RU2470076C2 - Method of selecting dna probes for microchip diagnosis, biochip and method for typing neuraminidase and haemagglutinin influenza virus a gene - Google Patents
Method of selecting dna probes for microchip diagnosis, biochip and method for typing neuraminidase and haemagglutinin influenza virus a gene Download PDFInfo
- Publication number
- RU2470076C2 RU2470076C2 RU2010123750/10A RU2010123750A RU2470076C2 RU 2470076 C2 RU2470076 C2 RU 2470076C2 RU 2010123750/10 A RU2010123750/10 A RU 2010123750/10A RU 2010123750 A RU2010123750 A RU 2010123750A RU 2470076 C2 RU2470076 C2 RU 2470076C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- probes
- neuraminidase
- typing
- gene
- dna
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 71
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims description 7
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 title abstract 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 101900156543 Influenza A virus Neuraminidase Proteins 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 7
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 7
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 2
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 claims 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 17
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 17
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 17
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 17
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 16
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 16
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 13
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 101900159346 Influenza A virus Hemagglutinin Proteins 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000702690 Human rotavirus A Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- -1 aminohexyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000002508 contact lithography Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, генетической инженерии, медицине и предназначено для использования при конструировании микрочипов, создаваемых для выявления целевых микроорганизмов с высоковариабельным геномом. Предлагаемый способ позволяет определять структуру представительных зондов для такого рода микрочипов. Например, предлагаемый способ позволяет находить зонды для выявления различных типов генов нейраминидазы и гемагглютинина вируса гриппа A. Предлагаемый способ типирования вируса гриппа основан на проведении двуэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР) кДНК вируса с последующей гибридизацией полученных флуоресцентно-меченых ампликонов с ДНК-микрочипом, содержащим соответствующие дискриминирующие гибридизационные зонды. Использование этого способа позволяет определять все 9 субтипов гена нейраминидазы вируса.The invention relates to molecular biology, genetic engineering, medicine, and is intended for use in the design of microchips created to identify target microorganisms with a highly variable genome. The proposed method allows to determine the structure of representative probes for such microchips. For example, the proposed method allows to find probes for detecting various types of influenza A virus neuraminidase and hemagglutinin genes. The proposed influenza virus typing method is based on a two-stage polymerase chain reaction (PCR) of virus cDNA followed by hybridization of the obtained fluorescently-labeled amplicons with a DNA microarray containing appropriate discriminatory hybridization probes. Using this method allows you to determine all 9 subtypes of the virus neuraminidase gene.
Биологические микрочипы в настоящее время используются для параллельного анализа специфических взаимодействий биологических макромолекул. За короткое время биологические микрочипы выделились в самостоятельную область анализа с приложениями от исследования фундаментальных проблем молекулярной биологии и молекулярной эволюции до практических применений в медицине, фармакологии, экологии, судебно-медицинской экспертизе и других областях. Возможность параллельного анализа одного образца на множестве типирующих зондов чрезвычайно важна для диагностики и типирования исследуемого микроорганизма. Это позволяет снизить время анализа от нескольких дней или даже недель до нескольких часов. Биологические микрочипы были успешно использованы для диагностики: вируса папилломы (An, H.J., Cho, N.H., Lee, S.Y., Kim, I.H., Lee, C., Kim, S.J., Mun, M.S., Kim, S.H. and Jeong, J.K. (2003) Correlation of cervical carcinoma and precancerous lesions with human papillomavirus (HPV) genotypes detected with the HPV DNA chip microarray method. Cancer, 97, 1672-1680), вируса атипичной пневмонии (SARS) (Wang, D., Urisman, A., Liu, Y.T., Springer, M., Ksiazek, Т.G., Erdman, D.D., Mardis, E.R., Hickenbotham, M., Magrini, V. et al. (2003) Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol., 1, E2), корона- и риновирусов (Kistler, A., Avila, P.C., Rouskin, S., Wang, D., Ward, Т., Yagi, S., Schnurr, D., Ganem, D., DeRisi, J.L. et al. (2007) Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J. Infect. Dis., 196, 817-825), филовирусов и малярийного паразита (Palacios, G., Quan, P.L., Jabado, O.J., Conlan, S., Hirschberg, D.L., Liu, Y., Zhai, J., Renwick, N., Hui, J. et al. (2007) Panmicrobial oligonucleotide array for diagnosis of infectious diseases. Emerg. Infect. Dis., 13, 73-81), ортопоксвирусов (Ryabinin VA, Shundrin LA, Kostina EB, Laassri M, Chizhikov V, Shchelkunov SN, Chumakov K, Sinyakov AN. Microarray assay for detection and discrimination of Orthopoxvirus species. 2006. J. Med. Virol. V.78, No 10, p.1325-1340), ротавирусов (Chizhikov, V., Wagner, M., Ivshina, A., Hoshino, Y., Kapikian, A.Z. and Chumakov, K. (2002) Detection and genotyping of human group A rotaviruses by oligonucleotide microarray hybridization. J. Clin. Microbiol., 40, 2398-2407) и ряда других микроогранизмов.Biological microchips are currently used for parallel analysis of specific interactions of biological macromolecules. In a short time, biological microchips have emerged as an independent field of analysis with applications ranging from studying the fundamental problems of molecular biology and molecular evolution to practical applications in medicine, pharmacology, ecology, forensic science, and other fields. The possibility of parallel analysis of one sample on a variety of typing probes is extremely important for the diagnosis and typing of the studied microorganism. This reduces the analysis time from a few days or even weeks to several hours. Biological microarrays have been successfully used to diagnose: papilloma virus (An, HJ, Cho, NH, Lee, SY, Kim, IH, Lee, C., Kim, SJ, Mun, MS, Kim, SH and Jeong, JK (2003) Correlation of cervical carcinoma and precancerous lesions with human papillomavirus (HPV) genotypes detected with the HPV DNA chip microarray method. Cancer, 97, 1672-1680), SARS virus (WAR, D., Urisman, A., Liu , YT, Springer, M., Ksiazek, T.G., Erdman, DD, Mardis, ER, Hickenbotham, M., Magrini, V. et al. (2003) Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. , 1, E2), corona- and rhinoviruses (Kistler, A., Avila, PC, Rouskin, S., Wang, D., Ward, T., Yagi, S., Schnurr, D., Ganem, D., DeRisi, JL et al. (2007) Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronaviru s and human rhinovirus diversity. J. Infect. Dis., 196, 817-825), filoviruses and malaria parasite (Palacios, G., Quan, PL, Jabado, OJ, Conlan, S., Hirschberg, DL, Liu, Y ., Zhai, J., Renwick, N., Hui, J. et al. (2007) Panmicrobial oligonucleotide array for diagnosis of infectious diseases. Emerg. Infect. Dis., 13, 73-81), orthopoxviruses (Ryabinin VA, Shundrin LA, Kostina EB, Laassri M, Chizhikov V, Shchelkunov SN, Chumakov K, Sinyakov AN. Microarray assay for detection and discrimination of Orthopoxvirus species. 2006. J. Med. Virol. V.78, No. 10, p. 1325-1340), rotaviruses (Chizhikov, V., Wagner, M., Ivshina, A., Hoshino, Y., Kapikian, AZ and Chumakov, K. (2002 ) Detection and genotyping of human group A rotaviruses by oligonucleotide microarray hybridization. J. Clin. Microbiol., 40, 2398-2407) and a number of other microorganisms.
