RU2460997C1 - Способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур - Google Patents
Способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур Download PDFInfo
- Publication number
- RU2460997C1 RU2460997C1 RU2011121993/10A RU2011121993A RU2460997C1 RU 2460997 C1 RU2460997 C1 RU 2460997C1 RU 2011121993/10 A RU2011121993/10 A RU 2011121993/10A RU 2011121993 A RU2011121993 A RU 2011121993A RU 2460997 C1 RU2460997 C1 RU 2460997C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoparticles
- cells
- test
- tested
- cultures
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 284
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 193
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 57
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 37
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 98
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 claims description 45
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 claims description 41
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 claims description 41
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- -1 silver ions Chemical class 0.000 claims description 29
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 27
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 26
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 23
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 22
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 229910052684 Cerium Inorganic materials 0.000 claims description 15
- GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N dialuminum;dioxosilane;oxygen(2-);hydrate Chemical compound O.[O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3].O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229910052901 montmorillonite Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 15
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 13
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 13
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Red Chemical compound [Cl-].C1=CC(CCl)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 claims description 7
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 claims description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 6
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 5
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N cerium Chemical compound [Ce] GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 11
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 9
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 8
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 8
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 8
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 4
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000006721 cell death pathway Effects 0.000 description 3
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910002492 Ce(NO3)3·6H2O Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CQBLUJRVOKGWCF-UHFFFAOYSA-N [O].[AlH3] Chemical class [O].[AlH3] CQBLUJRVOKGWCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- XVLXYDXJEKLXHN-UHFFFAOYSA-M dioc6 Chemical compound [I-].O1C2=CC=CC=C2[N+](CCCCCC)=C1C=CC=C1N(CCCCCC)C2=CC=CC=C2O1 XVLXYDXJEKLXHN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000011882 ultra-fine particle Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- WKAVAGKRWFGIEA-UHFFFAOYSA-N 17-acetyl-10,13-dimethyl-2,6,7,8,9,12,14,15,16,17-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,11-dione Chemical compound C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(=O)C)C1(C)CC2=O WKAVAGKRWFGIEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFNKZQNIXUFLBC-UHFFFAOYSA-N 2',7'-dichlorofluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Cl)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(Cl)C(O)=C1 VFNKZQNIXUFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000871 Acute monocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical class C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010063907 Glutathione Reductase Proteins 0.000 description 1
- 102000006587 Glutathione peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 108700016172 Glutathione peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 102100036442 Glutathione reductase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000035489 Monocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical class O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000004904 UV filter Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000006229 carbon black Substances 0.000 description 1
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 1
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- HSJPMRKMPBAUAU-UHFFFAOYSA-N cerium(3+);trinitrate Chemical compound [Ce+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O HSJPMRKMPBAUAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- MKYNHKOAYQRSBD-UHFFFAOYSA-N dioxouranium;nitric acid Chemical compound O=[U]=O.O[N+]([O-])=O.O[N+]([O-])=O MKYNHKOAYQRSBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000686 immunotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000006540 mitochondrial respiration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000007114 proinflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001374 small-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5073—Stem cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области микробиологии. Способ предназначен для оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур. Он предусматривает инкубацию первичных культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделяемых из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека, и мононуклеарных клеток - лимфоцитов, выделяемых из периферической крови человека, с суспензиями наночастиц. По завершении инкубации определяют влияние наночастиц на производство активных форм кислорода, на образование апоптотических и некротических клеток, на функции митохондрий, на состояние лизосомального компартмента, а также оценивают внутриклеточное накопление тестируемых наночастиц. Полученные показатели сравнивают с соответствующими показателями контрольных образцов исследуемых клеток. Способ позволяет определить биологическое влияние наночастиц на основные функциональные особенности клеточной системы живого организма, которые имитируются первичными культурами мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и мононуклеарными клетками - лимфоцитами. 8 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл.
Description
Область техники
Изобретение относится к биологическим исследованиям, а именно к способу оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур.
Стремительно развивающиеся исследования свойств наноматериалов и наночастиц, постоянно расширяющиеся области их применения ставят задачу поиска и апробации методов оценки их влияния на живые организмы, как на уровне всего организма, так и на отдельные клетки и клеточные структуры. Оценка клеточных эффектов является особенно важной вследствие наноразмерности действующих агентов, которые непосредственно воздействуют на клеточные структуры. Независимо от пути, по которому наночастицы и наноматериалы попадают в организм человека (например, при нанесении на кожу или при инъекциях в ткань или кровь), происходит их взаимодействие с клеточной системой различных тканей и органов, что влияет на функционирование клеточных органелл, жизнеспособность клеток и может оказывать токсическое действие на них.
Поэтому актуальной и важной является проблема создания тестов для оценки биологической активности наночастиц, их влияния на жизнедеятельность клеточных культур с учетом физико-химических и биологических особенностей, как наночастиц, так и клеточных культур.
