспечивает флуоресцентное мечение кДНК только одного гена - нейраминидазы или гемагглютинина ВГА, но не обоих генов одновременно, в силу того, что используемые пары праймеров строго специфичны только к одному из анализируемых генов (гемагглютинина или нейраминидазы) и не могут быть использованы одновременно в одной реакции. Проведение реакции в несколько этапов и необходимость использовать последовательно нескольких наборов специфичных праймеров усложняет способ, повышает вероятность технических ошибок, увеличивает стоимость и время, необходимое для проведения реакции.This method provides fluorescence labeling of cDNA of only one gene - neuraminidase or HAV hemagglutinin, but not both genes at the same time, due to the fact that the used primer pairs are strictly specific to only one of the analyzed genes (hemagglutinin or neuraminidase) and cannot be used simultaneously in one reactions. The reaction in several stages and the need to use several sets of specific primers sequentially complicates the method, increases the likelihood of technical errors, increases the cost and time required for the reaction.
Задачей изобретения является разработка способа одностадийного флуоресцентного мечения кДНК одновременно для всех восьми сегментов вирусного генома для любого из известных подтипов ВГА (16 подтипов НА или 9 подтипов NA) человека и животных.The objective of the invention is to develop a method for single-stage fluorescence labeling of cDNA simultaneously for all eight segments of the viral genome for any of the known HAV subtypes (16 HA subtypes or 9 NA subtypes) of humans and animals.
Поставленная задача решается тем, что в способе флуоресцентного мечения кДНК ВГА, включающем проведение реакции обратной транскрипции вирусной РНК и амплификации кДНК (ПЦР), новым является то, что проводят реакцию мультисегментной обратной транскрипции (М-ОТ) вирусной РНК, совмещая с реакцией амплификации кДНК, т.е. реакции проходят в один этап при помощи одной пары универсальных праймеров, подобранных к высококонсервативным областям, имеющимся во всех вирусных сегментах (MBTuni-12 5'-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG-3' и MBTuni-13 5'-ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG-3'), в присутствии флуоресцентно меченных нуклеотидов. Матрицей для этой совмещенной реакции служит одноцепочечная РНК вируса гриппа из анализируемых биологических образцов. Качество полученной флуоресцентно меченной кДНК ВГА проверяют методом электрофореза в 1% агарозном геле, с визуализацией меченых кДНК сегментов генома ВГА при помощи цифровой системы изображений на длинах волн, соответствующих используемой флуоресцентной метке.The problem is solved in that in the method of fluorescence labeling of HAV cDNA, including the reaction of reverse transcription of viral RNA and amplification of cDNA (PCR), it is new that a multi-segment reverse transcription (M-RT) reaction of viral RNA is carried out, combining with the cDNA amplification reaction , i.e. reactions proceed in one step using one pair of universal primers selected for the highly conserved regions found in all viral segments (MBTuni-12 5'-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG-3 'and MBTuni-13 5'-ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG-fluo 3') nucleotides. The matrix for this combined reaction is single-stranded RNA of influenza virus from the analyzed biological samples. The quality of the obtained fluorescently labeled HAV cDNA is checked by electrophoresis in 1% agarose gel, with visualization of the labeled cDNA segments of the HAV genome using a digital image system at wavelengths corresponding to the fluorescence label used.
Заявляемый способ основан на экспериментально подобранных условиях для проведения совмещенной реакции М-ОТ-ПЦР с применением универсальных праймеров MBTuni12 и MBTuni13. Универсальные праймеры MBTuni12 и MBTuni13, которые были разработаны ранее для целей, не связанных с флуоресцентным мечением вирусной кДНК, а именно для амплификации полного генома ВГА с целью определения нуклеотидной последовательности методом секвенирования и дальнейшего использования полученных амплификатов для создания рекомбинантных вакцин против гриппа типа А (2009, J. Virol. 83(19): 10309-10313) [8]. Реакция проводится при одновременном добавлении в реакционную смесь флуоресцентно меченных нуклеотидов, что требовало подбора специальных условий для получения качественной флуоресцентно меченной кДНК ВГА.The inventive method is based on experimentally selected conditions for conducting the combined reaction of M-RT-PCR using universal primers MBTuni12 and MBTuni13. Universal primers MBTuni12 and MBTuni13, which were previously developed for purposes not related to fluorescence labeling of viral cDNA, namely, for amplification of the entire HAV genome with the aim of determining the nucleotide sequence by sequencing and further using the obtained amplifications to create recombinant type A influenza vaccines (2009 J. Virol. 83 (19): 10309-10313) [8]. The reaction is carried out while fluorescently labeled nucleotides are added to the reaction mixture, which required the selection of special conditions to obtain high-quality fluorescently labeled HAV cDNA.