Успех разработки микрочиповой диагностики, основанной на гибридизации типирующих зондов с нуклеиновой кислотой образца патогена, зависит от правильного выбора дискриминирующих олигонуклеотидных зондов микрочипа. Задача поиска типирующих зондов решается достаточно просто для сильно различающихся по структуре геномных последовательностей, например, при нахождении родоспецифичных зондов и в большинстве случаев не представляет каких-либо проблем. Так отличить вирус оспы от вируса герпеса достаточно легко (Ryabinin VA, Shundrin LA, Kostina EB, Laassri M, Chizhikov V, Shchelkunov SN, Chumakov K, Sinyakov AN. Microarray assay for detection and discrimination of Orthopoxvirus species. 2006. J. Med. Virol. V.78, No 10, pp.1325-1340). Задача существенно осложняется при поиске зондов в высоковариабельных геномах.The success of developing microarray diagnostics based on the hybridization of typing probes with a nucleic acid of a pathogen sample depends on the correct choice of discriminating microarray oligonucleotide probes. The search for typing probes is solved quite simply for genomic sequences that differ greatly in structure, for example, when finding genus-specific probes and in most cases does not present any problems. It is quite easy to distinguish smallpox virus from herpes virus (Ryabinin VA, Shundrin LA, Kostina EB, Laassri M, Chizhikov V, Shchelkunov SN, Chumakov K, Sinyakov AN. Microarray assay for detection and discrimination of Orthopoxvirus species. 2006. J. Med. Virol. V.78, No. 10, pp. 1325-1340). The task is significantly complicated when searching for probes in highly variable genomes.
Известен способ (Wernersson, R., and Н.В. Nielsen. 2005. Oligo Wiz 2.0 - integrating sequence feature annotation into the design of microarray probes. Nucleic Acids Res. 33: W611-W615, прототип) для выбора микрочиповых зондов. Метод основан на попарном анализе нуклеотидных последовательностей с целью выявления консервативных районов в этих последовательностях. Затем в выявленных консервативных районах выбираются микрочиповые ДНК-зонды. При этом подбираются зонды, образующие близкие температуры плавления с мишенью, отсеиваются зонды, имеющие внутренние шпильки. Успех выбора зондов определяется наличием консервативных районов в анализируемых последовательностях. Если консервативных последовательностей программа в анализируемых последовательностях не находит, ДНК-зонды не могут быть выбраны.A known method (Wernersson, R., and N.V. Nielsen. 2005. Oligo Wiz 2.0 - integrating sequence feature annotation into the design of microarray probes. Nucleic Acids Res. 33: W611-W615, prototype) for selecting microarray probes. The method is based on a pairwise analysis of nucleotide sequences in order to identify conserved regions in these sequences. Then, microarray DNA probes are selected in the identified conservative areas. In this case, probes are selected that form close to the melting temperature with the target, probes having internal studs are screened out. The success of the choice of probes is determined by the presence of conservative regions in the analyzed sequences. If the program does not find conserved sequences in the analyzed sequences, DNA probes cannot be selected.
В случае высоковариабельных геномов данный подход очень трудно, если вообще возможно, реализовать, например, в случае вируса гриппа типа A. При попытке создать микрочип, выявляющий субтипы вируса гриппа A по генам нейраминидазы и геммаглютинина, выясняется, что невозможно найти одни и те же типирующие зонды для всех известных штаммов. Это обусловлено с одной стороны, высокой вариабельностью генома, а с другой стороны, большим числом (несколько тысяч) отсеквенированных геномных последовательностей вируса гриппа. Поэтому стратегия выбора зондов в таких случаях должна быть модифицирована.In the case of highly variable genomes, this approach is very difficult, if at all possible, to implement, for example, in the case of type A influenza virus. When trying to create a microchip that detects influenza A virus subtypes from the neuraminidase and hemmagglutinin genes, it turns out that it is impossible to find the same typing probes for all known strains. This is due, on the one hand, to the high variability of the genome, and, on the other hand, to a large number (several thousand) of sequenced genomic sequences of the influenza virus. Therefore, the probe selection strategy in such cases should be modified.
Для выбора дискриминирующих зондов в случае высоковариабельных геномов мы предлагаем использовать новый подход. При разработке модифицированной стратегии выбора зондов мы исходили из предположения, что при типировании микроорганизмов более важны сходные пептидные элементы белков исследуемого микроорганизма, а не кодирующие их нуклеиновые кислоты, поскольку именно белки и пептиды ответственны за биологические эффекты. Поэтому первым этапом поиска микрочиповых зондов в нашем методе является анализ аминокислотных последовательностей выбранных генов микроорганизма и выявление консервативных пептидов, характерных только для определенного субтипа микроогранизма. На следующем этапе для выявленных отобранных пептидов с помощью таблицы кодонов аминокислот определяются все возможные кодирующие их нуклеотидные последовательности. Из полученных последовательностей с помощью описанной ниже процедуры отбирают набор зондов, обеспечивающих типирование целевого гена.To select discriminating probes in the case of highly variable genomes, we suggest using a new approach. When developing a modified probe selection strategy, we proceeded from the assumption that when typing microorganisms, similar peptide elements of the proteins of the studied microorganism are more important, rather than nucleic acids encoding them, since it is proteins and peptides that are responsible for biological effects. Therefore, the first step in the search for microarray probes in our method is the analysis of the amino acid sequences of the selected genes of the microorganism and the identification of conservative peptides that are characteristic only for a specific subtype of microorganism. At the next stage, for the identified selected peptides, all possible nucleotide sequences encoding them are determined using the amino acid codon table. From the obtained sequences, using the procedure described below, a set of probes is selected to ensure the typing of the target gene.
Предлагаемый подход опробован на примере типирования вируса гриппа A по вирусным маркерам - генам нейраминидазы и гемагглютинина.The proposed approach was tested on the example of typing of influenza A virus by viral markers - neuraminidase and hemagglutinin genes.
Всего известно 9 субтипов нейраминидазы и учитывая, что протяженность гена нейраминидазы составляет примерно 1500 пар оснований, нахождение по 15-25 зондов, специфичных по отношению к каждому из 9 подтипов нейраминидазы, является сложной задачей. Отбор олигонуклеотидных зондов для определения подтипа нейраминидазы проводился с использованием разработанного программного обеспечения в два этапа. Первый этап включает в себя отбор специфичных аминокислотных последовательностей, характерных для определяемого подтипа, но отсутствующих в других белковых последовательностях анализируемого набора белков. На втором этапе проводится отбор олигонуклеотидных зондов, исходя из структуры пептидов.A total of 9 subtypes of neuraminidase are known, and given that the length of the neuraminidase gene is approximately 1,500 base pairs, finding 15–25 probes specific for each of the 9 subtypes of neuraminidase is a difficult task. The selection of oligonucleotide probes for determining the subtype of neuraminidase was carried out using the developed software in two stages. The first stage involves the selection of specific amino acid sequences that are characteristic of the determined subtype, but absent in other protein sequences of the analyzed set of proteins. At the second stage, oligonucleotide probes are selected based on the structure of the peptides.
Работа по расчету зондов включает следующие стадии:The work on the calculation of probes includes the following stages:
- отбор белковых и нуклеиновых последовательностей нейраминидазы;- selection of protein and nucleic sequences of neuraminidase;
- отбор пептидов, общих для определяемого субтипа нейраминидазы;- selection of peptides common to the determined subtype of neuraminidase;
- удаление из полученного набора тех пептидов, которые присутствуют в белковых последовательностях других подтипов нейраминидазы;- removing from the resulting set of those peptides that are present in the protein sequences of other subtypes of neuraminidase;
- расчет олигонуклеотидных зондов исходя из структуры пептидов;- calculation of oligonucleotide probes based on the structure of peptides;
- выбор наиболее представительных олигонуклеотидных зондов;- selection of the most representative oligonucleotide probes;
- удаление из полученного набора тех олигонуклеотидных зондов, введение в которые одной или двух точечных замен дают зонды, характерные для других подтипов нейраминидазы;- removal from the resulting set of those oligonucleotide probes, the introduction of which one or two point substitutions give probes characteristic of other subtypes of neuraminidase;
- выбор олигонуклеотидных зондов с оптимальной температурой плавления.- selection of oligonucleotide probes with optimal melting points.