Предшествующий уровень техники
Известны методики (тесты) in vitro по определению влияния наночастиц на клеточные культуры, в соответствии с которой рекомендовано использовать:
- в качестве моделей клеточных культур: мышиные макрофагоподобные клетки 774.А1, мышиные фибробласты L929, эмбриональные мышиные фибробласты линии Balb/3Т3 (линия 3Т3), человеческие моноцитарные линии ТНР-1 и HL-60 (периферическая кровь, острая моноцитарная лейкемия, промиелоцитарная лейкемия), человеческую лимфоидную линию К-562 (плевральная жидкость, хроническая миелогенная лейкемия);
- тестируемые наночастицы, диспергированные в растворителе, для введения в соответствующую питательную среду клеточной культуры;
- проведение тестирования in vitro для оценки влияния наночастиц на клеточные культуры по показателям: цитотоксичность, продукция активных форм кислорода (АФК), продукция фактора некроза опухоли-альфа, иммунотропное действие путем использования, в частности, метода проточной цитофлуориметрии по качественным и количественным изменениям в клетках (см. Методические указания МУ 1.2.2635-10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов». Утверждены 24.05.2010 Главным государственным санитарным врачом РФ).
В техническом решении (см. заявку US №20090269279, публ. 29.10.2009 г.) предложен способ оценки уровня токсичности, стрессовых реакций, повреждений ДНК (DNA) эпителиальных клеток, нормальных человеческих кератиноцитов (NHK), фибробластов человека (HSF) при воздействии на них многослойных углеродных нанотрубок с диаметром от 10 до 50 нм, используемых, в частности, с химико-терапевтическими целями в онкологии. Для оценки влияния названных наноматериалов на указанные клеточные культуры в известном техническом решении используют тесты для измерения клеточной пролиферации, степени апоптоза и некроза с использованием метода цитофлуориметрии.
В техническом решении (см. заявку US №20100279289, публ. 04.11.2010 г.) предложен способ оценки влияния наночастиц, в частности, золота (Au) с размером от 2 до 200 нм на клетки Т- лимфобластного лейкоза человека линии Джуркат (Jurkat) на основе измерения уровня экспрессии генов.
Известен также способ оценки влияния наночастиц на клеточные культуры (см. заявку US №20080295187, публ. 27.11.2008 г.), заключающийся в проведении тестов in vitro на клетки тест-культур, содержащих суспензии тестируемых наночастиц, по определению влияния наночастиц на производство активных форм кислорода, образованию апоптотических и некротических клеток, нарушению функций митохондрий с использованием цитологических флуоресцентных маркеров с последующим анализом на проточном цитофлуориметре, в оценке влияния наночастиц на клеток тест-культуры путем сравнения полученных показателей с соответствующими показателями контрольных образцов клеток тест-культур, не содержащих тестируемые наночастицы.
Данное техническое решение выбрано в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения.
В указанном техническом решении в качестве цитологических флуоресцентных маркеров (добавляемых к клеткам для визуализации и контроля функциональных изменений в клеточных структурах) используют стандартные в цитологии красители: дихлорфлуоресцин диацетат (DCFH-DA) - для выявления АФК, пропидий-йодид (PI) - для выявления апоптотических, некротических клеток, 3,3-дигексилоксакарбоцианин йодид (3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6)) - для выявления нарушений функций митохондрий (изменений трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm)), краситель MitoSOX™ red (красный) - для выявления АФК и функциональных изменений в клетках.
В качестве клеток тест-культур в экспериментах по данному техническому решению использовали макрофагоподобные клетки мышей RAW 264.7, при этом в соответствии с данным изобретением в качестве клеток тест-культур предлагается также использовать эпителиальные и эндотелиальные клетки, клетки почек и печени и др., которые выделяют из беспозвоночных, млекопетающих, бактерий и дрожжей.
При определении in vitro влияния наночастиц на клеточные культуры в качестве тестируемых наночастиц используют: ультрадисперсные частицы (UFP) отработанных газов энергетических (тепловых) установок, наночастицы сажи (Carbon black), наночастицы TiO2, фуллерены (Fullerol), микро- и наносферы полистирола (Polystyrene), при этом названные наночастицы при проведении их тестирования выдерживают в клеточных культурах от 1 часа до 4 недель.
В качестве контрольного образца использовались, в частности, макрофагоподобные клетки мышей тест-культуры RAW 264.7 без введения наночастиц.
В данном техническом решении определяют влияния наночастиц на клеточные культуры также по показателям: экспрессия антиоксидантных молекул глутатиона (на основе выявления индукции антиоксидантных ферментов - гемм-оксигеназы-1, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, каталазы); активация провоспалительных каскадов при окислительном стрессе (на основе выявления индукции провоспалительных цитокинов и хемокинов, например, tumour-necrosis factor-α (TNF-α)); клеточное поглощение и внутриклеточная локализация наночастиц (на основе электронной микроскопии макрофагоподобных клеток мышей RAW 264.7 и оценки изменений (повреждений) в митохондриях и вакуолях клеток).
