[go: up one dir, main page]

RU2468819C2 - Новые синтетические агонисты tlr9 - Google Patents

Новые синтетические агонисты tlr9 Download PDF

Info

Publication number
RU2468819C2
RU2468819C2 RU2010107207/10A RU2010107207A RU2468819C2 RU 2468819 C2 RU2468819 C2 RU 2468819C2 RU 2010107207/10 A RU2010107207/10 A RU 2010107207/10A RU 2010107207 A RU2010107207 A RU 2010107207A RU 2468819 C2 RU2468819 C2 RU 2468819C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
patient
immune response
disease
disorder
compounds
Prior art date
Application number
RU2010107207/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2010107207A (ru
Inventor
Экамбар Р. КАНДИМАЛЛА
ПУТТА Малликарджуна РЕДДИ
Дацин ВАН
Дун ЮЙ
Бхагат ЛАКШМИ
Судхир АГРАВАЛ
Original Assignee
Идера Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Идера Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Идера Фармасьютикалз, Инк.
Publication of RU2010107207A publication Critical patent/RU2010107207A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2468819C2 publication Critical patent/RU2468819C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

В изобретении описаны иммуномодулирующие соединения на основе олигонуклеотидов, которые индивидуально обеспечивают уникальные профили цитокинов и хемокинов посредством взаимодействия как агонистов TLR. Агонисты TLR9 предназначены для модуляции иммунных ответов, опосредованных Toll-подобным рецептором (TLR). Описаны также композиция, содержащая иммуномодулирующее соединение и физиологически приемлемый носитель и обеспечивающая получение иммунного ответа у пациента, способ получения иммунного ответа у пациента с использованием иммуномодулирующего соединения, способы терапевтического и профилактического лечения пациента, нуждающегося в модуляции иммунного ответа, в частности, при раке, аутоиммунном и воспалительном расстройствах, инфекционном заболевании, аллергии, астме и ряде других заболеваний. Иммуномодулирующие соединения могут использоваться в сочетании с другими терапевтическими средствами и химиотерапевтическими соединениями, используемыми при конкретных заболеваниях или расстройствах. Новые соединения по изобретению создают такие специфические модуляции иммунного ответа, которые отличаются от модуляций, создаваемых неметилированными динуклеотидами CpG. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 5 пр.