В работе использовали данные GENBANK (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) по нейраминидазе вируса гриппа A по март 2008 г.We used the GENBANK data (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) for influenza A virus neuraminidase as of March 2008.
Как видно из Таблицы 1, различные подтипы нейраминидазы представлены различным количеством последовательностей. Наиболее многочисленны подтипы N1 и N2; остальные подтипы присутствуют в существенно меньшей степени. Внутри определенного подтипа нейраминидазы имеется дифференциация, связанная с подтипом гемагглютинина. Так, нейраминидаза N1 в наибольшей степени представлена подтипом гемагглютинина H1 и H5, тогда как некоторые из подтипов гемагглютинина проявляются незначительно (H4, H10, H12) или не представлены вовсе (H8, H13, H14, H15).As can be seen from Table 1, different subtypes of neuraminidase are represented by a different number of sequences. The most numerous subtypes N1 and N2; the remaining subtypes are present to a much lesser extent. Within a specific subtype of neuraminidase, there is a differentiation associated with the hemagglutinin subtype. So, neuraminidase N1 is most represented by the hemagglutinin subtype H1 and H5, while some of the hemagglutinin subtypes appear slightly (H4, H10, H12) or not at all (H8, H13, H14, H15).
В полученной базе данных для каждого серотипа нейраминидазы (набор для всех субтипов геммагглютинина) выявляют общие пептиды, длиной в 7 аминокислотных остатков. Предварительный анализ показал, что выбор более длинных пептидов снижает число зондов, общих для определяемого подтипа, а более короткие являются менее специфичными. При анализе рассматривались только последовательности длиной не менее 200 аминокислотных остатков. Поскольку найти общие пептиды для абсолютно всех белков данного серотипа не удается как в силу вариабельности белковой последовательности, так из-за того, что в GenBank представлены частично секвененированные последовательности, то отбирались пептиды, содержащиеся не менее чем в 90% белков. Полученный набор пептидов для каждого серотипа нейраминидазы вируса гриппа определяет практически 100% всех штаммов и изолятов анализируемого типа.In the obtained database, for each serotype of neuraminidase (a set for all hemmagglutinin subtypes), common peptides with a length of 7 amino acid residues are detected. Preliminary analysis showed that the selection of longer peptides reduces the number of probes common to the determined subtype, while shorter ones are less specific. The analysis considered only sequences of at least 200 amino acid residues in length. Since it is not possible to find common peptides for absolutely all proteins of this serotype, both due to the variability of the protein sequence, and because partially sequenced sequences are presented in GenBank, peptides containing not less than 90% of the proteins were selected. The obtained set of peptides for each serotype of influenza virus neuraminidase determines almost 100% of all strains and isolates of the analyzed type.
На следующем этапе анализа производят селекцию пептидных наборов, характеризующих серотипы нейраминидазы. Из полученных наборов удаляют пептиды одной и той же структуры, но принадлежащие к наборам разных серотипов. В результате получают набор 7-членных пептидов, характеризующих определенный подтип нейраминидазы.At the next stage of the analysis, peptide sets characterizing neuraminidase serotypes are selected. Peptides of the same structure, but belonging to sets of different serotypes, are removed from the obtained sets. The result is a set of 7-membered peptides characterizing a particular subtype of neuraminidase.
На следующей стадии набор 7-членных пептидов переводят в набор 21-членных олигонуклеотидов, кодирующих эти пептиды.In the next step, a set of 7-membered peptides is transferred to a set of 21-membered oligonucleotides encoding these peptides.
Очевидно, что общее число олигонуклеотидных зондов, представляющих весь набор пептидов, слишком велико и может достигать нескольких тысяч. Поскольку многие из них определяют лишь несколько последовательностей ДНК, то следующим этапом является отбор из исходного полного набора зондов наиболее оптимальной по размеру выборки олигонуклеотидов (20-24 зонда), позволяющей с наибольшей вероятностью определять субтип нейраминидазы. На первый взгляд достаточно выбрать наиболее часто встречающиеся зонды. Но при таком подходе могут быть селективно отобраны зонды только для нейраминидазы с наиболее представленным субтипом гемагглютина. В случае субтипов нейраминидазы первого типа (H_X_N1) это будут последовательности H1N1 - 1140 последовательности из 2696 (42%) и H5N1 - 1295 последовательностей (48%). Для уменьшения влияния «фактора разной представленности» нейраминидазы первого типа различными подтипами гемагглютинина используется следующий прием (Фиг.2). Из полного набора зондов (Probe_Total) отбирается наиболее представительный (Probe_1-1) для полного набора ДНК последовательностей (Seq_0). На следующей стадии из полного набора последовательностей ДНК отбрасываются все те, которые содержат первый зонд (Probe_1-1), и получают набор Seq_1. Для этого набора находят наиболее представительный олигонуклеотидный зонд (Probe_1-2). Из набора Seq_1 отбрасывают последовательности, содержащие зонд Probe_1-2, и получают набор Seq_2. Операции повторяют до получения зондов Probe_1-3, Probe_1-4, Probe_1-5, Probe_1-6.Obviously, the total number of oligonucleotide probes representing the entire set of peptides is too large and can reach several thousand. Since many of them determine only a few DNA sequences, the next step is to select from the initial complete set of probes the most optimal oligonucleotide sample size (20-24 probes), which makes it possible to determine the subtype of neuraminidase. At first glance, it’s enough to choose the most common probes. But with this approach, only neuraminidase probes with the most represented hemagglutin subtype can be selectively selected. In the case of the subtypes of neuraminidase of the first type (H_X_N1), these will be the sequences H1N1 - 1140 sequences from 2696 (42%) and H5N1 - 1295 sequences (48%). To reduce the influence of the "factor of different representation" of the neuraminidase of the first type with different subtypes of hemagglutinin, the following technique is used (Figure 2). From the complete set of probes (Probe_Total), the most representative (Probe_1-1) for the complete set of DNA sequences (Seq_0) is selected. In the next step, all those that contain the first probe (Probe_1-1) are discarded from the complete set of DNA sequences and receive the Seq_1 set. The most representative oligonucleotide probe (Probe_1-2) is found for this kit. From the set of Seq_1, sequences containing the probe Probe_1-2 are discarded, and the set of Seq_2 is obtained. The operations are repeated until the probes Probe_1-3, Probe_1-4, Probe_1-5, Probe_1-6 are obtained.
На следующей стадии из набора Probe_Total отбрасывают первые шесть зондов (Probe_1-1) - (Probe_1-6) и из оставшихся олигонуклеотидных зондов отбирают по той же схеме еще шесть зондов, используя в качестве стартового полный набор ДНК (Seq_0). Операцию повторяют еще 3 раза и получают 30 зондов.At the next stage, the first six probes (Probe_1-1) - (Probe_1-6) are discarded from the Probe_Total set and six more probes are selected from the remaining oligonucleotide probes in the same way, using the complete DNA set (Seq_0) as the starting one. The operation is repeated 3 more times and 30 probes are obtained.
Следует отметить, что в случае малого количества последовательностей ДНК (например, для нейраминидазы четвертого типа, представленной 31 последовательностью) уже Probe_1-1 - Probe_1-3 определяли исходный набор ДНК. Тогда как, для нахождения большего количества зондов (20-24) расчет проводится не 5, а большее число раз. По мере увеличения числа итераций наиболее представительные зонды выявляют меньше штаммов целевого субтипа, а наименее представительные - больше.It should be noted that in the case of a small number of DNA sequences (for example, for the fourth type neuraminidase represented by 31 sequences), the initial DNA set was already determined by Probe_1-1 - Probe_1-3. Whereas, to find a larger number of probes (20-24), the calculation is carried out not 5, but more times. As the number of iterations increases, the most representative probes reveal fewer strains of the target subtype, and the least representative ones show more.