На фиг.1 представлена схема, поясняющая способ, где представлены реакции мультисегментной обратной транскрипции (А.) и полимеразной цепной реакции (Б.), проводящиеся с помощью единственной пары универсальных праймеров, MBTuni12 и MBTuni13, в единой реакционной смеси.Figure 1 presents a diagram explaining the method, which presents the reaction of multi-segment reverse transcription (A.) and polymerase chain reaction (B.), carried out using a single pair of universal primers, MBTuni12 and MBTuni13, in a single reaction mixture.
На фиг.2 представлены результаты проверки качества полученной флуоресцентно меченной кДНК ВГА (условия проверки приведены ниже). На панели А. показано электрофоретическое разделение флуоресцентно меченных продуктов М-ОТ-ПЦР (кДНК) в 1% агарозном геле, визуализация проводилась при помощи цифровой системы изображений KODAK Image Station при длине волны 646 нм, соответствующей использовавшейся метке Су5. На панели Б. представлен тот же агарозный гель, после окрашивания бромистым этидием. На обоих изображениях отмечены полосы, соответствующие кДНК НА, NP и NA сегментов вирусного генома.Figure 2 presents the results of quality control of the obtained fluorescently labeled HAV cDNA (verification conditions are given below). Panel A. shows the electrophoretic separation of fluorescently labeled M-RT-PCR (cDNA) products in a 1% agarose gel, visualization was performed using a KODAK Image Station digital imaging system at a wavelength of 646 nm corresponding to the Cy5 label used. Panel B. presents the same agarose gel after staining with ethidium bromide. In both images, bands corresponding to the cDNA of the HA, NP, and NA segments of the viral genome are marked.
Заявляемый способ заключается в следующем. Реакция мультисегментной обратной транскрипции (М-ОТ) и амплификации кДНК (ПЦР) в один этап при помощи одной пары универсальных праймеров подобранных к высококонсервативным областям, имеющимся во всех вирусных сегментах (MBTuni-12 5'-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG-3' и MBTuni-13 5'-ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG-3'), матрицей для этой совмещенной реакции служит одноцепочечная РНК вируса гриппа из анализируемых биологических образцов. Флуоресцентное мечение пробы происходит путем прямого встраивания Су3-dCTP (или любого другого флуоресцентно меченного нуклеотида) непосредственно в процессе М-ОТ-ПЦР с использованием набора Superscript III One-Step Quantitative RT-PCR System (Invitrogen), реакционная смесь при этом дополнительно содержит 1 мкл lmM Су3-dCTP (или любого другого флуоресцентно меченного нуклеотида). Амплификацию проводят в термоциклере согласно подобранной программе.The inventive method is as follows. Multisegment reverse transcription (M-RT) and cDNA amplification (PCR) in one step using one pair of universal primers selected for the highly conserved regions found in all viral segments (MBTuni-12 5'-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG-3 '13 and 5 MBTun '-ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG-3'), the matrix for this combined reaction is single-stranded RNA of influenza virus from the analyzed biological samples. Fluorescent labeling of the sample occurs by direct incorporation of Cy3-dCTP (or any other fluorescently labeled nucleotide) directly during M-RT-PCR using the Superscript III One-Step Quantitative RT-PCR System kit (Invitrogen), the reaction mixture additionally contains 1 μl lmM Cy3-dCTP (or any other fluorescently labeled nucleotide). Amplification is carried out in a thermal cycler according to a selected program.
Пример конкретной реализации.An example of a specific implementation.
В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли: на 50 мкл реакционной смеси, на один образец, берут 1 мкл смеси ферментов обратной транскриптазы/Taq полимеразы (SuperScriptIII RT /PlatinumR Taq Mix) из набора «SuperScript™ III One-Step RT-PCR Systems» производства компании Invitrogen, 25 мкл двукратной буферной смеси из того же набора, праймеры MBTuni12 и MBTuni13 в концентрации 20Е/мл - по 1,4 мкл каждого, 1 мкл ингибитора РНКаз RNaseOUT, РНК - 200-400 нг, добавляют 1 мкл 1 mM Су3-dCTP (или любой другой флуоресцентно меченный нуклеотид), объем реакции доводят до 50 мкл DEPC-обработанной водой. Смесь перемешивают и переносят в термоциклер и задают следующий температурный режим: Т=45°С в течение 60 мин, прогрев 2 минуты при Т=94°С, проводят 5 циклов полимеразной цепной реакции (ПЦР) в следующем температурном режиме: 30 сек Т=94°С, 30 сек Т=45°С, 3 мин Т=68°С, затем проводят еще 31 цикл ПЦР в следующих условиях: 30 сек Т=94°С, 30 сек Т=57°С, 3 мин Т=68°С. Способ проводится в термоциклере в одну стадию.In a separate tube, the total reaction mixture is prepared for N samples, which include the positive and negative controls: 50 μl of the reaction mixture, per sample, 1 μl of the reverse transcriptase / Taq polymerase enzyme mixture (SuperScriptIII RT / PlatinumR Taq Mix) from the kit Invitrogen SuperScript ™ III One-Step RT-PCR Systems, 25 μl of a double buffer mixture from the same kit, primers MBTuni12 and MBTuni13 at a concentration of 20 U / ml - 1.4 μl each, 1 μl of RNaseOUT RNAse inhibitor, RNA - 200-400 ng, add 1 μl of 1 mM Cy3-dCTP (or any other fluorescently labeled nuc leotide), the reaction volume is adjusted to 50 μl with DEPC-treated water. The mixture is stirred and transferred to a thermal cycler and the following temperature regime is set: Т = 45 ° С for 60 min, heating for 2 minutes at Т = 94 ° С, 5 cycles of polymerase chain reaction (PCR) are carried out in the following temperature regime: 30 sec T = 94 ° C, 30 sec T = 45 ° C, 3 min T = 68 ° C, then another 31 PCR cycles are carried out under the following conditions: 30 sec T = 94 ° C, 30 sec T = 57 ° C, 3 min T = 68 ° C. The method is carried out in a thermal cycler in one stage.
