RU2471864C1

RU2471864C1 - Пробиотический препарат против вирусных и бактериальных инфекций "токсиспорин", способ его получения, штамм бактерий bacillus licheniformis, используемый в качестве компонента пробиотического препарата

Info

Publication number: RU2471864C1
Application number: RU2011151497/10A
Authority: RU
Inventors: Михаил Юрьевич Волков; Наталья Яковлевна Буяновская
Original assignee: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "БИО Агат Групп"
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2011-12-13
Publication date: 2013-01-10

Abstract

Пробиотический препарат против вирусных и бактериальных инфекций содержит смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161 в споровой форме с титром не менее 10⁹спор/г, и глауконит. Оптимальное содержание спор бактерий Bacillus subtilis в их смеси со спорами Bacillus lichenifbrmis составляет 50%. Препарат получают раздельным культивированием вышеоговоренных бактерий в глюкозо-мелассной среде при рН - 6,8-7,0, получают смесь спор в количестве 0,1-1 мас.% от массы препарата и смешивают ее с глауконитом до содержания КОЕ не менее 10⁹ спор/г. Для приготовления препарата используют штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161. Изобретение обеспечивает расширение ассортимента пробиотиков, обладающих высокой антибактериальной и антивирусной активностью, и повышение терапевтической эффективности при лечении и профилактике вирусных и бактериальных инфекций. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 15 табл., 8 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пробиотическим препаратам, используемым в медицине и ветеринарии для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека и животных, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами, а также дисбактериозов, обусловленных этиологически разнородными факторами (инфекциями, антибиотике- и химиотерапией, ионизирующими излучениями, острыми и хроническими интоксикациями и др.) и технологии их получения.

В настоящее время известно большое число пробиотических препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека и животных (ЕР 0097484, 1984, кл. А23С 1/05; ЕР 0043962, 1980, кл. А23С 19/086; US 4289888, 1979, кл. А23С 9/123). Такой препарат, как правило, содержит клетки бактерий, остатки культуральной жидкости (КЖ), жиры, белки, лактозу, камедь и другие добавки. Технология их получения включает в себя, как правило, подготовку раствора или взвеси биомассы микроорганизмов, введение в нее специальных добавок, сублимационное высушивание и получение готового продукта. Условия процесса и состав композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.

Так, известен препарат и способ его получения (RU 2080795, 10.06.1997). Данный препарат содержит живые клетки Lactobacillus acidophilus, желатин, сахарозу, обезжиренное молоко, воду, остатки культуральной жидкости. Способ его получения предусматривает культивирование бактерий Lactobacillus acidophilus в жидкой питательной среде, введение защитной среды, содержащей желатин, сахарозу, обезжиренное молоко, замораживание при температуре - 30 - (-)35°С в течение 18-12 часов, сублимационную сушку в течение 45-52 часов.

Недостатком препарата является относительно невысокая эффективность, ограниченная область применения, а также невозможность длительного хранения.

В настоящее время одним из перспективных направлений для обеспечения оздоровляющего воздействия на ЖКТ является применение препаратов, содержащих несколько штаммов микроорганизмов, обладающих синергетическим действием.

Известен препарат (RU 2160992, А23С 9/12; 27.12.2000), содержащий жизнеспособные клетки 2-х симбиотических штаммов Lactobacillus acidophilus, остатки культуральной жидкости (КЖ) и вспомогательные вещества - желатин, сахарозу, обезжиренное молоко. Способ его получения предусматривает культивирование бактерий в жидкой питательной среде, введение защитной среды, содержащей желатин, сахарозу и обезжиренное молоко, замораживание при температуре минус 25-30°С в течение 2-3 часов и сублимационную сушку в течение 45-48 часов.

Недостатком препарата является его недостаточная эффективность в отношении повышения резистентности организма к неблагоприятным условиям внешней среды, недостаточная термоустойчивость, относительно узкий спектр воздействия на организм.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемой группе изобретений является препарат для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека, содержащий живые клетки штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 в споровой форме с титром не менее 3×10¹⁰ спор/г, а также наполнитель (RU №2142287, А61К 35/74, 1999).

Препарат характеризуется высокой антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов, однако в него входят живые микроорганизмы, чувствительные к антибиотикам, поэтому препарат не рекомендуется применять при лечении совместно с антибиотиками, он не обладает противовирусным действием, а также антиоксидантной и ионообменной активностью.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание нового пробиотика с повышенной эффективностью на основе симбиотических культур, имеющего более выраженную амилолитическую, протеолитическую и антагонистическую активность в отношении болезнетворных микроорганизмов, и способного храниться в широком диапазоне потребительских температур.

Задача - создание препарата на основе штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, обладающих повышенной термостабильностью, и иммобилизированых на природном ионообменнике и адсорбенте - глауконит. При этом предлагалось использовать микроорганизмы, способные подавлять рост как грибков (трихофитов, микроспориумов, эпидермофитонов, кандидомикозов и т.д.), так и болезнетворных бактерий - штаммов стафилококка, стрептококка, сальмонелл и др.

Технический результат заключается в расширении ассортимента пробиотиков, обладающих высокой антибактериальной и антивирусной активностью, и повышении терапевтической эффективности при лечении и профилактике вирусных и бактериальных инфекций.

Проведенные исследования показали, что иммобилизация спор бактерий, на глауконите обеспечивает им механическую защиту, длительный срок хранения, предотвращает слипание спор бактерий, способствует ускорению прорастания спор бактерий и пролонгированность действия, что повышает эффективность препарата и позволяет не менее суток поддерживать его активность на требуемом уровне.

При этом глауконит дополнительно обеспечивает связывание и выведение низкомолекулярных токсинов (метан, сероводород, аммиак и др.), тяжелых металлов и радионуклидов, участвует в селективном ионообмене (снимает или уменьшает негативное влияние на организм ионов алюминия, синергически взаимодействует с магнием и фтором, является дополнительным источником микроэлементов).

Технический результат был достигнут созданием группы изобретений, включающей в себя:

штамм бактерий Bacillus licheniformis, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-4161;

препарат, включающий смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в споровой форме и наполнителя, отличающийся тем, что в качестве биомассы штаммов бактерий он содержит биомассу штаммов бактерий Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161 в споровой форме с титрорм не менее 10⁹ спор/г, а в качестве наполнителя - глауконит при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

смесь спор бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis - 0,1-1,0;

глауконит - остальное;

способ получения препарата, включающий в себя раздельное культивирование бактерии Bacillus sub-tilis 3/28 ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis Л-34 ВКПМ В-4161 на глюкозо-мелассной среде при рН - 6,8-7,0, смешение полученной биомассы штаммов в споровой форме в соотношении 1:1 между собой и затем в количестве 0,1-1% мас. от массы препарата с глауконитом до содержания КОЕ не менее 10⁹ спор/г.

