RU2470628C2

RU2470628C2 - Состав

Info

Publication number: RU2470628C2
Application number: RU2010131482/15A
Authority: RU
Inventors: Фредрик НИЛЬССОН; Карл Йохан БРИНК
Original assignee: Биоинвент Интернешнл Аб
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2012-12-27
Also published as: UA100255C2; WO2009083225A8; WO2009083225A3; AU2008342942A1; JP2011507922A; CA2710775A1; IL206467A0; KR20100110841A; US20090169544A1; US20110014203A1; RU2010131482A; CN101951885A; WO2009083225A2; ZA201004439B; NZ586303A; BRPI0821600A2; EP2240156A2

Abstract

Группа изобретений относится к стабильной, водной фармацевтической композиции, содержащей антитело, имеющее тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID No:3 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID No:4, и фармацевтически приемлемый адъювант, разбавитель, носитель или наполнитель, где упомянутая композиция имеет рН от 4 до 6 и способам ее применения для лечения атеросклероза и ассоциированных с атеросклерозом заболеваний. Группа изобретений характеризуется высокой стабильностью и является эффективной при лечении атеросклероза. 9 н. и 43 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр., 2 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к фармацевтическим композициям, а конкретно к стабильным, водным фармацевтическим композициям связывающего окисленный ЛНП антитела, которое полезно при лечении атеросклероза.

Уровень техники

Атеросклероз является многофакторным заболеванием, развивающимся преимущественно у лиц с биохимическими факторами риска, включая курение, гипертонию, сахарный диабет, гиперхолестеринемию, повышенные уровни липопротеина низкой плотности (LDL) и триглицеридов, гиперфибриногенемию и гипергликемию. Атеросклероз является хроническим заболеванием, которое вызывает утолщение внутренней оболочки (интимы) больших и средних артерий. Это приводит к ослаблению потока крови и может вызвать ишемию и разрушение ткани в питаемых пораженным сосудом органах. У людей атеросклеротические бляшки развиваются в течение нескольких десятилетий, что приводит к осложнениям, таким как коронарная и церебральная ишемические и тромбоэмболическая болезни, инфаркту миокарда и церебральному инфаркту.

Атеросклероз является основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, включая инфаркт миокарда, инсульт и заболевание периферических артерий. Сердечно-сосудистые болезни являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в индустриальных странах и неуклонно прогрессируют в развивающихся странах, а коронарный атеросклероз является их центральной основополагающей патологией. Текущая терапия атеросклероза не вполне эффективна при предотвращении развития заболевания и осложнений.

Заболевание начинается с накопления липопротеинов, главным образом ЛНП, во внеклеточном матриксе сосуда. Эти частицы ЛНП агрегируют и подвергаются окислительной модификации. Окисленный ЛНП является токсичным и вызывает повреждение сосудов. Атеросклероз представляет, во многом, ответ на это повреждение, который включает воспаление и фиброз.

Высокий уровень холестерина в плазме, и в частности, высокий уровень ЛНП, как правило, признается движущей силой в развитии атеросклероза, в то время как высокий уровень липопротеина высокой плотности (ЛВП) противодействует развитию атеросклероза. Вследствие этого ЛВП называют хорошим холестерином, в то время как ЛНП называют плохим холестерином. Упрощенно, ЛНП транспортирует холестерин в ткани, в то время как ЛВП адсорбирует холестерин в тканях и транспортирует его в печень, где тот подвергается деградации. Терапевтические стратегии лечения атеросклероза, направленные на понижение уровня ЛНП и повышение уровня ЛВП, находятся в стадии разработки.

АроВ-100 - это белковый компонент ЛНП, который является основным переносчиком холестерина в сыворотке крови человека. Окисление ЛНП является важным этапом его конверсии в атерогенную частицу, а его окислительные модификации вызывают начальное формирование полос жира - наиболее ранних видимых атеросклеротических лезий.

Радиоактивномеченые формы связывающих окисленный ЛНП антител могут также использоваться для радиоиммунодетекции атеросклеротических лезий у экспериментальных животных (Tsimikas et al, 2000). Меченное йодом-125 антитело против эпитопа с модифицированным малоновым диальдегидом лизином использовалось для обнаружения бляшек у мышей и кроликов, при этом было обнаружено, что инъецированное антитело локализуется в бляшках аорты.

Из библиотеки фрагментов рекомбинантных антител n-CoDeR® были созданы человеческие антитела, нацеленные на полученные из человеческого АроВ-100 окисленные пептиды (WO 02/080954). Эти рекомбинантные антитела, а также антитела против других окисленных эпитопов ЛНП, показали значительное ингибирование образования бляшек и предотвращение развития атеросклеротических лезий на животных моделях (Schiopu et al, 2004; WO 2004/030607; US 6,716,410).

Далее было показано, что раскрытые в WO 2004/030607 связывающие окисленный АроВ-100 антитела, особенно IEI-E3, LDO-D4, КТТ-В8 и 2-D03, после нескольких недель лечения индуцируют активную регрессию уже существующих, сформировавшихся атеросклеротических бляшек в аорте (WO 2007/025781). Такие антитела предлагались для терапии запущенного атеросклероза для обращения прогрессии заболевания в результате уменьшения бляшечной нагрузки, а также для терапии ассоциированных с атеросклерозом сердечно-сосудистых заболеваний. Таким образом, нацеливание терапии на основе моноклональных антител на окисленный ЛНП является все более привлекательным способом лечения некоторых основных причин смертности в Западном мире.

В WO 2007/025781 2D03 являлось наиболее эффективным в индукции регрессии уже существующих бляшек антителом. V_H и V_L последовательности антитела 2D03 представлены на фигуре 3 WO 2004/030607, a CDR-последовательности антитела 2D03 приведены в таблице 2 WO 2007/025781. Как хорошо известно в данной области, стабильный состав упрощает распространение и хранение лекарственных средств, таким образом уменьшая затраты как для фармацевтической индустрии, так и для пациента (Lucas et al (2004) Pharmaceutical Technology, July 2004 Issue, pp: 69-72). В данной области существует необходимость в содержащем антитело 2D03 стабильном фармацевтическом составе, пригодном для терапевтического использования.

В последние несколько лет успехи в биотехнологии сделали возможным получение с помощью рекомбинантных технологий множества белков для фармацевтических приложений, таких как антитела. Так как белки крупнее и сложнее, чем традиционные органические и неорганические лекарственные препараты (т.е. обладают множеством функциональных групп в дополнение к сложным трехмерным структурам), то получение стабильного состава с белками представляет собой особую проблему. Для того чтобы белок, такой как антитело, оставался биологически активным, необходимо, чтобы состав поддерживал в сохранности интактную конформационную целостность, по меньшей мере, основной аминокислотной последовательности белка, в то же время, защищая функциональные группы белка от деградации. Пути деградации белков могут включать химическую нестабильность (т.е. любой процесс, в который вовлечена модификация белка путем формирования новых связей или разрыва существующих, что приводит к образованию новой химической сущности) или физическую нестабильность (т.е. изменения в белковой структуре высшего порядка). Химическая нестабильность может приводить к деамидированию, рацемизации, гидролизу, окислению, β-элиминации или к дисульфидному обмену. Физическая нестабильность может приводить, например, к денатурации, агрегации, преципитации или адсорбции. Тремя наиболее распространенными путями деградации белка являются агрегация белка, деамидирование и окисление (Cleland et al (1993) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10 (4): 307-377).

Множество составов известны своей способностью повышать стабильность композиций на основе антител. Например, US 6,171,586 описывает состав, который содержит стабилизирующие антитело полиол и ПАВ и не содержит хлорид натрия.

Раскрытие изобретения

Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что антитело 2D03 демонстрирует характеристики растворимости, отличные от ранее созданных продуктов с антителами на основе n-CoDeR®. Как правило, 10-20 мМ фосфатный буфер, содержащий 150 мМ NaCl, рН 7-7,5, стабилизирует состав с созданными на основе n-CoDeR® продуктами с антителами.