На основании анализа указанных выше технических решений можно сделать следующие выводы:
- не существует системы тестов, способной оценить биологическую активность, токсичность и безопасность существующих наноматериалов и наночастиц по отношению к клеточным культурам;
- разработчики, в основном, предлагают узкоспециализированные и недостаточно стандартизованные методики и тесты;
- в указанных выше технических решениях исследуются определенные культуры клеток (биологических жидкостей, тканей и органов живых организмов) и конкретные виды наноматериалов и наночастиц с целью их прикладного, частного применения в областях биологии, медицины или техники;
- в указанных выше технических решениях не исследованы некоторые важнейшие типы первичных культур клеток, ответственных за физиологическую тканевую регенерации и репарацию тканей после повреждения, определяющих иммунный ответ организма на чужеродные воздействия;
- в указанных выше технических решениях также не исследовано воздействие наночастиц на важнейшие органеллы клеток - лизосомы (ответственные за переваривание захваченных клеткой при эндоцитозе веществ или частиц, аутофагию и автолиз), а также не исследовано воздействие наночастиц в зависимости от их концентрации в клеточной среде на функционирование клеточных органелл в целом.
Сущность изобретения
С позиций современных биологических исследований и нанотехнологии важным представляется решение технической задачи по расширению, совершенствованию системы тестов (способов) определения биологического влияния наночастиц с учетом их физико-химических, биоактивных свойств на исследуемые культуры клеток, которые позволяют имитировать основные функциональные особенности клеточной системы живого организма.
Для решения данного технического результата предложен способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур, заключающийся в проведении тестов in vitro клеток тест-культур при инкубировании их с суспензиями тестируемых наночастиц для определения влияния наночастиц на производство активных форм кислорода, образование апоптотических и некротических клеток, нарушение функций митохондрий с использованием цитологических флуоресцентных маркеров с анализом на проточном цитофлуориметре и в оценке влияния наночастиц на исследуемые клетки тест-культур путем сравнения полученных показателей с соответствующими показателями контрольных образцов исследуемых клеток тест-культур, не содержащих тестируемые наночастицы, отличающийся тем, что в качестве клеток тест-культур используют первичные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделяемых из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека, и мононуклеарных клеток - лимфоцитов, выделяемых из периферической крови человека, дополнительно определяют влияние наночастиц на названые клетки тест-культур по цитотоксичности, состоянию лизосомального компартмента, внутриклеточному накоплению тестируемых наночастиц, при проведении тестов in vitro каждый показатель определения влияния наночастиц на клетки тест-культур исследуют при инкубировании их с суспензиями тестируемых наночастиц в ростовой среде в течение 12-36 часов при изменении концентрации тестируемых наночастиц от 1·10-2 до 1·10-4 мас.%, причем для получения суспензий используют 1,0% водные суспензии наночастиц и ростовые среды при их соотношениях: 1:100; 1:1000; 1:10000, и каждый показатель теста in vitro в зависимости от концентрации нананочастиц сравнивают с соответствующим показателем теста in vitro контрольного образца и оценивают влияние наночастиц на жизнедеятельность клеток по полученным показателям.
По настоящему изобретению в качестве тестируемых наночастиц используют диоксид кремния (SiO2) с размером частиц 5-12 нм; наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированные ионами серебра (Ag+), с размером частиц 20-200 нм, наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированные ионами церия (Ce3+), с размером частиц 20-200 нм.
По настоящему изобретению при проведении тестов in vitro для определения влияния наночастиц на производство активных форм кислорода в клетках тест-культур используют флуоресцентный маркер - дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA) с определением количества окрашенных клеток и интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре.
По настоящему изобретению для выявления апоптотических и некротических клеток в клетках тест-культур используют набор маркеров Annexin V с анализом тестируемых клеток на проточном цитофлуориметре.
По настоящему изобретению показатель нарушения функций митохондрий выявляют по изменению трансмембранного потенциала митохондрий клеток тест-культур при использовании флуоресцентного потенциалзависимого маркера МитоТрекер Красный (MitoTracker Red 580) с определением интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре.
По настоящему изобретению показатель цитотоксичности тестируемых наночастиц при воздействии на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки оценивают по методу МТТ-теста с использованием раствора 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида в ростовой среде.
По настоящему изобретению показатель цитотоксичности тестируемых наночастиц при воздействии на мононуклеарные клетки - лимфоциты оценивают по увеличению доли некротических клеток, выявленных при окрашивании маркером - пропидий-йодидом (PI), с анализом на проточном цитофлуориметре.
По настоящему изобретению для определения состояния лизосомального компартмента тестируемых клеток используют флуоресцентный рН-зависимый маркер ЛизоТрекер Зеленый (LysoTracker Green DND-26) с анализом тестируемых клеток на проточном цитофлуориметре.
По настоящему изобретению для оценки внутриклеточного накопления наночастиц используют измерение бокового светорассеяния клетками тест-культур с применением проточного цитофлуориметра.
