RU2477752C1 - Method of stimulating liver stem cell differentiation in vitro in tissue-specific direction - Google Patents
Method of stimulating liver stem cell differentiation in vitro in tissue-specific direction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2477752C1 RU2477752C1 RU2012105738/10A RU2012105738A RU2477752C1 RU 2477752 C1 RU2477752 C1 RU 2477752C1 RU 2012105738/10 A RU2012105738/10 A RU 2012105738/10A RU 2012105738 A RU2012105738 A RU 2012105738A RU 2477752 C1 RU2477752 C1 RU 2477752C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tissue
- liver
- specific direction
- vitro
- cells
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 title abstract 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 5
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 244000309464 bull Species 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 3
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000008964 Chemical and Drug Induced Liver Injury Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении.The invention relates to the field of experimental biology and medicine and relates to a method for stimulating the differentiation of liver stem cells in a tissue-specific direction.
Известно большое количество способов стимуляции in vitro клеток-предшественников различных классов [1-4].There are a large number of methods for stimulating in vitro progenitor cells of various classes [1-4].
Наиболее близким по техническому результату прототипом является способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток в печеночном направлении с помощью фактора роста гепатоцитов, получаемого генно-инженерным методом [5].The closest to the technical result of the prototype is a method of stimulating the differentiation of stem cells in the hepatic direction using hepatocyte growth factor obtained by genetic engineering method [5].
Недостатком данного способа является его недоступность для широкого использования, связанная с высокой стоимостью фактора роста гепатоцитов [6], а также недостаточная эффективность способа.The disadvantage of this method is its inaccessibility for widespread use, associated with the high cost of hepatocyte growth factor [6], as well as the lack of effectiveness of the method.
Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа и доступности его использования.The problem solved by this invention is to increase the efficiency of the method and the availability of its use.
Поставленная задача решается тем, что клетки печени в условиях in vitro подвергают в течение 10 минут воздействию питательной среды, содержащей 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.The problem is solved in that the liver cells in vitro are exposed for 10 minutes to a nutrient medium containing 2 U / ml of immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase.
Новым в предлагаемом изобретении является применение для стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.New in the invention is the use of immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase to stimulate the differentiation of liver stem cells.
Многие заболевания печени зачастую не поддаются лечению существующими медикаментозными средствами. Данное обстоятельство указывает на актуальность разработки новых гепатопротекторов. При этом наиболее перспективным является создание препаратов, способных оказывать влияние на стволовые клетки (СК) [7, 8].Many liver diseases are often not amenable to treatment with existing medications. This fact indicates the relevance of the development of new hepatoprotectors. Moreover, the most promising is the creation of drugs that can affect stem cells (SC) [7, 8].
Для изучения закономерностей функционирования клеток-предшественников печени и исследования механизмов их регуляции с целью создания патогенетически обоснованных методов лечения заболеваний печени используют различные экспериментальные способы культивирования клеточного материала in vitro. Для эффективного культивирования и стимуляции пролиферативно-дифференцировочных потенций СК необходимым условием является добавление в питательную среду факторов роста, которые значительно повышают эффективность клонирования клеток-предшественников [1-4]. При этом СК печени представляют собой гетерогенную популяцию элементов, которые способны давать начало не только тканеспецифичным, но и другим клеточным типам [8]. Данное обстоятельство с целью адекватной трактовки получаемых в экспериментах in vitro результатов требует использования специализированных ростовых факторов, позволяющих регистрировать образование лишь паренхиматозных СК печени. Кроме того, стимуляция развития СК в тканеспецифическом направлении является важным фактором, облегчающим изучение процессов их жизнедеятельности. На сегодняшний день в экспериментах in vitro наиболее часто для стимуляции дифференцировки СК печени в тканеспецифичном направлении используют дорогостоящий генно-инженерный фактор роста гепатоцитов [5], который, несмотря на свое название, является плейотропным фактором, действующим в отношении прогениторных клеток различных классов.To study the patterns of functioning of liver precursor cells and to study the mechanisms of their regulation in order to create pathogenetically substantiated methods of treating liver diseases, various experimental methods for culturing cellular material in vitro are used. For effective cultivation and stimulation of proliferative and differentiating potentials of SC, a necessary condition is the addition of growth factors to the nutrient medium, which significantly increase the cloning efficiency of progenitor cells [1-4]. Moreover, liver SCs are a heterogeneous population of elements that can give rise not only to tissue-specific, but also to other cell types [8]. This circumstance, in order to adequately interpret the results obtained in vitro experiments, requires the use of specialized growth factors that make it possible to register the formation of only parenchymal liver SCs. In addition, stimulation of the development of SC in a tissue-specific direction is an important factor facilitating the study of their vital processes. To date, in vitro experiments most often to stimulate the differentiation of liver SC in a tissue-specific direction, an expensive genetic engineering factor for the growth of hepatocytes is used [5], which, despite its name, is a pleiotropic factor that acts on progenitor cells of various classes.