Авторы обнаружили, что в отличие от других обладающих каркасом n-CoDeR® антител, 2D03 агрегирует при рН выше 6,0. Т.к. рН ниже 4 не годится для композиций для внутривенного или подкожного введения пациенту, авторы определили узкий интервал рН для содержащей антитело 2D03 композиции, которая имеет полезный период стабильности при хранении и которая подходит для внутривенного или подкожного введения пациенту.

Кроме того, если концентрирование 2D03 или замена его буфера ультрафильтрацией проходят в растворах с низкой проводимостью (менее чем 100 мМ эквивалента NaCl), то образуются агрегаты. Начальные исследования показали, что продукт на основе антитела 2D03 может быть сконцентрирован, по меньшей мере, до концентрации 160 мг/мл, если рН поддерживался при значении 5,5, а в состав был включен 150 мМ NaCl.

В первичных испытаниях, попытки повысить стабильность 2D03 путем добавления стандартных добавок, таких как полисорбат 20, аргинин, гистидин, глутаминовая кислота и маннитол, не были достаточно эффективны.

Соответственно, первый аспект изобретения, таким образом, обеспечивает водную фармацевтическую композицию, содержащую антитело 2D03 и фармацевтически приемлемый адъювант, разбавитель, носитель или наполнитель, где значение рН композиции находится в диапазоне от 4 до 6.

2D03 является полностью человеческим IgG₁-антителом, мишенью которого является окисленный ЛНП. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую и легкие цепи антитела 2D03, представлены на фигуре 1 и помечены как SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2, соответственно. Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи антитела 2D03 представлены на фигуре 2 и помечены как SEQ ID No: 3 и SEQ ID No: 4, соответственно.

Следовательно, данный аспект изобретения обеспечивает водную фармацевтическую композицию, содержащую антитело, обладающее аминокислотными последовательностями тяжелой цепи SEQ ID No: 3 и легкой цепи SEQ ID No: 4, и содержащую фармацевтически приемлемый адъювант, разбавитель, носитель или наполнитель, где значение рН композиции находится в диапазоне от 4 до 6.

Антитело в фармацевтической композиции может быть получено с помощью любого, хорошо известного в области создания антител подхода. Примерные способы получения рекомбинантных антител подробно описаны ниже.

Термин «фармацевтическая композиция» хорошо известен в данной области и относится к препарату, который находится в такой форме, которая позволяет быть эффективной биологической активности активного ингредиента (т.е. антитела 2D03) и который не содержит дополнительных, оказывающих токсичное воздействие на пациентов, которым будет вводится данная композиция, компонентов. Фармацевтически приемлемыми адъювантами, разбавителями, носителями и наполнителями являются те, которые могут быть целесообразно введены пациенту для обеспечения эффективной дозы используемого активного ингредиента и которые хорошо известны в данной области.

Существует множество путей, по которым может быть оценена стабильность содержащей антитело фармацевтической композиции, некоторые из которых подробно описаны в примерах 2 и 3. Например, стабильность содержащей антитело фармацевтической композиции может быть определена оценкой ее чистоты, например, с помощью гель-фильтрации, катионообменной хроматографии и/или ДСН-ПААГ. Дополнительно или альтернативно, стабильность содержащей антитело фармацевтической композиции может быть определена либо на глаз, либо по светорассеянию при 410 нм. Далее дополнительно или альтернативно, стабильность фармацевтической композиции может быть определена на основе активности антитела 2D03 и, как правило, на основе антигенсвязывающей активности антитела 2D03 (например, способности связываться с MDA-ApoB100). Таким образом, под «стабильной» фармацевтической композицией мы понимаем такую, в которой антитело сохраняет способность связывать MDA-АроВ100 после хранения (за определенный период времени и в определенных условиях), по сравнению с антителом, которое не сохраняется таким образом. Более предпочтительно, если антитело сохраняет, по меньшей мере, 60%, или, по меньшей мере, 70%, 80%, 90% или 95% его способности связываться с MDA-ApoB100. Еще более предпочтительно, если антитело сохраняет, по меньшей мере, 99% или 100% его способности связывать MDA-ApoB100 после определенного хранения, за установленный период времени и в представленных ниже условиях.

Под «стабильным фармацевтическим препаратом с антителом» мы понимаем, что чистота препарата антитела после определенного хранения, в течение указанного периода времени и в приведенных ниже условиях, составляет, по меньшей мере, 90% от чистоты интактного мономерного антитела, более предпочтительно 95% или больше от чистоты интактного мономерного антитела, в частности, 96% или 97% 98% или 99% или больше от чистоты интактного мономерного антитела. Предпочтительно, если чистота препарата антитела после хранения определяется и/или измеряется с помощью гель-фильтрации, как описано в сопутствующих примерах.

В настоящем документе указано, что по этому аспекту изобретения данная фармацевтическая композиция является стабильной фармацевтической композицией. Как правило, композиция является стабильной при хранении при температуре около 2-8°С, по меньшей мере, в течение 4 недель. Предпочтительно, если фармацевтическая композиция стабильна при температуре около 2-8°С, по меньшей мере, в течение 8 недель. Еще более предпочтительно, если фармацевтическая композиция стабильна при температуре около 2-8°С, по меньшей мере, в течение 14 недель или дольше. Еще более предпочтительно, если фармацевтическая композиция стабильна при температуре около 2-8°С, по меньшей мере, в течение 1,5 лет, а предпочтительней - в течение 3 лет. Наиболее предпочтительно, если фармацевтическая композиция стабильна в течение, по меньшей мере, 4 или 5 лет. Как правило, фармацевтическая композиция стабильна после замораживания и оттаивания композиции.

Удобно, если фармацевтическая композиция стабильна при температуре около 24°С (например, при температуре 25°С) в течение, по меньшей мере, 4 недель, и более предпочтительно в течение, по меньшей мере, 8 недель, или дольше. Как продемонстрировано в сопутствующих примерах, фармацевтические композиции по изобретению могут быть стабильны в течение 6 месяцев при температуре 25°С.

В воплощениях по изобретению фармацевтическая композиция имеет минимальное значение рН, равное 4,1, или 4,2, или 4,3, или 4,4, или 4,5, или 4,6, или 4,7, или 4,8, или рН 4,9, и максимальное значение рН равно 6,0.

В других воплощениях, фармацевтическая композиция имеет максимальное значение рН, равное 5,9, или 5,8, или 5,7, или 5,6, или 5,5, или 5,4, или 5,3, или 5,2, или 5,1, и минимальное значение рН, равное 4.

В некоторых других воплощениях, фармацевтическая композиция имеет максимальное значение рН, равное 5,9, или 5,8, или 5,7, или 5,6, или 5,5, или 5,4, или 5,3, или 5,2, или 5,1, и минимальное значение рН, равное 4.

В одном воплощении, фармацевтическая композиция имеет значение рН от 4,9 до 5,1, а более конкретно - рН 5,0.

В других воплощениях, фармацевтическая композиция имеет значение рН от 5 до 6, например, рН от 5,0 до 5,9, рН от 5 до 5,8, рН от 5 до 5,7, или рН от 5,0 до 5,6. В более конкретном воплощении, фармацевтическая композиция имеет рН от 5,4 до 5,6, а конкретнее - рН около 5,5.

Следует понимать, что в целях сохранения требуемого рН фармацевтическая композиция содержит буфер. Использованный здесь термин «буфер» относится к буферному раствору, который действием его кисло-основных сопряженных компонентов препятствует изменениям рН. Буфер по этому изобретению имеет значение рН в диапазоне от около 4 до около 6; предпочтительно, от около 4,5 до около 5,8; более предпочтительно от около 4,8 до около 5,6 и наиболее предпочтительно имеет значение рН между 5,0 и 5,6. Примеры буферов, контролирующих рН в этом диапазоне, включают ацетат (например, ацетат натрия) сукцинат (такой как сукцинат натрия), глюконат, цитрат и другие органические буферы. Предпочтительно, если буфер не является фосфатным буфером, особенно если требуется стабильный при заморозке-разморозке состав.