При реализации настоящего изобретения разработан эффективный способ оценки in vitro биологического влияния перспективных для медицинского и технического применения наночастиц на клеточные культуры, которые имитируют основные функциональные особенности клеточной системы человека, что объясняется:
- комплексной оценкой биологического влияния наночастиц на такие важнейшие типы клеток, как первичные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и мононуклеарных клеток крови (МНК) - лимфоцитов; ММСК - стромальные клетки-предшественники (называемые также мезенхимальными стволовыми клетками) являются принципиальными клеточными элементами физиологической тканевой регенерации и репарации тканей; МНК - это высокоспециализированные, дифференцированные клетки, определяющие иммунный ответ организма на чужеродные воздействия; ММСК и МНК представляют собой популяции, которые распространены по всему организму, таким образом, оценка in vitro воздействия наночастиц на клетки системы тканей внутренней среды позволит охарактеризовать возможный биомедицинский риск использования наночастиц на уровне всего организма в целом;
- целесообразностью разработки способа определения биологического влияния наночастиц на ММСК и МНК посредством оценки in vitro спектра параметров, характеризующих показатели жизнедеятельности клеток: жизнеспособность, пути клеточной гибели, энергетический потенциал и система деградации эндоцитированных продуктов (цитотоксичность; продукция активных форм кислорода (АФК); некротические и апоптотические пути клеточной гибели; нарушение функций митохондрий; изменение лизосомального компартмента, внутриклеточное накопление наночастиц);
- целесообразностью определения биологического влияния на ММСК и МНК наночастиц вида: наночастицы диоксида кремния (SiO2), наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами серебра (Ag+) или ионами церия (Ce3+) (для проявления антимикробного и антиоксидантного эффекта в готовых продуктах), которые используются для медицинских, фармакологических, косметологических и технических целей.
При анализе известного уровня техники не выявлено технических решений с совокупностью признаков, соответствующих настоящему изобретению и обеспечивающих описанный выше результат.
Приведенный анализ известного уровня техники свидетельствует о соответствии заявляемого технического решения критериям изобретения «новизна», «изобретательский уровень».
Настоящее изобретение может быть реализовано при использовании известных технологических процессов, оборудования и материалов, используемых в фармакологии и медицине.
Осуществление изобретения
Изобретение поясняется рисунками и таблицами.
Рис.1. Оценка жизнеспособности ММСК после воздействия наночастиц.
Рис.2. Оценка нарушений функций митохондрий ММСК после воздействия наночастиц.
Рис.3. Оценка производства активных форм кислорода (АФК) в ММСК после воздействия наночастиц.
Рис.4. Оценка состояния лизосомального компартмента ММСК после воздействия наночастиц.
Таблица 1. Оценка соотношения апоптотических и некротических ММСК после воздействия наночастиц.
Таблица 2. Оценка внутриклеточного накопления наночастиц по изменению светорассеяния ММСК.
Рис.5. Оценка жизнеспособности МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.
Рис.6. Оценка нарушений функций митохондрий МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.
Рис.7. Оценка производства активных форм кислорода (АФК) в МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.
Рис.8. Оценка состояния лизосомального компартмента МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.
Таблица 3. Оценка соотношения апоптотических и некротических МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.
Таблица 4. Оценка внутриклеточного накопления наночастиц по изменению светорассеяния МНК (лимфоцитами).
Для реализации изобретения используют применяемые в биотехнологии приборы и оборудование: ламинарный шкаф (ВЛ22, Сампо, Россия); CO2-инкубатор (Sanyo, Япония); световой фазово-контрастный инвертированный микроскоп Leica DM IL (Германия); флуоресцентный фазово-контрастный микроскоп Leica DM5000B (Германия), оснащенный ртутной лампой НВО 100АС, наборами фильтров для анализа флуоресценции UV (ВР 340-380, LP 425), UV/V (BP 355-425, LP 470), FITC (BP 450-490, LP 520), TRITC (BP 510-560, LP 590), камерой и системой анализа изображения DC420 (Leica, Германия); встряхиватель Вортекс (Elmi, Латвия); центрифуга Eppendorf 5204 R (Eppendorf, Германия); водяная баня (BioSan); проточный цитофлуориметр Coulter Epics XL (Beckman Coulter, США); автоматические пипетки (Eppendorf, Германия); гемоцитометр (Bright Line, США); холодильник (Indesit, Россия) и низкотемпературный холодильник (Sanyo, Япония).