Возможны и другие варианты селекции зондов. Например, для более полного учета минорных последовательностей ДНК (таких как H8N1, H10N1 и т.д.) можно модифицировать описанный выше подход. В процессе расчета из полного набора ДНК-последовательностей (Seq_0) можно исключить те, которые содержат больше заданного числа зондов (N_tr). Варьируя значение этого параметра можно изменять долю зондов, определяющих нейраминидазу первого типа в минорных наборах ДНК. Чем меньше значение N_tr, тем большее число последовательностей ДНК из полного набора будет иметь не менее N_tr зондов в своем составе, тогда как при больших значениях этого параметра расчет будет проводиться фактически по первому варианту. В рассматриваемом нами случае для всех оставшихся субтипов нейраминидазы используется набор из 30 олигонуклеотидных зондов.Other probe selection options are also possible. For example, to more fully account for minor DNA sequences (such as H8N1, H10N1, etc.), the approach described above can be modified. During the calculation, those that contain more than a given number of probes (N_tr) can be excluded from the complete set of DNA sequences (Seq_0). By varying the value of this parameter, one can change the proportion of probes that determine the first type of neuraminidase in minor DNA sets. The smaller the N_tr value, the greater the number of DNA sequences from the complete set will have at least N_tr probes in its composition, while for large values of this parameter the calculation will be carried out in fact according to the first option. In our case, for all the remaining subtypes of neuraminidase, a set of 30 oligonucleotide probes is used.
Для того чтобы уменьшить число ложноположительных результатов, олигонуклеотидные зонды, образующие ДНК-дуплексы с кДНК нецелевых субтипов с одним или двумя мисматчами, не используются в разрабатываемом микрочипе.In order to reduce the number of false-positive results, oligonucleotide probes forming DNA duplexes with cDNA of non-target subtypes with one or two mismatches are not used in the developed microchip.
Следующей стадией модификации зондов является их укорачивание или удлинение для выравнивания температур плавления ДНК-гибридов. Следует отметить, что для этого не ставились слишком жесткие условия. Разброс интервала температур плавления ДНК-гибридов был выбран равным 10°C. Последовательность зонда укорачивали либо удлиняли на 1-2 нуклеотидных основания. Модифицированные зонды подвергали проверке на наличие в последовательностях других подтипов.The next stage in the modification of probes is their shortening or extension to equalize the melting points of DNA hybrids. It should be noted that there were not too stringent conditions for this. The variation in the melting temperature range of DNA hybrids was chosen equal to 10 ° C. The probe sequence was shortened or extended by 1-2 nucleotide bases. Modified probes were checked for other subtypes in the sequences.
Подобным же образом были рассчитаны зонды и для других серотипов нейраминидазы. Количество зондов для определения конкретного серотипа нейраминидазы варьировалось от 19 до 24. Всего был отобран 191 зонд (Фиг.3).Probes for other serotypes of neuraminidase were likewise calculated. The number of probes for determining the specific serotype of neuraminidase varied from 19 to 24. A total of 191 probes were selected (Figure 3).
Для объективного представления результатов гибридизации на микрочипе важно проводить инструментальный анализ результатов сканирования чипа. Для этого после проведения сканирования проводился анализ флуоресценции спотов с использованием программы ScanArray Express (Perkin-Elmer).For an objective presentation of the results of hybridization on a microchip, it is important to carry out instrumental analysis of the results of scanning the chip. For this, after scanning, spot fluorescence analysis was performed using the ScanArray Express program (Perkin-Elmer).
При определения субтипа нейраминидазы вируса гриппа использовали подход, основанный на определении средней флуоресценции спота каждого подтипа (Yµ)In determining the subtype of influenza virus neuraminidase, an approach based on determining the average fluorescence of the spot of each subtype (Y µ ) was used
где µ - подтип нейраминидазы,where µ is a subtype of neuraminidase,
i - номер спота,i is the spot number,
N - число спотов на чипе для используемых для определения подтипа нейраминидазы.N is the number of spots on the chip used to determine the subtype of neuraminidase.
Такой подход был выбран потому, что даже в случае несовершенных дуплексов, имеет место связывание зондов с анализируемой ДНК и степень соответствия структуры зонда структуре ДНК всегда соответствует уровню флуоресценции спотов. Т.е. в большей степени будут флуоресцировать споты, характерные для определяемого подтипа нейраминидазы, чем таковые для всех других подтипов.This approach was chosen because, even in the case of imperfect duplexes, there is a binding of the probes to the analyzed DNA and the degree of correspondence of the probe structure to the DNA structure always corresponds to the spot fluorescence level. Those. the spots characteristic of the determined neuraminidase subtype will fluoresce more than those for all other subtypes.
Аналогично определяли субтип гемагглютинина вируса гриппа. Всего существует 16 субтипов вируса гриппа A. Как и для нейраминидазы, представленность подтипов гемагглютинина в базах данных была различной - максимальна для подтипов H1, H3, H5 и существенно более низкой для остальных подтипов. Наименее представлен подтип H14 - всего две последовательности, в связи с чем расчет зондов для данного подтипа не проводился. Для определения каждого подтипа гемагглютинина использовалось от 13 (пандемический свиной грипп H1N1) до 28 (гемагглютинин третьего типа) олигонуклеотидных зондов. Общее число зондов, использованных в микрочипе, составило 325.The influenza hemagglutinin subtype was similarly determined. In total, there are 16 subtypes of influenza A virus. As for neuraminidase, the representation of hemagglutinin subtypes in the databases was different - maximum for the H1, H3, H5 subtypes and significantly lower for the remaining subtypes. The H14 subtype is the least represented - only two sequences; therefore, the probes were not calculated for this subtype. To determine each subtype of hemagglutinin, 13 (pandemic swine flu H1N1) to 28 (type III hemagglutinin) oligonucleotide probes were used. The total number of probes used in the microchip was 325.
Принципиальная схема типирования гена нейраминидазы вируса гриппа A на микрочипе включает следующие стадии:The concept of typing the influenza A virus neuraminidase gene on a microchip involves the following steps:
Из образца слизистой ткани выделяют суммарную РНК;Total RNA is isolated from a sample of mucous tissue;
с помощью универсального праймера 5'-GACTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGG-3', специфичного к РНК вируса гриппа A, получают кДНК;using universal primer 5'-GACTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGG-3 'specific for RNA of influenza A virus, cDNA is obtained;
3. с помощью праймеров 5'-CTATAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3' и 5'-CACTATAGAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3', специфичных к гену нейраминидазы, из кДНК путем проведения ПЦР получают полноразмерный ампликон гена нейраминидазы вируса гриппа A;3. Using
4. полученный ампликон реамплифицируют в асимметричном режим с праймерами:4. The resulting amplicon is re-amplified in asymmetric mode with primers:
5'-CTATAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3',5'-CTATAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3 ',
5'-TAACAGGA(G/A)CA(C/T)TCCTC(A/G)TA(G/A)TG-3' и5'-TAACAGGA (G / A) CA (C / T) TCCTC (A / G) TA (G / A) TG-3 'and
5'-CACTATAGAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3',5'-CACTATAGAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTT-3 ',
5'-CACTATAGAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3'5'-CACTATAGAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTT-3 '
и метят путем введения флуоресцентной метки в его состав;and labeled by introducing a fluorescent label into its composition;
5. на следующей стадии проводят гибридизацию полученных ампликонов с дискриминирующими зондами, входящими в состав разработанного микрочипа;5. at the next stage, the resulting amplicons are hybridized with discriminating probes that are part of the developed microchip;
6. анализ результатов гибридизации проводят с помощью сканера микрочипов и программы Scanarray Express. Результаты анализа представляются в графической форме с помощью программы Microsoft Office Excel.6. The analysis of the results of hybridization is carried out using a microchip scanner and Scanarray Express. Analysis results are presented in graphical form using Microsoft Office Excel.
