RU2480227C2 - Противовирусное средство на основе меланина - Google Patents
Противовирусное средство на основе меланина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2480227C2 RU2480227C2 RU2011127305/15A RU2011127305A RU2480227C2 RU 2480227 C2 RU2480227 C2 RU 2480227C2 RU 2011127305/15 A RU2011127305/15 A RU 2011127305/15A RU 2011127305 A RU2011127305 A RU 2011127305A RU 2480227 C2 RU2480227 C2 RU 2480227C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- melanin
- virus
- concentration
- antiviral
- cells
- Prior art date
Links
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims abstract description 38
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 36
- 241000414067 Inonotus obliquus Species 0.000 claims abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 20
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 4
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 172
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 18
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 14
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 13
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 7
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 claims description 3
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 24
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 abstract description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 19
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 18
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 18
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 10
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 10
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 9
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 7
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 7
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 7
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical class O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000054 fungal extract Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- SBZBDWBZQAABFX-UHFFFAOYSA-N 7-(2-amino-2-carboxyethyl)-2-[7-(2-amino-2-carboxyethyl)-5-oxo-1,4-benzothiazin-2-yl]-5-hydroxy-4H-1,4-benzothiazine-3-carboxylic acid Chemical compound NC(Cc1cc(O)c2NC(C(O)=O)=C(Sc2c1)c1cnc2c(cc(CC(N)C(O)=O)cc2=O)s1)C(O)=O SBZBDWBZQAABFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009109 Betula pendula Nutrition 0.000 description 2
- 235000002992 Betula pubescens Nutrition 0.000 description 2
- 241001520764 Betula pubescens Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000027549 TRPC Human genes 0.000 description 2
- 108060008648 TRPC Proteins 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 2
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- XOYSDPUJMJWCBH-VKHMYHEASA-N (3s)-3,5-diamino-5-oxopentanoic acid Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)CC(O)=O XOYSDPUJMJWCBH-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000615866 Antho Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000003932 Betula Nutrition 0.000 description 1
- 241000219429 Betula Species 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- 235000009113 Betula papyrifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000219430 Betula pendula Species 0.000 description 1
- 235000010928 Betula populifolia Nutrition 0.000 description 1
- 238000006027 Birch reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001137864 Camelpox virus Species 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- 241000150230 Crimean-Congo hemorrhagic fever orthonairovirus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241001428546 Vaccinia virus L-IPV Species 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011011 black crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000011037 discontinuous sequential dilution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002809 genomoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000036564 melanin content Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003711 photoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004223 radioprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к противовирусному средству. Противовирусное средство на основе водорастворимого меланина, полученное экстракцией из базидиального гриба Inonotus obliquus и обладающее противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа, простого герпеса 2-го типа, иммунодефицита (ВИЧ-1) и осповакцины. Вышеописанное средство обладает широким спектром противовирусного действия. 4 з.п. ф-лы, 4 табл., 13 пр.
Description
Изобретение относится к противовирусному средству на основе меланина, полученного из высшего базидиального гриба Inonotus obliquus (чага), и может быть использовано в биотехнологии, фармацевтической промышленности и медицине.
Все виды меланиновых пигментов являются длинноцепочечными полимерами с гигантским молекулярным весом и сложной жидкокристаллической структурой. Известны сообщения о практическом использовании синтетических, полусинтетических и выделенных из биологических источников меланинов в медицине, косметологии, а благодаря их полупроводниковым свойствам в технике и электронике.
Меланины, выделенные из микроорганизмов, показывают сходные свойства с меланинами животного происхождения. Это фармакологически активные вещества, обладающие антиоксидантными, антитоксическими, противовоспалительными, иммуностимулирующими свойствами, защищающие от фотодинамических повреждений и др.
Меланины - аморфные высокомолекулярные вещества, не растворимые в воде, минеральных кислотах, органических растворителях; хорошо растворимы в щелочах, а затем выпадают в осадок при подкислении растворов, что используется для их выделения.
По предшественникам меланины разделяют на эумеланины, феомеланины и алломеланины. Эумеланины (черные) и феомеланины (желтые, красные и коричневые) распространены у животных, алломеланины (черные) - в растениях, грибах, бактериях. Предшественник эумеланинов - тирозин, из него в организме получаются пигменты, содержащие С, Н, N и О. Предшественники алломеланинов - дифенолы (пирокатехин и др.), из них образуются меланины, не содержащие азота.