Для реализации изобретения используют материалы и вещества:
- флуоресцентный маркер - 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA) (Invitrogen GmbH, Германия);
- набор маркеров Annexin V (аннексии V-FITC, пропидий-йодид (PI), связывающий буфер) [фирма Immunotech, Франция, Invitrogen (Molecular Probes), США];
- флуоресцентный потенциал - зависимый маркер МитоТрекер Красный (MitoTracker Red 580) [фирма Invitrogen (Molecular Probes), США, Invitrogen GmbH, Германия];
- реагент МТТ-теста - 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида [фирма ICN Pharmaceutical, США];
- флуоресцентный маркер - пропидий-йодид (Propidium Iodide, PI) [Sigma, США];
- флуоресцентный рН-зависимый маркер ЛизоТрекер Зеленый (LysoTracker Green DND-26) [фирма Invitrogen GmbH, Германия];
- апротонный растворитель - диметилсульфоксид (CH3)2SO (Компания «Биолот», Россия);
- фетальная (эмбриональная) телячья сыворотка (ФТС/FBS) [фирма HyClone, США, PromoCell, Германия];
- ростовая (питательная) среда α-MEM (фирма ICN Pharmaceutical, США) (для культуры ММСК);
- ростовая (питательная) среда RPMI-1640 (ИПВЭ имени М.П.Чумакова РАМН, Россия) (для культуры МНК);
- фосфатно-солевой буфер (ФСБ/PBS) [фирма Gibco, Великобритания];
- раствор: трипсин-ЭДТА (Trypsin-EDTA) [фирма Gibco, Великобритания];
- коллагеназа IA [фирма Sigma-Aldrich, США];
- градиент плотности Ficoll Histopaque [фирма Sigma, США];
- деионизованная вода [Компания «Сигма Тек», Россия].
Для реализации изобретения используют наночастицы:
1. Наночастицы диоксида кремния (SiO2) с размером частиц 5-12 нм
Внешний вид - белый порошок с удельной поверхностью 300±30 m2/g (DIN ISO 9277), гидрофильный, средний размер частиц 7 нм (nm). Торговая марка продукта AEROSIL® 30, производитель - Evonik Degussa GmbH, Германия.
Перед проведением тестов in vitro готовят исходную 1,0%-ную (10 мг/мл) водную суспензию наночастиц диоксида кремния (SiO2). Для приготовления водной суспензии наночастиц используют стерильную деионизованную воду.
2. Наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами серебра (Ag+), с размером частиц 20-200 нм, торговая марка Moonclay®
Наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами серебра (Ag+), получают по способу, согласно патенту RU №2330673 «Способ получения антимикробного препарата» (опубликованному 10.08.2008), разработчик и патентообладатель - ЗАО «Институт прикладной нанотехнологи» (Россия).
Способ получения наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами серебра (Ag+), заключается в модификации неорганического минерала с кремне- и алюмокислородными соединениями, а именно бентонита Na-формы, неорганической солью металла в полярном растворителе.
Перед модификацией бентонит обогащают ионами Na+ путем обработки его 3-10% водным раствором хлористого натрия с последующией промывкой и фильтрованием полученного полуфабриката.
Бентонит модифицируют 10-20% раствором неорганической соли металла, в качестве которого используют нитрат серебра (AgNO3).
Производят выдержку модифицируемого бентонита в указанном солевом растворе в течение 12-24 ч, а затем очистку модифицированного бентонита от солей натрия путем его промывки и фильтрации и после сушки (при температуре не выше 100°С) полученный препарат измельчают до дисперсности частиц 20-150 нм.
Обработку бентонита раствором нитрата серебра (AgNO3) производят при соотношении, вес.ч.: бентонит:раствор, как 1:(10-40).
В качестве бентонита Na-формы используют бентонит Саригюхского месторождения (Армения).
В качестве полярного растворителя используют воду или водно-спиртовой раствор.
Перед проведением тестов in vitro готовят исходную 1%-ную (10 мг/мл) водную суспензию наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами серебра (Ag+). Для приготовления водной суспензии наночастиц использовалась стерильная деионизованная вода.
3. Наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами церия (Ce3+), с размером частиц 20-200 нм
Наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами церия (Ce3+), получают при модификации неорганического минерала с кремне- и алюмокислородными соединениями, а именно бентонита Na-формы, неорганической солью металла в полярном растворителе.
Перед модификацией бентонит обогащают ионами Na+ путем обработки его 3-10% водным раствором хлористого натрия с последующей промывкой и фильтрованием полученного полуфабриката.
Бентонит модифицируют 10-20% раствором неорганической соли металла, в качестве которого используют азотнокислую соль церия (Се(NO3)3·6H2O).
Производят выдержку модифицируемого бентонита в указанном солевом растворе в течение 12-24 ч, а затем очистку промодифицированного бентонита от солей натрия путем его промывки и фильтрации и после сушки (при температуре не выше 100°С) полученный препарат измельчают до дисперсности частиц 20-150 нм.
Обработку бентонита раствором азотнокислой солью церия (Се(NO3)3·6H2O) производят при соотношении, вес.ч.: бентонит:раствор, как 1:(10-40).
В качестве бентонита Na-формы используют бентонит Саригюхского месторождения (Армения).
В качестве полярного растворителя используют воду или водно-спиртовой раствор.
Перед проведением тестов in vitro готовят исходную 1%-ную (10 мг/мл) водную суспензию наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами церия (Се3+). Для приготовления водной суспензии наночастиц использовалась стерильная деионизованная вода.