Оптимальные результаты достигаются при использовании спор микроорганизмов в равном соотношении, однако возможно их использование при несколько большей или меньшей доле одного из штаммов в смеси, например, в количестве 40-60% от общей массы смеси.

Высокий титр спор бактерий при культивировании (10¹² спор/г и более) обеспечивается за счет использования глюкозо-мелассной среде, оптимальной для выбранных микроорганизмов, имеющей следующий состав:

(NH₄)₂SO₄ - 10,0 г/дм³; КН₂РO₄ - 4,0 г/дм³; меласса - 50,0 г/дм³;

глюкоза - 20,0 г/дм³; соевый пептон 2,0 г /дм³; дрожжевой экстракт - 3,0 г/дм³, и проведения культивирования в следующих условиях: температура 37°С; аэрация -1,0 объем воздуха/объем среды в минуту; скорость перемешивания 250 об/мин; рO₂ - 40-60% от насыщения, время культивирования 24-36 часов.

Микроорганизмы до стадии смешения, как правило, подвергают сублимационной сушке, после чего смешивают сублимационно высушенную биомассу Bacillis subtilis 3/28 ВКПМ В-3679 и Bapillis licheniformis Л-34, ВКПМ В-4161 с глауконитом или напыляют биомассу на глауконит в сушильных установках или вакуумных аппаратах.

Иcпользуемые в композиции штампы обладают следующими характеристиками.

Штамм бактерий Bacillus subtilis 3/28, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-3679. Штамм выделен из грубых кормов и подвергался многостадийной селекции на подавление бактериального и грибкового роста.

Штамм не является патогенным - Заключение ОАО Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ), 2008 г.

Штамм ВКПМ В-3679 продуцирует биоспорицин - антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост грибков, стафилококков, стрептококков и синегнойной палочки.

С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста: трихофитов, микроспориумов, эпидермофитонов, кандидомикозов и других грибков.

При длительном хранении штамма субстанцию лиофильно высушивают. Для размножения бактерий используют мясопептонный агар (МПА), а культивирование проводят при температуре 37°С.

В качестве компонента пробиотического препарата, используемого для подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры, оказывающего противовоспалительное и иммунокорректирующее действие, описан в патенте RU 2367454, 20.09.2009.

Изучаемая культура характеризуется отсутствием гемолитической активности (табл.1).

Таблица 1
Физиолого-биохимические свойства штамма B.subtilis ВКПМ В-3679
Рост в анаэробных условиях	-
Ферментация
Глюкозы	+
арабинозы	+
ксилозы	+
маннита	+
Утилизация
цитрата	+
пропионата	-
Гидролиз
крахмала	+
мочевины	-
Редукция нитратов	+
Образование газа из NO₃ ^- в анаэробных условиях
Обесцвечивание метиленовой сини	+
Аргининдигидролаза	-
Лецитиназа	-
Гиалуронидаза	-
Гемолитическая активность	-
Образование глобул поли-^β-оксимасляной кислоты на глюкозном агаре
Лизоцимная активность	+

Как свидетельствуют данные, секционированный штамм Bacillus subtilis характеризуется типичными для этого вида физиолого-биохимическими признаками, которые могут обусловить широкий диапазон положительного действия при применении.

Антибиотикочувствительность. Исследования антибиотикоустойчивости штамма В.subtilis в отношении антибиотиков и антибиотических веществ, широко применяемых в практике здравоохранения, показали, что штамм обладает устойчивостью к ампициллину, бензилпенициллину, азтреонаму, цефтазидиму, цефтизоксиму и полимиксину Е (табл.2).

Таблица 2
Антибиотикочувствительность штамма B.subtilis ВКПМ В-3679
Изучаемый препарат	Диаметр зон задержки роста культур, мм
	B.subtilis 3А
Амоксициллин	18±0,1
Ампициллин	10±0,3
Мезлоциллин	20±0,3
Метициллин	18±0,1
Оксациллин	14±0,3
Бензилпенициллин	8±0,1
Азтреонам	0
Имипенем	36±0,4
Моксалактам	12±0,3
Цефалотин	32±0,5
Цефамандол	37±0,1
Цефоперазон	16±0,1
Цефотаксим	14±0,2
Цефтазидим	8±0,2
Цефтизоксим	0
Цефтриаксон	18±0,3
Амикацин	20±0,2
Гентамицин	24±0,2
Канамицин	23±0,1
Тобрамицин	24±0,3
Ванкомицин	12±0,1
Клиндамицин	10±0,3
Тетрациклин	24±0,3
Хлорамфеникол	16±0,2
Полимиксин Е	10±0,1
Нитрофурантоин	16±0,2
Триметоприм	24±0,1
Норфлоксацин	24±0,2

Штамм бактерий Bacillus licheniformis Л-34, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-4161. Штамм выделен из молока и получен многостадийным селекционным путем. Штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибкового роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста болезнетворных штаммов: стафилококка, стрептококка, сальмонелл, трихофитов, микроспориумов, эпидермофитонов, кандидомикозов и др.

Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма Вас.licheniformis ВКПМВ-4161. Штамм ВКПМ В-4161 относится к аэробам; грамположительная палочка, способная образовывать споры. Размеры вегетативных клеток (0,5-0,8) мкм и (1,5-3) мкм, иногда достигают до 6 мкм. Споры эллиптические, преимущественно расположены центрально, не более одной в клетке-спорангии, без отчетливой раздутости спорангии.

Вегетативные клетки В.licheniformis ВКПМ В-4161 хорошо растут на богатых питательных средах (мясопептонный бульон - МПБ и мясопептонный агар - МПА) при температуре (37-40)°С. Нет роста в присутствии 0,02% азида, но наблюдается рост на агаре Сабуро, при 7% NaCl и при добавлении 0,001%лизоцима.

Наблюдается слабый рост в анаэробном агаре.

На мясопептонном бульоне рН (7,30,1) через 48 часов инкубации при температуре (371)°С образует помутнение среды, а на поверхности - сухую пленку; на мясопептонном агаре Хоттингера рН (7,30,1) - слабовыпуклые сухие непрозрачные белесые колонии, полиморфные, мелкозернистые диаметром (4-6) мм, врастающие в питательную среду.

Биохимические свойства. Вегетативные клетки В.licheniformis ВКПМ В-4161 гидролизуют казеин и крахмал, каталазоположительны. Реакция Фогес-Проскауэра положительная.

Штамм не является патогенным - Заключение ОАО ВНЦ БАВ 2008 г.