Description

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Связанные заявки
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной патентной заявки США №60/953251, поданной 1 августа 2007 года, предварительной патентной заявки США №60/983601, поданной 30 октября 2007 года, предварительной патентной заявки США №60/987151, поданной 12 ноября 2007 года, и предварительной патентной заявки США №61/015292, поданной 20 декабря 2007 года, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.
Область изобретения
Изобретение относится к синтетическим химическим композициям, которые являются применимыми для модуляции иммунных ответов, опосредованных Toll-подобным рецептором (TLR). В частности, изобретение относится к агонистам Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), которые дают уникальные профили цитокинов и хемокинов.
Сущность связанной области техники
Toll-подобные рецепторы (TLR) присутствуют во множестве клеток иммунной системы, и было показано, что они вовлечены во врожденный иммунный ответ (Hornung V. et al., (2002) J.Immunol. 168:4531-4537). У позвоночных такое семейство состоит из одиннадцати белков, называемых TLR1-TLR11, которые известны как распознающие молекулярные образы, ассоциированные с патогенами бактерий, грибов, паразитов и вирусов (Poltorak A. et al. (1998) Science 282:2085-2088; Underhill D.M. et al., (1999) Nature 401: 811-815; Hayashi F. et al., (2001) Nature 410: 1099-1103; Zhang D. et al., (2004) Science 303: 1522-1526; Meier A. et al., (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570; Campos M.A. et al., (2001) J. Immunol. 167:416-423; Hoebe K. et al., (2003) Nature 424: 743-748; Lund J. (2003) J.Exp.Med. 198:513-520; Heil F. et al., (2004) Science 303: 1526-1529; Diebold S.S. et al., (2004) Science 303: 1529-1531; Hornung V. et al., (2004) J.Immunol. 173:5935-5943).
TLR являются ключевыми средствами, посредством которых позвоночные распознают и организуют иммунный ответ на инородные молекулы и также обеспечивают возможности, посредством которых связаны врожденные и адаптивные иммунные ответы (Akira S. et al., (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145). Некоторые TLR расположены на поверхности клеток для определения и развития ответа на внеклеточные патогены, и другие TLR расположены внутри клетки для определения и развития ответа на внутриклеточные патогены.
Известно, что TLR9 распознает неметилированные CpG участки в бактериальной ДНК и в синтетических олигонуклеотидах (Hemmi H. et al., (2000) Nature 408:740-745). Другие модификации фосфоротиоатных олигонуклеотидов, содержащие CpG, также могут влиять на их способность действовать как модуляторы иммунного ответа посредством TLR9 (см., например, Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al., (1996) Biochem. Pharmacol. 52:1537-1544; Zhao et al., (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502; Zhao et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458; Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 1051-1054; Yu D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Yu D. et al (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; и Kandimalla E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813). Было показано, что естественные агонисты TLR9 обладают противоопухолевой активностью (например, рост и ангиогенез опухоли), приводя к эффективному противораковому ответу (например, антилейкемия) (Smith J.B. и Wickstrom E. (1998) J.Natl. Cancer Inst 90:1146-1154). Кроме того, было показано, что агонисты TLR9 работают синергически с другими противоопухолевыми соединениями (например, цетуксимаб, иринотекан) (Vincenzo D. et al. (2006) Clin.Cancer Res. 12(2):577-583).
Определенные агонисты TLR9 состоят из 3'-3' связанных ДНК структур, содержащих ядерный динуклеотид CpR, где R представляет собой модифицированный гуанозин (патент США № 7276489). Кроме того, специфические химические модификации позволили получить специфические аналоги олигонуклеотидов, которые создают особые модуляции иммунного ответа. В частности, исследования взаимосвязи структуры и активности позволили определить синтетические структуры и новые соединения на основе ДНК, которые создают специфические модуляции иммунного ответа, и такие модуляции отличаются от таковых, созданных неметилированными динуклеотидами CpG (Kandimalla E. et al., (2005) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 102:6925-6930; Kandimalla E. et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100: 14303-14308; Cong Y. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 310:1133-1139; Kandimalla E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953; Kandimalla E. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400; Yu D. et al. (2003) Bioorg. Med.Chem. 11:459-464; Bhagat L. et al., (2003) Biochem.Biophys.Res. Commun. 300:853-861; Yu D. et al., (2002) Nucleic Acids Res.: 30:4460-4469; Yu D. et al. (2002) J.Med.Chem. 45:4540-4548, Yu D. et al., (2002) Biochem.Biophys.Res.Commun. 297:83-90; Kandimalla E. et al., (2002) Bioconjug. Chem.13:966-974; Yu D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619; Yu D. et al. (2001) Bioorg.Med.Chem. 9: 2803-2808; Yu D. et al. (2001) Bioorg. Med.Chem.Lett. 11:2263-2267; Kandimalla E. et al. (2001) Bioorg.Med.Chem. 9:807-813; Yu D. et al. (2000) Bioorg.Med.Chem.Lett. 10:2585-2588; Putta M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238).
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что уникальная модификация последовательности, окружающей сердцевинный динуклеотид CpR, связь между нуклеотидами или линкеры, соединяющие олигонуклеотиды, дают новые агонисты TLR9, которые дают отличающиеся in vitro и in vivo профили цитокинов и хемокинов. Такая способность «модифицировать в соответствии с требованиями заказчика» цитокиновый и хемокиновый ответ на олигонуклеотид, содержащий CpR, дает способность предотвращать и/или лечить различные патологические состояния главным образом, специфическим для заболевания или даже специфическим для пациента. Следовательно, существует необходимость в новых соединениях - аналогах олигонуклеотидов для обеспечения таких «модифицированных в соответствии с требованиями заказчика» ответов.
КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение обеспечивает новые соединения на основе олигонуклеотидов, которые индивидуально обеспечивают определенные профили иммунного ответа посредством их взаимодействий как агонистов TLR9. Агонисты TLR9 по изобретению характеризуются специфическими и уникальными химическими модификациями, которые обеспечивают их определенные профили активации иммунного ответа.
Агонисты TLR9 по изобретению вызывают иммунные ответы в различных типах клеток и в различных экспериментальных моделях in vitro и in vivo, каждый агонист обеспечивает определенный профиль иммунного ответа. Агонисты TLR9 по изобретению также являются применимыми в профилактике и/или лечении различных заболеваний или отдельно, или в комбинации с, или совместно вводимыми с другими лекарственными средствами, или в виде адъювантов для антигенов, используемых в вакцинах. Как таковые они применимы в качестве средств для исследования иммунной системы, а также для сравнения иммунных систем различных видов животных, таких как люди и мыши.
Следовательно, в первом аспекте изобретение обеспечивает агонисты TLR9 на основе олигонуклеотидов («соединение»).
Во втором аспекте изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие агонист TLR9 на основе олигонуклеотидов по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
В третьем аспекте изобретение обеспечивает вакцину. Вакцины по настоящему аспекту включают фармацевтическую композицию по изобретению и дополнительно включают антиген.
В четвертом аспекте изобретение обеспечивает способы для создания TLR9-опосредованного иммунного ответа у пациента, указанные способы включают введение пациенту соединения, фармацевтической композиции или вакцины по изобретению.
В пятом аспекте изобретение обеспечивает способы для терапевтического лечения пациента, имеющего заболевание или расстройство, такие способы включают введение пациенту соединения фармацевтической композиции или вакцины по изобретению.
В шестом аспекте изобретение обеспечивает способы для профилактики заболевания или расстройства, такие способы включают введение пациенту соединения фармацевтической композиции или вакцины по изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 представляет собой схему синтеза для линейного синтеза иммуномодулирующих соединений по изобретению. DMTr=4,4'-диметокситритил; СЕ=цианоэтил.
Фиг.2 представляет собой схему синтеза для параллельного синтеза иммуномодулирующих соединений по изобретению. DMTr=4,4'-диметокситритил; СЕ=цианоэтил.
На фиг.3А-3С изображена активность NF-κB в клетках HEK293, экспрессирующих TLR9, которые культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 2 ниже. Коротко, клетки HEK293 стимулировали 10 мкг/мл иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 18 часов и уровень NF-κB определяли с использованием SEAP (секретируемая форма человеческой эмбриональной щелочной фосфатазы) анализа.
На фиг.3D-3G изображена активность NF-κB в клетках HEK293, экспрессирующих TLR9, которые культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 2 ниже. Коротко, клетки HEK293 стимулировали 0 (PBS/среда), 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 или 10 мкг/мл иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 18 часов и уровень NF-κB определяли с использованием SEAP (секретируемая форма человеческой эмбриональной щелочной фосфатазы) анализа. На фиг.3D-3G более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили активации TLR9.
На фиг.4А и 4В изображены концентрации цитокинов и хемокинов из человеческих PBMC, которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, PBMC выделяли из свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.4А и 4В более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает определенные профили цитокинов и хемокинов.
На фиг.4С-4Н изображены концентрации цитокинов и хемокинов из человеческих PBMC, которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, PBMC выделяли из свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 0 (PBS/среда), 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 или 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.4С-4Н более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает определенные профили цитокинов и хемокинов.
На фиг.4I-4N изображены концентрации цитокинов и хемокинов из человеческих PBMC, которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, PBMC выделяли из свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 0 (PBS/среда), 1,0 или 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.4I-4N более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили цитокинов и хемокинов.
На фиг.4О-4FF изображены концентрации цитокинов и хемокинов из человеческих PBMC, которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, PBMC выделяли из свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 0 (PBS/среда), 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 или 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.4О-4FF более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили цитокинов и хемокинов.