Содержащиеся в грибах пигменты меланины - самые мощные биопротекторы, защищающие живую клетку от неблагоприятных внешних и внутренних воздействий. Это также и самые сильные природные антиоксиданты. Меланины способны нейтрализовать различные свободные радикалы, возникающие в живой клетке под действием проникающей радиации, ультрафиолетового облучения, различных токсинов и ферментов патогенных бактерий. У многих медицинских грибов, прежде всего у трутовиков, содержание меланинов высоко и может достигать 30% сухой массы и даже более. Часть грибных меланинов способна переходить в раствор и может всасываться в желудочно-кишечном тракте, разноситься кровью по организму и защищать живые клетки от разрушительного действия свободных радикалов (http://www.amrita.net.ua/pi/products_id/329).
Установлено, что меланин из чаги Inonotus obliquus и некоторых других трутовых грибов обладает фото- и радиопротекторным, антиоксидантным и генопротекторным свойствами [Щерба В.В., Бабицкая В.Г., Курченко В.П., Иконникова Н.В., Кукулянская Т.А. Антиоксидантные свойства меланиновых пигментов грибного происхождения // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т.36. - №5. - С.569-574; Сушинская Н.В., Курченко В.П., Горовой Л.Ф., Сенюк О.Ф. Получение и использование в медицине меланинов из трутовых грибов // Успехи медицинской микологии. - 2005. - Т.6. - С.255-259].
Наиболее близким аналогом (прототипом) является противовирусное средство на основе водорастворимых меланинов, полученных химическим синтезом из следующих компонентов: L-дезоксидопамин, L- дезоксидопамин, цистеин, L-дезоксидопамин/глутатион, L-тирозин, серотонин, допамин, адреналин и норадреналин (Патент США №5057325, МПК A61K 31/195, опубл. 1991 г.). Указанное противовирусное средство может полностью или частично защитить в условиях in vitro лимфоциты человека от вируса иммунодефицита (ВИЧ-1 и ВИЧ-2).
Однако в публикации отсутствуют сведения о противовирусной активности
заявленного средства в отношении других вирусов, в частности вирусов гриппа, простого герпеса, осповакцины.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение противовирусного средства на основе меланина, обладающего более широким спектром противовирусного действия.
Указанный технический результат достигается тем, что противовирусное средство на основе меланина, согласно изобретению, в качестве меланина оно содержит водорастворимый меланин, полученный экстракцией из базидиального гриба Inonotus obliquus и обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа, простого герпеса 2-го типа, иммунодефицита (ВИЧ-1) и осповакцины.
Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 0,002 мг/мл до 25 мг/мл.
Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 0,002 мг/мл до 0,2 мг/мл, обладающий активностью против вируса иммунодефицита (ВИЧ-1).
Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 0,125 мг/мл до 1,56 мг/мл, обладающий активностью против вируса осповакцины.
Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 0,02 мг/мл до 0,25 мг/мл, обладающий активностью против вируса гриппа.
Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 0,006 мг/мл до 25,0 мг/мл, обладающий активностью против вируса герпеса 2 типа.
В известных источниках информации отсутствуют сведения о природных меланинах грибного происхождения, в том числе в водорастворимой форме, обладающих антивирусной активностью. При наличии противовирусных свойств у химически синтезированных меланинов (патент США №5057325) неочевидно, что указанные свойства будут проявляться у природных меланинов в водорастворимой форме, что подтверждает новизну и изобретательский уровень заявляемого технического решения.
В качестве сырья, содержащего меланин, в заявленном техническом решении используют базидиальный гриб Inonotus obliquus (чага), произрастающий на березах лесной зоны юга Западной Сибири. В Российской Федерации этот гриб развивается на березе бородавчатой и березе белой (Betula pendula Roth и Betula alba L.), имеет широкий ареал распространения. Препараты гриба Inonotus obliquus нашли широкое применение в медицине.
Ниже приведены примеры составов противовирусного средства:
Пример 1. Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации 0,002 мг/мл, обладающий активностью против ВИЧ-1.
Пример 2. Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации 0,2 мг/мл, обладающий активностью против ВИЧ-1.
Пример 3. Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 0,125 мг/мл, обладающий активностью против вируса осповакцины.
Пример 4. Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 1,56 мг/мл, обладающий активностью против вируса осповакцины.
Пример 5. Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации 0,006 мг/мл, обладающий активностью против вируса простого герпеса 2-го типа.
Пример 6. Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации 25,0 мг/мл, обладающий активностью против вируса простого герпеса 2-го типа.
Пример 7. Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 0,02 мг/мл, обладающий активностью против вируса гриппа.
Пример. 8. Средство содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации 0,25 мг/мл, обладающий активностью против вируса гриппа.