Принципиальная схема типирования гена гемагглютинина вируса гриппа A на микрочипе включает следующие стадии:The concept of typing the influenza A virus hemagglutinin gene on a microchip involves the following steps:
1. Из образца слизистой ткани выделяют суммарную РНК;1. Total RNA is isolated from a sample of mucous tissue;
2. с помощью универсального праймера 5'-GACTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGG-3', специфичного к РНК вируса гриппа A, получают кДНК;2. Using the universal primer 5'-GACTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGG-3 'specific for RNA of influenza A virus, cDNA is obtained;
3. с помощью праймеров 5'-GACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3' и 5'-GTGACACTATAGAAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3', специфичных к гену гемагглютинина, из кДНК путем проведения ПЦР получают полноразмерный ампликон гена гемагглютинина вируса гриппа A;3. Using primers 5'-GACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3 'and 5'-GTGACACTATAGAAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3', specific for the hemagglutinin gene, a full-size hemagglutin gene gene amplification from the cDNA is obtained;
4. полученный ампликон реамплифицируют в асимметричном режим с праймерами:4. The resulting amplicon is re-amplified in asymmetric mode with primers:
5'-GACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3'5'-GACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3 '
5'-59-TCWATRAANCCNGCDATDGCHCC-3'5'-59-TCWATRAANCCNGCDATDGCHCC-3 '
5'-GGDGCHATHGCNGGNTTYATWGA-3'5'-GGDGCHATHGCNGGNTTYATWGA-3 '
5'-GGTGACACTATAGAAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3' и метят путем введения флуоресцентной метки в его состав;5'-GGTGACACTATAGAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3 'and labeled by introducing a fluorescent label in its composition;
5. на следующей стадии проводят гибридизацию полученных ампликонов с дискриминирующими зондами, входящими в состав разработанного микрочипа;5. at the next stage, the resulting amplicons are hybridized with discriminating probes that are part of the developed microchip;
6. анализ результатов гибридизации проводят с помощью сканера микрочипов и программы Scanarray Express. Результаты анализа представляются в графической форме с помощью программы Microsoft Office Excel.6. The analysis of the results of hybridization is carried out using a microchip scanner and Scanarray Express. Analysis results are presented in graphical form using Microsoft Office Excel.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:The invention is illustrated by the following graphic materials:
Фиг.1. Таблица 1. Количество анализированных серотипов нейраминидазы вируса гриппа типа А.Figure 1. Table 1. The number of analyzed serotypes of influenza virus neuraminidase type A.
Фиг.2. Таблица 2. Количество анализированных серотипов гемагглютинина вируса гриппа типа A.Figure 2. Table 2. The number of analyzed serotypes of influenza virus type A hemagglutinin
Фиг.3. Схема селекции олигонуклеотидных зондов для типирования гена нейраминидазы первого типа вируса гриппа A.Figure 3. The selection scheme of oligonucleotide probes for typing the neuraminidase gene of the first type of influenza A.
Фиг.4. Таблица 3. Структура олигонуклеотидных зондов для выявления серотипов нейраминидазы вируса гриппа A.Figure 4. Table 3. The structure of oligonucleotide probes for detecting serotypes of influenza A virus neuraminidase.
Фиг.5. Таблица 4. Структура олигонуклеотидных зондов для выявления серотипов гемагглютинина вируса гриппа A.Figure 5. Table 4. The structure of oligonucleotide probes for detecting serotypes of influenza A virus hemagglutinin.
Фиг.6. Структура микромассива микрочипа, выявляющего субтип гена нейраминидазы вируса гриппа A.6. The structure of the microarray of a microchip detecting a subtype of the influenza A virus neuraminidase gene.
Фиг.7. Результат типирования ампликонов гена нейраминидазы вируса гриппа A на микрочипе. Вертикальной чертой указана относительная ошибка измерения значения флуоресценции.7. The result of typing amplicons of the influenza A virus neuraminidase gene on a microchip. The vertical bar indicates the relative measurement error of the fluorescence value.
Фиг.8. Структура микромассива микрочипа, выявляющего субтип гена гемагглютинина вируса гриппа A.Fig. 8. The structure of the microarray of a microchip detecting the subtype of the influenza A virus hemagglutinin gene
Фиг.9. Результат типирования ампликонов гена гемагглютинина вируса гриппа A на микрочипе. Вертикальной чертой указана относительная ошибка измерения значения флуоресценции.Fig.9. The result of typing amplicons of the influenza A virus hemagglutinin gene on a microchip. The vertical bar indicates the relative measurement error of the fluorescence value.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже приведены примеры его конкретного выполнения.For a better understanding of the invention, the following are examples of its specific implementation.
Пример 1. Изготовление микрочипов для типирования генов нейраминидазы геммаглютинина вируса гриппа AExample 1. The manufacture of microarrays for typing genes for neuraminidase hemmagglutinin influenza A virus
Печать микрочипов осуществляли на стеклянных, содержащих изотиоцианатную группу слайдах методом контактной печати на споттере BioOdyssey Calligrapher miniarrayer («Bio-Rad») одним пином. Каждый слайд содержал 4 эквивалентных микромассивов зондов (микроэрреея), пригодных для одновременной гибридизации 4 образцов. Средний диаметр спотов (ячеек микрочипа с иммобилизованными зондами) был ~360 µm, расстояние между спотами - 380 µm.Microchips were printed on glass slides containing an isothiocyanate group by contact printing on a BioOdyssey Calligrapher miniarrayer (Bio-Rad) spotter using one pin. Each slide contained 4 equivalent microarrays of probes (microarray), suitable for simultaneous hybridization of 4 samples. The average diameter of the spots (microchip cells with immobilized probes) was ~ 360 μm, the distance between the spots was 380 μm.
Формат микроэррея составлял 24×25 спотов. Микромассив микрочипа для типирования гена нейраминидазы содержал 24×9 спотов (фиг.6), а микромассив микрочипа для типирования гена гемагглютинина - 24×9 слотов (фиг.8). Печать проводилась из 384-луночных планшетов (24×16). Каждому подтипу нейраминидазы или гемагглютинина отводилась одна строка. На фиг.6 и 8 приведены расположение зондов в планшетах и, соответственно, в микромассивах микрочипа.The format of the microerray was 24 × 25 spots. The microarray of the microarray for typing the gene of neuraminidase contained 24 × 9 spots (Fig.6), and the microarray of the microarray for typing the gene of hemagglutinin contained 24 × 9 slots (Fig. 8). Printing was carried out from 384-well plates (24 × 16). Each subtype of neuraminidase or hemagglutinin was given one line. 6 and 8 show the location of the probes in the tablets and, respectively, in the microarrays of the microchip.
Для удобства работы и нормирования сигнала в крайние ячейки плашки добавлялся маркерный зонд, несущий на 3'-конце аминогексильную группу, необходимый для иммобилизации на поверхности слайда. На 5'-конце зонда находится флуорофор на основе тетраметилродамина (Tamra), позволяющий визуализировать границы субэррея, определять качество печати чипа и проводить нормировку сигнала флуоресценции.For convenience of operation and signal normalization, a marker probe was added to the extreme cells of the plate, carrying an aminohexyl group at the 3'-end necessary for immobilization on the surface of the slide. At the 5'-end of the probe there is a fluorophore based on tetramethylrodamine (Tamra), which allows visualizing the boundaries of the subarray, determining the print quality of the chip, and normalizing the fluorescence signal.