Концентрация буфера может быть от около 1 мМ до около 50 мМ, приемлемо от около 5 мМ до около 40 мМ, а предпочтительно от около 10 мМ до около 30 мМ, в зависимости, например, от буфера и требуемой изотоничности состава.

В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция содержит ацетатный буфер. Как правило, ацетат присутствует в концентрации 5-30 мМ, а более предпочтительно в концентрации 10-30 мМ. В более конкретном воплощении, ацетат присутствует в концентрации около 20 мМ.

В воплощении, фармацевтическая композиция дополнительно содержит хлорид натрия. Хлорид натрия может присутствовать в концентрации от около 50 мМ до около. 200 мМ, приемлемо в концентрации от около 100 мМ до около 200 мМ, а более предпочтительно в концентрации 150 мМ.

Дополнительно или вместо хлорида натрия, фармацевтическая композиция может содержать другие соли и/или аминокислоты.

Как правило, антитело присутствует в фармацевтической композиции в концентрации от 10 до 200 мг/мл, например, от 25 до 150 мг/мл. В конкретных воплощениях, антитело присутствует в фармацевтической композиции в концентрациях 25±10 мг/мл, 120±20 мг/мл, или около 150±10 мг/мл. Например, антитело может присутствовать в фармацевтической композиции в концентрации 10 мг/мл, или 20 мг/мл, или 30 мг/мл, или 40 мг/мл, или 50 мг/мл, или 60 мг/мл, или 70 мг/мл, или 80 мг/мл, или 90 мг/мл, или 100 мг/мл, или 110 мг/мл, или 120 мг/мл, или 130 мг/мл, или 140 мг/мл, или 150 мг/мл, или 160 мг/мл. Предпочтительно, если антитело присутствует в фармацевтической композиции в концентрации менее чем 160 мг/мл, такой как менее чем 100 мг/мл или менее чем 50 мг/мл, или менее чем 25 мг/мл.

Предпочтительное воплощение изобретения обеспечивает стабильную, водную фармацевтическую композицию, содержащую на мл:

от 15 до 160 мг определенного выше антитела 2D03;

8,77 мг хлорида натрия;

2,35 мг ацетата натрия 3-гидрата;

0,16 мкл уксусной кислоты;

гидроксид натрия в количестве, достаточном для получения рН 5,5; и

воду в количестве, достаточном для достижения конечного объема в 1 мл.

Антитело может присутствовать в концентрациях 25±10 мг/мл, 120±20 мг/мл, или около 150±10 мг/мл.

В дополнительном предпочтительном воплощении, изобретение обеспечивает стабильную, водную фармацевтическую композицию, содержащую:

25 мг/мл антитела по п.1;

20 мМ ацетата натрия;

150 мМ хлорида натрия;

гидроксид натрия в количестве, достаточном для получения рН 5,5,

≥95% чистота.

Следует понимать, что фармацевтическая композиция может также содержать консервант. «Консервант» - это соединение, которое может быть включено в состав для существенного сокращения в нем бактерий, таким образом, например, способствуя получению состава для универсального использования. Примеры потенциальных консервантов включают хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония (смесь хлоридов алкилбензилдиметиламмония, в которых алкильные группы являются соединениями с длинной цепью) и хлорид бензетония. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирты, алкилпарабены, такие как метилпарабен и пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и m-крезол. Предпочтительным консервантом является бензиловый спирт. Однако следует понимать, что консервант может и не потребоваться, поскольку представленные в примере 3 составы являются стерильными и свободными от бактериальных или грибковых загрязнений.

Следует понимать, что фармацевтическая композиция может, в некоторых воплощениях, также содержать полиол. «Полиолом» является субстанция с множеством гидроксильных групп, к которой относятся сахара (восстанавливающие и не восстанавливающие сахара), сахарные спирты и сахарные кислоты. Типичные полиолы имеют молекулярную массу меньше чем около 600 кДа (например, в диапазоне от около 120 до около 400 кДа). «Восстанавливающий сахар» - это сахар, содержащий полуацетальную группу, которая может восстанавливать металлические ионы или реагировать ковалентно с лизином или другими аминогруппами в белках, а «не восстанавливающий сахар» - это тот, который не обладает данными свойствами восстанавливающего сахара. Примерами восстанавливающих сахаров являются фруктоза, манноза, мальтоза, лактоза, арабиноза, ксилоза, рибоза, рамноза, галактоза и глюкоза. Не восстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелезитозу и раффинозу. Ксилитол, эритритол, треитол, сорбитол и глицерин являются примерами сахарных спиртов. Не восстанавливающие сахара, такие как сахароза и трегалоза, могут в некоторых случаях быть предпочтительными полиолами.

Далее следует понимать, что фармацевтическая композиция может в некоторых воплощениях также содержать ПАВ, многие из которых хорошо известны в данной области. Примерные ПАВ включают полоксамеры (например, полоксамер 188). Может быть добавлено такое количество ПАВ, которое уменьшает агрегацию антитела и/или минимизирует образование частиц в составе. Например, ПАВ может присутствовать в составе в количестве от около 0,001% до около 0,2%, предпочтительно от около 0,01% до около 0,1%.

В одном воплощении композиция не содержит полиол и/или ПАВ.

В одном воплощении изобретения, фармацевтическая композиция не содержит добавки, выбранные из полисорбата 20, аргинина, гистидина, глутаминовой кислоты и маннитола.

В воплощении, изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, в которой антитело предоставляется с чистотой 95% или больше (например, 96%, или 97%, или 98%, или 99%, или более вплоть до 100%).

Фармацевтическая композиция, используемая для введения пациенту in vivo, предпочтительно является стерильной. Это легко достигается, к примеру, фильтрацией через 0,22 мкм стерильный фильтр.

Фармацевтическая композиция может быть составлена для подкожного или внутривенного введения. В некоторых воплощениях, особенно когда фармацевтическая композиция составлена для внутривенного введения, предпочтительно, если эта композиция является изотонической. Под «изотоническим» понимается состав, который по существу обладает таким же осмотическим давлением, что и человеческая кровь. Изотонические составы будут, как правило, иметь осмотическое давление от около 250 до 350 мОсм. Например, изотоничность может быть измерена газопаровым или криоскопическим осмометром.

В воплощении, фармацевтическая композиция, содержащая антитело, не подвергается предварительной лиофилизации.

В данной области хорошо известны способы создания антител, таких как антитело, обладающее тяжелой цепью с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 3 и легкой цепью с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 4.

Вкратце, для получения рекомбинантного антитела 2D03, кодирующий его полинуклеотид (фигура 1) вставляется в реплицируемые векторы для экспрессии. Доступно множество подходящих экспрессирующих векторов. Компоненты вектора, как правило, включают сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или несколько генов-маркеров, энхансерный элемент, промотер и последовательность терминации транскрипции.

Подходящие клетки хозяина для экспрессии гликозилированного антитела получают из многоклеточных организмов. Хотя клетки растений и насекомых могут быть подходящими клетками хозяина, предпочтительно, если ими являются клетки позвоночных, т.к. культивирование клеток позвоночных в тканевой культуре стало обычной процедурой. Примерами полезных клеточных линий млекопитающих являются COS-7, CV1, VERO-76, НЕК293, ВНК, СНО, ТМ4, HELA, MDCK, BRL 3А, W138, Нер G2, ММТ, TRI, MRC5, NSO и FS4.

Для продуцирования антител клетки хозяина трансфицируются экспрессирующими векторами и культивируются в обычной питательной среде, модифицированной, при необходимости, для индукции промоторов, отбора трансфектантов или амплификации генов, кодирующих последовательности антител. Используемые для продуцирования антитела клетки могут культивироваться в различных хорошо известных и коммерчески доступных средах, которые могут быть дополнены, при необходимости, гормонами и/или другими факторами роста, солями, буферами, нуклеотидами, антибиотиками, микроэлементами и источниками энергии, такими как глюкоза. Также могут быть включены любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, известные специалистам в данной области. Культуральные условия, такие как температура, рН и т.п., также хорошо известны в данной области.