На фиг.5А-5В изображены концентрации цитокинов и хемокинов человеческих плазматических дендритных клеток (pDc), которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, pDc выделяли из PBMC свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.5А и 5В более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили цитокинов и хемокинов.
На фиг.6А-6F изображена пролиферация человеческих В-клеток, индуцированная иммуномодулирующими олигонуклеотидами по изобретению. Человеческие В-клетки выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали по примеру 4 ниже. Коротко, человеческие В клетки выделяли из свежеполученных PBMC здоровых людей-добровольцев и культивировали с различными дозами иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 68 часов и возбуждали 3Н-тимидином в течение 6-8 часов. Поглощение 3Н-тимидинома определяли с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика. На фиг.6А-6F в общем продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили пролиферации клеток, которые варьируются в зависимости от композиции основания, уникальной модификации и количества вводимого олигонуклеотида.
На фиг.7А изображена индукция цитокинов и хемокинов сыворотки у мышей C57BL/6, которых лечили в соответствии с примером 5 ниже. Коротко, через 2 часа после того, как мышам вводили подкожно 1 мг/кг дозу иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению, сыворотку получали и анализировали в отношении уровня цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex.
На фиг.7В изображена индукция цитокинов сыворотки у мышей BALB/c, которых лечили в соответствии с примером 5 ниже. Коротко, через 2 часа после того, как мышам вводили подкожно 1 мг/кг дозу иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению, сыворотку получали и анализировали в отношении уровня IL-12 посредством ELISA.
На фиг.7С изображена индукция цитокинов сыворотки у мышей BALB/c, которых лечили в соответствии с примером 5 ниже. Коротко, через 2 часа после того, как мышам подкожно вводили 0,25 или 1 мг/кг дозу иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению, сыворотку получали и анализировали в отношении уровня IL-12 посредством ELISA. На фиг.7А-7F более полно продемонстрировано, что in vivo введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили активации TLR9, что обнаруживает применение при множестве заболеваний.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение обеспечивает новые соединения на основе олигонуклеотидов, которые индивидуально обеспечивают особые профили иммунного ответа посредством их взаимодействий в качестве агонистов с TLR9. Агонисты TLR9 по изобретению характеризуются уникальными химическими модификациями, которые обеспечивают их особые профили активации иммунного ответа. Все публикации, указанные в настоящем описании, отражают уровень знаний в области техники и являются, таким образом, включенными в виде ссылки полностью. Любое противоречие между указаниями этих ссылок и настоящей спецификацией должно быть разрешено в пользу последней.
Агонисты TLR9 по изобретению вызывают иммунные ответы различных типов клеток и в различных экспериментальных моделях in vivo и in vitro, причем каждый агонист обеспечивает особый профиль иммунного ответа. По существу, они являются применимыми в качестве средств для изучения иммунной системы, а также для сравнения иммунных систем различных видов животных, таких как люди и мыши. Агонисты TLR9 по изобретению также являются применимыми в профилактике и лечении различных заболеваний или отдельно, или в комбинации с, или при совместном введении с другими лекарственными средствами, или в качестве добавок к антигенам, таким как вакцины.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Термин «2'-замещенный нуклеозид» или «2'-замещенный арабинозид» обычно включает нуклеозиды или арабинонуклеозиды, в которых гидроксильная группа в 2'-положении пентозного или арабинозного компонента замещена с образованием 2'-замещенного или 2'-О-замещенного рибонуклеозида. В определенных вариантах осуществления изобретения такое замещение осуществляют низшей углеводородной группой, содержащей 1-6 насыщенных или ненасыщенных атомов углерода, атомами галогена или арильной группой, имеющей 6-10 атомов углерода, где такая углеводородная или арильная группа может быть незамещенной или может быть замещенной, например, галогеном, гидрокси, трифтометил, циано, нитро, ацил, ацилокси, алкокси, карбоксил, карбоалкокси или аминогруппами. Примеры 2'-О-замещенных рибонуклеозидов или 2'-О замещенных арабинозидов включают, без ограничения, 2'-амино, 2'-фтор, 2'-аллил, 2'-О-алкил и 2'-пропаргил рибонуклеозиды или арабинозиды, 2'-О-метилрибонуклеозиды или 2'-О-метиларабинозиды и 2'-О-метоксиэтоксирибонуклеозиды или 2'-метоксиэтоксирабинозиды.
Термин «3'» при использовании направленно обычно относится к области или положению в полинуклеотиде или олигонуклеотиде 3' (относительно 3'-положения олигонкулеотида) из другого участка или положения в том же самом полинуклеотиде или олигонуклеотиде.
Термин «5'» при использовании направленно обычно относится к области или положению в полинуклеотиде или олигонуклеотиде 5' (относительно 5'-положения олигонуклеотида) из другого участка или положения в том же самом полинуклеотиде или олигонуклеотиде.
Термин «около» обычно обозначает, что точное число не является критичным. Следовательно, количество остатков нуклеозидов в олигонуклеотидах не является критичным, и олигонуклеотиды, имеющие на один или два меньше остатков нуклеозидов или от одного до нескольких дополнительных нуклеозидных остатков, предусматриваются как эквиваленты каждого из вариантов осуществления изобретения, описанных выше.
Термин «воспаление дыхательных путей» обычно включает, без ограничения, воспаление в респираторном тракте, вызванное аллергенами, включая астму.
Термин «аллерген» обычно относится к антигену или антигенной части молекулы, обычно белка, который вызывает аллергический ответ при воздействии на пациента. Обычно пациент имеет аллергию на аллерген, как указывается, например, посредством тестов с волдырями и покраснением или любых способов, известных в области техники. Говорят, что молекула является аллергеном, даже если только небольшая группа пациентов имеет аллергический иммунный ответ (например, IgE) при воздействии молекулы.
Термин «аллергия» обычно включает, без ограничения, пищевую аллергию, дыхательную аллергию и кожную аллергию.
Термин «антиген» обычно относится к веществу, которое распознается и селективно связывается антителом или рецептором антигена Т клеток. Антигены могут включать, но не ограничиваются, пептиды, белки, нуклеозиды, нуклеотиды и их комбинации. Антигены могут быть естественными или синтетическими и обычно вызывают иммунный ответ, который специфичен для такого антигена.
Термин «аутоиммунное расстройство» обычно относится к расстройствам, при которых «свой» антиген подвергается атаке иммунной системы. Такой термин включает, без ограничения, системную красную волчанку, рассеянный склероз, сахарный диабет I типа, синдром раздраженного кишечника, болезнь Крона, ревматоидный артрит, септический шок, универсальную алопецию, острый диссеминированный энцефаломиелит, болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилит, синдром антифосфолипидных антител, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, буллезный пемфигоид, болезнь Чагаса, хроническую обструктивную болезнь легких, заболевания брюшной полости, дерматомиозит, эндометриоз, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, болезнь Хашимото, гнойный гидраденит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, интерстициальный цистит, очаговую склеродермию, злокачественную миастению, нарколепсию, нейромиотонию, пузырчатку, пернициозную анемию, полимиозит, первичный билиарный цирроз, шизофрению, синдром Шегрена, височный артериит («гигантоклеточный артериит»), васкулит, витилиго, вульводинию и гранулематоз Вегенера, аутоиммунную астму, септический шок, псориаз и малярию.
Термин «рак» обычно относится к, без ограничения, любому злокачественному новообразованию или опухоли, вызванной нарушенной или неконтролируемой пролиферацией и/или делением клеток. Рак может развиваться у людей и/или животных и может возникнуть в любой и во всех тканях. Лечение пациента с раком с помощью изобретения может включать введение соединения, фармацевтической композиции или вакцины по изобретению с воздействием на нарушенную или неконтролируемую пролиферацию и/или деление клеток.
Термин «носитель» обычно охватывает любое вспомогательное вещество, разбавитель, наполнитель, соль, буфер, стабилизатор, масло, липид, пузырьки, содержащие липиды, микросферы, липосомальные инкапсуляции или другие материалы, хорошо известные в области техники для применения в фармацевтических композициях. Необходимо понимать, что характеристики носителя, вспомогательного вещества или разбавителя будут зависеть от пути введения для определенного применения. Получение фармацевтически приемлемых композиций, содержащих такие материалы, описано в, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.
Термин «фармацевтически приемлемый» или «физиологически приемлемый» обычно относится к материалу, который не влияет на эффективность соединения по изобретению и является совместимым с биологической системой, такой как клетка, культура клеток, ткань или организм. Предпочтительно биологической системой является живой организм, такой как позвоночное.
Термин «совместное введение» или «вводимый совместно» обычно относится к введению по меньшей мере двух различных веществ, достаточно близко по времени для модуляции иммунного ответа. Предпочтительно совместное введение относится к одновременному введению по меньшей мере двух различных веществ.
Термин «фармацевтически эффективное количество» обычно относится к количеству, достаточному для развития желаемого биологического эффекта, такого как полезный результат. Следовательно, «фармацевтически эффективное количество» будет зависеть от контекста, в котором его вводят. Фармацевтически эффективное количество можно вводить в одном или более профилактических или терапевтических введениях.
Термин «в комбинации с» обычно обозначает введение соединения по изобретению и другого средства, применимого для лечения заболевания или состояния, которое не прекращает эффект соединения антагонизма TLR9 в курсе лечения пациента. Такое введение может осуществляться в любом порядке, включая одновременное введение, а также в разделенном по времени порядке с перерывом от нескольких секунд до нескольких дней. Такое комбинированное лечение может также включать более чем однократное введение соединения по изобретению и/или независимо другого средства. Введение соединения по изобретению и другого средства может осуществляться одним и тем же или различными путями.
Термин «индивид» или «пациент» обычно относится к млекопитающему, такому как человек. Млекопитающие обычно включают, но не ограничиваются, людей, нечеловекообразных приматов, крыс, мышей, кошек, собак, лошадей, крупный рогатый скот, коров, свиней, овец и кроликов.