В каждую ячейку планшета при печати добавлял 60 мкл раствора А (135 мМ NaHCO3) и 20 мкл раствора зонда (С=200 нмоль/мл). Т - 80 мкл 6 нМ раствор Tamra (dT8)~NH2 в 100 мМ NaHCO3. В буфер - 60 мкл раствора А (135 мМ NaHCO3) и 10 мкл воды.When printing, 60 μl of solution A (135 mM NaHCO 3 ) and 20 μl of probe solution (C = 200 nmol / ml) were added to each cell of the tablet. T - 80 μl of a 6 nM solution of Tamra (dT8) ~ NH 2 in 100 mM NaHCO 3 . 60 μl of solution A (135 mM NaHCO 3 ) and 10 μl of water are added to the buffer.
Пример 2. Синтез кДНК вируса гриппа AExample 2. Synthesis of influenza A cDNA
Геномную РНК выделяли из 140 мкл клеточной культуры (титр вируса 105-107 pfu/мл) с использованием набора QIAquick Viral RNA Kit (QIAGEN, Valencia, Ca).Genomic RNA was isolated from 140 μl of cell culture (virus titer 10 5 -10 7 pfu / ml) using the QIAquick Viral RNA Kit (QIAGEN, Valencia, Ca).
Обратную транскрипцию проводили следующим образом: смесь, содержащую 1 мкл праймера 5'-GACTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGG-3' (20 мкМ), 9 мкл РНК (из экстрагированного объема 80 мкл) и 2 мкл dNTP (10 мМ) нагревали 10 мин при 65°C, охлаждали во льду. Добавляли 4 мкл 5х кДНК буфера, 1 мкл 0.1 М DTT, 1 мкл РНКзина (40 ед), 1 мкл воды, 1 мкл обратной транскриптазы ThermoScript (Invitrogen, Carlsbad, CA). Смесь центрифугировали и инкубировали 55°C - 5 мин, 60°C - 55 мин.Reverse transcription was carried out as follows: a mixture containing 1 μl of primer 5'-GACTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGG-3 '(20 μM), 9 μl of RNA (from the extracted volume of 80 μl) and 2 μl of dNTP (10 mm) were heated for 10 min at 65 ° C, cooled in ice. Added 4 μl of 5x cDNA buffer, 1 μl of 0.1 M DTT, 1 μl of RNAzin (40 units), 1 μl of water, 1 μl of ThermoScript reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). The mixture was centrifuged and incubated 55 ° C for 5 minutes, 60 ° C for 55 minutes.
Пример 3. Получение флуоресцентных ампликонов гена нейраминидазы для анализаExample 3. Obtaining fluorescent amplicons of the gene of neuraminidase for analysis
Для амплификации фрагментов гена нейраминидазы использовали следующие пары праймеров - внешний и внутренний:For amplification of fragments of the gene of neuraminidase used the following pairs of primers - external and internal:
NA_F1 5'-CTATAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3' иNA_F1 5'-CTATAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3 'and
NA_R1 5'-TAACAGGA(G/A)CA(C/T)TCCTC(A/G)TA(G/A)TG-3';NA_R1 5'-TAACAGGA (G / A) CA (C / T) TCCTC (A / G) TA (G / A) TG-3 ';
NA_F2 5'-CA(C/T)TA(C/T)GAGGA(G/A)TG(C/T)TCCTGTTA-3' иNA_F2 5'-CA (C / T) TA (C / T) GAGGA (G / A) TG (C / T) TCCTGTTA-3 'and
NA_R2 5'-CACTATAGAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3'.NA_R2 5'-CACTATAGAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3 '.
Длина нарабатываемых ампликонов составляла ~830 и ~600 пар нуклеотидов, соответственно. Для получения преимущественно одноцепочечной ДНК проводили ПЦР в асимметричном режиме. Состав реакционной смеси (50 мкл): буфер для ПЦР «Qiagen» (1.5 мМ MgCl2, KCl, (NH4)2SO4, Трис-HCl, pH 8.7), MgCl2 - 1.5 мМ, 200 нМ dATP, dCTP dGTP, 70 нМ dTTP, 100 нМ dUTP-Су3, 80 нМ прямого праймера, 1 мкМ обратного праймера, 1.25 ед. Hot Start Taq-полимеразы («Qiagen») и 2 мкл раствора ДНК. ПЦР проводили в термоциклере iCycler («BioRad»), используя следующий протокол: 95°C - 15 мин, затем 35 циклов 94°C - 30 сек, 52°C - 55°C - 30 сек, 72°C - 1 мин 10 сек. Контроль наработки ампликона осуществляли электрофорезом в 1% агарозном геле с окрашиванием этидий бромидом. Флуоресцентно-меченые ампликоны очищали от избытка меченых трифосфатов на гель-фильтрующих колонках «Qiagen», высушивали досуха на вакуумной центрифуге при 60° и использовали для гибридизации.The length of the generated amplicons was ~ 830 and ~ 600 nucleotide pairs, respectively. To obtain predominantly single-stranded DNA, PCR was performed in asymmetric mode. The composition of the reaction mixture (50 μl): Qiagen PCR buffer (1.5 mM MgCl 2 , KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 , Tris-HCl, pH 8.7), MgCl 2 - 1.5 mM, 200 nM dATP, dCTP dGTP , 70 nM dTTP, 100 nM dUTP-Cy3, 80 nM forward primer, 1 μM reverse primer, 1.25 units Hot Start Taq polymerase ("Qiagen") and 2 μl of DNA solution. PCR was performed in the iCycler thermal cycler (BioRad) using the following protocol: 95 ° C for 15 min, then 35 cycles of 94 ° C for 30 sec, 52 ° C for 55 ° C for 30 sec, 72 ° C for 1
Пример 4. Получение флуоресцентных ампликонов гена гемагглютинина для анализаExample 4. Obtaining fluorescent amplicons of the hemagglutinin gene for analysis
Для амплификации фрагментов гена гемагглютинина использовали следующие пары праймеров - внешний и внутренний:For amplification of fragments of the hemagglutinin gene used the following pairs of primers - external and internal:
HA_F1: 5'-GACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3'HA_F1: 5'-GACTCACTATAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3 '
HA_R1: 5'-59-TCWATRAANCCNGCDATDGCHCC-3'HA_R1: 5'-59-TCWATRAANCCNGCDATDGCHCC-3 '
HA_F2: 5'-GGDGCHATHGCNGGNTTYATWGA-3'HA_F2: 5'-GGDGCHATHGCNGGNTTYATWGA-3 '
HA_R1: 5'-GGTGACACTATAGAAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3'.HA_R1: 5'-GGTGACACTATAGAAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3 '.