Пример 9. Технология приготовления водорастворимого экстракта меланина из базидиального гриба чага
Вначале осуществляют измельчение грибной массы известным способом с последующим извлечением целевого продукта посредством гидролиза при pH 12-14 под давлением 0,5-07 атм в течение 30 мин или при 50°C в течение 1-2-суток; подкислением фугата после центрифугирования до pH 2,0-3,0, осаждением осадка пигмента центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин, промыванием и высушиванием продукта при температуре 50°C. Полученный препарат не растворяется в воде, но хорошо растворяется в щелочах. Водорастворимую форму получают тщательным растворением полученного пигмента в 10% растворе аммиака с последующим мягким выпариванием остаточного аммиака и воды. Полученный препарат полностью растворим в воде.
В готовом виде меланин представляет собой черные кристаллы с ярким мерцающим блеском. Полученные пигменты идентифицировали при помощи качественной реакции с KMnO4, H2O2, FeCl3. Меланин обесцвечивается под воздействием Н2О2, при взаимодействии с FeCl3, происходит выпадение хлопьевидного осадка, который растворяется при добавлении избытка хлорида железа, а при добавлении к растворам пигмента KMnO4 окраска изменялась до зеленой с последующим выпадением осадка и обесцвечиванием растворов [Кукулянская Т.А., Курченко Н.В., Курченко В.П., Бабицкая В.Г. Физико-химические свойства меланинов, образуемых чагой в природных условиях и при культивировании.// Прикладная биохимия и микробиология. 2002. - Т.38. - №1. - С.68-72]. Поглощение УФ и видимого света водными и щелочными растворами пигмента регистрировали на спектрофотометре (Genesys 5 Spectrophotometers, United States). Спектр поглощения раствора меланина имел форму наклонной прямой, характерную для меланинов грибного происхождения [Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Иконникова Н.В. Меланиновый комплекс гриба Inonotus obliquus. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - №4. - Т.36. - С.439-444].
Из водорастворимого сухого меланина приготавливают 2,5% растворы в дистиллированной воде для изучения противовирусных свойств. Растворимость меланина составила 94-98%.
Пример 10. Определение противовирусной активности экстракта меланина в отношении вируса гриппа на культуре клеток
Данную работу проводили на перевиваемой культуре клеток MDCK. Сначала при добавлении разных разведений препаратов к монослою клеток MDCK определяли концентрации экстрактов, оказывающих токсическое действие на клетки, с использованием инвертированного микроскопа. Для исследования противовирусной активности брали те разведения экстрактов, которые не оказывали токсического действия на клетки MDCK. Противовирусную активность препаратов оценивали в отношении штамма вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1). Наличие вируса в среде культивирования клеток MDCK определяли через 2 сут после их инфицирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.
Культуры клеток. Для тестирования противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клеточную культуру MDCK получали из лаборатории в виде суспензии с указанной концентрацией. В стерильном месте суспензию разводили предварительно подогретой до температуры +37°C средой Axcevir - MDCK до концентрации 1×105 клеток/мл. По 100 мкл суспензии клеток MDCK вносили в 96-луночные планшеты 12-канальной автоматической пипеткой. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре +37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2-3 сут до образования клеточного монослоя.
Для определения токсических доз препаратов экстракты разводили несколько раз и оценивали наличие токсического действия в монослоях культуры клеток MDCK с помощью инвертированного микроскопа. Для этого делали разведения исходного препарата в 2 раза, в 10, 50, 100, 500, 1000, 10000 раз средой Axcevir - MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре +37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 сут. Через 2 сут с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями грибных экстрактов. На следующем этапе для определения противовирусной активности грибных экстрактов брали максимально переносимые концентрации (МПК) и меньшие. Токсичная доза для клеток MDCK (разведение 1:100) составляла 0,25 мг/мл.
Вирус. В работе использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и штамм вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) из коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», наработанные на 10-суточных куриных эмбрионах (КЭ). Концентрацию вируса в исследуемых образцах определяли путем титрования на КЭ или на клетках MDCK, рассчитывали и выражали в lgЭИД50/мл (десятичных логарифмах 50% эмбриональных инфицирующих доз в мл) или в lgТЦД50/мл (десятичных логарифмах 50% тканевых цитопатических доз в мл), соответственно, по методу Спирмана-Кербера. Наработанные и использованные в работе серии вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) со штаммами вируса гриппа хранили при -70°C.
Концентрации вируса в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляли по разным экспериментам от 6,3 до 8,3 lg ЭИД50/мл (50% эмбриональных инфицирующих доз в мл).
Готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения экстракта и 100 мкл разведения ВАЖ. Заражение клеточного монослоя проводили по общепринятой методике, при этом для культивирования вирусов использовали поддерживающую среду Axcevir - MDCK (Stem Alpha, Франция), содержащую 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США). Клетки инкубировали 2 сут при температуре +37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.
В качестве контроля использовали:
1) контроль клеток MDCK, культивируемых в питательной среде Axcevir - MDCK (Stem Alpha, Франция), содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США), без вируса и без препаратов;
2) контроль репродукции вируса гриппа в разведениях с 1 до 8 с десятикратным шагом в клетках MDCK, культивируемых в питательной среде Axcevir - MDCK (Stem Alpha, Франция), содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США), без внесения разведении грибных экстрактов.
В табл.1 представлены данные по определению противовирусной активности меланина в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) на клетках MDCK.
| Таблица 1 | |||
| Результаты противовирусной активности экстракта меланина в культуре клеток MDCK, инфицированных штаммом вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) | |||
| Раствор меланина и его разведение | Эффективная доза раствора меланина, мг/мл | Инфекционность вируса (титр ВАЖ) в клетках MDCK (ИД50 в lgTЦД50/мл) через 2 суток | Индекс нейтрализации ИД50конт - ИД50опыт (lg) через 2 суток |
| Контроль вируса | 6,7 | 0 | |
| Пример 1. Меланин (1:500) | 0,02 | 4,5 | 2,2 |
Как видно из табл.1, индекс нейтрализации вируса раствором меланина составил 2,2 lg, эффективная доза водного раствора меланина при этом была 0,02 мг/мл.
Пример 11. Определение противовирусной активности экстракта меланина в отношении вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2)
Штамм MS вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2) был получен из Американской коллекции типовых культур (АТСС). В ГНЦ ВБ "Вектор" вирусный штамм прошел 1 пассаж на культуре клеток Vero. До начала работ исходную суспензию, содержащую вирус, хранили в жидком азоте. Штамм Egypt 101 (Eg101) вируса Западного Нила (ВЗН) был получен из Государственной коллекции вирусных штаммов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва, Россия).
Определение токсичности проб для клеток. Для определения токсичности на клетки в 96-луночные планшеты с культурой клеток Vero вносили экспериментальные пробы, которые предварительно были разведены на питательной среде DMEM (ГНЦ ВБ "Вектор"), содержащей 5% сыворотки. Экспозицию проводили в течение 1 часа при 37°C в атмосфере 5% CO2. Затем клетки трехкратно промывали средой DMEM без сыворотки и заливали средой DMEM с 2% сыворотки крупного рогатого скота (ООО "БиолоТ", Москва), прогретой до 56°C. Наблюдение за состоянием клеток, обработанных препаратами и в контрольных, необработанных рядах, проводили в течение семи суток при помощи световой микроскопии. Нетоксичной для клеток Vero по данной методике была исходная концентрация 25,0 мг/мл.
Экспериментальные образцы стерилизовали путем фильтрования через фильтр 0,2 мкм (Millipore, США).
Определение антивирусной активности. Изучение антивирусной активности грибных проб проводили, руководствуясь методами, представленными в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ и статьей Госфармакопии (Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное сырье. - М.: Медицина, 1990. - II изд. - Вып.2. - том 2. - С.187-209). Снижение инфекционного титра вируса оценивали после инкубации вирусной суспензии с экспериментальными препаратами в течение часа при 37°C. Далее, эти суспензии препаратов с вирусом вносили в лунки 96-луночных планшетов с культурой клеток. После адсорбции в течение 1 часа при 37°C монослой клеток промывали средой без сыворотки и заливали поддерживающую среду. Снижение инфекционного титра вируса, обработанного или инактивированного пробами, выражали для вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2) в бляшкообразующих единицах (БОЕ). Результаты учитывали визуально при ежедневном наблюдении в световой микроскоп. Протоколы заполнялись на каждые сутки наблюдений. В тот день, когда выявляли ЦПД в лунках контрольного ряда титрования вируса (для ВПГ-2 обычно на 2-3 сут), учитывали результат титрования ВПГ-2 в БОЕ, и инактивации вируса исследуемыми препаратами, то есть меньшее количество или отсутствие 10-100 БОЕ для ВПГ по сравнению с контролем. Результаты представлены в табл.2.
| Таблица 2 | ||
| Антивирусная активность экстракта меланина против вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2) | ||
| Исходный раствор меланина, % | Разведение препарата, 100% подавляющего адсорбцию вируса на клетки Vero | |
| Множественность заражения вируса | ||
| 0,1 БОЕ/клетка | 0,01 БОЕ/клетка | |
| Меланин (2,5% раствор) | 1:4046 | 1:4046 |
Как видно из полученных результатов (табл.2), полное подавление развития вируса ВПГ-2 на культуре клеток Vero происходило при очень низких концентрациях меланина. Эффективная доза составляла 0,006 мг/мл (пример 5).