При использовании рекомбинантных методов, антитело может продуцироваться внутриклеточно, в периплазмическое пространство либо секретироваться напрямую в среду. Если антитело продуцируется внутриклеточно, то на первом этапе дисперсный дебрис либо хозяйских клеток, либо лизированных клеток, удаляется, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Если антитело секретируется в среду, то супернатант из таких экспрессирующих систем, как правило, концентрируется с помощью коммерчески доступного фильтра для концентрирования белка, например, с помощью блока ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеаз, такой как PMSF, может быть включен на любом из вышеуказанных этапов для ингибирования протеолиза, а антибиотики могут быть включены для предотвращения роста случайных контаминантов.

Приготовленная из клеток композиция с антителом может быть очищена с помощью, например, гидроксиапатитной хроматографии, гель-электрофореза, диализа, аффинной хроматографии, и аффинная хроматография является предпочтительным методом очистки. Возможность применения протеина А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа присутствующего в антителе иммуноглобулинового Fc-домена. Протеин А может быть использован для очистки антител, в основе которых лежат тяжелые цепи γ1, γ2 или γ4 (Lindmark et al, (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13). Матрицей, к которой прикрепляется аффинный лиганд, чаще всего является агароза, но также имеются другие варианты матриц. Механически устойчивые матрицы такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(стирендивинил)бензол позволяют использовать более быстрые скорости потока и более короткие периоды проведения процесса, по сравнению с агарозой. Другие полезные методы для очистки белка включают фракционирование на ионообменной колонке, преципитацию с этанолом, обратно-фазную ВЭЖХ, хроматографию на окиси кремния, хроматографию на гепарине, хроматографию "Sepharoset™" на анионо- или катионообменной смоле (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, ДСН-ПААГ и преципитацию с сульфатом аммония.

Предпочтительно, если используемое в составе антитело 2D03 является преимущественно чистым и желательно преимущественно гомогенным (т.е. свободным от примесных белков). «Преимущественно чистый» состав с антителом - это композиция, которая содержит, по меньшей мере, 90 мас.% антитела, исходя из общей массы белков в композиции, предпочтительно 95 мас.%. «Преимущественно гомогенный» состав с антителом - это композиция, которая содержит, по меньшей мере, 99 мас.% антитела, исходя из общей белковой массы в композиции.

Второй аспект изобретения обеспечивает изделие, содержащее стерильный контейнер, содержащий стабильный водный фармацевтический состав, определенный в первом аспекте изобретения. Изделие может быть одноразовым шприцем, сосудом или флаконом или т.п. Контейнер может быть сформирован из различных материалов, таких как стекло или пластик. Примерный контейнер является 3-20 мл одноразовым стеклянным флаконом. Альтернативно, контейнер может быть 3-100 мл стеклянным флаконом. Контейнер содержит состав и, при необходимости, ярлык как на самом контейнере, так и вместе с ним, который может содержать инструкцию по применению. Изделие дополнительно может включать другие, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, материалы, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листок-вкладыш с инструкцией по применению.

Как уже было описано в WO 2004/030607 и WO 2007/025781, антитело 2D03 обладает способностью предотвращать и индуцировать регрессию атеросклеротических бляшек. Соответственно, третий аспект изобретения обеспечивает способ лечения, и/или профилактики, и/или редукции, и/или борьбы с атеросклерозом, или с ассоциированным с атеросклерозом сердечно-сосудистым заболеванием у пациентов, способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, определенной выше, в связи с первым аспектом изобретения.

В контексте настоящего изобретения, «терапевтически эффективное количество» антитела - это количество, эффективное для профилактики или лечения атеросклероза, или сердечно-сосудистого заболевания, ассоциированного с атеросклерозом.

Изобретение включает использование 2D03, т.е. антитела, обладающего тяжелой цепью с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 3 и легкой цепью с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 4, при изготовлении фармацевтической композиции, определенной в первом аспекте изобретения для лечения, и/или профилактики, и/или сокращения, и/или борьбы с атеросклерозом, или сердечно-сосудистого заболевания, ассоциированного с атеросклерозом, у пациента.

Изобретение также включает фармацевтическую композицию, определенную выше в первом аспекте изобретения для использования для лечения, и/или профилактики, и/или редукции, и/или борьбы с атеросклерозом, или с сердечно-сосудистым заболеванием, ассоциированным с атеросклерозом у пациента.

В воплощении, антитело в фармацевтической композиции редуцирует образование атеросклеротических бляшек у пациента, т.е. замедляет развитие атеросклероза, и предпочтительно редуцирует или предотвращает образование новых атеросклеротических бляшек.

В другом воплощении, антитело в фармацевтической композиции индуцирует регрессию уже существующих атеросклеротических бляшек в пациенте.

Под «регрессией атеросклеротических бляшек» мы понимаем редукцию размера и/или количества и/или степени атеросклеротических бляшек. Как правило, регрессия атеросклеротических бляшек приводит к редукции в области внутренней, покрытой бляшками, артериальной поверхности. Таким образом, к «регрессии атеросклеротических бляшек» мы относим снижение общей бляшечной нагрузки у индивидуума, а также редуцирование размера некоторых, или всех, атеросклеротических бляшек индивидуума. Регрессия атеросклеротических бляшек также ведет к увеличению просвета сосудов (т.е. к увеличению эффективного поперечного сечения артериального сосуда), что вносит свой вклад в усиление кровотока.

Способы измерения размера и/или количества и/или степени атеросклеротических бляшек у индивидуума хорошо известны специалисту в данной области и включают ангиографию, ультразвуковое исследование сосудов, компьютерную и магнитно-резонансную томографии.

В «редуцирование размера и/или числа и/или степени» мы включаем редукцию на около 1-25%, такую как редукция на около 1 или 2 или 3 или 4 или 5% или более сильную редукцию на около 6 или 7 или 8 или 9 или 10% или редукцию на 10-25%. Более предпочтительной является более сильная редукция на 25-50%, или 50-75% или больше.

В редуцирование площади покрытой атеросклеротическими бляшками внутренней артериальной поверхности мы включаем редукцию на около 1-25%, такую, как редукция на около 1 или 2 или 3 или 4 или 5%, или более сильную редукцию на около 6 или 7 или 8 или 9 или 10%, или редукцию на 10-25%. Более предпочтительной является более сильная редукция на 25-50%, или 50-75% или больше.

Под увеличением эффективного поперечного сечения артериального сосуда мы понимаем увеличение на 1-25%, такое как увеличение на около 1 или 2 или 3 или 4 или 5%, или более сильное увеличение на около 6 или 7 или 8 или 9 или 10% или увеличение на 10-25%. Более предпочтительной является более сильное увеличение на 25-50%, или 50-75% или 75-100%. Более предпочтительно, если эффективное поперечное сечение артериального сосуда увеличивается в 2 или 3 или 4 или 5 или 10 раз или более. Очевидно, степень увеличения поперечного сечения артериального сосуда зависит от уровня артериальной блокады, вызванной атеросклеротическими лезиями до начала лечения.

Как правило, регрессировать будут атеросклеротические бляшки, которые находятся в аорте индивидуума, но также могут быть найдены в других артериальных участках пациента, таких как бедренная, сонная или коронарная артерии.

Как правило, лечиться будут пациенты, являющиеся млекопитающими, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, животных зоопарка, спортивных животных, домашних животных, таких как собаки, кошки, лошади, коровы, овцы, свиньи, верблюды и т.п. Предпочтительным пациентом является человек.

Как правило, пациентом является человек с атеросклерозом. Следует понимать, что поскольку присутствующие в фармацевтической композиции антитела приводят к редукции размера уже существующих атеросклеротических бляшек (WO 2007/025781), фармацевтическая композиция является особенно полезной при лечении пациентов с прогрессирующей или тяжелой формой атеросклероза, и с прогрессирующей или тяжелой формой ассоциированного с атеросклерозом сердечно-сосудистого заболевания.