Протяженность ампликонов составляла 600 и 800 нт соответственно.. Для получения преимущественно одноцепочечной ДНК проводили ПЦР в асимметричном режиме. Состав реакционной смеси (50 мкл): буфер для ПЦР «Qiagen» (1.5 мМ MgCl2, KCl, (NH4)2SO4, Трис-HCl, pH 8.7), MgCl2 - 1.5 мМ, 200 нМ dATP, dCTP dGTP, 70 нМ dTTP, 100 нМ dUTP-Су3, 80 нМ прямого праймера, 1 мкМ обратного праймера, 1.25 ед. Hot Start Taq-полимеразы («Qiagen») и 2 мкл раствора ДНК. ПЦР проводили в термоциклере iCycler («BioRad»), используя следующий протокол: 95°C - 15 мин, затем 35 циклов 94°C - 30 сек, 52°C - 55°C - 30 сек, 72°C - 1 мин 10 сек. Контроль наработки ампликона осуществляли электрофорезом в 1% агарозном геле с окрашиванием этидий бромидом. Флуоресцентно-меченые ампликоны очищали от избытка меченых трифосфатов на гель-фильтрующих колонках «Qiagen», высушивали досуха на вакуумной центрифуге при 60° и использовали для гибридизации.The amplicon lengths were 600 and 800 nt, respectively. To obtain predominantly single-stranded DNA, PCR was performed in asymmetric mode. The composition of the reaction mixture (50 μl): Qiagen PCR buffer (1.5 mM MgCl 2 , KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 , Tris-HCl, pH 8.7), MgCl 2 - 1.5 mM, 200 nM dATP, dCTP dGTP , 70 nM dTTP, 100 nM dUTP-Cy3, 80 nM forward primer, 1 μM reverse primer, 1.25 units Hot Start Taq polymerase ("Qiagen") and 2 μl of DNA solution. PCR was performed in the iCycler thermal cycler (BioRad) using the following protocol: 95 ° C for 15 min, then 35 cycles of 94 ° C for 30 sec, 52 ° C for 55 ° C for 30 sec, 72 ° C for 1
Пример 5. Гибридизация анализируемых ампликоновExample 5. Hybridization of the analyzed amplicons
Высушенный образец ампликона растворяли в 10 мкл воды, добавляли 10 мкл 2х гибридизационного буфера (1х гибридизационный буфер: 6х SSC, 5х раствор Денхардта, 0.1% Tween 20) и прогревали перед нанесением на слайд 2 мин при 97°C, охлаждали во льду. Гибридизацию проводили в гибридизационной камере фирмы ArrayIt, Sunnyvale при температуре 55° - 60°C в течение 2 час. Затем слайд последовательно отмывали в растворах 6х SSC, 2х SSC + 0,1% SDS, 2х SSC и 1х SSC, центрифугировали и сканировали на сканере Scan Array Express 2.0 («Perkin Elmer») при длинах волны возбуждающего лазера λ=543 нм и λ=633 нм. Изображение анализировали с использованием программы ScanArray Express, входящих в математическое обеспечение сканера.The dried amplicon sample was dissolved in 10 μl of water, 10 μl of 2x hybridization buffer (1x hybridization buffer: 6x SSC, 5x Denhardt solution, 0.1% Tween 20) was added and warmed up before application to the slide for 2 min at 97 ° C, cooled in ice. Hybridization was carried out in a hybridization chamber of ArrayIt, Sunnyvale company at a temperature of 55 ° - 60 ° C for 2 hours. Then the slide was sequentially washed in solutions of 6x SSC, 2x SSC + 0.1% SDS, 2x SSC and 1x SSC, centrifuged and scanned on a Scan Array Express 2.0 scanner (Perkin Elmer) at the wavelengths of the exciting laser λ = 543 nm and λ = 633 nm. The image was analyzed using the ScanArray Express program included in the scanner software.
Пример 6. Анализ результатов гибридизацииExample 6. Analysis of the results of hybridization
Сканирование слайда проводили на сканере ScanArray Express 2.0 (Perkin Elmer) последовательно с использованием двух возбуждающих лазеров с длинами волн λ1=543 нм для Су3 и λ2=633 нм для Су5. Изображение, полученное по каналу возбуждения флуоресценции с длиной волны λ2, служило показателем качества печати чипа, а интегральная величина флуоресценции каждого спота рассматривалась в качестве нормировочной для флуоресценции того же спота, измеренной по каналу возбуждения с λ1. Анализ изображения осуществляли с использованием программы Scanarray Express, входящих в математическое обеспечение сканера. Для i-го спота нормированную флуоресценцию рассчитывали по формуле:The slide was scanned on a ScanArray Express 2.0 scanner (Perkin Elmer) sequentially using two exciting lasers with wavelengths λ 1 = 543 nm for Cy3 and λ 2 = 633 nm for Cy5. The image obtained through the fluorescence excitation channel with a wavelength of λ 2 served as an indicator of the print quality of the chip, and the integral fluorescence value of each spot was considered as normal for fluorescence of the same spot measured along the excitation channel with λ 1 . Image analysis was performed using the Scanarray Express program included in the scanner software. For the i-th spot, normalized fluorescence was calculated by the formula:
Ii=Ii(Су3)/Ii(Cy5),I i = I i (Cy3) / I i (Cy5),
где Ii(Су3)=Fi(Су3)-Bi(Су3), Fi(Су3) - интегральная интенсивность флуоресценции в пределах спота, Bi(Су3) - средняя фоновая интенсивность флуоресценции в окружении спота. Аналогичным образом рассчитывали величину Ii(Су5).where I i (Cy3) = F i (Cy3) -B i (Cy3), F i (Cy3) - the integral of the fluorescence intensity within a spot, B i (Cy3) - average background fluorescence intensity surrounded spot. In a similar manner, the value of I i (Cy5) was calculated.
Для анализа результатов гибридизации рассчитывали среднюю флуоресценцию спотов по формуле:To analyze the results of hybridization, the average fluorescence of spots was calculated by the formula:
где µ - подтип нейраминидазы,where µ is a subtype of neuraminidase,
i - номер спота,i is the spot number,
N - число спотов на чипе для используемых для определения подтипа нейраминидазы.N is the number of spots on the chip used to determine the subtype of neuraminidase.
Субтип определяли по столбцу гистограммы с максимальным значением средней флуоресценции спотов. Указанием на однозначность отнесения является отсутствие перекрывания интервалов ошибок субтипов. Интервал ошибок для каждого из субтипов рассчитывался по формулеThe subtype was determined by the histogram column with the maximum average spot fluorescence value. An indication of the unambiguity of the assignment is the absence of overlapping intervals of subtype errors. The error interval for each of the subtypes was calculated by the formula
Sµ=SxYµ,Sµ = S x Y µ ,
где Sx - относительная ошибка флуоресценции.where S x is the relative fluorescence error.
Относительная ошибка измерения значения флуоресценции определялась исходя из вариации в интенсивности флуоресценции маркерных спотов субэррея (xi, расположены в левой и правой колонках микрочипа).The relative error in measuring the fluorescence value was determined based on the variation in the fluorescence intensity of the marker spots of suberray (x i , located in the left and right columns of the microchip).
Sx=σ/Хср, гдеS x = σ / X cf , where
xi - флуоресценция i-го маркерного спота;x i - fluorescence of the i-th marker spot;
n - число маркерных спотов.n is the number of marker spots.
Эта ошибка является интегральной и включает в себя все ошибки, связанные с приготовлением раствора олигонуклеотида для печати и печатью микрочипа.This error is integral and includes all errors associated with the preparation of an oligonucleotide solution for printing and the printing of a microchip.
Результаты анализа представляются в графической форме с помощью программы Microsoft Office Excel.Analysis results are presented in graphical form using Microsoft Office Excel.
Результаты анализа вируса гриппа A, содержащих различные субтипы гена нейраминидазы, приведены на Фиг.7.The results of the analysis of influenza A virus containing various subtypes of the neuraminidase gene are shown in Fig.7.
Результаты анализа вируса гриппа A, содержащих различные субтипы гена гемагглютинина, приведены на Фиг.9.The results of the analysis of influenza A virus containing various subtypes of the hemagglutinin gene are shown in Fig.9.
Во всех проанализированных случаях типирование генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A с помощью заявляемого микрочипа осуществлялось корректно.In all analyzed cases, typing of the genes for hemagglutinin and neuraminidase of influenza A virus using the inventive microchip was carried out correctly.
Claims (3)
а) на первом этапе проводят анализ аминокислотных последовательностей белков микроорганизма, выявляют консервативные олигопептиды и определяют внутри них короткие дискриминирующие микроорганизм пептиды;
б) с помощью генетического кода определяют структуру ДНК-зондов, кодирующих дискриминирующие микроорганизм пептиды.1. The method of selecting DNA probes for microarray diagnostics of highly variable genomes, characterized in that the selection of such DNA probes is based on the analysis of protein sequences and is carried out in two stages:
a) at the first stage, the amino acid sequences of the proteins of the microorganism are analyzed, conservative oligopeptides are detected and short peptides discriminating against the microorganism are determined inside them;
b) using the genetic code determine the structure of DNA probes encoding microorganism discriminating peptides.