Пример 12. Оценка противовирусного действия экстракта меланина на репродукцию вируса иммунодефицита человека в культуре клеток МТ-4
Токсичность образца водного раствора меланина исследовали с использованием лимфоидной культуры клеток человека МТ-4. Для этого суспензию клеток МТ-4, разведенную до посевной концентрации 0,5×106 клеток в миллилитре питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°C в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, помещали в лунки 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. К клеткам добавляют раствор меланина (по 20 мкл в лунку), до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40, 1:80…1:1280. Максимальная исследованная концентрация меланина на культуре клеток МТ-4 в тесте на «токсичность» составляла 300 мг/мл. Использовали по 3 лунки на каждую дозу. Контролем служили клетки, в которые вместо исследуемого соединения добавляли то же количество растворителя (среда RPMI-1640 без сыворотки и антибиотиков). Планшеты инкубировали в термостате при 37°C. На 5 сутки культивирования подсчитывали концентрацию и жизнеспособность клеток методом прижизненного окрашивания клеток МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Результат учитывали на спектрофотометре Anthos при 570-620 нм. Разведение, оказывающее 50% токсическое действие на клетки МТ-4 (при котором клетки сохраняли 50% жизнеспособность, ТС50), определяли по графику зависимости оптической плотности от концентрации и жизнеспособности клеток. В результате эксперимента определяли 50% токсическую концентрацию меланина (ТС50) для культуры клеток МТ-4, которая составила 200 мкг/мл.
Противовирусное действие меланина оценивали по подавлению вируспродукции в клетках МТ-4. В суспензию клеток МТ-4 добавляли вируссодержащий материал (ВИЧ-1, штамм ГКВ 4046), клетки разносили по лункам 96-луночных планшетов. Одновременно в лунки вносили образец меланина, разведенный в среде RPMI-1640, с шагом 3-кратных последовательных разведений препарата (1:3, 1:9, 1:27 и т.д.), по три лунки на каждую дозу. Планшеты инкубировали в течение часа при 37°C для адсорбции вируса, затем клетки разводили до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°C в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, содержащей соответствующие дозы меланина. Контролями служили инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4 без добавления меланина. Планшеты инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 5 сут.
Анти-ВИЧ активность меланина (IC50) оценивали по методу МТТ (сравнительная оценка жизнеспособности инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных клеток МТ-4) и по подавлению накопления вирусного белка р24 в инфицированных ВИЧ-1 клетках с использованием количественного определения р24 методом прямого иммуноферментного анализа. 50% ингибирующая концентрация меланина (IC50) в отношении ВИЧ-1 в экспериментах с использованием культуры клеток человека МТ-4 методом МТТ составила 1,3 мкг/мл. Подавление прироста вирусспецифического белка р24 различными разведениями меланина определяли с помощью тест-системы производства «Вектор-Бест». Результат учитывали на спектрофотометре BioRad при 450 нм. Базовый уровень белка р24 в момент инфицирования составил 6,67 нг/мл (lg 6,67=0,8241). Концентрация белка р24 через 5 дней при культивировании ВИЧ-1 на клетках МТ-4 без добавления меланина составила 1,03×104 нг/мл (lg 1,03×104=4,0128), при этом 50% подавление прироста вирусспецифического белка р24 происходило при добавлении меланина в концентрации 2,6 мкг/мл. Усредненные данные по двум независимым методам оценки противовирусной эффективности препарата показали, что меланин обладает способностью к 50% подавлению репродукции ВИЧ-1 при концентрации 1,95±0,65 мкг/мл, индекс селективности (ТС50/IC50) для меланина превышает 100.
В табл.3 приведены результаты изучения токсического и противовирусного действия меланина в отношении ВИЧ-1.