Пациентом может быть человек, который страдает, или имеет риск развития, ассоциированного с атеросклерозом сердечно-сосудистого заболевания. Термин «ассоциированное с атеросклерозом сердечно-сосудистое заболевание» относится к заболеваниям, которые по медицинским показаниям связаны с атеросклерозом, в виду того, что они являются следствием атеросклеротических лезий. Можно упомянуть следующие ассоциированные с атеросклерозом сердечно-сосудистые заболевания: ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда и инсульты.

Также следует понимать, что поскольку антитело фармацевтической композиции одновременно редуцирует образование атеросклеротических бляшек и индуцирует регрессию уже существующих атеросклеротических бляшек, то фармацевтическая композиция является полезной для уменьшения риска возникновения ассоциированного с атеросклерозом сердечно-сосудистого заболевания у пациента с риском развития упомянутых сердечно-сосудистых заболеваний из-за присутствия атеросклеротических бляшек. Пациентом с риском развития ассоциированного с атеросклерозом сердечно-сосудистого заболевания может быть пациент с такими уровнями холестерина в крови, которые могут вызвать или усугубить сердечно-сосудистое заболевание или дисфункцию.

Пациентом может быть: тот, кто имеет риск развития ишемической болезни сердца, являющейся следствием множества факторов риска (включая ожирение, курение, гипертонию, сахарный диабет и семейный анамнез преждевременной ишемической болезни сердца); тот, кто обладает наследуемым состоянием, которое характеризуется повышенными концентрациями в плазме холестерина и триглицеридов; тот, кто страдает гиперлипидемией, не вторичной по отношению к базовым заболеваниям (таким как гипотиреоз, нефротический синдром, болезнь печени или алкоголизм); тот, у кого повышенный уровень ЛНП-холестерина; или тот, кто находится под диетическим гиполипидемическим воздействием (дополнительное лечение).

В воплощении этого аспекта изобретения, изобретение может включать предыдущий этап определения размера и/или количества и/или степени атеросклеротических бляшек в индивидууме. Это может быть сделано для оценки необходимости лечения индивидуума для уменьшения нагрузки атеросклеротическими бляшками, или может быть сделано для обеспечения базового измерения для оценки эффективности такого лечения или для обеих целей. Следует понимать, что нагрузка атеросклеротическими бляшками, которую необходимо редуцировать, может быть связана с размерами и/или степенью общей бляшечной нагрузки. Дополнительно или альтернативно, это может быть связано с природой бляшек, например, с их нестабильностью.

При необходимости, и, как правило, после введения фармацевтической композиции изобретение может также содержать последовательный этап определения размера и/или количества и/или степени атеросклеротических бляшек в пациенте, с тем, чтобы оценить эффективность лечения по сравнению с контрольными измерениями, произведенными до начала лечения.

Является ли определенный пациент тем, кто получит пользу от лечения, определяется врачом.

Доказано, что статины (ингибиторы 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А (HMG-CoA) редуктазы) являются эффективными средствами предотвращения острых сердечно-сосудистых состояний путем редуцирования содержания холестерина в плазме (и путем дополнительных, еще не выясненных, механизмов). Описанное выше введение статина вместе с иммунотерапией может быть полезным средством лечения, дополняющим регрессию атеросклеротических бляшек.

Соответственно, четвертый аспект изобретения обеспечивает набор, содержащий компоненты: фармацевтическую композицию или лиофилизированную композицию, определенную выше в связи с первым аспектом изобретения, и статин. Подходящие и предпочтительные статины выбираются из аторвастатина, церивастатина, флувастатина, ловастатина, мевастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина. Как правило, статины вводятся в состав для перорального введения.

Каждый из компонентов представлен в форме, которая подходит для введения в сочетании с другими. Под «сочетанием» мы понимаем то, что компоненты могут подходить для одновременного или комбинированного введения пациенту. Однако, т.к. компоненты, как правило, вводятся разными путями, то под «сочетанием» мы также понимаем последовательное или отдельное введение в течение одного режима лечения.

Набор может дополнительно включать другие, желательные с коммерческой или пользовательской точки зрения, материалы, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листок-вкладыш с инструкцией по применению. Предпочтительно, если два компонента набора выбираются для получения синергического эффекта.

Пятый аспект изобретения включает способ лечения, и/или профилактики, и/или редукции, и/или борьбы с атеросклерозом, или с ассоциированным с атеросклерозом сердечно-сосудистым заболеванием, включающий введение индивидууму фармацевтической композиции, определенной выше в отношении первого аспекта изобретения, и статина.

Изобретение включает фармацевтическую композицию, определенную выше в отношении первого аспекта изобретения, и статин для использования в комбинации при лечении, и/или предотвращении, и/или редукции, и/или борьбе с ассоциированным с атеросклерозом сердечно-сосудистым заболеванием.

Предпочтительно, если для получения синергического эффекта выбирается режим с двумя дозами.

Подходящие и предпочтительные статины включают аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин.

Все упомянутые здесь документы включены посредством ссылки в полном объеме. В частности, полные раскрытия WO 2004/030607 и WO 2007/025781, относящихся к антителу 2D03, включены здесь посредством ссылки в полном объеме.

Перечисление или обсуждение ранее опубликованного документа в этом описании не должно обязательно рассматриваться как подтверждение того, что документ является частью утверждений текущего уровня или относится к области общих знаний.

Далее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры и фигуры.

На фигуре 1 изображена полинуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь 2D03 (SEQ ID No: 1) и легкую цепь (SEQ ID No: 2).

На фигуре 2 изображены аминокислотные последовательности тяжелой цепи 2D03 (SEQ ID No: 3) и легкой цепи (SEQ ID No: 4), кодируемые полинуклеотидами, представленными на фигуре 1. Области CDR подчеркнуты.

Пример 1: Влияние рН на стабильность

В ходе разработки способа очистки авторы обнаружили, что антитело 2D03 демонстрирует различные характеристики растворимости по сравнению с продуктами, ранее созданными с помощью n-CoDeR®. Как правило, 10-20 мМ фосфатный буфер, содержащий 150 мМ NaCl, рН 7-7,5 стабилизирует состав с антительными продуктами, созданными с помощью n-CoDeR®. Однако антитело 2D03 не стабильно в этом составе. Соответственно, авторы оценивали влияние рН и концентрации солей на стабильность антитела 2D03.

В итоге выяснилось, что:

- продукт с антителом 2D03 агрегирует при рН выше 6,0, но не при более низких значениях рН;

- если концентрирование или замена буфера ультрафильтрацией проводятся в растворах с низкой проводимостью (менее чем 100 мМ эквивалентов NaCl (в миллиСименсах)), то это приводит к образованию агрегатов, но этого не случается при более высоких концентрациях.

Начальные исследования показали, что продукт на основе антитела 2D03 может быть сконцентрирован, по меньшей мере, до 160 мг/мл, если поддерживать рН 5,5, а в состав включить 150 мМ NaCl.

Пример 2: Тесты на стабильность

Реферат

Цель этого исследования заключалась в выявлении стабильного состава для антитела 2D03 с концентрацией выше 100 мг/мл. Стабильность шести различных составов с концентрациями антител 100-150 мг/мл и рН 5,5 исследовали после инкубации при 5°С и при 24°С (ускоренное исследование).

Предпосылки

В примере 1 авторы обнаружили, что антитела 2D03 демонстрируют отличающиеся от ранее созданных с помощью n-Coder® антительных продуктов характеристики растворимости. В итоге, оказалось, что продукт агрегирует при рН выше 6,0, а концентрирование и замена буфера ультрафильтрацией приводят к появлению агрегатов, если проводятся в растворах с малой проводимостью. Основываясь на этих выводах, последующие исследования стабильности были ограничены составами с рН 5,5 и 150 мМ NaCl.

Исходя из опыта работы авторов с высококонцентрированными составами на основе продуктов n-CoDeR®, в большинство тестируемых составов был включен полисорбат 20, т.к. было продемонстрировано, что его введение повышает стабильность составов на основе антител n-CoDeR®; в один состав как вспомогательные вещества были включены аргинин и глутаминовая кислота, на основе данных, изложенных Golovanov et al (2004) J. Am. Chem. Soc, 126: 8933-8939; в один тестовый состав был включен маннитол, так как было продемонстрировано, что он повышает стабильность составов на основе антител; а гистидин был протестирован, так как является, как правило, подходящим биологическим буфером с соответствующим буферным диапазоном.