Штамм ВКПМ В-4161 продуцирует протеолитические ферменты, подавляющие рост грибков, стафилокков, стрептококков и синегнойной палочки.

Терапевтическое действие препарата заключается в эффективном устранении условно-патогенной микрофлоры и восстановлении нормофлоры.

Препарат на основе ассоциации спор бактерий рода Bacillus получил условное наименование ТОКСИСПОРИН (заявителем подана заявка на товарный знак).

ТОКСИСПОРИН может использоваться как в сухой, так и в жидкой формах, путем введения в корм или пищу или самостоятельно. Для лечения препарат назначают перорально из расчета 1 кг препарата на 1 т корма или от 3 до 10 г на голову до выздоровления организма.

Препарат эффективен для всех видов млекопитающих при лечении и профилактике колибактериозов, дисфункций и дисбактериозов различной природы, чумки, парагриппа, гриппа, диспепсии, сальмонеллезов, инфекционного ринотрахеита крупнорогатого скота, вирусной диареи, ротавирусного энтерита, дизентерии, стафилококковых инфекций, везикулярного стоматита, язвенного дерматита, а также для профилактики иммунодефицитных состояний.

Препарат обладает одновременно антибактериальной и антивирусной активностью за счет высокой антагонистической активности микробной ассоциации спор бактерий рода Bacillus и действия глауконита, а также стимулирует клеточные и гуморальные факторы иммунитета и способен повышать неспецифическую резистентность организма.

Ассоциация бактерий, иммобилизированная на глауконите, отличается высокой устойчивостью к пищеварительным сокам и ферментам желудочно-кишечного тракта млекопитающих и способностью к быстрому заселению желудка и кишечника. При приеме внутрь с водой или пищей бактерии размножаются в желудочно-кишечном тракте в течение 3-6 суток, затем они полностью выводятся из организма, не вызывая негативных последствий даже при передозировке.

Размножаясь, бактерии своими протеазами лизируют все несвойственные организму млекопитающего белки, денатурированные белки и нуклеопротеиды. При этом уничтожаются бактериальные токсины, элементы опухолевых новообразований и другие дефектные клетки. Здоровые клетки остаются неповрежденными благодаря наличию в них ингибиторов-антиферментов.

Предлагаемый способ достаточно технологичен, не требуется использование дорогих ферментов на стадии культивирования, не требуется очистка и концентрирование препарата; удаление или перераспределение влаги совмещено с получением готовой формы препарата.

Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Штаммы B.subtilis ВКПМ В-3679 и В.licheniformis ВКПМ В-4161 культивировали на среде Громыко (мясо-пептонный агар+сусло-агар в соотношении 1:1) при 37°С в течение 48 часов. Бактерии смывали с поверхности агара 7%-ным раствором NaCl и прогревали при 121°С в течение 15 мин. Полученный лизат разводили физиологическим раствором до получения вариантов с различной концентрацией клеток (по оптическому стандарту мутности). В другом варианте бактерии смывали с поверхности агара 7%-ным раствором NaCl и разводили физиологическим раствором до получения вариантов с различной концентрацией клеток (по оптическому стандарту мутности).

Вариант 1

Лизат биомассы штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×10⁸ КОЕ/мл

Вариант 2

Лизат биомассы штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×10⁹ КОЕ/мл

Вариант 3

Лизат биомассы штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×10¹⁰ КОЕ/мл

Вариант 4

Лизат биомассы штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×10¹¹ КОЕ/мл

Вариант 5

Биомасса штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×10⁸ КОЕ/мл

Вариант 6

Биомасса штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×10⁹ КОЕ/мл

Вариант 7

Биомасса штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×10¹⁰ КОЕ/мл

Вариант 8

Биомасса штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×10¹¹ КОЕ/мл

Изучали антагонистическую активность полученных вариантов препарата в отношении тест-культур (Таблица 3).

Таблица 3
Антагонистическая активность различных вариантов пробиотика
Варианты препарата	Зона подавления роста тест-культур, мм
Варианты препарата	Staphylococcus aures	Salmonella typhimurium	Shigella zonnei	Candida albicans
1	22	9	9	17
2	25	11	9	20
3	28	12	10	22
4	26	10	10	19
5	6	10	9	21
6	6	12	10	23
7	29	13	12	25
8	27	11	12	24

Как видно из данных, приведенных в таблице 3, оптимальным количеством микробных клеток в 1 мл препарата является - 1×10⁹-1×10¹⁰ КОЕ/мл как живых клеток, так и их лизатов. Дальнейшее увеличение количества бактериальных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Пример 2. Исследование антагонистической активности штаммов В.subitilis ВКПМ В-3679 и В.licheniformis ВКПМ В-4161

Антагонистическую активность в отношении тест-культур проверяют методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-культур используют Shigella sonnei, Salmonella typhimurium. S.stenly, S.reading, S.derby, Staphylococous aureus, Pseudomonas aeruginose, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, C.tropicalis и др. Используемые тест-микробы должны удовлетворять следующим требованиям: находиться в S-форме, иметь типичные морфологические и ферментативные свойства.

Используемые штаммы тест-микробов давали положительную керато-конъюнктивальную пробу на морских свинках.

Тест-штаммы стафилококков образовывали зону гемолиза размером 3-5 мм вокруг своих колоний через 18-20 часов роста на кровяном агаре, коагулировали плазму крови кролика в течение 2-х часов, вызывали некроз в течение 48-72 часов при внутрикожном введении кролику 200 млн микробных клеток суточной культуры в 0,2 мл физиологического раствора.

Исследование антагонистической активности штаммов В.subtilis ВКПМ В-3679 и В.licheniformis ВКПМ В-4161 производили на плотной среде Гаузе N2.

Рецептура плотной среды Гаузе N2 на 1 л:

1. Бульон Хоттингера (700 мг% общего азота) - 30 мл

2. Пептон - 5 г

3. Натрия хлорид - 5 г

4. Глюкоза - 10 г

5. Агар микробиологический - 15 г

6. Дистиллированная вода - до общего объема 1 л.

После смешивания компонентов среду разогревали до полного растворения агара и фильтровали через ватно-марлевый фильтр в колбы по 0,3-0,4 л. Колбы со средой стерилизовали в автоклаве при давлении 0,1 МПа в течение 15 мин. После остывания до температуры (45±2)°С среду разливали по стерильным чашкам Петри. Чашки Петри со средой помещали в термостат и выдерживали при температуре (371)°С в течение (24±2) часов для проверки стерильности.

Культуры Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Candida albicans и другие вышеуказанные тест-культуры выращивали на чашках Петри в течение (18±2) часов на мясопептонном агаре (МПА). В стерильные пробирки приливали по 1 мл физиологического раствора и готовили суспензии тест-штаммов с концентрацией (3,0±0,2)10⁹ клеток/мл.