Качество полученной флуоресцентно меченной кДНК ВГА проверяется методом электрофореза в 1% агарозном геле, электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля, в течение 60 мин (фиг.2). Визуализацию флуоресцентно меченных кДНК сегментов генома ВГА осуществляют при помощи цифровой системы изображений KODAK Image Station на длинах волн, соответствующих используемой флуоресцентной метке. Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле на уровне полос, соответствующих восьми сегментам генома ВГА (см. фиг.2). Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру сегментам генома ВГА (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта).The quality of the obtained fluorescently labeled HAV cDNA is checked by electrophoresis in 1% agarose gel, electrophoresis is carried out at a voltage of 8 volts / cm length of the gel, for 60 min (figure 2). Visualization of the fluorescently labeled cDNA segments of the CAA genome is carried out using the KODAK Image Station digital image system at wavelengths corresponding to the fluorescent label used. Samples are considered positive, the bands in which are located in the gel at the level of bands corresponding to eight segments of the HAV genome (see Fig. 2). The test samples are considered negative if they do not reveal any bands or the bands do not correspond in size to the segments of the HAV genome (i.e., are located at a different distance from the start).
Предложенный способ флуоресцентного мечения кДНК ВГА методом мультисегментного одностадийного М-ОТ-ПЦР позволяет проводить быстрое получение флуоресцентно меченных амплификатов вирусной кДНК для всех сегментов вирусного генома. Использование данного способа существенно уменьшает время, необходимое для проведения детекциии и субтипирования ВГА на диагностических биочипах в анализируемых образцах. Проведение мечения в один этап в одной реакционной смеси упрощает процедуру мечения и сокращает количество необходимого расходного материала, что снижает финансовые затраты. В то же время, благодаря использованию универсальных праймеров MBTuni-12 и MBTuni-13, с помощью которых в одних условиях возможна наработка амплификатов всех возможных субтипов ВГА, метод позволяет субтипирование фактически любого подтипа ВГА, т.е. сохраняются достоинства, описанные в прототипе. Способ разработан и проверен в ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.The proposed method for the fluorescence labeling of HAV cDNA by multisegment one-step M-RT-PCR allows for the rapid production of fluorescently labeled amplifications of viral cDNA for all segments of the viral genome. The use of this method significantly reduces the time required for detection and subtyping of the HAV on diagnostic biochips in the analyzed samples. Conducting labeling in one step in one reaction mixture simplifies the labeling procedure and reduces the amount of consumable required, which reduces financial costs. At the same time, due to the use of universal primers MBTuni-12 and MBTuni-13, with the help of which under the same conditions it is possible to generate amplitudes of all possible subtypes of CAA, the method allows subtyping of virtually any subtype of CAA, i.e. the advantages described in the prototype are preserved. The method was developed and tested in the Federal State Budgetary Institution Scientific Research Institute of Influenza of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011129731/10A RU2480525C2 (en) | 2011-07-18 | 2011-07-18 | METHOD FOR FLUORESCENT LABELLING OF cDNA VIRUS OF FLU, TYPE A |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011129731/10A RU2480525C2 (en) | 2011-07-18 | 2011-07-18 | METHOD FOR FLUORESCENT LABELLING OF cDNA VIRUS OF FLU, TYPE A |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011129731A RU2011129731A (en) | 2013-01-27 |
| RU2480525C2 true RU2480525C2 (en) | 2013-04-27 |
Family
ID=48805252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011129731/10A RU2480525C2 (en) | 2011-07-18 | 2011-07-18 | METHOD FOR FLUORESCENT LABELLING OF cDNA VIRUS OF FLU, TYPE A |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2480525C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2836375C1 (en) * | 2023-12-19 | 2025-03-14 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" | Method for pre-symptomatic detection of viral infections in plants using pam-fluorometry |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2361924C1 (en) * | 2007-11-23 | 2009-07-20 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского Российской академии медицинских наук | Way of detection of virus of flu a of h5n1 subtype |
-