Аналитические методы

Следующие методы были использованы для оценки стабильность антитела 2D03 в различных составах. Каждый анализ (измерение концентрации, внешний вид, чистота, активность связывания с антигеном, осмолярность и качественный анализ) проводили с каждым из составов I-VI после 0, 4, 8, 14 и 18 недель хранения при температурах 5°С и 24°С.

Очистка гель-фильтрацией

Чистоту антитела качественно определяли с помощью ВЭЖХ на колонке «TSKgel 3000SWXL» фирмы TOSOH Bioscience. Данная колонка для гель-фильтрации отделяет молекулы в соответствии с их молекулярной массой и имеет наиболее эффективное разрешение в диапазоне 10-500 кДа. Мобильную фазу 5 мМ фосфата калия, содержащую 0,4 М хлорид натрия, рН 7,2, использовали при скорости потока 1 мл/мин. УФ-детекцию проводили при 280 нм, а площадь мономерного пика рассчитывали, как процент от общей площади пиков. Интегрирование автоматизировали после ручной настройки параметров.

Измерение концентрации белка по A₂₈₀

Определение содержания белка основано на поглощении ультрафиолета ароматическими остатками белка при 280 нм. Поглощение при 280 нм прямо пропорционально концентрации белка в соответствии с законом Lambert-Beers. Поглощение определяли с помощью спектрофотометра «UltrospecllO pro». Образец разводили в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, 0,15 М NaCl, рН 7,4 для того, чтобы попасть в диапазон 0,05-1 единиц оптической плотности. Концентрацию белка вычисляли по формуле:

А=εbc,

где А - поглощение, ε - коэффициент поглощения (в данном случае 1,62), с - концентрация в мг/мл и b - длина луча света в кювете в сантиметрах.

Катионообменная хроматография

Качественный анализ антитела проводили с помощью катионообменной хроматографии, которая разделяет молекулы на основе их различий в общем заряде белка. Использовали катионообменную колонку «ProPac® weak». Эта колонка специально разработана для обеспечения высокого разрешения и высокой эффективности разделения белков и гликопротеинов с pI=3-10, и Mw>10000. 10 мМ ацетат натрия, рН 5,0 (мобильная фаза А) и 10 мМ ацетат натрия, 1 М NaCl, рН 5,0 (мобильная фаза В) использовали со скоростью потока 1 мл/мин. Применяли линейный градиент 0-75% мобильной фазы В. Детекцию проводили по поглощению при 280 нм.

Светорассеяние при 410 нм

Для оценки преципитации, с помощью спектрофотометра «Ultrospec110 pro» измеряли светорассеяние при 410 нм. Для калибровки использовали деионизованную воду.

ДСН-ПААГ

Систему «SDS-PAGE Phast system™» использовали в соответствии с рекомендациями изготовителя. Белки (Phastgel Gradient 8-25) детектировали после окрашивания Кумасси. Концентрация образца при загрузке составляла около 0,5 мг/мл, в каждую лунку загружали по 3-4 мкл. Белковый маркер молекулярной массы «Fermentas PageRuler Prestained Protein Ladder» вносили в первую лунку каждого геля.

Связывание с антигеном

Планшеты для микротитрования покрывали MDA-АроВ100 в течение ночи. После отмывки, планшеты блокировали 0,45% рыбьим желатином в течение одного часа при комнатной температуре. Стандартные титры 2D03 и тестируемые образцы добавляли к покрытым и заблокированным планшетам для микротитрования и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После отмывки, добавляли конъюгат Ig-HRP Р214 (rabbit-anti-Human) и инкубировали планшеты еще час при комнатной температуре. Связывание визуализировали с помощью субстрата, о-фенилендиамин дигидрохлорида (OPD), и останавливали 1 М HCl. Поглощение считывали ридером «Versamax» при двух длинах волн, 490 нм (тест) и 650 нм (эталон). Данные собирались программным обеспечением «SOFTmax Pro 4.0», на котором проводили подсчет удельной концентрации антитела. Связывание антигена рассчитывали как удельную концентрацию, полученную данным методом ELISA, разделенную на полученное значение анализа общего белка (измеренное по A₂₈₀).

Осмолярность

Количественную осмолярность измеряли с помощью осмометра «Micro-Osmometer Typ 13/13 DR». Точки калибровки находились в интервале от 0 до 300 мОсм/кг Н₂О. При необходимости, образец разводили в воде MilliQ для попадания в калибровочный интервал.

Чистота

Измеренная после теста на стабильность чистота составов составляла не менее чем 95%.

Результаты

Состав I

Антитело 2D03 136 мг/мл

Ацетат натрия 20 мМ

NaCl 150 мМ

рН 5,5

Результаты

Стабильность при 5°С: стабильный через 14 недель, потеря стабильности через 18 недель.

Стабильность при 24°С: стабильный через 8 недель, потеря стабильности через 14 недель.

Состав II:

Антитело 2D03 136 мг/мл

Ацетат натрия 20 мМ

NaCl 150 мМ

Полисорбат 20 0.1% (1.1 мг/мл)

рН 5,5

Результаты

Стабильность при 5°С: стабильный через 4 недель, потеря стабильности через 8 недель.

Стабильность при 24°С: стабильный через 0 недель, потеря стабильности через 4 недели.

Состав III:

Антитело 2D03 136 мг/мл

Ацетат натрия 20 мМ

NaCl 150 мМ

Полисорбат 20 0,1% (1,1 мг/мл)

Маннитол 50 мМ

рН 5,5

Результаты

Стабильность при 5°С: стабильный через 8 недель, потеря стабильности через 14 недель.

Состав IV:

Антитело 2D03 136 мг/мл

Ацетат натрия 20 мМ

NaCl 150 мМ

His-HCl 50 мМ

Полисорбат 20 0,1% (1,1 мг/мл)

рН 5,5

Результаты

Стабильность при 5°С: стабильный через 0 недель, потеря стабильности через 4 недели.

Состав V:

Антитело 2D03 136 мг/мл

Ацетат натрия 20 мМ

NaCl 150 мМ

Аргинин 50 мМ

Глутамат 50 мМ

Полисорбат 20 0,1% (1,1 мг/мл)

рН 5,5

Результаты

Состав VI:

Антитело 2D03 151 мг/мл

Ацетат натрия 20 мМ

NaCl 150 мМ

His-HCl 50 мМ

Полисорбат 20 0,1% (1,1 мг/мл)

рН 5,5

Результаты

Заключение

Состав I был стабилен, по меньшей мере, в течение 14 недель при 5°С и, по меньшей мере, в течение 8 недель в ускоренном исследовании при 24°С и был наиболее стабильным выявленным составом. Этот состав был сочтен нестабильным в течение 18 недель при 5°С и в течение 14 недель при 24°С из-за присутствия осадка, наличие которого было оценено на глаз и по светорассеянию при 410 нм.

Для каждого из составов с I по VI, любым из вышеописанных способов в любом составе с течением времени не было отмечено каких-либо различий в чистоте, концентрации, характерных свойствах или активности. Нестабильность всех составов определяли по преципитации, различимой на глаз, и по светорассеянию при 410 нм.

Пример 3: Состав с концентрированным раствором 2D03

Краткое изложение

Антитело 2D03 в основном объеме раствора (37,3 г в объеме 1534,6 мл, исходя из концентрации белка 24,3 мг/мл, определенной по A2so) концентрировали фильтрацией с помощью фильтра «Pellicon» (давление на входе: 1.4-2.1 бар; давление ретентата: 0-0,7 бар) до конечной концентрации 120±20 мг/мл при комнатной температуре (фактическая концентрация 133 мг/мл).

После концентрирования продукт фильтровали через стерильный 0,22 мкм фильтр и хранили при температурах от +2°С до +8°С в стерильных бутылках из PETG.