Для проведения испытания от каждой серии отбирали четыре пробы по 2 г. Далее 0,5 г препарата на основе штамма В.subtilis разводили в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали штрихом с помощью микробиологической петли по диаметру чашки Петри с плотной средой Гаузе N2. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсеивали посевной материал тест-микробов методом перпендикулярных штрихов.

Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служил их параллельный высев на чашки с той же плотной средой Гаузе N2 без исследуемой ассоциации культур.

Штамм В.subtilis ВКПМ В-3679 характеризуется следующими показателями зон задержки роста тест-культуры (мм):

Shigella sonnei - 17-22

Salmonella typhimarium - 21-25

S.stenly - 13-17

S.reading - 14-18

S.derby - 15-18

Staphylococcus aureus - 22-27

Pseudomonas fluoresocens - 8-10

Pseudomonas vulgaris - 10-12

Pseudomonas aeruginose - 7-9

Proteus vulgaris - 12-14

Klebsiella pheumoniae - 13-15

Candida albicans - 25-32

С.tropicalis - 22-26

Штамм В.licheniformis 4161 характеризуется следующими показателями зон задержки роста тест-культуры (мм):

Shigella sonnet - 22-27

Salmonella typhimurim - 26-30

S.stenly - 18-22

S.reading - 19-23

S.derby - 20-23

Stapgylococcus aureus - 27-33

Pseudomonas aeruginose - 12-15

Proteus vulgaris - 17-19

Klebsiella pneumoniae - 18-20

Candida albicans - 30-34

С.tropicalis - 27-31

Таким образом, исследуемые штаммы бактерий имеют высокую антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

Следует отметить, что штаммы не проявляют антагонистическую активность в отношении представителей нормальной микрофлоры - бифидо-, лактобактерий и кишечной палочки и относительно друг друга.

Спектр биологической активности штамма B.subtilis ВКПМ В-3679 дополнительно изучали по диффузии продуцируемых биологически активных веществ (БАВ) в агар по зонам задержки роста тест-культур.

Тест-культуры в концентрации 10⁹ КОЕ/мл засевали на поверхность ага-ризованной среды (100 мкл суспензии/чашку). Сверлом (диаметр 6 мм) в агаре делали лунки, в которые вносили по 100 мкл лизата культуры B.subtilis. Чашки культивировали при 37°С в течение 24-48 часов. Активность препарата определяли по зонам угнетения роста штаммов.

Таблица 4
Спектр биологической активности штамма B.subtilis ВКПМ В-3679
Тест-культура	Зона задержки роста тест-культур, мм
S.aureus 209	13±1.8
S.aureus 3Ч	14±2.0
E.fecalis 115Ч	17±1.9
E.coli 22Ч	9±1.1
Enterobacter ssp.3Ч	10±1.4
Candida albicans 5Ч	16±2.0
Helicobacter pylori 2	14±1.3
H.pylori 1	11±0.7
H.pylori 5	15±1.4
H.pylori 38	12±1.2
H.pylori 11	13±0.9
H.pylori 54	16±1.7

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что пробиотический штамм B.subtilis ВКПМ В-3679 продуцирует биологически активные вещества широкого спектра специфического действия.

Пример 3. При промышленной технологии культивирование штаммов В.Subtilis и В.licheniformis ведется раздельно в ферментере с глюкозо-мелассной средой, содержащей: (NH₄)₂SO₄ - 10,0 г/дм³; KH₂PO₄ - 4,0 г/дм³; мелассу - 50,0 г/дм³; глюкозу - 20,0 г/дм³; соевый пептон - 2,0 г/дм³; дрожжевой экстракт - 3,0 г/дм³, рН 6,8-7,0, при температуре 37°С, скорости аэрации 1,0 об.воздуха/об.среды в минуту; скорости перемешивания 250 об/мин; pO₂ - 40-60% от насыщения в течение 24-36 и 30-36 ч соответственно.

Процесс считается законченным, если концентрация клеток составляет 3-3,5 и 1 млрд/мл соответственно и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1.

По окончании инкубации штаммов B.subtilis и В.licheniformis и смешивании в соотношении 1:1, смесь концентрируют на бактофуге с периодической выгрузкой пасты. Сепарирование культуральной жидкости проводят при скорости вращения ротора - 6000 об/мин. Скорость подачи культуральной жидкости 80-100 л/ч. Выгрузку производят через каждый час. Выход пасты по объему составляет 10-15% от объема культуральной жидкости. Содержание сухих веществ в пасте - 18-20%. По окончании сепарирования пасту охлаждают до 20°С, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом без добавления протекторов.

Концентрат лиофильно высушенных споровых культур Bacillis subtilis 3/28 штамм ВКПМ В-3679 и Bacillis licheniformis Л-34 штамм ВКПМ В-4161 смешивается с глауконитом в смесителе до содержания КОЕ не менее 1-3×10⁹ в 1 грамме.

Пример 4.

Получение препарата путем обезвоживания.

По окончании инкубации штаммов B.subtilis и В.licheniformis и смешивании их в соотношении 1:1, по технологии примера 4, отбирают 10% весовых частей от массы конечной формы препарата. Навеску биомассы в жидком виде смешивают с расчетным количеством глауконита до достижения остаточной влажности 4-6%, после чего препарат расфасовывают. При необходимости препарат подсушивают в вакуум сушильном агрегате (на полках). Конечное содержание клеток не менее 1×10⁹ КОЕ/г.

Пример 5. Получение препарата в вакуум сушильных агрегатах.

По окончании инкубации штаммов B.subtilis и В.lichenifbrmis и смешивании 1:1, по технологии примера 4, отбирают 10% весовых частей от массы конечной формы препарата. Навеску биомассы в жидком виде напыляют на расчетное количество глауконита фонтанирующее в нагретом до 90°С воздухе в сушильной установке до достижения остаточной влажности 4-6%, после чего препарат выгружают и расфасовывают. Конечное содержание клеток - не менее 1×10⁹ КОЕ/г.

Пример 6. Исследование стабильности препарата. Было изучено влияние технологии получения на стабильность Токсиспорина на примере исследования 9 экспериментальных серий препарата, полученного тремя различными способами. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5.
Стабильность Токсиспорина полученного различными способами высушивания
Способ высушивания	Показатели Токсиспорина в процессе хранения, КОЕ/г
Способ высушивания	6 мес.	12 мес.	18 мес.	24 мес.
Сублимация	3×10⁹	3×10⁹	3×10⁹	2×10⁹
Капиллярно-химическое обезвоживание	4×10⁹	3×10⁹	2×10⁹	2×10⁹
Вакуум сушильный шкаф	2×10⁹	2×10⁹	2×10⁹	10⁹

Как показывают полученные результаты, после хранения препарата при комнатной температуре на протяжении 24 мес. содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 10⁹ КОЕ/г, что свидетельствует об эквивалентности данных способов получения.

