RU2474610C1 - Method of separating haematopoietic stem cells - Google Patents
Method of separating haematopoietic stem cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2474610C1 RU2474610C1 RU2012109054/10A RU2012109054A RU2474610C1 RU 2474610 C1 RU2474610 C1 RU 2474610C1 RU 2012109054/10 A RU2012109054/10 A RU 2012109054/10A RU 2012109054 A RU2012109054 A RU 2012109054A RU 2474610 C1 RU2474610 C1 RU 2474610C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stem cells
- amount
- hsc
- cells
- separating
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title abstract description 7
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 title abstract 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 17
- FXWGWZQOSOJYOC-UHFFFAOYSA-N propane-1,2,3-triol;titanium Chemical compound [Ti].OCC(O)CO FXWGWZQOSOJYOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012453 solvate Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 13
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 239000010936 titanium Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 102000013925 CD34 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108050003733 CD34 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101001065556 Mus musculus Lymphocyte antigen 6G Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000018901 negative regulation of programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выделению гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови, и может быть использовано при культивировании стволовых клеток с последующим их использованием в клеточной терапии.The invention relates to the field of biotechnology, specifically to the isolation of hematopoietic stem cells from cord blood, and can be used in the cultivation of stem cells with subsequent use in cell therapy.
На сегодняшний день существуют различные способы выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).Today, there are various ways to isolate hematopoietic stem cells (HSCs).
Известен способ выделения ГСК мыши с использованием прямой иммуномагнитной сепарации с использованием антител к антигенам стволовых клеток -1 (SCA-1+), CD 117+.. Этот способ заключается в выделении из первичной суспензии клеток только SCA-1+ клеток (Catalog 2010 StemCell Technologies, Канада. P.236). Однако на сегодняшний день не выделен какой-либо один специфический маркер ГСК. Таким образом, происходит существенная потеря клеток и снижается выход целевого продукта.A known method for the isolation of mouse HSCs using direct immunomagnetic separation using antibodies to stem cell antigens -1 (SCA-1 + ), CD 117 +. . This method consists of isolating only SCA-1 + cells from a primary cell suspension (Catalog 2010 StemCell Technologies, Canada. P.236). However, to date, no one specific marker of HSC has been isolated. Thus, a significant loss of cells occurs and the yield of the target product is reduced.
Известен также способ выделения ГСК мыши с использованием непрямой иммуномагнитной сепарации, ориентированной лишь на один маркер ГСК, в данном случае отрицательный маркер Lin- (Catalog 2010 StemCell Technologies, Канада. P.236).There is also a known method for isolating mouse HSCs using indirect immunomagnetic separation that focuses on only one HSC marker, in this case, a negative Lin marker - (Catalog 2010 StemCell Technologies, Canada. P.236).
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ выделения гемопоэтических стволовых клеток методом непрямой иммуномагнитной сепарации с использованием буфера, состоящего из 0,5% BSA (интерактивной фетальной бычьей сыворотки) и 2 ммоль ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (Goodel MA, Rosenweig М., Kim Н, et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 1977; 3 (12): 1337-1345 / (Biology).The closest technical solution to the claimed is a method for the isolation of hematopoietic stem cells by indirect immunomagnetic separation using a buffer consisting of 0.5% BSA (interactive fetal bovine serum) and 2 mmol EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) (Goodel MA, Rosenweig M., Kim H, et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 1977; 3 (12): 1337-1345 / (Biology).
Данный способ позволяет получить суспензию, обогащенную гемопоэтическими стволовыми клетками, однако выход жизнеспособных клеток, полученных таким образом, недостаточно высок - 82%. Техническим результатом изобретения является получение максимально возможного выхода целевого продукта - ГСК за счет увеличения содержания жизнеспособных клеток.This method allows to obtain a suspension enriched in hematopoietic stem cells, however, the yield of viable cells obtained in this way is not high enough - 82%. The technical result of the invention is to obtain the maximum possible yield of the target product - HSC by increasing the content of viable cells.