Термин «ингибитор киназ» обычно относится к молекулам, которые антагонизируют или ингибируют зависимую от фосфорилирования передачу клеточного сигнала и/или путей роста в клетке. Ингибиторы киназ могут быть естественными или синтетическими и включают небольшие молекулы, которые возможно вводить в качестве пероральных лекарственных средств. Ингибиторы киназ обладают способностью быстро и специфически ингибировать активацию целевых молекул киназ. Протеинкиназы являются привлекательными мишенями для лекарственных средств частично потому, что они регулируют широкое множество сигнальных и ростовых путей и включают множество различных белков. По существу, они обладают значительной эффективностью в лечении заболеваний, включающих передачу сигнала киназами, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания, воспалительные заболевания, диабет, макулярную дегенерацию и неврологические расстройства. Примеры ингибиторов киназ включают сорафениб (Nexavar®), Sutent®, дасатиниб, DasatinibTM, ZactimaTM, TykerbTM и STI571.
Термин «линейный синтез» обычно относится к синтезу, который начинается на одном конце олигонуклеотида и прогрессирует линейно к другому концу. Линейный синтез допускает включение и идентичных или неидентичных (в отношении длины, состава оснований или включаемых химических модификаций) мономерных единиц в олигонуклеотид.
Термин «млекопитающее» широко предназначен для включения теплокровных позвоночных животных, включая, без ограничения, людей.
Термин «модифицированный нуклеозид» обычно представляет собой нуклеозид, который включает модифицированное гетероциклическое основание, модифицированный сахарный компонент или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированным нуклеозидом является неестественный пиримидиновый или пуриновый нуклеозид, как описано в настоящем описании. Для целей изобретения модифицированный нуклеозид, аналог пиримидина или пурина или неестественный пиримидин или пурин, могут быть использованы взаимозаменяемо и относятся к нуклеозидам, которые включают неестественное основание и/или неестественный сахарный компонент. Для целей изобретения основание расценивают как неестественное, если оно не является гуанином, цитозином, аденином, тимином или урацилом.
Термин «модуляция» или «модулирующий» обычно относится к изменению, такому как увеличение ответа или количественная разница в ответе, опосредованном TLR9.
Термин «линкер» обычно относится к любому компоненту, который может быть прикреплен к олигонуклеотиду посредством ковалентных или нековалентных связей посредством сахара, основания или скелета. Линкер может использоваться для прикрепления одного или больше нуклеозидов или может быть прикреплен к 5' и/или 3'-концевому нуклеотиду в олигонуклеотиде. В определенных вариантах осуществления изобретения такой линкер может быть ненуклеотидным линкером.
Термин «ненуклеотидный линкер» обычно относится к химическому компоненту, иному, чем нуклеотидный линкер, который может быть прикреплен к олигонуклеотиду посредством ковалентной или нековалентной связи. Предпочтительно такой ненуклеотидный линкер имеет от около 2 ангстрем до около 200 ангстрем в длину и может быть или в цис-, или в трансориентации.
Термин «нуклеотидная связь» обычно относится к химической связи для объединения двух олигонуклеотидов посредством их сахаров (например, 3'-3', 2'-3', 2'-5', 3'-5'), состоящих из атома фосфора и заряженной или нейтральной группы (например, фосфодиэфира, фосфоротиоата или фосфородитиоата) между соседними нуклеозидами.
Термин «соединение на основе олигонуклеотидов» относится к полинуклеозиду, образованному из множества связанных нуклеозидных единиц. Нуклеозидные единицы могут быть частью или могут быть частично сделаны из вирусов, бактерий, обломков клеток, сиРНК или микроРНК. Такие олигонуклеотиды также могут быть получены из существующих источников нуклеиновых кислот, включая геномную или кДНК, но предпочтительно получены синтетическими методами. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения такая нуклеозидная единица включает гетероциклическое основание и пентофуранозил, трегалозу, арабинозу, 2'-деокси-2'-замещенный нуклеозид, 2'-деокси-2'-замещенную арабинозу, 2'-О-замещенную арабинозу или гексозную сахарную группу. Нуклеозидные остатки могут быть связаны друг с другом с помощью любого из множества известных межнуклеотидных связей. Такие межнуклеозидные связи включают, без ограничения, фосфодиэфир, фосфоротиоат, фосфородитиоат, алкилфосфонат, алкилфосфонотиоат, фосфотриэфир, фосфорамидат, силоксан, карбонат, карбоалкокси, ацетамидат, карбамат, морфолино, борано, тиоэфир, мостиковый фосфорамидат, мостиковый метиленфосфонат, мостиковый фосфоротиоат и сульфоновые межнуклеозидные связи.
Термин «соединения на основе олигонуклеотидов» также охватывает полинуклеозиды, имеющие одну или больше стереоспецифичных межнуклеозидных связей (например, (Rp)- или (Sp)-фосфоротиоат, алкилфосфонат или фосфотриэфирные связи). Как используется в настоящем описании, термины «олигонуклеотид» и «динуклеотид» широко предназначены для включения полинуклеозидов и динуклеозидов, имеющих любые такие межнуклеозидные связи, включают ли эти связи фосфатную группу или нет. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения такие межнуклеозидные связи могут быть фосфодиэфирными, фосфоротиоатными или фосфородитиоатными связями или их комбинациями.
Термин «пептид» в общем относится к полипептидам, которые имеют достаточную длину и состав для влияния на биологический ответ, например продукцию антител или активность цитокинов, является ли пептид гаптеном или нет. Термин «пептид» может включать модифицированные аминокислоты (или естественные, или неестественные), где такие модификации включают, но не ограничиваются, фосфорилирование, гликозилирование, пегилирование, липидизацию и метилирование.
Термин «агонист TLR9» в общем относится к соединению на основе олигонуклеотида, которое способно усиливать, индуцировать или модулировать иммунную стимуляцию, опосредованную TLR9.
Термин «лечение» в общем относится к подходу, предназначенному для получения целебного или желаемого результата, который может включать облегчение симптомов или отсрочку или облегчение прогрессирования заболевания.
Определенные агонисты TLR9 по изобретению показаны в таблице I ниже. В этой таблице агонисты TLR9 на основе олигонуклеотидов имеют все фосфоротиоатные (PS) связи за исключением тех, где указано. Однако специалисту в области техники понятно, что могут быть использованы фосфодиэфирные (РО) связи или комбинация PS и PO связей. За исключением того, где указано, все нуклеотиды представляют собой деоксирибонуклеотиды.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Figure 00000005
G1=7-деаза-dG; G2=AraG; G3=7-деаза-араG; A/G/C/U=2'-O-метилрибонуклеозиды; dU=U1=2'-деокси-U; ο=афосфодиэфирная связь; рο=5'-монофосфат; ps=5'фосфоротиоатная связь; pm=метилфосфонат (неионный линкер); L=1,5-пентандиоловый линкер; L=1,2-дидеоксирибоза; L1=триэтиленгликолевый линкер; L2=тетраэтиленгликолевый линкер; L3=гексаэтиленгликолевый линкер, М=цис,цис-1,3,5-циклогексантриоловый линкер; m=цис,транс-1,3,5-циклогексантриоловый линкер; Х=глицериновый линкер; X1=1,2,4-бутантриоловый линкер; Х2=линкер 1,3,5-трис(2-гидроксиэтил)циануровая кислота; Х3=изобутантриоловый линкер; Y=1,3-пропандиоловый линкер; Y1=1,2-этилендиоловый линкер; Y2=1,4-бутандиоловый линкер; Y3=1,5-пентандиоловый линкер; Z=1,3,5-пентантриоловый линкер.
Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении иммуностимулирующей активности в клетках HEK293, экспрессирующих TLR9, как описано в примере 2. Результаты, показанные на фиг.3А, 3В, 3С, 3D и 3Е, демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов будут изменять их TLR9 опосредованный профиль активации NF-κB
через 18 часов после введения. В общем, полученные данные демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов могут быть использованы для увеличения или снижения активации NF-κB.
Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении иммуностимулирующей активности в анализе человеческих PBMC в отношении IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, IL-1Rα, IL-2R и MCP-1, как описано в примере 3. Результаты, показанные на фиг.4А-4FF, демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов будут изменять их TLR9 опосредованный профиль активации IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, IL-1Rα, IL-2R и MCP-1 в человеческих PBMC. В общем, полученные данные демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов могут быть использованы для увеличения или снижения активации IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, IL-1Rα, IL-2R и MCP-1.
Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении иммуностимулирующей активности в анализе человеческих pDC в отношении IL-12, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β и TNFα, как описано в примере 3. Результаты, показанные на фиг.5А и 5В, демонстрируют, что специфические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов изменяют их TLR9 опосредованный профиль иммунной активации в человеческих pDC. В общем, полученные данные демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов могут использоваться для увеличения или снижения активации IL-12, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β и TNFα.
Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении иммуностимулирующей активности в анализе пролиферации человеческих В-клеток, как описано в примере 4. Результаты, показанные на фиг.6А, 6В, 6С, 6D, 6Е и 6F, демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов изменяют их TLR9 опосредованную пролиферативную активность В-клеток и этот профиль активации может быть дозозависимым в зависимости от химической модификации. В общем, полученные данные демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов могут быть использованы для регуляции пролиферации В-клеток.
Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении in vivo иммуностимулирующей активности у мышей C57B1/6 и BALB/c, как описано в примере 5. Результаты, показанные на фиг.7А, 7В, 7D, 7Е и 7F, демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'-связанных олигонуклеотидов изменяют их TLR9 опосредованный in vivo профиль иммунной активации в моделях на мышах. В общем, полученные данные демонстрируют, что такие специфические химические модификации 3'-3'-связанных олигонуклеотидов могут изменять in vivo концентрации цитокинов и/или хемокинов, что находит применение при множестве заболеваний.
Как описано выше, изобретение обеспечивает в первом аспекте синтетические агонисты TLR9 на основе олигонуклеотидов. На основании определенных химических модификаций основания, сахара, связи или линкера агонисты TLR9 могут обладать повышенной стабильностью при ассоциации и/или удвоении с другими молекулами агониста TLR9 при удержании приемлемого 5'-конца.
В некоторых вариантах осуществления изобретения ненуклеозидные линкеры могут включать, но не ограничиваются, перечисленные в таблице II.
Таблица II
Характерные ненуклеотидные линкеры
Figure 00000006