2011
- 2011-07-18 RU RU2011129731/10A patent/RU2480525C2/en active IP Right Revival
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2361924C1 (en) * | 2007-11-23 | 2009-07-20 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского Российской академии медицинских наук | Way of detection of virus of flu a of h5n1 subtype |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RIABININ V.A. et al., "Oligonucleotide microarray for subtyping of influenza virus A neuraminidase", Bioorg Khim. 2010 Sep-Oct; 36(5): 688-99. RIABININ V.A. et al., "Subtyping of influenza virus A hemagglutinine with hybridization microarray", Bioorg Khim. 2010 Nov-Dec; 36(6): 849-52. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2836375C1 (en) * | 2023-12-19 | 2025-03-14 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" | Method for pre-symptomatic detection of viral infections in plants using pam-fluorometry |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011129731A (en) | 2013-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shabat et al. | Development of a real-time TaqMan RT-PCR assay for the detection of H9N2 avian influenza viruses | |
| BR112014000138B1 (en) | METHOD FOR IDENTIFYING THE PRESENCE OR ABSENCE OF A TARGET NUCLEIC ACID | |
| JP2009536825A (en) | 100% sequence match detection method for variable genome | |
| CN106435024A (en) | Fluorescent quantitative PCR primer, probe, kit and detection method for detecting avian influenza subtype | |
| CN103320544B (en) | Primer, kit and detection method for detecting avian influenza H7N9 virus by using RT-LAMP method | |
| CN108192996A (en) | A kind of multiple RT-RPA primers for influenza A virus detection and H1 and H3 partings combine and its application | |
| Liu et al. | Development and application of a triplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of avian influenza virus subtype H5, H7 and H9 | |
| Graaf-Rau et al. | Emergence of swine influenza A virus, porcine respirovirus 1 and swine orthopneumovirus in porcine respiratory disease in Germany | |
| Bolotin et al. | Development of a novel real-time reverse-transcriptase PCR method for the detection of H275Y positive influenza A H1N1 isolates | |
| RU2504585C1 (en) | Set of oligodesoxyribonycleotide primers and fluorescent-marked probe for identification of rna of human coronavirus associated with severe sharp respiratory syndrome | |
| JP2008502362A (en) | Diagnostic primers and methods for detecting avian influenza virus subtypes H5 and H5N1 | |
| CN104498629A (en) | Duplex real-time fluorescence quantitative PCR (polymerase chain reaction) detection kit for H3N2 subtype avian influenza virus (AIV) | |
| CN102251061A (en) | Nucleic acid dual fluorescence PCR (Polymerase Chain Reaction) detection kit for influenza A/B virus | |
| Boora et al. | RT-LAMP is a potential future molecular diagnostic tool for influenza A virus | |
| CN102286639A (en) | Type A H1N1/influenza A virus nucleic acid dual fluorescent polymerase chain reaction (PCR) detection kit | |
| Wu et al. | A multiplex reverse transcription-PCR assay for the detection of influenza A virus and differentiation of the H1, H3, H5 and H9 subtypes | |
| Haach et al. | One-step multiplex RT-qPCR for the detection and subtyping of influenza A virus in swine in Brazil | |
| KR101809710B1 (en) | Primers for Detecting Avian Influenza Virus Neuramidase Subtype and Uses Thereof | |
| RU2480525C2 (en) | METHOD FOR FLUORESCENT LABELLING OF cDNA VIRUS OF FLU, TYPE A | |
| CN113817870A (en) | Primer composition for simultaneous detection of seven respiratory tract-associated viruses and its application | |
| CN104946735A (en) | Kit and method for determining genotype of predetermined SNP site of DNA sample to be tested | |
| RU2515911C1 (en) | Set of oligodesoxyribonucleic primers and fluorescence-labelled probes for identification of rna and differentiation of human parainfluenza virus of 1, 2, 3 and 4 types | |
| CN109722492B (en) | Method for detecting H5 and H7N9 subtype highly pathogenic avian influenza virus and H9 subtype avian influenza virus | |
| Kuriakose et al. | Detection of avian influenza viruses and differentiation of H5, H7, N1, and N2 subtypes using a multiplex microsphere assay | |
| TWI531654B (en) | Oligonucleotide probes, kit containing the same and method for pathotyping of h5 avian influenza viruses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130719 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20140910 |
|
| TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20161018 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20170523 |