Технический результат достигается тем, что в способе выделения гемопоэтических стволовых клеток методом непрямой иммуномагнитной сепарации с использованием инактивированной фетальной бычьей сыворотки и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) инактивированную фетальную бычью сыворотку (BSA) вводят в количестве 4%, а ЭДТА - в количестве 0,5 ммоль и дополнительно в полученный состав вводят 5%-ный водный раствор аквакомплекса глицеросольвата титана (АГТ).The technical result is achieved by the fact that in the method for isolation of hematopoietic stem cells by indirect immunomagnetic separation using inactivated fetal bovine serum and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), inactivated fetal bovine serum (BSA) is administered in an amount of 4%, and EDTA in an amount of 0.5 mmol and additionally, a 5% aqueous solution of titanium glycerosolvate aquacomplex (AGT) is added to the resulting composition.
Сущность изобретения состоит в использовании непрямой иммуномагнитной сепарации с измененным составом буфера, который обеспечивает угнетение запрограммированной гибели клеток (апоптоз) за счет увеличения факторов роста BSA и АГТ. В результате появляется возможность выделить отдельно ГСК и клетки крови, отличающиеся от ГСК по набору поверхностных антигенов. Изменение состава буфера для иммуномагнитной сепарации (БИМС) позволяет получить более высокое содержание целевого продукта. Содержание инактивированной фетальной бычьей сыворотки (BSA) в количестве 4%, ЭДТА - 0,5 ммоль с добавлением в полученный состав БИМС 5%-ного водного раствора аквакомплекса глицеросольвата титана (АГТ) в количестве 1% от количества полученного состава способно существенно увеличить содержание жизнеспособных ГСК, т.е. увеличить выход целевого продукта - ГСК.The essence of the invention consists in the use of indirect immunomagnetic separation with a modified buffer composition, which provides inhibition of programmed cell death (apoptosis) by increasing the growth factors of BSA and AGT. As a result, it becomes possible to separate HSCs and blood cells that differ from HSCs in a set of surface antigens. Changing the composition of the buffer for immunomagnetic separation (BIMS) allows to obtain a higher content of the target product. The content of inactivated fetal bovine serum (BSA) in an amount of 4%, EDTA - 0.5 mmol with the addition of a 5% aqueous solution of titanium glycerosolvate aquacomplex (AGT) in the BIMS composition in an amount of 1% of the amount of the obtained composition can significantly increase the content of viable GSK, i.e. increase the yield of the target product - GSK.
Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемого состава буфера для иммуномагнитной сепарации в совокупности с аквакомплексом глицеросольвата титана (АГТ), позволяющего существенно увеличить содержание жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток, нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».From an analysis of the scientific, technical and patent literature of the claimed composition of the buffer for immunomagnetic separation in conjunction with the aquacomplex of titanium glycerol solvate (AGT), which can significantly increase the content of viable hematopoietic stem cells, we have not identified, which allows us to conclude that the claimed technical solution meets the criteria of "novelty" and "inventive step".
Изобретение осуществляется следующим образом.The invention is as follows.
После получения пуповинной крови лабораторных мышей доводят объем выделенной крови до 1,0 мл с помощью буфера для окрашивания. При этом состав буфера для окрашивания берут следующий: фосфатный буфер без ионов Са2+ и Mg2+ с добавлением 3% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS). Производят подсчет клеток в камере Горяева (Е.А.Кост. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - М., Медицина, 1975, с.33-34, 137-138). К полученной таким образом суспензии клеток добавляют мышиные антитела к CD16C/CD32 в соотношении 0,25 мкг/млн клеток. Инкубируют 15 мин на льду. После чего добавляют коктейль антител (Anti-mouse CD3e, clone 145-2С11, Anti-mouse CD45R/B220, clone RA3-6B2, Anti-mouse TER-119 / Erythroid Cell, clone TER-119, Anti-mouse CD11, clone M1/70, Anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1), clone RB 6-8C5) в концентрации 5 мкл/млн клеток. Полученный состав инкубируют 15 мин на льду. Ресуспендируют полученную суспензию клеток в 1,0 мл БИМС (фосфатный буфер с содержанием 4% BSA и 0,5 ммоль ЭДТА) +10,0 мкл (1% от 1,0 мл БИМС) 5%-ного водного раствора АГТ. Затем центрифугируют при 300 g в течение 7 минут. Полученный осадок