Пример 7. Изучение способности препарата Токсиспорин адсорбировать ротавирус из жидкости.

Адсорбционную активность пробиотика Токсиспорин в отношении ротавирусов изучали, анализируя изменение количества пробиотика в вируссодержащей жидкости. При этом использовали культуральную жидкость ротавирусов крупного рогатого скота - штаммы Тиверваль и человека HRV-134 на культурах клеток почек зеленых мартышек с 0,25% раствора трипсина (20 БОЕ). Для исследований были выбраны следующие дозы пробиотика Токсиспорина в вируссодержащей жидкости (мг/мл): 1,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0.

Во флаконы с различными навесками Токсиспорина вносили 10,0 мл вируссодержащей жидкости. Флаконы интенсивно встряхивали в течение 10 минут, центрифугировали при 3000 об/мин на протяжении 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали и исследовали на наличие инфекционно-активного вируса методом титрования в культуре клеток по ЦПД₅₀/мл вирусных антигенов в РНГА.

Полученные значения титра вирусов преобразовали в % адсорбированного вируса по формуле: А=100·(1-Т/То)%,

где Т - титр вируса в надосадочной жидкости после адсорбции,

То - исходный титр вируса в культуральной среде.

В итоге проведенного исследования установлена способность пробиотика Токсиспорин адсорбировать ротавирус из культуральной жидкости.

Установлено, что внесение пробиотика Токсиспорин в количестве 1,0 мг/мл количество адсорбированного вируса для штамма HVR-134 составило 45,0±1,0%, для штамма Тиверваль - 65,0±0,5%. Увеличение дозы Токсиспорина до 10,0 мг/мл повышался процент адсорбированного вируса для всех исследованных штаммов.

Сорбировалось: 73,0±1,0% штамма HRV-134 и 80,0±0,6% штамма Тиверваль. Увеличение дозы Токсиспорина до 15,0 мг/мл приводило к дальнейшему повышению процента адсорбированного ротавируса: 95,5±0,3% - для штаммов Тиверваль и 89,4±0,4% - для штамма HRV-134. Дальнейшее увеличение дозы Токсиспорина в вируссодержащей жидкости не вызывало изменений достигнутых величин.

Проведенные исследования показали способность пробиотика Токсиспорина адсорбировать ротавирусы из жидкой среды, что дает основания для использования его для профилактики и лечения ротавирусных диарей животных и человека.

Пример 8. Терапевтическая эффективность препарата Токсиспорин при желудочно-кишечных болезнях поросят.

Оценку терапевтического действия препарата проводили на поросятах-сосунах 2-3 недельного возраста (26 голов, из них 8 - контрольных) и поросятах-отъемышах в возрасте 2-3 месяцев (40 голов, из них 10 контрольных). Для этой цели были отобраны животные с признаками диареи: угнетенное состояние, низкая потребность в пище, наличие жидкого фекалия с неприятным запахом, повышенная температура тела. Больные животные опытных групп получали препарат в разных дозах 2 раза в день в течение 6 дней. Перед применением прпарат растворяли в теплой кипяченой воде и давали поросятам-сосунам из резиновой пипетки, а поросятам-отъемышам - смешав с кормом. Поросят-сосунов контрольной группы лечили тилоном (внутрь по 1,0 мл 4-5 дней), а поросят-отъемышей - смесью фармазина с трихополом (4-5 дней). Наблюдения проводились в течение 60 дней с начала постановки опыта. Схема формирования опытных и контрольных групп поросят в зависимости от применяемых доз препарата и результаты клинического наблюдения представлены в таблице 6.

Таблица 6
Терапевтическая эффективность Токсиспорина при желудочно-кишечных болезнях поросят
Группы животных	Кол-во голов	Лечебный курс	Доза и кратность	Выздоровело, гол.	Пало, гол	Эффективность, %
Поросята-сосуны
1 гр.-3,0 г на гол.	10	6 дней	0,5×2	10	-	100
2 гр. - 2,5 г на гол.	8	6 дней	0,25×2	8	-	100
3 гр. - контрольная	8	4-5 дн.	-	5	1	-
Поросята-отъемыши
1 гр. - 10,0 г на гол.	20	6 дней	1,0×2	20	-	100
2 гр. - 5,0 г на гол.	10	6 дней	0,5×2	9	-	90,0
3 гр. - контрольная	10	4-5 дн.	-	6	-	-

Из данных, представленных в таблице видно, что высокая терапевтическая эффективность Токсиспорин (100%) отмечается при дозе препарата поросятам-сосунам 3 г на голову, так и 2,5 г на голову раз в день 6 дней подряд. У поросят-отъемышей 100%-ная эффективность препарата отмечена в группе, где животных лечили препаратом Токсиоспорин из расчета 10,0 г на голову раз в день. Продолжительность болезни у поросят опытных групп составила 5-7 дней, у поросят контрольных групп - 7-10 дней. Один поросенок контрольной группы пал на 4 день болезни.

Таким образом, эффективной терапевтической дозой Токсиспорин для поросят-сосунов является 3,0 г на голову раз в день 6 дней подряд (100%-ная эффективность), а для поросят-отъемышей - 10,0 г на голову раз в день 6 дней подряд (100%-ная эффективность). Пробы фекалий от поросят всех групп для бактериологических исследований отбирали до и после постановки опыта и определяли количественный и качественный бактериальный состав кишечной микрофлоры в 1 г. У идентифицированных бактерий определяли биохимические, гемолитические, адгезивные свойства и патогенность на белых мышах (табл.7).