Глицерин (1,2,3-пропантриол)
Figure 00000007

1,1,1-трис(гидроксиметил)нитрометан
Figure 00000008

1,2,4-бутантриол
Figure 00000009

1,1,1-трис(гидроксиметил)пропан
Figure 00000010

2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол
Figure 00000011

1,2,6-гексантриол
Figure 00000012

2-(гидроксиметил)-1,4-бутандиол
Figure 00000013

3-метил-1,3,5-пентантриол
Figure 00000014

1,3,5-пентантриол
Figure 00000015

1,2,3-гептантриол
Figure 00000016

1,1,1-трис(гидроксиметил)этан
Figure 00000017

2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол
 
Figure 00000018

N-[трис(гидроксиметил)метил]акрил-амид
Figure 00000019

Цис-1,3,5-циклогексантриол
Figure 00000020

1,3-ди(гидроксиэтокси)-2-гидроксилпропан
Figure 00000021

Цис-1,3,5-три(гидроксиметил)циклогексан
Figure 00000022

1,3-ди(гидроксипропокси)-2-гидроксилпропан
Figure 00000023

1,3,5-тригидроксилбензол
Figure 00000024

2-деокси-D-рибоза
Figure 00000025

3,5-ди(гидроксиметил)фенол
Figure 00000026

1,2,4-тригидроксибензол
Figure 00000027

1,3,5-три(гидроксиметил)бензол
Figure 00000028

D-галактоал
Figure 00000029

1,6-ангидро-β-D-глюкоза
Figure 00000030

4,6-нитропирогаллол
Figure 00000031

1,3,5-трис(2-гидроксиэтил)циануровая кислота		  
Figure 00000032

Галловая кислота		  
Figure 00000033

3,5,7-тригидроксифлавон		  
Figure 00000034

Этиленгликоль
Figure 00000035

1,5-пентандиол
Figure 00000036

1,3-пропандиол
Figure 00000037

2,4-пентандиол
Figure 00000038

1,2-пропандиол
Figure 00000039

1,6-гександиол
Figure 00000040

1,4-бутандиол
Figure 00000041

1,2-гександиол
Figure 00000042

1,3-бутандиол
Figure 00000043

1,5-гександиол
Figure 00000044

2,3-бутандиол
Figure 00000045

2,5-гександиол
Figure 00000046

1,4-бутандиол		  
Figure 00000047

1,7-гептандиол
Figure 00000048

2-(1-аминопропил)-1,3-пропандиол
Figure 00000049

1,8-октандиол
Figure 00000050

1,2-дидеоксирибоза
Figure 00000051

1,2-октандиол		  
Figure 00000052

1,9-нонандиол		  
Figure 00000053

1,12-додекандиол		  
Figure 00000054

Триэтиленгликоль		  
Figure 00000055

Тетраэтиленгликоль		  
Figure 00000056

Гексаэтиленгликоль		  
Figure 00000057

Цис,цис-циклогексантриоловый линкер
Figure 00000058

Цис,транс-циклогексантриоловый линкер
Figure 00000059

1,3,4-изобутантриол
Figure 00000060

Циануровая кислота
Во втором аспекте изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие агонист TLR9 на основе олигонуклеотида («соединение») по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Активное соединение включают в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в количестве, достаточном для введения пациенту фармацевтически эффективного количества, не вызывая серьезных токсических эффектов у пациента, получающего лечение. Эффективный диапазон доз фармацевтически приемлемых производных может быть рассчитан на основе массы исходного вводимого соединения или другими средствами, известными специалисту в области техники. Если производное обладает активностью как таковое, эффективная дозировка может быть оценена, как указано выше, с использованием массы производного или другими средствами, известными специалисту в области техники.
В третьем аспекте изобретение обеспечивает вакцину. Вакцины по настоящему аспекту включают фармацевтическую композицию по изобретению и дополнительно включают антиген. Антиген представляет собой молекулу, которая вызывает специфический иммунный ответ. Такие антигены включают, без ограничения, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и комплексы или комбинации любых из них. Любой такой антиген может необязательно быть связанным с иммуногенным белком или пептидом, например гемоцианином фиссуреллы (KLH), В субъединицей холерного токсина или любым другим иммуногенным белком-носителем.
Вакцины по изобретению могут дополнительно включать любой из множества известных адъювантов, включая, без ограничения, полный адъювант Фрунда, гемоцианин фиссуреллы (KLH), монофосфориллипид А (MPL), квасцы и сапонины, включая QS-21, имихимод, R848, агонисты TLR или их комбинации.
В четвертом аспекте изобретение обеспечивает способы для получения TLR9-опосредованного иммунного ответа у пациента, такие способы включают введение пациенту соединения, фармацевтической композиции или вакцины по изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения пациентом является млекопитающее. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения соединение, фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, нуждающемуся в иммунной стимуляции.
В способах по данному аспекту изобретения введение соединения, фармацевтической композиции или вакцины по изобретению может осуществляться любым подходящим путем, включая, без ограничения, парентеральный, пероральный путь, введение в опухоль, сублингвальный, трансдермальный, местный, интраназальный, аэрозоль, внутриглазной, интратрахеальный, интраректальный, через слизистые, вагинальный, посредством генетической жвачки, кожного пластыря или в глазных каплях или в форме полоскания для рта. Введение соединения, фармацевтической композиции или вакцины может проводиться с использованием известных методик в дозировках и в течение периодов времени, эффективных для уменьшения симптомов или суррогатных маркеров заболевания. При введении системно соединение, фармацевтическую композицию или вакцину предпочтительно вводят в достаточной дозировке для достижения уровня соединения в крови по изобретению от около 0,0001 микромоль до около 10 микромоль. Для местного введения более низкие концентрации, чем эта, могут быть эффективными и гораздо более высокие концентрации могут переноситься без серьезных токсических эффектов. Предпочтительно общая дозировка соединения по изобретению варьируется от около 0,001 мг пациенту в сутки до около 200 мг на кг массы тела в сутки. Может быть желательно вводить одновременно или последовательно терапевтически эффективное количество одной или больше терапевтических композиций по изобретению пациенту в виде эпизода разового лечения.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения соединение, фармацевтическую композицию или вакцину по изобретению вводят совместно или вводят в комбинации с другим средством, включая без ограничения, антитела, цитотоксические средства, аллергены, антибиотики, антисмысловые олигонуклеотиды, сиРНК, аптамеры, рибозимы, целевое лечение, ингибиторы киназ, пептиды, белки, векторы генной терапии, ДНК вакцины и/или адъюванты для усиления специфичности или выраженности иммунного ответа.
Способы по данному аспекту изобретения являются применимыми для профилактического или терапевтического лечения болезней человека или животных. Например, способы являются применимыми для применения педиатрических и ветеринарных вакцин. Способы также являются применимыми для исследований иммунной системы на моделях.
В пятом аспекте изобретение обеспечивает способы для терапевтического лечения пациента, имеющего заболевание или расстройство, такие способы включают введение пациенту соединения, фармацевтической композиции или вакцины по изобретению. В различных вариантах осуществления изобретения заболеванием или расстройством для лечения является рак, аутоиммунное расстройство, инфекционное заболевание, воспаление дыхательных путей, воспалительные расстройства, аллергия, астма или заболевания, вызванные патогеном или аллергеном. Патогены включают, например, бактерии, паразиты, грибы, вирусы, вироиды и прионы. Введение осуществляют, как описано для четвертого аспекта изобретения.
В шестом аспекте изобретения обеспечивают способы для профилактики заболевания или расстройства, указанные способы включают введение пациенту соединения, фармацевтической композиции или вакцины по изобретению. В различных вариантах осуществления изобретения предотвращаемым заболеванием или расстройством является рак, аутоиммунное заболевание, воспаление дыхательных путей, воспалительные заболевания, инфекционные заболевания, аллергия, астма или заболевания, вызванные патогеном. Патогены включают, без ограничения, бактерии, паразиты, грибы, вирусы, вироиды и прионы. Введение осуществляют, как описано для четвертого аспекта изобретения.
В любом из способов по изобретению соединение, фармацевтическую композицию или вакцину по изобретению могут вводить совместно или вводить в комбинации с любым другим средством, применимым для профилактики или лечения заболевания или состояния, которое не прекращает иммуностимулирующий эффект соединения, фармацевтической композиции или вакцины по изобретению. В любом из способов по изобретению средство, применимое для профилактики или лечения заболевания или состояния, включает, но не ограничивается, вакцины, антигены, антитела, цитотоксические средства, аллергены, антибиотики, антисмысловые олигонуклеотиды, агонисты TLR, ингибиторы киназ, пептиды, белки, векторы для генной терапии, вакцины ДНК и/или адъюванты для усиления специфичности или величины иммунного ответа или совместно стимулирующие молекулы, такие как цитокины, хемокины, лиганды белков, трансактивирующие факторы, пептиды и пептиды, включающие модифицированные аминокислоты. Например, в профилактике и/или лечении рака предусматривается, что соединение, фармацевтическая композиция или вакцина по изобретению могут вводиться совместно или вводиться в комбинации с химиотерапевтическим соединением или моноклональным антителом. Предпочтительные химиотерапевтические средства включают, без ограничения, Гемцитабин метотрексат, винкристин, адриамицин, цисплатин, сахарнесодержащие хлорэтилнитрозомочевины, 5-фторурацил, митомицин С, блеомицин, доксорубицин, дакарбазин, Taxol®, фрагилин, мегламин GLA, валрубицин, кармустаин и полиферпосан, MMI270, BAY 12-9566, ингибитор RAS фамезил трансферазы, ингибитор фамезилтрансферазы, MMP, MTA/LY231514, LY26468/Lometexol, Glamolec, TNP-470, Гикамтин/Топотекан, PKC412, Вальсподар/PSC833, Novantrone®/Митроксантрон, Метарет/Сурамин, Батимастат, Е7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Мармистат, ВВ2516/Мармистат, CDP 845, D2163, PD183805, DX895lf, Lemonal DP 2202, FK 317, иматиниб мезилат/Gleevec®, Picibanil/OK-432, AD 32/Валрубицин, Metastron®/производное стронция, Темодал/Темозоломид, Эвацет/липосомальный доксорубицин, Ютаксан/Паклитаксел, Taxol®/Паклитаксел, Кселоад/Капецитабин, Фуртулон/Доксифлуридин, Циклопакс/пероральный паклитаксел, пероральный Таксоид, SPU-077/Цисплатин, HMR1275/Флавопиридол, CP-358 (774)/EGFR, CP-609(754)/ингибитор RAS онкогена, BMS-18275/пероральная платина, UFTTM(Тегафур/Урацил), Ergamisol®/Левамизол, Энилурацил/776С85/5FU усилитель, Кампто/Левамизол, Camptosar®/Иринотекан, Тумодекс/Ралитрексед, Leustatin®/Кладрибин, Паксес/паклитаксел, Doxil®/липосомальный доксорубицин, Целикс/липосомальный доксорубицин, Fludara®/Флударабин, Фармарубицин/Эпирубицин, DepoCyt®, ZD1839, LU 79553/Бис-нафталимид, LU103793/Доластатин, Цетикс/липосомальный доксорубицин, Gemzar®/Гемцитабин, ZD0473/Anormed®, YM 116, семена lodin, ингибиторы CDK4 и CDK2, ингибиторы PARP, D4809/Дексифозамид, Ифес/Mesnex®/Ифосамид, Vumon®/Тенипозид, Paraplatin®/Карбоплатин, Платинол/цисплатин, Вепезид/Этопозид, ZD9331, Taxotere®/Доцетаксел, пролекарство арабинозида гуанина, аналог Таксана, нитрозомочевины, алкилирующие агенты, такие как мелфелан и циклофосфамид, аминоглютетимид, аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, хлоромбуцил, цитарабин HCl, Дактиномицин, Даунорубицин HCl, эстрамустин фосфат натрия, Этопозид (VP16-213), Флоксуридин, Фторурацил (5-FU), Флутамид, Гидроксимочевина (гидроксикарбамид), Ифосфамид, Интерферон альфа-2а, альфа 2b, ацетат Лейпролида (аналог LHRH-высвобождающего фактора), Ломустин (CCNU), Мехлорэтамин HCl (азотистый иприт), Меркаптопурин, Месна, Митотан (о.р'-DDD), Митоксантрон HCl, Октреотид, Пликамицин, Прокарбазин HCl, Стрептозоцин, цитрат Тамоксифена, Тиогуанин, Тиотепа, сульфат Винбластина, Амсакрин (m-AMSA), Азацитидин, Эритропоэтин, Гексаметилмеламин (HMM), Интерлейкин 2, Митогуазон (метил-GAG; метил глиоксаль бис-гуанилгидразон; MGBG), Пентостатин (2'деоксикоформицин), Семустин (метил-CCNU), Тенипозид (VM-26) и сульфат Виндесина. Предпочтительные моноклональные антитела включают, но не ограничиваются, Panorex® (Glaxo-Welicome), Rituxan® (IDEC/Genetech/Hoffman la Roche), Mylotarg® (Wyeth), Campath® (Millenium), Zevalin® (IDEC and Shering AG), Bexxar® (Corixa/GSK), Erbitux® (Imclone/BMS), Avastin® (Genetech), Herceptin® (Genetech/Hoffman la Roche), Tarceva® (OSI Pharmaceuticals/Genetech).