Вместе с тем известна возможность стимуляции стволовых клеток костного мозга с помощью иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы (гиалуронидазы) [9] за счет образования под ее влиянием in situ низко- и среднемолекулярных форм гиалуроновой кислоты, повышающих интенсивность процессов клеточного деления [9, 10].At the same time, it is known that bone marrow stem cells can be stimulated using immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase (hyaluronidase) [9] due to the formation of low- and medium-molecular forms of hyaluronic acid under its influence, which increase the intensity of cell division [ 9, 10].
Однако способность гиалуронидазы оказывать прямое влияние на стволовые клетки печени, заключающееся в стимуляции их дифференцировки в тканеспецифичном направлении, не известна.However, the ability of hyaluronidase to exert a direct effect on liver stem cells, which consists in stimulating their differentiation in a tissue-specific direction, is not known.
Факт применения иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции in vitro дифференцировки стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении, для специалиста не является очевидным.The fact of using immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase with the achievement of a new technical result, which consists in effective stimulation of in vitro differentiation of liver stem cells in a tissue-specific direction, is not obvious to a specialist.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.The claimed essential features in the aggregate showed new properties that are not explicitly derived from the prior art in this field. The present invention can be used in experimental biology and medicine with access to practical health care. An identical set of features was not found in the study of the state of the art in patent and medical literature.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».Based on the foregoing, the claimed technical solution should be considered relevant criteria: "Novelty", "Inventive step", "Industrial applicability".
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Взвесь клеток печени лабораторных животных (мышей) помещают на 10 минут в питательную среду, содержащую 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.A suspension of liver cells of laboratory animals (mice) is placed for 10 minutes in a nutrient medium containing 2 U / ml of immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 26 шт. массой 18-20 г, которые получены из питомника экспериментально-биологической клиники лабораторных животных НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).The proposed method was studied in experiments on mice of the CBA / CaLac line (category 1 animals, conventional linear mice) in an amount of 26 pcs. weighing 18-20 g, which were obtained from the nursery of the experimental biological clinic of laboratory animals of the Research Institute of Pharmacology SB RAMS (certificate is available).
Пример 1Example 1
У мыши линии CBA/CaLac массой 20 г, умерщвленной с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) извлекали печень. Печень отмывали от эритроцитов в физиологическом растворе. Затем ее помещали в гомогенизатор с питательной средой DMEM и гомогенизировали до получения однородной клеточной взвеси. После этого клеточный материал фильтровали через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов, дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5-10 мин и подсчитывали общее количество нуклеаров, определяя их жизнеспособность с помощью трипанового синего. Затем клеточный материал поместили на 10 минут в среду DMEM (“Serva”, ФРГ), содержащую 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск).In a CBA / CaLac mouse weighing 20 g killed by dislocation of the cervical vertebrae under ether anesthesia, the liver was removed under sterile conditions (box equipped with laminar). The liver was washed from red blood cells in physiological saline. Then it was placed in a homogenizer with DMEM nutrient medium and homogenized until a homogeneous cell suspension was obtained. After this, the cellular material was filtered through a nylon mesh to remove large aggregates, washed twice by centrifugation at 1500 rpm for 5-10 minutes, and the total number of nuclears was counted, determining their viability using trypan blue. Then, the cellular material was placed for 10 minutes in DMEM medium (Serva, Germany) containing 2 IU / ml of immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase (LLC “Scientific Future Management”, Novosibirsk).