Таблица 7
Бактериологические исследования фекалий поросят до и после дачи Токсиспорин в терапевтических дозах
Группы животных	Динамика исследований
	До дачи препарата	После лечения
Поросята - сосуны
1 группа 3,0 г на гол.	Бифидо-лактобакт.- 10⁵, E.coli - 10⁶; P.mirabilis - 10⁵, Salmonella - 10³, C.freundi - 10³.	Бифидо-лактобакт.- 10¹⁰, E.coli - 10⁷, C.freundi - 10³.
2 группа 2,5 г на гол.	Бифидо-лактобактобактер-10⁵; E.coli-10⁶-10⁷; P.mirabilis - 10^5; K.pneumonia - 10⁶.	Бифидо-лактобактобакт - 10⁹; E.coli - 10⁸.
Контрольная группа	Бифидо-лактобакт.- 10⁵, Е.соli - 10⁶-10⁷, P.mirabilis - 10⁵, Salmonella - 10³, K.pneumonia - 10⁵	Бифидо-лактобакт.- 10⁸, P.mirabilis - 10⁵, Salmonella - 10³, K.pneumonia - 10⁵
Поросята - отьемыши
1 группа 10,0 г на гол.	Бифидо-лактобакт.- 10⁷, E.coli - 10⁷-10⁸, P.mirabilis - 10⁵, Salmonella - 10³, K.pneumonia - 10⁶, Staphilococcus - 10³.		Бифидо-лактобакт.- 10¹⁰, E.coli - 10⁷.
2 группа 5,0 г на гол.	Бифидо-лактобакт.- 10⁶, E.coli - 10⁷, P.mirabilis - 10⁵, Salmonella - 10³, C.freundi - 10³, Staphilococcus - 10³.		Бифидо-лактобакт.- 10⁸, E.coli - 10⁷, P.mirabilis - 10⁵, C.freundi - 10³, Staphi-lococcus - 10³.
Контрольная группа	Бифидо-лактобакт.- 10⁷, E.coli - 10⁷-10⁸, P.mirabilis - 10⁵, P.vulgaris - 10⁵, Salmonella - 10³.		Бифидо-лактобакт.- 10⁸, E.coli - 10⁷-10⁸, P.mirabilis - 10⁵, P.vulgaris - 10⁵, Salmonella - 10³.

Из данных таблицы следует, что содержание бифидо- и лактобактерий в 1 г кишечного содержимого поросят-сосунов до дачи препарата находилось на достаточно низком уровне и составляло 10⁵ м.кл. От всех поросят-сосунов как опытных, так и контрольной групп выделяли Е.соli и P.mirabilis. От поросят-сосунов 1-й опытной группы, кроме того, выделяли Salmonella и C.freundi; от поросят-сосунов 2-й опытной и контрольной групп выделяли также K.pneumonia.

От поросят-отъемышей выделяли такую же микрофлору, как и от поросят-сосунов, а также Staphylococcus. Выделенные Staphylococcus были коагулазоположительными, что является одним из признаков патогенности этих микроорганизмов.

Выделенная от поросят до постановки опыта условно-патогенная микрофлора обладала вирулентными свойствами. Такие микроорганизмы как P.mirabilis, E.coli и Salmonella образовывали зоны гемолиза на кровяном агаре. Особенно четко эти свойства были выражены у энтеропатогенной E.coli (преобладал, в основном, β-гемолиз).

Адгезивные свойства определяли в РА с антиадгезивными сыворотками К88, К99, F41, Р987. Энтеропатогенные E.coli, выделенные от поросят как опытных, так и контрольных групп, обладали различными адгезивными антигенами - 80% изолятов E.coli содержали К88-антиген, 12% - К99-антиген и 8% изолятов E.coli содержали антиген F41. Кроме того, 8 изолятов P.mirabilis давали положительную РА с К99 адгезивной сывороткой. Контролем в этом случае служили те же микроорганизмы, выращенные при комнатной температуре (при этом не образуются адгезивные антигены).

Патогенность выделенных микроорганизмов определяли на белых мышах, которым вводили внутрибрюшинно суточные культуры микроорганизмов в концентрации 500 млн. м.кл. Мыши пали на 2-3 сутки. При вскрытии павших мышей выделяли исходные бактерии.

Результаты опытов представлены в таблице 8.

Таблица 8
Вирулентные свойства бактерий, выделенных от поросят
Исследуемые культуры	До дачи препарата			После лечения
Исследуемые культуры	гемол.	адгез.	токсиг.	гемол.	адгез.	токсиг.
E.coli	22	22	22	15	15	15
P.mirabilis	15	18	15	12	5	10
P.vulgaris	2	-	2	-	-	-
C.freundii	11	2	11	8	-	8
Salmonella	9	3	9	3	-	1
K.pneumonia	6	-	6	3	-	3
Staphylococcus	15 культур коагулазоположительные			7 культур коагулазоположительные

Из данных таблицы следует, что после лечения Токсиспорином происходило не только снижение частоты выделения условно-патогенных и патогенных бактерий, но и ослабевали их вирулентные свойства. Особенно это заметно в группе поросят-отъемышей, где количество коагулазоположительных штаммов стафилококков снизилось вдвое, что свидетельствует о высоком антагонистическом действии препарата по отношению к указанным бактериям.

В контрольной группе поросят-отъемышей к концу лечения не наблюдали значительных изменений в составе кишечной микрофлоры. Нормализация микрофлоры кишечника происходила медленно, и концентрация клеток составила 10⁸ м.кл. в 1 г кишечного содержимого. Выделялась та же микрофлора, что и перед постановкой опыта.

Результаты бактериологических исследований дают основание предполагать, что причиной расстройства пищеварения у поросят явилась ассоциация условно-патогенных микроорганизмов, обладающих вирулентными свойствами. При исследовании фекалий после лечения поросят различными дозами препарата Токсиспорин отмечалось следующее:

- в группе сосунов, где поросята получали препарат в дозе 3 г, происходило увеличение концентрации бифидо- и лактобактерий до 10⁹-10¹⁰ м.кл. в 1 г фекалий, а в группе поросят-сосунов, которым давали препарат в дозе 10 г, концентрация бифидо- и лактобактерий увеличивалась до - 10⁸-10⁹м. кл. У поросят контрольной группы отмечали низкое содержание бифидо- и лактобактерий (10³-10⁵ м. кл);

- у поросят опытных групп после лечения не обнаруживали сальмонелл, в то время как в контрольных группах эти микроорганизмы обнаруживались во все дни исследований;

- в группе поросят-отъемышей к концу лечения происходило увеличение содержания бифидо- и лактобактерий до 10¹⁰ м.кл. в 1 г фекалий, особенно в той группе, где применяли 10,0 г препарата Токсиспорин - на 1 голову;

- на 6 день с момента постановки опыта было установлено ослабление вирулентных свойств бактерий, выделенных из кишечника поросят опытных групп.

Проводили также гематологические исследования, которые заключались в анализе лейкограммы крови больных поросят контрольных и опытных групп (табл.9).