NA-F1 5'-CTATAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3' и
NA_R1 5'-TAACAGGA(G/A)CA(C/T)TCCTC(A/G)TA(G/A)TG-3';
NA _F2 5'-CA(C/T)TA(C/T)GAGGA(G/A)TG(C/T)TCCTGTTA-3' и
NA-R2 5'-CACTATAGAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3'), в качестве биочипа - микроматрицу, охарактеризованную в п.2, в качестве регистрирующего устройства - флуоресцентный сканер, а интерпретацию полученных результатов проводят с помощью программы Scanarray Express. 3. A method for typing the influenza A virus neuraminidase gene, including isolation of total RNA from a natural sample, RT-PCR for amplification of the influenza virus genome segment encoding the neuraminidase gene in asymmetric mode using specific oligonucleotides-primers to obtain fluorescently labeled predominantly single-stranded DNAs DNA-DNA hybridization of the obtained amplicons with discriminating probes that are part of the biochip, registration of the fluorescent signal of the labeled sample using th recording device and interpretation of the results, characterized in that the neuraminidase gene amplification using a set of primer oligonucleotides
NA-F1 5'-CTATAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3 'and
NA_R1 5'-TAACAGGA (G / A) CA (C / T) TCCTC (A / G) TA (G / A) TG-3 ';
NA _F2 5'-CA (C / T) TA (C / T) GAGGA (G / A) TG (C / T) TCCTGTTA-3 'and
NA-R2 5'-CACTATAGAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3 '), as a biochip - the microarray described in clause 2, as a recording device - a fluorescence scanner, and the interpretation of the results is carried out using the Scanarray Express program.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010123750/10A RU2470076C2 (en) | 2010-06-10 | 2010-06-10 | Method of selecting dna probes for microchip diagnosis, biochip and method for typing neuraminidase and haemagglutinin influenza virus a gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010123750/10A RU2470076C2 (en) | 2010-06-10 | 2010-06-10 | Method of selecting dna probes for microchip diagnosis, biochip and method for typing neuraminidase and haemagglutinin influenza virus a gene |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010123750A RU2010123750A (en) | 2011-12-20 |
| RU2470076C2 true RU2470076C2 (en) | 2012-12-20 |
Family
ID=45403833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010123750/10A RU2470076C2 (en) | 2010-06-10 | 2010-06-10 | Method of selecting dna probes for microchip diagnosis, biochip and method for typing neuraminidase and haemagglutinin influenza virus a gene |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2470076C2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2538168C2 (en) * | 2013-03-25 | 2015-01-10 | Закрытое акционерное общество "ИмДи" | Sets of oligonucleotide primers and probes, biological microchip and test system for identifying and typing influenza a and b virus with using them |
| RU2560591C2 (en) * | 2013-05-06 | 2015-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Biochip and method typing genes of hemagglutinin and neuraminidase of influenza a virus |
| RU2562117C1 (en) * | 2014-04-14 | 2015-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Biochip and method of typing pathogens of group i which belongs to family of arena- and filoviruses |
| RU2603000C1 (en) * | 2015-07-28 | 2016-11-20 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method of identifying rna of influenza viruses a and b with simultaneous determination of variants of hemagglutinin and neuraminidase of influenza virus a, identification of genetic markers of pathogenicity and resistance to influenza preparations on biological microchips, biochip, set of oligonucleotide probes, used in method |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2290444C2 (en) * | 2004-12-02 | 2006-12-27 | Виктор Федорович Иванов | Determination of influenza viruses |
-
2010
- 2010-06-10 RU RU2010123750/10A patent/RU2470076C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2290444C2 (en) * | 2004-12-02 | 2006-12-27 | Виктор Федорович Иванов | Determination of influenza viruses |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| RYABININ V.A. et al. Microarray assay for detection and discrimination of Orthopoxvirus species//J Med Virol. 2006 Oct; 78(10): 1325-40. * |
| WERNERSSON R. at al. Oligo Wiz 2.0 - integrating sequence feature annotation into the design of microarray probes//Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1; 33 (Web Server issue): W611-5. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2538168C2 (en) * | 2013-03-25 | 2015-01-10 | Закрытое акционерное общество "ИмДи" | Sets of oligonucleotide primers and probes, biological microchip and test system for identifying and typing influenza a and b virus with using them |
| RU2560591C2 (en) * | 2013-05-06 | 2015-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Biochip and method typing genes of hemagglutinin and neuraminidase of influenza a virus |
| RU2562117C1 (en) * | 2014-04-14 | 2015-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Biochip and method of typing pathogens of group i which belongs to family of arena- and filoviruses |
| RU2603000C1 (en) * | 2015-07-28 | 2016-11-20 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method of identifying rna of influenza viruses a and b with simultaneous determination of variants of hemagglutinin and neuraminidase of influenza virus a, identification of genetic markers of pathogenicity and resistance to influenza preparations on biological microchips, biochip, set of oligonucleotide probes, used in method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010123750A (en) | 2011-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20080003565A1 (en) | Viral nucleic acid microarray and method of use | |
| CN107090519B (en) | Multiple RT-PCR combined gene chip detection kit for common respiratory pathogens | |
| RU2470076C2 (en) | Method of selecting dna probes for microchip diagnosis, biochip and method for typing neuraminidase and haemagglutinin influenza virus a gene | |
| Choi et al. | Peptide nucleic acid-based array for detecting and genotyping human papillomaviruses | |
| EA008388B1 (en) | Amplification-hybridisation method for detecting and typing human papillomavirus | |
| CN107735500A (en) | For detecting the grand genome composition and method of breast cancer | |
| CN107937618A (en) | The droplet numeral RT PCR detection primers of A types Senecan virus and probe and its application | |
| Kim et al. | Simultaneous detection of major enteric viruses using a combimatrix microarray | |
| WO2013189306A1 (en) | Methods and compositions for assessing copy number of target polynecleotides | |
| Ryabinin et al. | Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus | |
| KR101018407B1 (en) | Human papillomavirus diagnostic probe and its genotyping method | |
| EP1969145B1 (en) | Oligonucleotide microarray and method for identification of pathogens | |
| Li et al. | Detection and subtyping of influenza A virus based on a short oligonucleotide microarray | |
| An et al. | Peptide nucleic acid-based (PNA) array for the antigenic discrimination of canine parvovirus | |
| KR101335483B1 (en) | Method of Detecting Human Papilloma Virus and Genotyping Thereof | |
| KR102276396B1 (en) | A composition and RT-qPCR based chip for detecting avian influenza viruses and method for detecting avian influenza viruses using the same | |
| Nguyen et al. | HPAI 9G DNAChip: Discrimination of highly pathogenic influenza virus genes | |
| JP5898831B2 (en) | Detection of human papillomavirus | |
| Xiao‐Ping et al. | Development of a consensus microarray method for identification of some highly pathogenic viruses | |
| Arron et al. | Validation of a diagnostic microarray for human papillomavirus: coverage of 102 genotypes | |
| RU2560591C2 (en) | Biochip and method typing genes of hemagglutinin and neuraminidase of influenza a virus | |
| RU2006113439A (en) | SET OF PRIMER OLIGONUCLEOTIDES, BIOCHIP AND METHOD FOR SPECIFIC IDENTIFICATION OF ORTOPOX AND HERPESVIRUSES PATHOGEN FOR HUMAN | |
| Adams et al. | Microarray platform for the detection of a range of plant viruses and viroids | |
| US20160153060A1 (en) | Method for species identification by using molecular weights of nucleic acid cleavage fragments | |
| KR20110093392A (en) | HPP Genotype Diagnosis Probe and Analysis Method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130611 |