Заданные по настоящему изобретению исходные 1,0%-ные суспензии тестируемых наночастиц в деионизованной воде наиболее оптимальны по условию образования устойчивых концентрированных дисперсионных систем, необходимых для оценки влияния наночастиц на клетки тест-культур. При увеличении концентрации наночастиц в деионизованой воде возможен процесс осаждения наночастиц, при уменьшении концентрации наночастиц в деионизованой воде усложняется последующий процесс по оценке их биологического влияния на исследуемые клетки тест-культур.
Для проведения тестов in vitro 1,0%-ные водные суспензии наночастиц диоксида кремния (SiO2), наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами серебра (Ag+), наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами церия (Ce3+), добавляют в соответствующие ростовые среды для приготовления суспензий тестируемых наночастиц.
При приготовлении суспензий наночастиц используют исходные 1,0%-ные водные суспензии наночастиц и ростовые среды (α-МЕМ для культуры ММСК и RPMI-1640 для культуры МНК) при их соотношении: 1:100; 1:1000; 1:10000 с получением суспензий наночастиц с концентрацией от 1·10-2 до 1·10-4 мас.%.
Конкретно для получения суспензий вышеназванных наночастиц используют на 10 мл:
- при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.%: ростовая среда - 9,9 мл; 1,0%-ная водная суспензия наночастиц - 0,1 мл;
- при концентрации наночастиц 1·10-3 мас.%: ростовая среда - 9,99 мл; 1,0%-ная водная суспензия наночастиц - 0, 01 мл;
- при концентрации наночастиц 1·10-4 мас.%: ростовая среда - 9,999 мл; 1,0%-ная водная суспензия наночастиц - 0,001 мл.
Используемые в среде тест-культур суспензии наночастиц при указанной их концентрации наиболее достоверно определяют процесс влияния тестируемых наночастиц на показатели внутриклеточного метаболизма, что и подтверждается нижеприведенным описанием.
Для реализации изобретения используют клетки тест-культур:
1. Первичные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК)
ММСК - стромальные клетки-предшественники (называемые также мезенхимальными стволовыми клетками), являются клеточными элементами физиологической тканевой регенерации и репарации тканей. ММСК являются субстратзависимыми (адгезионными) культурами клеток.
ММСК выделяют из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека (из подкожной жировой клетчатки). Для получения первичной культуры ММСК используют способ, изложенный в патенте RU №2351649 «Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата» (опубликовано 10.04.2009), разработчик и патентообладатель - ГНЦ РФ «Институт медико-биологических проблем» РАН, и методологию, описанную в работе - Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 2002, Vol.13, pp.4279-4295.
Первоначально жировую ткань дважды отмывают от крови фосфатным буфером. Для этого в центрифужную пробирку помещают жировую ткань и доводят объем пробирки до 50 мл фосфатно-солевым буфером так, чтобы соотношение объема жировой ткани и буфера было 1:2. Полученную смесь центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 600 g (1000 об/мин). Затем проводят ферментативную дезагрегацию ткани. Для этого после отмывки жировую ткань взвешивают, добавляют раствор коллагеназы IA до конечной концентрации 0,075% и инкубируют 30 мин на водяной бане при 37°С, периодически встряхивая. Затем фермент инактивируют равным объемом полной ростовой среды, содержащей 10% ФТС, и центрифугируют 10 мин при ускорении 600 g (1000 об/мин).
Получают осадок, представляющий собой стромально-васкулярную фракцию клеток, содержащую ММСК. Осадок ресуспендируют в ростовой среде (α-МЕМ) и пропускают через 100-мкм клеточные фильтры. ММСК из полученной суспензии получают путем их адгезии к пластику. Для этого полученную клеточную суспензию помещают в чашки Петри, плотность посадки составляет 3·103 клеток/см2. Через 24 часа неприкрепившиеся клетки удаляют, первичную культуру промывают фосфатным буфером и добавляют свежую полную среду роста (α-МЕМ + 10% ФТС (FBS)). После достижения 80-90% конфлуентности (степени смыкания монослоя клеток) ММСК пассируют. В исследовании используют клетки 2-4 пассажей.
При субкультивировании полученные ММСК рассаживают в культуральные флаконы с ростовой средой (α-МЕМ + 10% ФТС (FBS)) с плотностью 2·104 клеток/см2 и после достижения 70-80% конфлуентности (степени смыкания монослоя клеток) в них вводят суспензии тестируемых наночастиц.
Клетки без наночастиц, инкубировавшиеся в тех же условиях, используют для определения исходных (контрольных) значений изучаемых показателей.
После 24 часов инкубации готовят пробы для анализа исследуемых показателей (см. ниже).
2. Первичные культуры мононуклеарных клеток крови (МНК) - лимфоциты
МНК - дифференцированные клетки, определяющие иммунный ответ организма на чужеродные воздействия. МНК являются суспензионными культурами клеток.
Лимфоциты (лейкоциты) выделяют из периферической крови человека (здоровых доноров) методом центрифугирования. Процесс получения культуры мононуклеарных клеток крови (МНК) осуществляют по Протоколу фирмы Amersham BioSciences (UK).