Оценка эффективности противовирусного действия меланина на культуре клеток человека МТ-4, инфицированной ВИЧ-1, показала, что при низкой токсичности (ТС50 составляет 200 мкг/мл) экстракт меланина обладает способностью к 50% подавлению репродукции ВИЧ-1 при концентрации 1,95±0,65 мкг/мл (пример 1), индекс селективности (ТС50/IC50) для меланина превышает 100. Пример подтверждает, что меланин оказывает выраженный ингибирующий эффект в отношении вируса иммунодефицита человека I типа.
| Таблица 3 | ||||
| Исследование токсического и противовирусного действия экстракта меланина в отношении ВИЧ-1 (штамм ГКВ 4046) в экспериментах на клетках МТ-4 | ||||
| Исходный раствор меланина, % | Метод оценки анти-ВИЧ активности | ТС50, мкг/мл | IC50, мкг/мл | Индекс селективности |
| Меланин (2,5% раствор) | МТТ | 200,0 | 2,6 | 76,9 |
| Меланин (2,5% раствор) | Количественный анализ р24 ВИЧ-1 | 200,0 | 1,3 | 153,8 |
| Меланин (2,5% раствор) | Средние данные по двум независимым методам | 200,0 | 1,95±0,65 | 102,6 |
Пример 13. Оценка противовирусного действия экстракта меланина на репродукцию вируса осповакцины в культуре клеток Vero
Вирус. Вирус осповакцины (ВОВ), штамм Л-ИВП был получен из коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработан на культуре клеток Vero с титром 5×105 БОЕ/мл.
Культура клеток. Культура клеток Vero была получена из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Для получения монослоя клетки выращивали в течение 1-3 суток в 96-луночных пластиковых планшетах в питательной среде (100 мкл/лунку): среда ДМЭМ, содержащая 125 мкг/мл канамицина, 150 мкг/мл L-глутамина и 2% эмбриональной сыворотки плодов коров (Fetal Bovine Serum, HyClone, Lot. No. CSC0518), инактивированной при 56°C в течение 30 мин).
Противовирусное действие экстракта меланина. Противовирусное действие препарата оценивали, используя метод (Paragas J., Whitehouse C.A., Endy Т.Р., Bray M. A simple assay for determining antiviral activity against Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Antiviral Research. - 2004. - V 62. P.21-25).
Меланин с исходной концентрацией 25 мг/мл разводили в питательной среде семь раз с трехкратным шагом. К содержащимся в лунках с монослоем клеток Vero 100 мкл питательной среды добавляли по 50 мкл разведении препарата, включая и препарат без разведения (нулевое разведение). Концентрация меланина в лунках планшет составляла 6,25; 2,08; 0,69; 0,23; 0,08; 0,025; 0,0086 и 0,0029 мг/мл. Каждое разведение препарата было внесено в шесть лунок. В три из них был внесен вирус, разведенный в питательной среде, в объеме 50 мкл в дозе 1000 БОЕ, а в три внесено по 50 мкл питательной среды - эти лунки использовались для определения токсичности препарата. По шесть лунок было использовано для контроля вируса и контроля клеток.
Планшеты инкубировали при 37°C в CO2 инкубаторе в течение 5 суток, ежедневно с помощью инвертированного микроскопа, наблюдая состояние клеточного монослоя и убеждаясь, что через 5 суток в лунках с вирусом, но без препарата (контроль вируса) наблюдается полное 100% цитопатическое действие вируса.
Окраска планшетов производится с помощью витального красителя нейтрального красного и основана на поглощении красителя живыми клетками. Для приготовления основного раствора красителя 3,33 г сухого красителя растворяли в 1 л дистиллированной воды, раствор фильтровали через бумажный фильтр и хранили +4°C. Перед употреблением 1 часть раствора красителя смешивали с 2 частями питательной среды, полученный раствор подогревали до +37°C и в объеме 50 мкл вносили в лунки планшет. Планшеты возвращали в CO2 инкубатор на 1,5 часа. После инкубации среду из планшет удаляли, и лунки планшет промывали двукратно физиологическим раствором (по 300 мкл/лунку). Оставшийся в лунках краситель нейтральный красный растворяли, добавляя в лунки по 100 мкл раствора 50% этилового спирта и 50% 0,1М NH4H2PO4 (pH 3.5). Планшеты выдерживали 30 мин при комнатной температуре и измеряли оптическую плотность (ОП) раствора в лунках при длине волны 490 нм с помощью планшетного спетрофотометра, соединенного с компьютером.