Для регистрации процессов дифференцировки СК использовали культуральные методы. Для этого клетки, обработанные веществом, дважды отмыли центрифугированием и помещали их в концентрации 105/мл в среду следующего состава: 90% среды DMEM (“Serva”, ФРГ), 10% ЭТС («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 5000 МЕ/л гепарина (“Biochemie“, Австрия), 5 мг/л свиного многокомпонентного инсулина (“Novo Nordisk“, Дания). По 0,5 мл приготовленной клеточной взвеси помещали в 24-луночные планшеты («Corning», США) в CO2-инкубаторе при 37°C, 5% CO2 и 100% влажности воздуха и инкубировали 20 сут. После этого в 20-ти суточных культурах регистрировали рост паренхиматозных колониеобразующих единиц (КОЕ-Печ) [4] и фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) [1]. Подсчет проводили под инвертированным микроскопом «Axio Observer A.1» (Carl Zeiss, Германия). Под КОЕ-Печ подразумевали круглое либо неправильной формы неприлипающее образование, содержащее более 30 клеток, под КОЕ-Ф - прилипшее образование из 30 и более фибробластоподобных клеток. Морфологический контроль проводили путем изучения под иммерсией препаратов, окрашенных азур II-эозином в течение 30-40 мин.To register the processes of SC differentiation, cultural methods were used. For this, the cells treated with the substance were washed twice by centrifugation and placed at a concentration of 10 5 / ml in a medium of the following composition: 90% DMEM medium (Serva, Germany), 10% ETS (Sigma, USA), 50 mg / l of gentamicin (Sigma, USA), 5000 IU / l of heparin (Biochemie, Austria), 5 mg / l of porcine multicomponent insulin (Novo Nordisk, Denmark). 0.5 ml of prepared cell suspension was placed in 24-well plates (Corning, USA) in a CO 2 incubator at 37 ° C, 5% CO 2, and 100% air humidity and incubated for 20 days. After that, the growth of parenchymal colony forming units (CFU-Pech) [4] and fibroblast colony forming units (CFU-F) [1] was recorded in 20 day old cultures. The counting was performed under an inverted microscope Axio Observer A.1 (Carl Zeiss, Germany). Under CFU-Pech meant a round or irregular non-stick formation containing more than 30 cells, under CFU-F - an adherent formation of 30 or more fibroblast-like cells. Morphological control was carried out by studying under immersion preparations stained with azure II-eosin for 30-40 minutes.
Для сравнения эффективности заявляемого способа со способом-прототипом дополнительно использовали культуру клеток печени (не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой) в среде того же состава, но с добавлением 20 нг/мг фактора роста гепатоцитов («Sigma», США).To compare the effectiveness of the proposed method with the prototype method, a culture of liver cells (not treated with immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase) in an environment of the same composition, but with the addition of 20 ng / mg of hepatocyte growth factor (Sigma, USA) was additionally used )
В ходе эксперимента наблюдалась значительная стимуляция роста КОЕ-Печ при добавлении в культуру клеток, не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой, фактора роста гепатоцитов (табл.). При этом значение показателя составляло 255,6% от контроля. Полученные результаты свидетельствовали об активации процессов дифференцировки СК под влиянием данного фактора в тканеспецифичном направлении [5].During the experiment, significant growth stimulation of CFU-Pech was observed when hepatocyte growth factor was added to the culture of cells not treated with immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase (table). The value of the indicator was 255.6% of the control. The obtained results testified to the activation of SC differentiation processes under the influence of this factor in a tissue-specific direction [5].
Изучение изменения роста КОЕ-Печ из клеток, обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой, также выявило существенное возрастание их количества (таблица). Причем величина исследуемого параметра достоверно превышала таковую в случае стимуляции процессов дифференцировки СК по способу-прототипу.The study of changes in the growth of CFU-Pech from cells treated with immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase also revealed a significant increase in their number (table). Moreover, the value of the studied parameter significantly exceeded that in the case of stimulation of the processes of differentiation of SC according to the prototype method.
Более того, при изучении культур ткани печени было обнаружено, что внесение в питательную среду фактора роста гепатоцитов в меньшей степени, чем преинкубация клеток в растворе иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы снижает рост стромальных колоний (КОЕ-Ф). Данный феномен в совокупности с вышеприведенными результатами (падение выхода КОЕ-Ф на фоне резкого увеличения образования КОЕ-Печ) подтверждает тот факт, что использование предлагаемого изобретения приводит к стимуляции дифференцировки мультипотентных стволовых клеток печени [11, 12] в паренхиматозном направлении.Moreover, when studying liver tissue cultures, it was found that introducing hepatocyte growth factor into the nutrient medium to a lesser extent than cell preincubation in a solution of immobilized hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase reduces the growth of stromal colonies (CFU-F). This phenomenon, together with the above results (a decrease in the output of CFU-F against the background of a sharp increase in the formation of CFU-Pech) confirms the fact that the use of the invention leads to stimulation of differentiation of multipotent liver stem cells [11, 12] in the parenchymal direction.
Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать дифференцировку стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении в условиях in vitro.The proposed method allows you to effectively stimulate the differentiation of liver stem cells in a tissue-specific direction in vitro.
Цитируемая литератураCited literature
1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.1. Goldberg E.D., Dygay A.M., Shakhov V.P. Methods of tissue culture in hematology. - Tomsk: Publishing house of TSU, 1992. - 272 p.
2. Патент (RU) на изобретение №2308280 «Способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца», 2007 г. (опубл. 20.10.2007., Бюл. №.29). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.2. Patent (RU) for the invention No. 2308280 "Method for in vitro cloning of regional progenitor cells of the heart", 2007 (publ. 20.10.2007., Bull. No. 29). Authors: Goldberg E.D., Dygay A.M., Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V.
3. Патент (RU) на изобретение №2308281 «Способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы», 2007 г. (опубл. 20.10.2007. Бюл. №29). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.3. Patent (RU) for the invention No. 2308281 "Method for in vitro cloning of regional stem cells of the pancreas", 2007 (publ. 20.10.2007. Bull. No. 29). Authors: Goldberg E.D., Dygay A.M., Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V.
4. Патент (RU) на изобретение №2295971 «Способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита», 2007 г. (опубл. 27.03.2007 г., Бюл. №9). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др.4. Patent (RU) for the invention No. 2295971 "Method for the treatment of experimental chronic toxic hepatitis", 2007 (publ. March 27, 2007, Bull. No. 9). Authors: Goldberg E.D., Dygay A.M., Zhdanov V.V., Zyuzkov G.N. and etc.
5. Liu WH, Tao KS, You N, Liu ZC, Zhang HT, Dou KF. Differences in the properties and mirna expression profiles between side populations from hepatic cancer cells and normal liver cells // PLoS One. 2011; 6 (8):e23311.5. Liu WH, Tao KS, You N, Liu ZC, Zhang HT, Dou KF. Differences in the properties and mirna expression profiles between side populations from hepatic cancer cells and normal liver cells // PLoS One. 2011; 6 (8): e23311.
6. Каталог SIGMA-ALDRICH 2004/2005.6. SIGMA-ALDRICH 2004/2005 catalog.
7. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы. // Наука в России. - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С.4-8.7. Digay A.M., Zyuzkov G.N. Cell therapy: new approaches. // Science in Russia. - Moscow: Publishing House "Science", 2009. - Volume. 169. - No. 1. S.4-8.
8. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.8. Goldberg E.D., Dygay A.M., Zyuzkov G.N. Hypoxia and the blood system. - Tomsk: Publishing house Tom. University, 2006 .-- 142 p.
9. Патент (RU) на изобретение №2405822 «Средство, увеличивающее резерв стволовых клеток в организме» (опубл. 10.12.2010, Бюл. №34). Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Верещагин Е.И. и др.9. Patent (RU) for the invention No. 2405822 "Tool that increases the reserve of stem cells in the body" (publ. 10.12.2010, Bull. No. 34). Authors: Artamonov A.V., Bekarev A.A., Vereshchagin E.I. and etc.
10. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы. // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.6-9.10. Digay A.M., Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V. et al. Regulation of progenitor cell functions using hyaluronidase. // Bulletin of RAMS. - 2009. - No. 11. - S. 6-9.
11. Fausto N. Oval cells and liver carcinogenesis: an analysis of cell lineages in hepatic tumors using oncogene transfection techniques. Prog. Clin. Biol. Res.1990; 331:325-34.11. Fausto N. Oval cells and liver carcinogenesis: an analysis of cell lineages in hepatic tumors using oncogene transfection techniques. Prog. Clin. Biol. Res. 1990; 331: 325-34.