Для этого кровь, собранную в пробирки с 3,8% раствором цитрата натрия, центрифугируют 25 мин при ускорении 1800 g (3000 об/мин). Плазму крови сливают, к форменным элементам добавляют фосфатный буфер до исходного объема крови и тщательно ресуспендируют. Полученную суспензию аккуратно наслаивают на Ficoll Pague Plus в соотношении 2,5:1 и центрифугируют 40 мин при 1800 g (3000 об/мин). Интерфазное кольцо, представленное мононуклеарной фракцией клеток крови, собирают и отмывают трижды в фосфатном буфере.
После выделения МНК по Протоколу, описанному выше, подсчитывают количество клеток в гемацитометре, ресуспендируют в ростовой среде RPMI-1640 + 5% ФТС (FBS) из расчета 1×106 клеток/мл, в которые вводят суспензии исследуемых наночастиц. Систему инкубируют 24 часа.
МНК представляют собой суспензионную культуру, в которой клетки достаточно быстро седиментируют на дно культурального флакона. В связи с этим для улучшения контакта клеток с тестируемыми наночастицами порядок инкубации МНК с наночастицами осуществляют в термостате (37°С) на горизонтальном шейкере, обеспечивающем непрерывное перемешивание среды.
Клетки тест-культур без наночастиц, инкубировавшиеся в тех же условиях, используют для определения исходных значений изучаемых показателей. После окончания инкубации готовят пробы для анализа исследуемых показателей (см. ниже).
Для реализации изобретения используют известные при цитологических исследованиях методы и тесты для измерения исследуемых показателей:
1. Метод проточной цитофлуориметрии
Измерение показателей, выбранных для оценки влияния наночастиц на состояние системы клеточных органелл, проводится методом проточной цитофлуориметрии.
Метод проточной цитофлуориметрии основан на пропускании суспензии клеток по капилляру через зону чувствительности прибора, скорость прохождения клеток через капилляр около 1000 клеток/сек, в зоне чувствительности прибора находится не более одной клетки, клетки поочередно пересекают сфокусированный луч света, который используется для возбуждения флуоресценции. При помощи светочувствительных датчиков (фотодиодов и фотоэлектронных умножителей) регистрируются поглощение и рассеивание света (прямое светорассеяние под углом 0,5-2° и угловое (боковое) светорассеяние под углом 90°) клеткой, а также флуоресценция маркеров (красителей), связанных с клеткой. Используется проточный цитофлуориметр Beckman Coulter Epics XL (США).
Полученная информация представляется в виде частотных гистограмм распределения, которые представлены на приведенных в описании рисунках.
2. Оценка цитотоксичности по жизнеспособности клеток методом МТТ-теста и способом маркировки пропидием-йодида (PI)
При тестировании оценивают количество живых клеток (при воздействии наночастиц). Принцип метода МТТ-теста (Протокол фирмы Invitrogen (Molecular Probes), США) основан на способности фермента сукцинатдегидрогеназы митохондриальной мембраны клеток млекопитающих восстанавливать желтую соль 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) до кристаллов формазана фиолетового цвета, накапливающихся в результате этой реакции в цитоплазме живых клеток. По интенсивности накопления кристаллов формазана в цитоплазме судят об уровне митохондриального дыхания клетки, что является показателем ее жизнеспособности. Количество образуемого формазана в клеточном монослое пропорционально имеющемуся количеству живых клеток. Формазан экстрагируется из клеток апротонным растворителем ДМСО - диметилсульфоксидом ((СН3)2SO). Интенсивность окраски раствора пропорциональна количеству живых клеток и определяется колориметрически.
Непосредственно перед использованием готовят рабочий раствор МТТ (1,5 мг/мл 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид) на ростовой среде. Клетки инкубируют 2 часа в рабочем растворе МТТ в стандартных условиях (+37°С, 5% CO2). Останавливают реакцию удалением раствора, добавляют ДМСО и помещают клетки на 15 минут на шейкер при 150 об/мин. Интенсивность окраски измеряют на спектрофотометре при λ=540 нм.
Метод МТТ-теста рассчитан на исследование адгезионных клеточных культур, поэтому метод по настоящему изобретению используется для исследования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК).
Первичная культура мононуклеарных клеток крови (МНК) - лимфоцитов представляет собой суспензию клеток, что усложняет оценку цитотоксичности наночастиц с помощью стандартного МТТ-теста. В связи с этим цитотоксичность оценивают, выявляя живые МНК с помощью маркировки (окраски) клеток пропидием-йодида (PI). Результаты окрашивания МНК оценивают на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Epics XL (США).
3. Выявление нарушений функций митохондрий клеток
Нарушения функций митохондрий клеток, согласно Протоколу фирмы Invitrogen (Molecular Probes), CШA, выявляют по изменению трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) тестируемых клеток с помощью флуоресцентного потенциалзависимого маркера (красителя) МитоТрекер Красный (MitoTracker Red 580) (λвозбуждения=581 нм, λиспускания=644 нм) с определением количества окрашенных клеток и средней интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре. МитоТрекер в конечной концентрации 0,5 мМ добавляют к исследуемым клеткам тест-культур соответственно, содержащих суспензии с тестируемыми наночастицами, и к контрольным образцам исследуемых клеток тест-культур, не содержащих наночастицы. В стандартных условиях (+37°С, 5% CO2) исследуемые образцы инкубируют в течение 1 час, затем трижды отмывают ФСБ, снимают с пластика раствором трипсина - ЭДТА, суспензию центрифугируют 10 мин при 500 g, осадок ресуспендируют в ФСБ и анализируют на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Epics XL (США).