Таблица 9
Лейкограмма крови поросят-сосунов
	Поросята в возрасте 14 дней (норма по Кар-путь)	Клинически здоровые	Больные поросята	После лечения
				1 группа	2 группа	Контрольная группа
Лейкоциты

Базофилы	-	0	0	0	0	0
Эозинофилы	0,6-1,4	0,62	0,9	1,0	1,0	1,5
Нейтрофилы:
Ю	0,5-1,1	0,45	0,9	1,0	1,0	1,0
П	4,3-9,7	9,95	10,4	9,6	10,25	10,75
С	29,1-36,9	30,4
С	29,1-36,9	30,4	31,3	33,6	41,0	40,0
Лимфоциты	51,2-56,8	55,4	52,1	54,0	37,5	43,25
Лимфоциты	51,2-56,8
Моноциты	3,2-4,88	3,4	6,3	3,6	4,75	3,25

При анализе лейкограммы больных поросят-сосунов до лечения отмечали, прежде всего, выраженный моноцитоз, свидетельствующий о бактериальной инфекции и усилении фагоцитарной активности этих клеток. При микроскопии мазков крови в моноцитах наблюдали бактериальные включения в цитоплазме. Также отмечали множество лимфоцитов с цитоплазматическими выпячиваниями, что указывает на интоксикацию организма.

Анализируя данные лейкограммы поросят-сосунов, получавших различные дозы препарата, можно констатировать, что после прекращения дачи Токсиспорина у поросят 1 группы, получавших 3 г препарата на голову раз в день, показатели лейкограммы соответствовали показателям здоровых поросят.

У поросят 1 группы, получавших Токсиспорин по 2,5 г раз в день обнаружили увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов в сочетании с лимфопенией, что, вероятно, связанно с недостаточной дозировкой препарата и наличием в организме воспалительного процесса. Аналогичная картина лейкограммы в послетерапевтический период отмечена у поросят контрольной группы, которых лечили химиотерапевтическими препаратами.

Лейкограмма крови больных поросят-отъемышей представлена в таблице 10.

Таблица 10
Лейкограмма крови поросят-отъемышей
	3-4 месячные поросята (норма по Карпутю)	Клинически здоровые	Больные поросята	После лечения
Лейкоциты				1 группа	2 группа	Контрольная группа
				1 группа	2 группа	Контрольная группа
Базофилы	0,2	0	0	0	0	0
Эозинофилы	1,1-3,3	2,0	1,0	1,6	0,5	0,7
Нейтрофилы:
Нейтрофилы:	0,4-0,8	0,4	0,53	0,6	0,5	0,6
Ю	9,6-13,3	14,2	9,6	9,3	11,0	11,0
П	27,2-32,0	32,8	17,8	23,7	27,5	34,4
С	49,0-57,8	47,1	64,0	61,0	58,5	50,3
Лимфоциты	1,9-5,5	3,5	9,7	4,0	2,0	3,0

Как следует из таблицы 10, лейкограмма заболевших поросят-отъмышей характеризовалась эозинопенией, нейтропенией, выраженным моноцитозом и повышенным уровнем лимфоцитов. При анализе лейкограммы больных поросят-отъемышей до лечения установили следующее:

у больных животных, по сравнению с клинически здоровыми, отмечали эозинопению, характеризующую острую интоксикацию организма. Уменьшение числа эозинофилов связано с разрушением этих клеток, а также с миграцией в ткани для элиминации комплексов антиген - антитело;

наблюдаемое снижение числа нейтрофилов, особенно сегментоядерных, у больных поросят, объясняется разрушением этих клеток за счет интенсификации фагоцитоза в результате внедрения микробных элементов. В цитоплазме нейтрофилов при микроскопии обнаруживали фагоцитированные бактериальные субстанции;

выраженный лимфо- и моноцитоз также свидетельствовали о заболевании бактериальной этиологии. В мазках крови встречались лимфоциты с цитоплазматическими выпячиваниями, что является показателем высокой интоксикации организма;

по сравнению с поросятами-сосунами, у отъемышей воспалительный процесс был более выраженным, что подтверждается данными бактериологических и гематологических исследований.

После лечения поросят-отъемышей отмечали следующее:

в группе поросят, получавших препарат в дозе 3,0 г раз в день, отмечали эозинопению; приблизительно на 60% повысилось число сегментоядерных нейтрофилов, не достигнув при этом нормы, т.е. имело место наличие некоторой нейтропении, свидетельствующей о продолжительном фагоцитозе в процессе действия препарата Токсиспорин. Число лимфоцитов несколько снизилось, однако оставалось на более высоком уровне, по сравнению с клинически здоровыми животными. Количество моноцитов было значительно сниженным, что также свидетельствует о защитной функции этих клеток;

у поросят, получавших препарат Токсиспорин по 10,0 г на голову раз в день количество эозинофилов практически соответствовало уровню у клинически здоровых поросят. Отмечалась нейтропения, что, возможно, свидетельствует о передозировке препарата. Число лимфоцитов изменилось незначительно. Уровень моноцитов снизился до нормального;

у животных контрольной группы имела место эозинопения, что говорит о достаточно устойчивой и продолжительной интоксикации организма. Число нейтрофилов, особенно зрелых, увеличилось практически в 2 раза и было выше, чем у клинически здоровых поросят данного хозяйства.

Таким образом, характер лейкограммы крови поросят-отъемышей опытных и контрольной групп свидетельствует о воспалительном процессе в организме животных. Тем не менее, клиническое состояние животных, высокая терапевтическая эффективность препарата Токсиспорин, а также результаты бактериологических исследований говорят о предпочтительной терапевтической дозе - 3,0 г препарата на голову при однократном применении в течение 6 дней.

При изучении влияния Токсиспорина на интенсивность роста поросят-отъемышей опытных групп, поставленных на откорм, в комбикорм поросятам опытных групп вносили препарат Токсиспорин в дозе 3 г на голову в сутки в течение 1 месяца. В опыте использовалось то же поголовье поросят-отъемышей, которым препарат вводили с профилактической целью. Животных 2-х опытных групп объединили в одну группу (табл.11).

Таблица 11
Изменение живой массы и среднесуточных приростов у поросят-отъемышей на откорме
Показатель	Группа животных
Показатель	опытная	контрольная
Живая масса, кг	43,3±2,16	43,6±1,22
Среднесуточный прирост, г	624±26,9	534±42,8
В % к контрольной группе	116,8	100,0
Общий прирост, кг	67,4	58,2
Среднесуточное потребление комбикорма, кг
Среднесуточное потребление комбикорма, кг	2,18	2,18
Затрачено комбикорма на 1 кг прироста, кг	3,27	3,78
В % к контрольной группе	86,5	100,0

Установлено, что Токсиспорин способствует усвоению корма животными и приросту живой массы.

У свиней опытной группы, получавших Токсиспорин, среднесуточный прирост массы увеличился до 667 г (Р<0,02), у животных контрольной группы - в целом за опыт составил 576 г.

Таким образом, среднесуточный прирост массы у свиней опытной группы увеличился по сравнению с контролем на 15,8%.

Кроме повышения интенсивности роста поросят, использование в составе комбикормов Токсиспорин способствовало улучшению эффективности использования кормов, что выразилось в снижении их затрат на 1 кг прироста живой массы откармливаемых свиней опытной группы на 16,9-19,4%.