Анализ данных. Противовирусное действие экстракта меланина оценивали по увеличению ОП в лунках, содержащих препарат, и вирус по сравнению с контролем вируса. Для построения кривой зависимости ОП от концентрации препарата в лунках использовали опцию «4-Parameter» программы SOFTmax PRO, version 4.0. С помощью данной программы определяли ингибирующую 50% концентрацию препарата (IC50) - концентрацию препарата, при которой 50% клеточного монослоя остается защищенным от действия вируса, а также токсическую 50% концентрацию препарата (TC50) - концентрацию препарата, при которой 50% клеточного монослоя повреждается за счет токсического действия самого препарата. ТС50 и IC50 были вычислены как средние величины из трех значений, полученных при проведении эксперимента на одном планшете. Индекс селективности (SI) был вычислен как отношение ТС50 к IC50 (Duraffour S, Snoeck R, de Vos R, van Den Oord JJ, Crance JM, Garin D, Hmby DE, Jordan R, De Clercq E, Andrei G. Activity of the anti-orthopoxvirus compound ST-246 against vaccinia, cowpox and camelpox viruses in cell monolayers and organotypic raft cultures // Antivir Ther. 2007; 12(8):1205-16).
Результаты изучения эффективности противовирусного действия экстрактов меланина в отношении осповакцины представлены в табл.4.
| Таблица 4 | |||||
| Результаты изучения токсического и противовирусного действия экстракта меланина из чаги в отношении вируса осповакцины(штамм Л-ИВП)в экспериментах на клетках Vero | |||||
| Исходный раствор меланина, % | Диапазон изученных концентраций | Диапазон концентраций, оказывающих противовирусное действие | ТС50, мг/мл | IC50, мг/мл | SI |
| Меланин (2,5% раствор | от 0,0029 до 6,25мг/мл | от 0,125 до 1,56 мг/мл (примеры 3-4) | 1,56 | 0,125 | 12,5 |
На основании представленных в табл.4 данных можно заключить, что экстракт меланина, полученный из Inonotus obliquus, обладает противовирусной активностью в отношении вируса осповакцины (индекс селективности SI=12,5).
Claims (5)
1. Противовирусное средство на основе меланина, отличающееся тем, что в качестве меланина оно содержит водорастворимый меланин в концентрации от 0,002 мг/мл до 25 мг/мл, полученный экстракцией из базидиального гриба Inonotus obliquus и обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа, простого герпеса 2-го типа, иммунодефицита (ВИЧ-1) и осповакцины.
2. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 0,002 мг/мл до 0,2 мг/мл, обладающий активностью против вируса иммунодефицита (ВИЧ-1).
3. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus в концентрации от 0,125 мг/мл до 1,56 мг/мл, обладающий активностью против вируса осповакцины.
4. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Innonotus obliquus в концентрации от 0,02 мг/мл до 0,25 мг/мл, обладающий активностью против вируса гриппа.
5. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно содержит водный раствор меланина из базидиального гриба Innonotus obliquus в концентрации от 0,006 мг/мл до 25,0 мг/мл, обладающий активностью против вируса простого герпеса 2 типа.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011127305/15A RU2480227C2 (ru) | 2011-07-01 | 2011-07-01 | Противовирусное средство на основе меланина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011127305/15A RU2480227C2 (ru) | 2011-07-01 | 2011-07-01 | Противовирусное средство на основе меланина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011127305A RU2011127305A (ru) | 2013-01-10 |
| RU2480227C2 true RU2480227C2 (ru) | 2013-04-27 |
Family
ID=48795289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011127305/15A RU2480227C2 (ru) | 2011-07-01 | 2011-07-01 | Противовирусное средство на основе меланина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2480227C2 (ru) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2546006C1 (ru) * | 2014-03-07 | 2015-04-10 | Римма Ильинична Ашкинази | Противовирусное средство |
| US10080728B2 (en) | 2015-01-20 | 2018-09-25 | Viktor Veniaminovich Tets | Hemostatic agent |
| RU2716590C1 (ru) * | 2019-09-30 | 2020-03-12 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм базидиального гриба Inonotus obliquus - продуцент пигмента меланина, обладающего противовирусной и противоопухолевой активностью |
| RU2747018C1 (ru) * | 2020-10-14 | 2021-04-23 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе меланина из гриба Inonotus obliquus |
| US11285170B2 (en) | 2017-05-24 | 2022-03-29 | Viktor Veniaminovich Tets | Fractionated antimicrobial compositions and use thereof |
| RU2800446C1 (ru) * | 2022-08-25 | 2023-07-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Водорастворимый пигмент меланин из базидиального гриба Inonotus obliquus, обладающий противовирусной активностью |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5057325A (en) * | 1990-03-20 | 1991-10-15 | Vanderbilt University | Method of inhibiting replication of HIV with water-soluble melanins |