Альтернативно, средство, применимое для профилактики или лечения заболевания или состояния, может включать векторы ДНК, кодирующие антиген или аллерген. В этих вариантах осуществления изобретения соединение, фармацевтическая композиция или вакцина по изобретению могут различным образом действовать как адъюванты и/или вызывать непосредственные иммуномодулирующие эффекты.
Следующие примеры предназначены для дополнительной иллюстрации определенных предпочтительных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения рамок изобретения каким-либо образом.
Пример 1
Синтез соединений на основе олигонуклеотидов, содержащих иммуностимулирующие компоненты
Химические вещества по изобретению синтезировали в объеме от 1 мкмоль до 0,1 мМ с использованием автоматизированного ДНК синтезатора (OligoPilot II, AKTA, (Amersham) и/или Expedite 8909 (Applied Biosystem)) с последующими методиками линейного или параллельного синтеза, указанными на фиг.1 и 2.
5'-DMT dA, dG, dC и Т фосфорамидиты покупали у Proligo (Boulder, Co). 5'-DMT 7-деаза-dG и araG фосфорамидиты получали от Chemgenes (Wilmington, MA). Твердую подложку с DiDMT-глицериновым линкером получали от Chemgenes. 1-(2'-деокси-β-D-рибофуранозил)-2-оксо-7-деаза-8-метилпуринамидит получали от Glen Research (Sterling, VA), 2'-O-метилрибонуклеозидамидиты получали от Promega (Obispo, CA). Все соединения по изобретению были модифицированы по фосфоротиоатному скелету.
Все нуклеозидные фосфорамидиты характеризовали посредством 31Р и 1Н ЯМР спектров. Модифицированные нуклеозиды включали в специфические сайты с использованием обычных циклов связывания, рекомендованных поставщиком. После синтеза соединения депротектировали с использованием концентрированного гидроксида аммония и очищали обращенно-фазной ВЭЖХ, детрилированием с последующим диализом. Очищенные соединения в форме натриевой соли лиофилизировали перед использованием. Чистоту исследовали посредством CGE и MALDI-TOF MC. Уровень эндотоксина определяли посредством LAL теста, и он был ниже 1,0 МЕ/мг.
Пример 2
Условия и реагенты для культур клеток
Клетки HEK293 или HEK293XL, экспрессирующие мышиный TLR (Invivogen, San Diego, CA), культивировали в 48-луночных планшетах в 250 мкл/ячейку DMEM, дополненной 10% FBS, инактивированной нагреванием, в 5% СО2 инкубаторе. При 80% слиянии культуры временно трансфицировали 400 нг/мл плазмидой репортером SEAP (секретируемая форма человеческой эмбриональной щелочной фосфатазы) (pNifty2-Seap) (Invivogen) в присутствии 4 мкл/мл липофектамина (Invitrogen, Carlsbad, CA) в культуральной среде. Плазмидную ДНК и липофектамин разводили отдельно в среде без сыворотки и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. После инкубации разведенную ДНК и липофектамин смешивали и смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Аликвоты по 25 мкл смеси ДНК/липофектамина, содержащие 100 нг плазмидной ДНК и 1 мкл липофектамина, добавляли к каждой ячейке культурального планшета и культивирование продолжали в течение 4 часов.
Индукция цитокинов примерными соединениями из таблицы I в клетках HEK293, экспрессирующих мышиный TLR9
После трансфекции среду заменяли свежей культуральной средой, примерные соединения из таблицы I добавляли к культурам в концентрации 0, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, или 10,0 мкг/мл и культивирование продолжали в течение 18 часов. В конце обработки соединениями определяли уровень NF-κB с использованием анализа SEAP (секретируемая форма человеческой эмбриональной щелочной фосфатазы) в соответствии с протоколом производителя (Invivogen). Коротко, 30 мкл надосадочной жидкости культур получали от каждой обработки и инкубировали с субстратом п-нитрофинилфосфатом и образующийся желтый цвет измеряли счетчиком планшетов на 405 нм (Putta MR et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34:3231-8).
Пример 3
Индукция цитокинов примерными соединениями из таблицы I в человеческих PBMC, pDc и мышиных спленоцитах
Выделение человеческих PBMC
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) из свежеполученной крови здоровых добровольцев (CBR Laboratories, Boston, MA) выделяли методом центрифугирования по градиенту плотности Ficoll (Histopaque-1077, Sigma).
Выделение человеческих pDc
Человеческие плазматические дендритные клетки (pDc) выделяли из свежеполученных PBMC крови здоровых добровольцев позитивной селекцией с использованием наборов для выделения клеток BDCA4 (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя.
Выделение мышиных спленоцитов
Человеческие PBMC сеяли в 48-луночные планшеты с использованием 5×106 клеток/мл. Человеческие pDc сеяли в 96-луночные чашки с использованием 1×106 клеток/мл. Примерные соединения из таблицы I, растворенные в DPBS (рН 7,4; Mediatech), добавляли к культурам клеток в дозах 0, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 или 10,0 мкг/мл. Клетки затем инкубировали при 37°С в течение 24 часов и надосадочные жидкости собирали для многоканальных анализов luminex или ELISA. В определенных экспериментах уровни IFN-α, IL-6 и/или IL-12 измеряли посредством сэндвича ELISA. Требуемые реагенты, включая антитела к цитокинам и стандарты, покупали у PharMingen.
Многоканальный анализ цитокинов Luminex
В определенных экспериментах уровни IL-1Rα, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, MIP-1α, MIP-β, MCP-1 и IL-12p40p70 в надосадочных жидкостях культур измеряли многоканальными анализами Luminex, которые проводили с использованием наборов для многоканального анализа человеческих цитокинов Biosource на приборе Luminex 100 и данные анализировали с использованием программного обеспечения StarStation поставляемого Applied Cytometry Systems (Sacramento, CA).
Активация человеческих иммунных клеток
Человеческие плазматические дендритные клетки (pDc) выделяли из свежеполученных PBMC крови здоровых добровольцев и культивировали с 50 мкг/мл агонистов TLR9 или контроля в течение 24 час. Клетки окрашивали с помощью флуоресцентно-конъюгированных Ab (CD123, CD80, CD86) и данные получали на цитометре FC500 MPL. Среднюю интенсивность флуоресценции CD80 и CD86 на клетках CD123+ анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и выражали как кратное увеличение по сравнению с контролем PBS.
Человеческие миелоидные дендритные клетки (mDC) выделяли из свежеполученных PBMC крови здоровых добровольцев и культивировали с 50 мкг/мл агонистов TLR9 или контроля в течение 24 час. Клетки окрашивали с помощью флуоресцентно-конъюгированных Ab (CD11c, CD80, CD40) и данные получали на цитометре FC500 MPL. Среднюю интенсивность флуоресценции CD80 и CD40 на клетках CD11c+ анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и выражали как кратное увеличение по сравнению с контролем PBS.
Пример 4
Анализ пролиферации человеческих В клеток в присутствии примерных соединений из таблицы I
Человеческие В клетки выделяли из PBMC позитивной селекцией с использованием набора для выделения клеток CD19 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) в соответствии с инструкциями производителя.
Культуральная среда, используемая для анализа, состояла из среды RPMI 1640, дополненной 1,5 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ необязательных аминокислот, 50 мкМ меркаптоэтанола, 100 МЕмл смеси пенициллин-стрептомицин и 10% эмбриональной сыворотки телят, инактивированной нагреванием.
Всего 0,5×106 В клеток на мл (т.е. 1×105/200 мкл/ячейку) стимулировали в 96-луночных плоскодонных планшетах различными концентрациями примерных соединений из таблицы I в трех экземплярах в течение периода всего 68 часов. После 68 часов клетки обрабатывали 0,75 мкКи [3H]-тимидина (1 Ки=37 ГБк; Perkin Elmer Life Sciences) в 20 мкл среды RPMI 1640 (без сыворотки) на ячейку и собирали через 6-8 часов. Затем планшеты собирали с использованием коллектора клеток и включение радиоактивной метки определяли с использованием стандартной методики жидкостной сцинтилляции. В некоторых случаях соответствующие [3H]-Т (ц/мин) преобразовывали в индекс пролиферации и сообщали как таковой.
Пример 5
Секреция цитокинов in vivo в модели на мышах, получающих соединения агонисты TLR9
Мышей C57BL/6 и BALB/c в возрасте 5-6 недель получали от Taconic Farms, Germantown, NY и содержали в соответствии с протоколом для животных, одобренным Idera Pharmaceutical's IACUC. Мышам (n=3) вводили подкожно (п/к) отдельные иммуномодулирующие соединения из таблицы I в концентрации 0,25 или 1,0 мг/кг (разовая доза). Сыворотку собирали посредством ретроорбитального кровотечения через 2 часа после введения иммуномодулирующего соединения и определяли концентрации IL-12, IL-10, IL-6, KC, MCP1, MIG, MIP-1α и TNF-α посредством сэндвич ELISA или многоканального анализа Luminex. Результаты показаны на фиг.7А, 7В, 7С, 7D, 7E и 8F и демонстрируют, что in vivo введение иммуномодулирующих соединений, содержащих новые химические композиции, дает уникальные профили цитокинов и хемокинов. Все реагенты, включая антитела к цитокинам и хемокинам и стандарты, покупали у PharMingen (San Diego, CA).
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Тогда как вышеуказанное изобретение описано в некоторых подробностях для целей ясности и понимания, специалисту в области техники должно быть понятно после чтения настоящего описания, что различные изменения в форме и деталях могут быть осуществлены без отклонения от истинной сущности изобретения и приложенной формулы изобретения.