В концентрированном растворе антитела с помощью описанных ниже известных процедур контроля качества оценивали внешний вид, концентрацию белка, рН, эндотоксины, чистоту, изоэлектрическое фокусирование, биологическую нагрузку, связывание с антигеном.

Внешний вид

Проводили визуальный осмотр раствора образца для выявления частиц, определения чистоты и цвета. Для выявления частиц, образец осматривали фронтально против черного и белого фона. Для определения чистоты, 1 мл образца переносили в стеклянную пробирку и проверяли на опалесцентность против черного фона, сравнивая с эталонными растворами, в соответствии с Европейской фармакопеей 2.2.1. Образец считался чистым, если был прозрачным как вода, или если его опалесценция не было более выраженной, чем у контрольной суспензии I. Если образец не отвечал этим критериям, то уровень опалесценции регистрировался как меньший, чем у первой эталонной суспензии, которая является более опалесцентной, чем образец, например, <// или <///. Цвет образца определяли по сравнению с водой против белого фона. Если образец был бесцветным как вода, то он регистрировался как бесцветный. Если нет, то описывался оттенок цвета.

Критерий допустимости был следующим: практическое отсутствие частиц. Зарегистрированные опалесценция и цвет.

Измерение концентрация белка по А₂₈₀

Концентрацию белка определяли так, как описано в примере 2, за исключением того, что использовался спектрофотометр «Shimandzu UV-1601».

Критерий допустимости был следующим: концентрация белка 120±20 мг/мл.

Измерение рН

рН-метр, комбинированный рН-электрод, «Radiometer-Copenhagen pHM-210» калибровали в диапазоне измерений с помощью стандартных буферных растворов, полученных от «Radiometer Analytical». Измеряли рН образца.

Критерий допустимости был следующим: рН 5,5±0,5.

Измерения уровня эндотоксина с помощью кинетического LAL

Для детекции грамм-негативного бактериального эндотоксина количественным кинетическим анализом использовали набор « Kinetic-QCL™ kit» от BioWhittaker. Анализ основан на энзиматической реакции, в которой эндотоксин активирует проэнзим в лизате амебоцитов Limulus (LAL), который в свою очередь катализирует расщепление р-нитроанилина (pNA), продуцируя желтый цвет.

Образцы и стандартные титры эндотоксина разводили в воде LAL реагента в свободных от эндотоксина стеклянных пробирках. Разведения по 100 мкл переносили в апирогенный 96-луночный планшет. В каждое разведение образца вносили известное количество эндотоксина. Планшеты преинкубировали в микропланшетном ридере «Versamax» при 37°С в течение 10 минут. LAL/субстрат разводили в воде LAL реагента. После инкубации в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора с LAL/субстрат. Считывание начинали немедленно и проводили каждые 2,5 минуты в течение 40 прогонов. Реакцию проводили при 37°С. Поглощение измеряли при длине волны 405 нм. Необходимое для проявления желтого цвета время является обратно пропорциональным количеству присутствующего в образце эндотоксина. Данные собирались программным обеспечением «SOFTmax Pro 4.0», после чего проводились расчеты. Количество эндотоксина выражается в определенных Международных Единицах - МЕ/мл. Принимается самое низкое разведение образца, дающее 50-150% восстановление внесенного эндотоксина.

Критерий допустимости был следующим: ≤4,0 МЕ/мл.

Определение чистоты (с помощью ВЭЖХ с гель-фильтрацией)

Чистоту антитела выражали количественно с помощью системы «Beckman System Gold» и ВЭЖХ на колонке «TSK3000» (TosoHaas). Данная колонка для гель-фильтрации отделяет молекулы в соответствии с их молекулярной массой и имеет наиболее эффективное разрешение в диапазоне 10-500 кДа. Мобильную фазу 5 мМ фосфата калия, содержащую 0,4 М хлорид натрия, рН 7,2, использовали со скоростью потока 1 мл/мин. Вводимый объем составлял 20 мкл. УФ-детекцию проводили при длине волны 280 нм. Площадь интегрированной поверхности автоматически рассчитывали с помощью установленных вручную параметров и программного обеспечения «32 Karat Version 5.0».

Критерий допустимости был следующим: ≥90% площади. Регистрировали время удерживания и % площади для основного пика и для пиков с % площади ≥0,5.

Определение чистоты (с помощью ДСН-ПААГ)

Чистоту образца оценивали электрофорезом в ДСН-полиакриламидном геле. Содержащие белок образцы нагревали до 95°С в течение пяти минут в буфере Трис-глицин-ДСН-Бромфеноловый Синий с или без меркаптоэтанола. Образцы и стандарты молекулярной массы Broad Range (BioRad) загружали в гели заводской заливки, с градиентом 4-20%, фирмы Novex. Гели прогоняли в буфере Трис-глицин-ДСН при напряжении 125 В в течение 120 минут на оборудовании «Novex X-cell II Mini cell». Белки визуализировали окрашиванием «GELCODE Blue». Окрашенные гели сканировали на денситометре «BioRad GS-710», и подсчитывали относительную чистоту. Результаты оценивали с помощью программного обеспечения «Quantity-One» (BioRad).

Критерий допустимости был следующим: сопоставимость с эталоном, и отсутствие дополнительных полос, соответствующих более чем 10% общего белка.

Изоэлектрическое фокусирование

Изоэлектрическое фокусирование проводили на электрофоретическом оборудовании «Multiplier II» с помощью плат «IsoGel® Agarose» с диапазоном рН 3-10. Анодным раствором была 0,5 М уксусная кислота, а катодным раствором - 1 М гидроксид натрия. Набор «IEF Calibration kit Broad pi» (Amersham Biosciences) использовали в качестве маркера. Перед введением в гель образцы обессоливали диализом против 1% глицина. Температура устанавливали на 10°С, а образцы предварительно фокусировали при 1500 В и 150 мА. После предварительного фокусирования, воздействие увеличивали до 25 Вт, фокусирование проводили в течение 60 минут. Белок детектировали окрашиванием Кумасси, гель сканировали на денситометре «GS-710» (BioRad). Значения pI образцов подсчитывали на программном обеспечении «Quantity One» с помощью калибровочной кривой, созданной исходя из дистанций миграции маркерных белков и их значений pI.

Этот способ был оптимизирован для антитела 2D03: мы обнаружили, что оптимальное количество белка для загрузки составляет 25 мкг при дистанции от катода 5 см. Исходя из этих данных, образцы анализировали в трех повторах, определяли значения р1 и количество полос, результаты регистрировали в виде pI (мин.) - pI (макс.) и количества полос.

Критерий допустимости был следующим: Сопоставимость с эталоном.

Биологическая нагрузка (микрофлора)

В течение 24 часов после взятия пробы, для обнаружения бактерий продукт инкубировали в чашке с триптон-соевым агаром при температуре 32,5±2.5°С, а для обнаружения грибов также инкубировали в чашке с агаром Сабуро с декстрозой при температуре 22,5±2,5°С. Через три дня, чашку с триптон-соевым агаром проверяли визуально и подсчитывали колонии, а через пять дней проверяли визуально чашку с агаром Сабуро с декстрозой.

Критерий допустимости был следующим: отсутствие бактерий и грибов.

Связывание с антигеном

Связывание с антигеном определяли, как описано в примере 2.

Критерий допустимости был следующим: ≥50% эталона.

Результаты

Концентрированный раствор 2D03 был составлен следующим образом (на мл):

133 мг антитела 2D03;

8,77 мг хлорида натрия;

2,35 мг ацетата натрия, тригидрата;

0,16 мкл уксусной кислоты;

гидроксид натрия в достаточном для достижения конечного рН 5,5 количестве;

и вода в достаточном для достижения конечного объема в 1 мл количестве.

По результатам двукратного тестирования концентрированный раствор 2D03 удовлетворил всем критериям допустимости вышеуказанных тестов.

Пример 4: Анализ долговременной стабильности препарата 2D03.

Исследования долговременной стабильности проводили для того, чтобы показать, что препарат антитела обладает достаточным сроком хранения, необходимым для использования в клинических условиях.