12. Dabeva M.D., Shafritz D.A. Activation, proliferation and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the D-galactosamine model of liver regeneration. Am. J. Pathol. 1993; 143(6):1606-20.12. Dabeva M.D., Shafritz D.A. Activation, proliferation and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the D-galactosamine model of liver regeneration. Am. J. Pathol. 1993; 143 (6): 1606-20.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012105738/10A RU2477752C1 (en) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Method of stimulating liver stem cell differentiation in vitro in tissue-specific direction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012105738/10A RU2477752C1 (en) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Method of stimulating liver stem cell differentiation in vitro in tissue-specific direction |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2477752C1 true RU2477752C1 (en) | 2013-03-20 |
Family
ID=49124401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012105738/10A RU2477752C1 (en) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Method of stimulating liver stem cell differentiation in vitro in tissue-specific direction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2477752C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2686718C1 (en) * | 2018-03-12 | 2019-04-30 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Agent stimulating mesenchymal progenitor cell functions in vitro |
| RU2713122C1 (en) * | 2019-02-19 | 2020-02-03 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Method for stimulation of erythropoietin production by bone marrow cells in vitro |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0168803A2 (en) * | 1984-07-14 | 1986-01-22 | Nippon Petrochemicals Company, Limited | Method for producing p-Isobutylstyrene |
| RU2346981C2 (en) * | 2002-07-19 | 2009-02-20 | Веста Терапьютикс, Инк. | Method for production of human living hepatic cells, including hepatic stem cells/precursor cells |
-
2012
- 2012-02-17 RU RU2012105738/10A patent/RU2477752C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0168803A2 (en) * | 1984-07-14 | 1986-01-22 | Nippon Petrochemicals Company, Limited | Method for producing p-Isobutylstyrene |
| RU2346981C2 (en) * | 2002-07-19 | 2009-02-20 | Веста Терапьютикс, Инк. | Method for production of human living hepatic cells, including hepatic stem cells/precursor cells |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2686718C1 (en) * | 2018-03-12 | 2019-04-30 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Agent stimulating mesenchymal progenitor cell functions in vitro |
| RU2713122C1 (en) * | 2019-02-19 | 2020-02-03 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Method for stimulation of erythropoietin production by bone marrow cells in vitro |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Voloshin et al. | Practical use of immortalized cells in medicine: current advances and future perspectives | |
| US20100035327A1 (en) | Use of rice-derived products in a universal cell culture medium | |
| KR102445537B1 (en) | Method and system for 3D cell culture and use thereof | |
| KR102320800B1 (en) | Stem cell-derived microvesicles with enhanced efficacy, use thereof and method for enhancing efficacy | |
| Hackett et al. | Electrospun biocomposite polycaprolactone/collagen tubes as scaffolds for neural stem cell differentiation | |
| Takahashi et al. | Methods for generating vascularized islet‐like organoids via self‐condensation | |
| US20200360443A1 (en) | Stem cell material and method of manufacturing | |
| Gu et al. | Control of in vitro neural differentiation of mesenchymal stem cells in 3D macroporous, cellulosic hydrogels | |
| Stacpoole et al. | Neural precursor cells cultured at physiologically relevant oxygen tensions have a survival advantage following transplantation | |
| Lichtenberg et al. | A multifunctional bioreactor for three-dimensional cell (co)-culture | |
| Palumbo et al. | CAM model: Intriguing natural bioreactor for sustainable research and reliable/versatile testing | |
| RU2477752C1 (en) | Method of stimulating liver stem cell differentiation in vitro in tissue-specific direction | |
| Fuku et al. | Evaluation of the usefulness of human adipose-derived stem cell spheroids formed using SphereRing® and the lethal damage sensitivity to synovial fluid in vitro | |
| RU2665818C1 (en) | Method for stimulating granulocyte colony stimulating factor production by bone marrow cells in vitro | |
| RU2439147C1 (en) | Method of stimulation in vitro pluripotent hemopoetic stem cells | |
| Huang et al. | A study of the differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth on 3D silk fibroin scaffolds using static and dynamic culture paradigms | |
| Kim et al. | Mycoplasma detection and elimination are necessary for the application of stem cell from human dental apical papilla to tissue engineering and regenerative medicine | |
| Grossemy et al. | Stimulation of cell growth and neurogenesis using protein-functionalized microfibrous scaffolds and fluid flow in bioreactors | |
| Gharravi et al. | Status of tissue engineering and regenerative medicine in Iran and related advanced tools: Bioreactors and scaffolds | |
| CN105378065A (en) | Method for producing graft material for treating nerve damage | |
| CN109576308A (en) | A kind of method and its application improving human stem cells source hepatic lineage function of detoxification | |
| RU2589288C1 (en) | METHOD FOR STIMULATING PRODUCTION OF ERYTHROPOIETIN IN A CELL CULTURE in vitro | |
| RU2399664C1 (en) | Method for determination of production of stem cell homing factors | |
| CN102690782A (en) | Fibroblast culture solution | |
| Nazneen et al. | Isolate and Culture Mouse Primary Neurons for West Nile Virus Infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140218 |