| US20040105869A1 (en) * | 2002-02-01 | 2004-06-03 | Kazuo Sakuma | Methods for cultivation of Kabanoanatake secreting and containing active ingredients for prophylactic and therapeutic agents against microbe-related syndromes including HIV |
| RU2375073C1 (ru) * | 2008-06-11 | 2009-12-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа |
-
2011
- 2011-07-01 RU RU2011127305/15A patent/RU2480227C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5057325A (en) * | 1990-03-20 | 1991-10-15 | Vanderbilt University | Method of inhibiting replication of HIV with water-soluble melanins |
| US20040105869A1 (en) * | 2002-02-01 | 2004-06-03 | Kazuo Sakuma | Methods for cultivation of Kabanoanatake secreting and containing active ingredients for prophylactic and therapeutic agents against microbe-related syndromes including HIV |
| RU2375073C1 (ru) * | 2008-06-11 | 2009-12-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2546006C1 (ru) * | 2014-03-07 | 2015-04-10 | Римма Ильинична Ашкинази | Противовирусное средство |
| US10299480B2 (en) | 2014-03-07 | 2019-05-28 | Viktor Veniaminovich Tets | Antiviral agent |
| US10080728B2 (en) | 2015-01-20 | 2018-09-25 | Viktor Veniaminovich Tets | Hemostatic agent |
| US11285170B2 (en) | 2017-05-24 | 2022-03-29 | Viktor Veniaminovich Tets | Fractionated antimicrobial compositions and use thereof |
| RU2716590C1 (ru) * | 2019-09-30 | 2020-03-12 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм базидиального гриба Inonotus obliquus - продуцент пигмента меланина, обладающего противовирусной и противоопухолевой активностью |
| RU2747018C1 (ru) * | 2020-10-14 | 2021-04-23 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе меланина из гриба Inonotus obliquus |
| RU2800446C1 (ru) * | 2022-08-25 | 2023-07-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Водорастворимый пигмент меланин из базидиального гриба Inonotus obliquus, обладающий противовирусной активностью |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011127305A (ru) | 2013-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sharma et al. | Green synthesis of silver nanoparticles from medicinal plants and evaluation of their antiviral potential against chikungunya virus | |
| ES2882588T3 (es) | Actividad antiviral de setas medicinales y sus constituyentes activos | |
| Sundararajan et al. | Influenza virus variation in susceptibility to inactivation by pomegranate polyphenols is determined by envelope glycoproteins | |
| RU2480227C2 (ru) | Противовирусное средство на основе меланина | |
| Knox et al. | Anti‐influenza virus activity of crude extract of Ribes nigrum L. | |
| US9445605B2 (en) | Method for disinfection or infection control against a non-enveloped virus | |
| Lam et al. | Evaluation of berberine/bovine serum albumin nanoparticles for liver fibrosis therapy | |
| US20060171958A1 (en) | Antiviral activity from medicinal mushrooms | |
| Elnosary et al. | Antiviral and antibacterial properties of synthesis silver nanoparticles with nigella arvensis aqueous extract | |
| Serkedjieva et al. | Plant polyphenolic complex inhibits the reproduction of influenza and herpes simplex viruses | |
| Ashraf et al. | Phytochemical composition and potent biological activities of Ficus benjamina var. comosa leaves extract | |
| US9364511B2 (en) | Antiviral preparations obtained from a natural cinnamon extract | |
| Masalu et al. | Antibacterial and anti-HIV-1 reverse transcriptase activities of selected medicinal plants and their synthesized zinc oxide nanoparticles | |
| Usha et al. | Antiviral activity of lathakaranja (Caesalpinia crista L.) crude extracts on selected animal viruses | |
| JPH03206043A (ja) | ウイルス感染防止剤 | |
| Kumari et al. | In-vitro pharmacological evaluation of leaf extracts of a medicinal mangrove plant Bruguiera gymnorhiza L | |
| Ledoux et al. | In vitro antiviral activity against SARS-CoV-2 of 28 Strychnos extracts | |
| RU2800446C1 (ru) | Водорастворимый пигмент меланин из базидиального гриба Inonotus obliquus, обладающий противовирусной активностью | |
| RU2747018C1 (ru) | Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе меланина из гриба Inonotus obliquus | |
| CN102166276B (zh) | 一种防治甲型流感的中药组合物及其制备方法和用途 | |
| JP4307459B2 (ja) | インフルエンザ予防・治療剤 | |
| RU2475531C2 (ru) | ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ШТАММА НЕМАТОФАГОВОГО ГРИБА Duddingtonia flagrans F-882 | |
| CN111603526A (zh) | 一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用 | |
| RU2283126C1 (ru) | Средство для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц | |
| Nurviani et al. | The inhibition of Tobamovirus by using the extract of banana flower |