Claims (9)

1. Иммуномодулирующее соединение, выбранное из соединений №1-169:
Figure 00000061

Figure 00000062

Figure 00000063

Figure 00000064

Figure 00000065
2. Композиция, обеспечивающая получение иммунного ответа, включающая иммуномодулирующее соединение по п.1 и физиологически приемлемый носитель.
3. Способ получения иммунного ответа у пациента, включающий введение пациенту соединения по п.1 в фармацевтически эффективном количестве.
4. Способ терапевтического лечения пациента, имеющего заболевание или расстройство, при котором модуляция иммунного ответа будет полезной, включающий введение пациенту соединения по п.1 в фармацевтически приемлемом количестве.
5. Способ по п.4, где заболеванием или расстройством является рак, аутоиммунное расстройство, воспалительное расстройство, инфекционное заболевание, кожное заболевание, аллергия, астма или заболевание, вызванное патогеном или аллергеном.
6. Способ по п.4, дополнительно включающий введение одного или более химиотерапевтических соединений, нацеленных терапевтических средств, вакцин, антигенов, антител, цитотоксических средств, аллергенов, антибиотиков, антисмысловых олигонуклеотидов, агонистов TLR, ингибиторов киназ, пептидов, белков, ДНК вакцин, адъювантов, ко-стимулирующих молекул или их комбинаций.
7. Способ профилактического лечения пациента, имеющего заболевание или расстройство, при котором будет полезной модуляция иммунного ответа, включающий введение пациенту соединения по п.1 в фармацевтически эффективном количестве.
8. Способ по п.7, где заболеванием или расстройством является рак, аутоиммунное расстройство, воспалительное расстройство, инфекционное заболевание, кожное заболевание, аллергия, астма или заболевание, вызванное патогеном или аллергеном.
9. Способ по п.7, дополнительно включающий введение одного или более химиотерапевтических соединений, нацеленных терапевтических средств, вакцин, антигенов, антител, цитотоксических средств, аллергенов, антибиотиков, антисмысловых олигонуклеотидов, агонистов TLR, ингибиторов киназ, пептидов, белков, ДНК вакцин, адъювантов, ко-стимулирующих молекул или их комбинаций.
RU2010107207/10A 2007-08-01 2008-07-31 Новые синтетические агонисты tlr9 RU2468819C2 (ru)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95325107P 2007-08-01 2007-08-01
US60/953,251 2007-08-01
US98360107P 2007-10-30 2007-10-30
US60/983,601 2007-10-30
US98715107P 2007-11-12 2007-11-12
US60/987,151 2007-11-12
US1529207P 2007-12-20 2007-12-20
US61/015,292 2007-12-20
PCT/US2008/071738 WO2009018431A2 (en) 2007-08-01 2008-07-31 Novel synthetic agonists of tlr9

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010107207A RU2010107207A (ru) 2011-09-10
RU2468819C2 true RU2468819C2 (ru) 2012-12-10

Family

ID=40305273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010107207/10A RU2468819C2 (ru) 2007-08-01 2008-07-31 Новые синтетические агонисты tlr9

Country Status (12)

Country Link
US (2) US7960362B2 (ru)
EP (3) EP2650369B1 (ru)
JP (2) JP5563455B2 (ru)
KR (1) KR20100053598A (ru)
CN (3) CN105177014B (ru)
AU (1) AU2008282172B2 (ru)
BR (1) BRPI0813981A2 (ru)
CA (1) CA2693266C (ru)
ES (2) ES2585239T3 (ru)
IN (1) IN2010KN00195A (ru)
RU (1) RU2468819C2 (ru)
WO (1) WO2009018431A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017052403A1 (ru) * 2015-09-25 2017-03-30 Анатолий Викторович ЗАЗУЛЯ Изготовление таблетки с механизмом повышения терапевтической эффективности лекарственного средства нанодозой микрорнк