Препараты антитела, содержащие 25 мг/мл антитела 2D03 в 20 мМ ацетате натрия, 150 мМ хлориде натрия, рН 5,5, хранили при +5°С в течение 12 месяцев. Чистота препарата была выше 95%.

Анализ стабильности и результаты:

Тест	Способ	Критерий допустимости	Результат через 12 месяцев
Концентрация белка	Поглощение при А280	25,0±5,0 мг/мл	26,2
рН	рН-метр	5,5±0,5	5,6
Чистота	ВЭЖХ с гель-фильтрацией	≥95,0%	96,8

Эти результаты показывают, что в этом составе антитело 2D03 является достаточно стабильным в течение 12 месяцев при температуре +5°С, что позволяет использовать его в клинических условиях.

Пример 5: Анализ долговременной стабильности препарата 2D03.

Препарат антитела, такой же как и в примере 4, хранили при +25°С в течение 6 месяцев.

Тест	Способ	Критерий допустимости	Результат через 12 месяцев
Концентрация белка	Поглощение при А280	25,0±5,0 мг/мл	25,4
рн	рН метр	5,5±0,5	5,6
Чистота	ВЭЖХ с гель-фильтрацией	≥95,0%	95,7

Эти результаты показывают, что в этом составе антитело 2D03 является достаточно стабильным в течение 6 месяцев при температуре +25°С, что позволяет использовать его в клинических условиях.

Claims

1. Водная фармацевтическая композиция для лечения пациента от атеросклероза или кардиоваскулярного заболевания, ассоциированного с атеросклерозом, содержащая терапевтически эффективное количество антитела, имеющего тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID No:3 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID No:4, и фармацевтически приемлемый адъювант, разбавитель, носитель или наполнитель, где упомянутая композиция имеет рН от 4 до 6.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, имеющая рН 4,5 и выше.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, имеющая рН 4,9 и выше.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, имеющая рН от 4,9 до 5,1.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, имеющая рН около 5.

6. Фармацевтическая композиция по п.1, имеющая рН от 5 до 6.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, имеющая рН от 5 до 5,9.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, имеющая рН от 5,4 до 5,6.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, имеющая рН около 5,5.

10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-9, где антитело обеспечивается с чистотой 95% или больше, например, с чистотой 96%, или 97%, или 98%, или 99%, или больше, или с чистотой 100%.

11. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой антитело присутствует в концентрации от 10 до 200 мг/мл.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, в которой антитело присутствует в концентрации от 25 до 150 мг/мл.

13. Фармацевтическая композиция по п.11, в которой антитело присутствует в концентрации 25±10 мг/мл.

14. Фармацевтическая композиция по п.11, в которой антитело присутствует в концентрации 120±20 мг/мл.

15. Фармацевтическая композиция по п.11, в которой антитело присутствует в концентрации 150±10 мг/мл.

16. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая ацетатный буфер.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, в которой ацетат присутствует в концентрации 5-30 мМ.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, в которой ацетат присутствует в концентрации 10-30 мМ.

19. Фармацевтическая композиция по п.18, в которой ацетат присутствует в концентрации около 20 мМ.

20. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая хлорид натрия.

21. Фармацевтическая композиция по п.20, в которой хлорид натрия присутствует в концентрации от 100 мМ до 200 мМ, предпочтительно около 150 мМ.

22. Фармацевтическая композиция по п.1, дополнительно содержащая консервант.

23. Фармацевтическая композиция по п.22, в которой консервантом является бензиловый спирт.

24. Фармацевтическая композиция по п.1 для подкожного и внутривенного введения.

25. Фармацевтическая композиция по п.1, которая является стабильной при температуре 2-8°С, по меньшей мере, в течение 14 недель.

26. Фармацевтическая композиция по п.1, которая является стабильной при температуре 2-8°С, по меньшей мере, в течение 12 месяцев.

27. Фармацевтическая композиция по п.1, которая является стабильной при температуре 2-8°С в течение, по меньшей мере, 1,5 или, по меньшей мере, 3 лет.

28. Фармацевтическая композиция по п.1, которая является стабильной при температуре около 24°С в течение, по меньшей мере, 8 недель.

29. Фармацевтическая композиция по п.1, которая стабильна при замораживании и размораживании.

30. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой антитело не является предварительно лиофилизованным.

31. Фармацевтическая композиция по п.1, где пациент является человеком, имеющим атеросклероз.

32. Фармацевтическая композиция по п.1, где пациент является человеком, имеющим ассоциированное с атеросклерозом сердечно-сосудистое заболевание или риск его получения.

33. Фармацевтическая композиция по п.32, где ассоциированное с атеросклерозом заболевание выбирается из ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и инсульта.

34. Фармацевтическая композиция для лечения атеросклероза или кардиоваскулярного заболевания, ассоциированного с атеросклерозом, содержащая на мл:
от 15 до 160 мг антитела, определенного в п.1;
8,77 мг хлорида натрия;
2,35 мг тригидрата ацетата натрия;
0,16 мкл уксусной кислоты;
гидроксид натрия в достаточном количестве для достижения рН 5,5; и воду в достаточном количестве для достижения объема 1 мл.

35. Фармацевтическая композиция по п.34, в которой антитело присутствует в концентрации 25±10 мг/мл, 120±20 мг/мл, или 150±10 мг/мл.

36. Фармацевтическая композиция для лечения пациента от атеросклероза или ассоциированного с атеросклерозом кардиоваскулярного заболевания, содержащая:
25 мг/мл антитела по п.1;
20 мМ ацетата натрия;
150 мМ хлорида натрия;
гидроксид натрия в достаточном для достижения рН 5,5 количестве.

37. Изделие, содержащее стерильный контейнер, для удержания стабильной водной фармацевтической композиции по любому из пп.1-36.

38. Изделие по п.37, которое является одноразовым шприцом.

39. Набор для лечения пациента от атеросклероза или ассоциированного с атеросклерозом кардиоваскулярного заболевания, включающий стабильную фармацевтическую композицию, по любому из пп.1-36, и статин.

40. Набор по п.39, в котором статин введен в состав для перорального введения.

41. Набор по п.39 или 40, где статин выбирается из аторвастатина, церивастатина, флювастатина, ловастатина, мевастатина, правастатина, розувастатина и симвастатина.

42. Способ борьбы с атеросклерозом или с ассоциированным с атеросклерозом сердечно-сосудистым заболеванием у пациентов включающий введение фармацевтической композиции по любому из пп.1-36 нуждающемуся в ней пациенту.

43. Способ по п.42, в котором антитело уменьшает образование атеросклеротических бляшек у пациента.

44. Способ по п.42, в котором антитело индуцирует регрессию уже существующих атеросклеротических бляшек у пациентов.

45. Способ по любому из пп.42-44, где пациент является человеком, имеющим ассоциированное с атеросклерозом сердечно-сосудистое заболевание или риск его получения.

46. Способ по п.45, где ассоциированное с атеросклерозом сердечно-сосудистое заболевание выбирается из ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и инсульта.

47. Применение антитела, имеющего тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID No:3 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID No:4, в производстве фармацевтической композиции по любому из пп.1-36 для борьбы с атеросклерозом или с ассоциированным с атеросклерозом сердечно-сосудистым заболеванием у пациента.

48. Применение по п.47, при котором пациент является человеком, имеющим атеросклероз.

49. Применение по п.47, при котором пациент является человеком, имеющим ассоциированное с атеросклерозом сердечно-сосудистое заболевание или риск его получения.

50. Применение по п.49, при котором ассоциированное с атеросклерозом сердечно-сосудистое заболевание выбирается из ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и инсульта.

51. Способ борьбы с ассоциированным с атеросклерозом сердечно-сосудистым заболеванием, включающий введение индивидууму фармацевтической композиции по любому из пп.1-36 и статина.
52 Фармацевтическая композиция по п.1 и статин для использования в комбинации для борьбы с ассоциированным с атеросклерозом сердечно-сосудистым заболеванием.