В результате исследований фекалий подопытных животных было установлено, что использование препарата Токсиспорин для откармливаемых свиней привело к повышению переваримости питательных веществ у животных опытной группы - жира и БЭВ соответственно на 3,2 абс.% и 4,4 абс.%.

Сырую клетчатку животные опытной группы переваривали в сравнении с контрольными аналогами лучше на статистически достоверную величину (Р<0,01) или в процентном выражении на 13,8 абс.% (табл.12).

Таблица 12
Переваримость питательных веществ подопытными поросятами
Показатель, абс.%	Группа животных
Показатель, абс.%	опытная	контрольная
Органическое вещество	83,8±1,15	80,6±1,73
Сырой протеин	79,5±1,27	75,1±2,08
Сырой жир	43,2±6,39	40,0±3,55

Использование Токсиспорина оказывало положительное влияние на использование азота в организме поросят опытной группы (табл.13).

Таблица 13
Среднесуточный баланс и использование азота подопытными животными
Показатель	Группа животных
Показатель	опытная	контрольная
Принято с кормом, г	67,5	66,72
Выделено в кале, г	13,84±0,62	16,67±1,38
Переварено, г	53,66±0,3	50,05±1,38
Выделено в моче, г	28,50±1,1	27,08±0,51
Отложилось в теле, г	25,16±1,15	22,97±1,55
Использовано, в %:
от принятого	37,3	34,44
от переваренного	46,8	45,8

Установлено, что «потери» азота с калом и мочой у поросят контрольной группы составили 43,75 г, а опытной - 42,34 г, в связи, с чем у животных контрольной группы ежесуточно откладывалось 22,97 г азота, в сравнении с контролем поросята опытной группы откладывали азота в теле на 2,19 г больше. Поросята опытной группы также наиболее рационально использовали азот. От принятого количества азота с кормом они откладывали в теле 37,3%, а от переваренного - 46,8%, против 34,44% и 45,8% в контроле.

Влияние препарата Токсиспорина на качество мясной продуктивности оценивали после контрольного убоя 10 поросят и разделки туш. Результаты убоя и обвалки туш приведены в таблице 14.

Таблица 14
Показатели продуктивности откормленных свиней
Показатели	Мясная продуктивность по группам животных
Показатели	опытная	контрольная
Предубойная живая масса, кг	110,7	101,8
Убойная масса, кг	86,2	78,6
Убойный выход, %	77,9	77,2
Масса охлажденной полутуши, кг	32,2	30,6
в том числе масса ткани, кг:
мышечной	18,3	17,3
жировой	10,4	9,8
костной	3,5	3,2
Соотношение тканей к массе полутуши, %:
Соотношение тканей к массе полутуши, %:
мышечная	56,8	56,5
жировая	32,8	32,0
костная	10,9	10,5

Анализ результатов убоя подопытных животных показал, что у поросят опытной группы наблюдалось увеличение убойной массы на 9,7%, в сравнении с поросятами контрольной группы. Использование Токсиспорина значительно не повлияло на качество туш.

Таким образом, Токсиспорин не оказывает существенного влияния на убойный выход и морфологический состав туш, однако масса туш животных из опытной группы была больше. От них было получено в среднем на 1 голову на 3,2 кг мяса больше, чем от контрольных животных.

В таблице 15 представлены результаты производственной проверки по изменению живой массы поросят, приростам и затратам кормов.

Таблица 15
Зоотехнические показатели эффективности Токсиспорина при откорме свиней
Показатель	Группа животных
Показатель	опытная	контрольная
Живая масса, кг:
в начале откорма	39,6±0,23	39,4±0,25
в конце откорма	116,0±0,69	108,0±0,78
Среднесуточный прирост, г	735±5,97	660±7,57
% к контрольной группе	111,4	100,0
Среднесуточное потребление комбикорма	2,30	2,30
Затрачено комбикорма на 1 кг прироста, кг	3,13	3,48
% к контрольной группе	89,9	100,0

Установлено, что Токсиспорин способствует усвоению корма животными и приросту живой массы. Среднесуточный прирост живой массы за период производственной проверки у животных опытной группы в сравнении с контрольной был выше на 5 г (11,4% при достоверном р<0,001), а затраты комбикорма на 1 кг были ниже на 10,1% (3,13 кг против 3,48 кг). Анализ результатов убоя подопытных животных показал, что у поросят опытной группы наблюдалось увеличение убойной массы на 9,7% по сравнению с поросятами контрольной группы.

Приведенные данные показали, что Токсиспорин эффективен для всех видов млекопитающих при лечении и профилактике колибактериозов, дисфункций и дисбактериозов различной природы, чумки, парагриппа, гриппа, диспепсии, сальмонеллезов, инфекционного ринотрахеита крупнорогатого скота, вирусной диареи, ротавирусного энтерита, дизентерии, стафилококковых инфекций, везикулярного стоматита, язвенного дерматита, а также для профилактики иммунодефицитных состояний.

Производственная оценка эффективности препарата Токсиспорин при откорме свиней подтверждена результаты экспериментов на поросятах-отъемышах о благоприятном влиянии препарата на гомеостаз организма животных, интенсивность роста и конверсию корма.

Claims

1. Пробиотический препарат против вирусных и бактериальных инфекций, содержащий смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в споровой форме и наполнитель, отличающийся тем, что в качестве биомассы штаммов бактерий он содержит биомассу штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161 в споровой форме с титром не менее 10⁹ спор/г, а в качестве наполнителя глауконит при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
смесь спор бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis 0,1 -1,0 глауконит остальное

2. Пробиотический препарат по п.1, отличающийся тем, что содержание спор бактерий Bacillus subtilis в их смеси со спорами Bacillus licheniformis составляет 50%.

3. Способ получения пробиотического препарата по п.1, включающий в себя раздельное культивирование бактерии Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161 на глюкозо-мелассной среде при рН 6,8-7,0, смешивание полученной биомассы штаммов в споровой форме в соотношении 1:1 между собой и затем в количестве 0,1-1 мас.% от массы препарата с глауконитом до содержания КОЕ не менее 10⁹ спор/г.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что микроорганизмы культивируют при температуре 37°С в течение 24-36 ч, аэрации 1,0 об. воздуха/об. среды в минуту, скорости перемешивания 250 об/мин, рO₂ 40-60% от насыщения, рН 6,8-7,0.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что полученную смесь биомассы штаммов в споровой форме перед смешиванием с глауконитом подвергают сублимационной сушке.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что бактерии наносят на глауконит путем напыления.

7. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161, используемый в качестве компонента пробиотического препарата против вирусных и бактериальных инфекций.