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
US8158768B2 (en) * 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
AU2004252505B2 (en) * 2003-06-11 2010-10-28 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immunomodulatory oligonucleotides
EP2363141A1 (en) * 2003-07-15 2011-09-07 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compsition comprising two oligonucleotides linked directly at their 3'ends wherein at leat one oligonucleotide has an accessible 5'end and the compound further comprising IL-2 used for synergistically stimulating an immune response in a patient.
CA2536139A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
RU2468819C2 (ru) * 2007-08-01 2012-12-10 Идера Фармасьютикалз, Инк. Новые синтетические агонисты tlr9
EP2391718A2 (en) * 2009-01-30 2011-12-07 Idera Pharmaceuticals, Inc. Novel synthetic agonists of tlr9
PT2411521E (pt) 2009-03-25 2015-04-21 Univ Texas Composições para estimulação de resistência imunitária inata de mamíferos contra patogénicos
US8709419B2 (en) 2010-08-17 2014-04-29 Hoffmann-La Roche, Inc. Combination therapy
US20120045433A1 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 Kapil Dhingra Combination therapy
US9295669B2 (en) 2010-12-14 2016-03-29 Hoffman La-Roche Inc. Combination therapy for proliferative disorders
WO2014110081A1 (en) * 2013-01-08 2014-07-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (iro) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
AR095882A1 (es) 2013-04-22 2015-11-18 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra csf-1r humano con un agonista de tlr9
GB2514591A (en) * 2013-05-30 2014-12-03 Mologen Ag Predictive biomarker for cancer therapy
WO2015187966A1 (en) 2014-06-04 2015-12-10 Aurasense Therapeutics, Llc Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
US20170298178A1 (en) * 2014-09-12 2017-10-19 Vantage Specialty Chemicals, Inc. Derivatives of 1,3-propanediol
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
AU2015330731B2 (en) * 2014-10-10 2020-07-09 Idera Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancer using TLR9 agonist with checkpoint inhibitors
CN107106493A (zh) 2014-11-21 2017-08-29 西北大学 球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
MX2019002925A (es) 2016-09-15 2019-09-05 Idera Pharmaceuticals Inc Modulacion inmune con agonistas de tlr9 para el tratamiento del cancer.
JP2020508436A (ja) 2016-12-07 2020-03-19 プロジェニティ， インコーポレイテッド 胃腸管の検出方法、装置およびシステム
EP3554344A1 (en) 2016-12-14 2019-10-23 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tlr modulator
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
CN109206481B (zh) 2017-07-05 2023-08-18 尚华医药科技(江西)有限公司 一种肽类化合物、其应用及含其的组合物
WO2019066571A2 (ko) 2017-09-28 2019-04-04 연세대학교 산학협력단 골수유래 면역반응 억제세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 골수유래 면역반응 억제세포 및 그 용도
CA3145889A1 (en) 2019-07-05 2021-01-14 Tambo, Inc. Trans-cyclooctene bioorthogonal agents and uses in cancer and immunotherapy
US20230107927A1 (en) 2020-02-28 2023-04-06 First Wave Bio, Inc. Methods of treating iatrogenic autoimmune colitis
AU2021300632A1 (en) 2020-07-02 2023-02-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of achieving HIV viral remission using long-acting antiretroviral agents
WO2022032191A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Tambo, Inc. Trans-cyclooctene bioorthogonal agents and uses in cancer and immunotherapy

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0986572A2 (en) * 1997-06-06 2000-03-22 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
RU2000132668A (ru) * 2000-12-27 2002-10-27 Александр Наумович Наровлянский Иммуномодулятор-метаболик-детоксикант-адаптоген-радиопротектор
US6562798B1 (en) * 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US20040087534A1 (en) * 1994-07-15 2004-05-06 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
WO2004096156A2 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Centocor, Inc. Toll-like receptor 9 effector agents and uses thereof
US20050244410A1 (en) * 2004-04-29 2005-11-03 Ashlyn Bassiri Toll-like receptor 9 effector agents and uses thereof
US20060058254A1 (en) * 2002-12-23 2006-03-16 Dino Dina Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6673613B2 (en) * 2000-07-26 2004-01-06 Cognis Corporation Use of CYP52A2A promoter to increase gene expression in yeast
US6503734B1 (en) * 2000-07-26 2003-01-07 Cognis Corporation Cytochrome b5 gene and protein of Candida tropicalis and methods relating thereto
DE60142410D1 (de) * 2000-12-27 2010-07-29 Dynavax Tech Corp Immunomodulatorische polynukleotide und verfahren zur deren verwendung
RU2194502C2 (ru) * 2000-12-27 2002-12-20 Наровлянский Александр Наумович Иммуномодулятор - метаболик - детоксикант - адаптоген - радиопротектор
WO2003000922A2 (en) * 2001-06-21 2003-01-03 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
AU2004252505B2 (en) * 2003-06-11 2010-10-28 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immunomodulatory oligonucleotides
ES2645158T3 (es) * 2004-06-15 2017-12-04 Idera Pharmaceuticals, Inc. Multímeros de oligonucleótidos inmunoestimuladores
AU2006304205C1 (en) * 2005-10-12 2012-11-15 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
AU2005338035B2 (en) * 2005-11-07 2012-06-07 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
MX2008008279A (es) * 2005-12-20 2009-03-04 Idera Pharmaceuticals Inc Actividad inmunoestimuladora de oligonucleotidos inmunoestimuladores palindromicos que contienen diferentes longitudes de segmentos palindromicos.
EP2079305A4 (en) * 2006-12-12 2010-01-27 Idera Pharmaceuticals Inc SYNTHETIC AGONISTS OF TLR9
WO2008131074A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-30 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of toll-like receptor-9 agonists, toll-like receptor-4 antagonists, and/or nuclear oligomerization domain-2 agonists for the treatment or prevention of toll-like receptor-4-associated disorders
RU2468819C2 (ru) * 2007-08-01 2012-12-10 Идера Фармасьютикалз, Инк. Новые синтетические агонисты tlr9

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040087534A1 (en) * 1994-07-15 2004-05-06 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
EP0986572A2 (en) * 1997-06-06 2000-03-22 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6562798B1 (en) * 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
RU2000132668A (ru) * 2000-12-27 2002-10-27 Александр Наумович Наровлянский Иммуномодулятор-метаболик-детоксикант-адаптоген-радиопротектор
US20060058254A1 (en) * 2002-12-23 2006-03-16 Dino Dina Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
WO2004096156A2 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Centocor, Inc. Toll-like receptor 9 effector agents and uses thereof
US20050244410A1 (en) * 2004-04-29 2005-11-03 Ashlyn Bassiri Toll-like receptor 9 effector agents and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017052403A1 (ru) * 2015-09-25 2017-03-30 Анатолий Викторович ЗАЗУЛЯ Изготовление таблетки с механизмом повышения терапевтической эффективности лекарственного средства нанодозой микрорнк

Also Published As

Publication number Publication date
ES2539353T3 (es) 2015-06-30
EP2650369B1 (en) 2015-04-29
US8361986B2 (en) 2013-01-29
RU2010107207A (ru) 2011-09-10
KR20100053598A (ko) 2010-05-20
CN102864151A (zh) 2013-01-09
EP2173912A4 (en) 2013-03-20
CN105177014A (zh) 2015-12-23
HK1216430A1 (zh) 2016-11-11
AU2008282172B2 (en) 2014-05-22
JP2014205691A (ja) 2014-10-30
EP2821488A2 (en) 2015-01-07
EP2650369A1 (en) 2013-10-16
WO2009018431A2 (en) 2009-02-05
CN101878311A (zh) 2010-11-03
US20090053206A1 (en) 2009-02-26
CA2693266C (en) 2015-06-30
AU2008282172A1 (en) 2009-02-05
EP2173912A2 (en) 2010-04-14
BRPI0813981A2 (pt) 2017-05-09
JP2010535242A (ja) 2010-11-18
US20110311518A1 (en) 2011-12-22
EP2821488A3 (en) 2015-04-29
JP5563455B2 (ja) 2014-07-30
CN102864151B (zh) 2015-07-08
JP5816720B2 (ja) 2015-11-18
IN2010KN00195A (ru) 2015-08-28
CN105177014B (zh) 2018-04-06
EP2821488B1 (en) 2016-07-27
CA2693266A1 (en) 2009-02-05
WO2009018431A3 (en) 2009-12-30
US7960362B2 (en) 2011-06-14
ES2585239T3 (es) 2016-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2468819C2 (ru) Новые синтетические агонисты tlr9
KR101126030B1 (ko) 사이토킨 및/또는 화학치료제 또는 방사선 치료와 연계하여면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물을이용하여 면역계를 공동 상승 자극시키는 방법
US7569554B2 (en) Synergistic treatment of cancer using immunomers in conjunction with therapeutic agents
US20110293565A1 (en) Novel synthetic agonists of tlr9
JP2009521218A (ja) 異なる長さのパリンドロームセグメントを含むパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド（ｉｍｏ（ｔｍ））の免疫賦活作用
US20080279785A1 (en) Novel synthetic agonists of toll-like receptors containing CG dinucleotide modifications
AU2014203624B2 (en) Novel synthetic agonists of TLR9
HK1216430B (en) Synthetic agonists of tlr9