клеток ресуспендируют в БИМС до объема 1,1 мл. Добавляют частицы для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM 5 мкл/млн клеток. Охлаждают 30 мин при 6-12°С. После чего меченые антителами клетки переносят в 5 мл пробирку Falcon. Инкубируют 8 мин на иммуномагнитном сепараторе (ИМС). Удаляют супернатант (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, содержащая обогащенную фракцию ГСК в новую пробирку Falcon. Добавляют БИМС и ресуспендируют 10-15 раз, затем инкубируют 8 мин на ИМС. Удаляют супернатант в прежнюю пробирку Falcon. Пробирку с суспензией клеток после негативной селекции инкубируют 8 минут на ИМС. Удаляют супернатант - это и будет конечная фракция, обогащенная ГСК методом ИМС. Используя набор антител определяют содержание гемопоэтических стволовых клеток в полученной суспензии.After receiving the cord blood of laboratory mice, the volume of the isolated blood was adjusted to 1.0 ml using a staining buffer. The composition of the staining buffer is as follows: phosphate buffer without Ca 2+ and Mg 2+ ions with the addition of 3% inactivated fetal bovine serum (FBS). Cells are counted in the Goryaev’s chamber (E.A. Kost. Reference to clinical laboratory research methods. - M., Medicine, 1975, pp. 33-34, 137-138). To the cell suspension thus obtained, murine anti-CD16C / CD32 antibodies were added in a ratio of 0.25 μg / million cells. Incubate for 15 minutes on ice. Then add a cocktail of antibodies (Anti-mouse CD3e, clone 145-2C11, Anti-mouse CD45R / B220, clone RA3-6B2, Anti-mouse TER-119 / Erythroid Cell, clone TER-119, Anti-mouse CD11, clone M1 / 70, Anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1), clone RB 6-8C5) at a concentration of 5 μl / million cells. The resulting composition was incubated for 15 minutes on ice. Resuspend the resulting cell suspension in 1.0 ml of BIMS (phosphate buffer containing 4% BSA and 0.5 mmol EDTA) + 10.0 μl (1% of 1.0 ml BIMS) of a 5% aqueous AGT solution. Then centrifuged at 300 g for 7 minutes. The resulting cell pellet was resuspended in BIMS to a volume of 1.1 ml. Particles were added to separate Streptavidin Particles Plus - DM 5 μl / million cells. Cool for 30 minutes at 6-12 ° C. Then, antibody-labeled cells are transferred to a 5 ml Falcon tube. Incubated for 8 min on an immunomagnetic separator (IMS). Remove the supernatant (suspension obtained by negative selection containing the enriched HSC fraction in a new Falcon tube. Add BIMS and resuspend 10-15 times, then incubate for 8 min on an IC. Remove the supernatant in the old Falcon tube. Tube with cell suspension after negative selection incubated for 8 minutes on the IMS. The supernatant is removed - this will be the final fraction enriched with HSC by the IMS method. Using a set of antibodies, the content of hematopoietic stem cells in the resulting suspension is determined.
Выход целевого продукта (ГСК) по изобретению и по прототипу приведены в таблице.The yield of the target product (HSC) according to the invention and the prototype are shown in the table.
Как видно из таблицы, при одинаковом общем выходе ГСК содержание жизнеспособных клеток в них, полученных заявляемым способом, на 17% выше, чем полученных по прототипу.As can be seen from the table, with the same total output of HSCs, the content of viable cells in them obtained by the claimed method is 17% higher than that obtained by the prototype.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012109054/10A RU2474610C1 (en) | 2012-03-11 | 2012-03-11 | Method of separating haematopoietic stem cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012109054/10A RU2474610C1 (en) | 2012-03-11 | 2012-03-11 | Method of separating haematopoietic stem cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2474610C1 true RU2474610C1 (en) | 2013-02-10 |
Family
ID=49120422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012109054/10A RU2474610C1 (en) | 2012-03-11 | 2012-03-11 | Method of separating haematopoietic stem cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2474610C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2628092C1 (en) * | 2016-02-10 | 2017-08-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) | Method for obtaining of msc-associated non-differentiated hemopoietic precursor cells with cd34+/cd133+ phenotype |
| RU2833142C1 (en) * | 2024-08-27 | 2025-01-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского" (ФГБНУ "РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского") | Method for separation of stromal-vascular fraction from adipose tissue |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6605275B1 (en) * | 1987-11-12 | 2003-08-12 | Pharmastem Therapeutics, Inc. | Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood |
| RU2292895C2 (en) * | 2005-04-18 | 2007-02-10 | ГУ Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН | Method for selecting mononuclear human bone marrow cells |
| RU2433176C2 (en) * | 2009-12-14 | 2011-11-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Омский государственный педагогический университет" (ГОУ ОмГПУ) | METHOD OF ISOLATING HEPATOCYTES FROM BIRDS OF GENUS Columba livia |
-
2012
- 2012-03-11 RU RU2012109054/10A patent/RU2474610C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6605275B1 (en) * | 1987-11-12 | 2003-08-12 | Pharmastem Therapeutics, Inc. | Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood |
| RU2292895C2 (en) * | 2005-04-18 | 2007-02-10 | ГУ Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН | Method for selecting mononuclear human bone marrow cells |
| RU2433176C2 (en) * | 2009-12-14 | 2011-11-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Омский государственный педагогический университет" (ГОУ ОмГПУ) | METHOD OF ISOLATING HEPATOCYTES FROM BIRDS OF GENUS Columba livia |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2628092C1 (en) * | 2016-02-10 | 2017-08-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) | Method for obtaining of msc-associated non-differentiated hemopoietic precursor cells with cd34+/cd133+ phenotype |
| RU2833142C1 (en) * | 2024-08-27 | 2025-01-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского" (ФГБНУ "РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского") | Method for separation of stromal-vascular fraction from adipose tissue |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Avanzini et al. | Generation of mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate: a phenotypic and functional comparison of umbilical cord blood-and bone marrow-derived progenitors | |
| JP5341525B2 (en) | Methods and compositions for enhancing hematopoietic stem cell engraftment | |
| Xing et al. | Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells | |
| US20190353643A1 (en) | Method For Sorting Highly Effective Stem Cells For Treating Immune Disorder | |
| US12011461B2 (en) | Compositions and methods of hematopoietic stem cell transplants | |
| Portevin et al. | Regulatory activity of azabisphosphonate-capped dendrimers on human CD4+ T cell proliferation enhances ex-vivo expansion of NK cells from PBMCs for immunotherapy | |
| KR101948534B1 (en) | Mass Propagation Method Of NK Cells By Controlling The Density Of Cells | |
| Yin et al. | An optimized protocol for the generation and functional analysis of human mast cells from CD34+ enriched cell populations | |
| Ishida et al. | Pre-transplantation blockade of TNF-α-mediated oxygen species accumulation protects hematopoietic stem cells | |
| Bacher et al. | Clinical-scale isolation of the total Aspergillus fumigatus–reactive T–helper cell repertoire for adoptive transfer | |
| Capra et al. | Changes in the proteomic profile of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells during passages | |
| Salot et al. | Large scale expansion of γ9δ2 T lymphocytes: Innacell γδ™ cell therapy product | |
| CN103710306A (en) | Method used separating and purifying microglia cells | |
| CN113677789A (en) | immune regulatory mesenchymal stem cells | |
| CN109453198A (en) | The treatment or prevention method of graft versus host disease | |
| RU2474610C1 (en) | Method of separating haematopoietic stem cells | |
| Lorentz et al. | Isolation and characterization of human intestinal mast cells | |
| Chesneau et al. | New method for the expansion of highly purified human regulatory granzyme B-expressing B cells | |
| Windmolders et al. | Clinical‐scale in vitro expansion preserves biological characteristics of cardiac atrial appendage stem cells | |
| WO2018106610A1 (en) | Immunomagnetic bead-based method to enrich stem cells from whole hematopoietic tissue | |
| Duits et al. | In vitro assessment of cancer cell-induced polarization of macrophages | |
| Ong et al. | Cotransplantation of Ex Vivo Expanded and Unexpanded Cord Blood Units in Immunodeficient Mice Using Insulin Growth Factor Binding Protein-2–Augmented Mesenchymal Cell Cocultures | |
| Asl et al. | Cord blood stem cell-generated KIR+ NK cells effectively target leukemia cell lines | |
| Zhang et al. | An innovative method to generate a Good Manufacturing Practice–ready regulatory T-cell product from non-mobilized leukapheresis donors | |
| Gabryšová et al. | Glycosylation-dependent modulation of the lL-2 signaling axis determines Th17 differentiation and IL-10 production |