4. Выявление производства активных форм кислорода (АФК) в клетках
Для выявления производства АФК в клетках при воздействии наночастиц, согласно Протоколу фирмы Invitrogen (Molecular Probes), США, используют флуоресцентный маркер - дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA) (10 мкг/мл) с определением количества окрашенных клеток и интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре. H2DCF-DA представляет собой бесцветный эфир, который при взаимодействии с АФК превращается во флуоресцирующий продукт - H2DCF. Этот продукт визуализируется и по интенсивности его флуоресценции оценивают количество АФК в клетках. При исследовании внутриклеточного уровня АФК добавляли H2DCF-DA в клеточную среду культивирования за 30 минут до проведения определения уровня АФК, затем клетки дважды промывали средой с сывороткой.
Для анализа на проточном цитофлуориметре мононуклеарные клетки крови (МНК) - лимфоциты ресуспендировали в фосфатном буфере.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) открепляли от пластика раствором трипсина - ЭДТА. Суспензии центрифугировали 10 мин при ускорении 500 g, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере.
Методом проточной цитофлуориметрии определяют производство активных форм кислорода (АФК) в клетках после воздействия наночастиц.
5. Определение состояния лизосомального компартмента клеток
Принцип компартментализации клеток свидетельствет о том, что биохимические процессы в клетке локализованы в определенных отсеках - компартментах. Большинство органоидов в клетках являются компартментами, в т.ч. лизосомы.
Выявление лизосом в клетках (при воздействии наночастиц) и оценку интенсивности флуоресценции (свидетельствующей об активности лизосом) проводят с использованием флуоресцентного рН-зависимого маркера (красителя) LysoTracker Green DND-26 (λвозбуждения=504 нм, λиспускания=511 нм) в рабочей концентрации 50 нМ, согласно Протоколу фирмы Invitrogen (Molecular Probes), США. Клетки инкубируют с ЛизоТрекером 1 час в стандартных условиях (+37°С, 5% CO2) и анализируют на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Epics XL (США).
6. Выявление соотношения апоптотических и некротических клеток
Для оценки воздействия наночастиц на клетки применяется набор маркеров (красителей) Aimexin V (аннексии V-FITC, пропидий-йодид (PI), связывающий буфер), позволяющий выявлять одновременно апоптотические и некротические клетки, согласно Протоколу фирмы Immunotech, Франция. Аннексии V в присутствии ионов Ca2+ и Mg2+ взаимодействует с фосфатидилсерином, который на ранних стадиях апоптоза переходит с внутренней мембраны клетки на наружную. Клеточная мембрана живых клеток непроницаема для пропидий-йодида (PI). Однако при необратимом повреждении клетки (некроз) пропидий-йодид проходит через клеточную мембрану и взаимодействует с малой бороздкой дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Двойное окрашивание аннексином V и пропидий-йодидом свидетельствует о поздних стадиях апоптоза.
Непосредственно перед использованием готовят рабочий раствор - 84 мкл дистиллированной воды, 10 мкл холодного 10х буфера, 5 мкл пропидий-йодида, 1 мкл аннексина V на 100 мкл раствора. Клетки промывают холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и инкубируют в растворе 15 мин при +4°С или на льду без доступа света. Затем клетки промывают ростовой средой и анализируют во флуоресцентном фазово-контрастном микроскопе Leica DM5000B (фильтр ВР 450-490, LP 520 для аннексина V; фильтр ВР 510-560, фильтр LP 590 для пропидий-йодида). Для анализа на проточном цитофлуориметре клетки снимают с пластика раствором: 0,05% трипсина - 0,04% ЭДТА, трижды отмывают ФСБ и окрашивают клеточную суспензию. Результаты окрашивания оценивают на проточном цитофлуориметре. Используют проточный цитофлуориметр Beckman Coulter Epics XL (США). Методом проточной цитофлуориметрии определяют долю живых клеток, некротических и апоптотических клеток (соотношение некротических и апоптопических путей гибели клеток) после воздействия наночастиц.
7. Оценка внутриклеточного накопления наночастиц по выявлению клеток с измененным светорассеянием
О внутриклеточном накоплении наночастиц судят по появлению клеток с измененным боковым светорассеянием. Используют проточный цитофлуориметр Beckman Coulter Epics XL (США). Высокочувствительные датчики цитофлуориметра, расположенные вблизи проточной ячейки, фиксируют рассеивание света под углом от 2 до 19°, которое называется прямым или малоугловым светорассеянием (FSC), и под углом 90° - боковое светорассеяние (SSC). SSC (side scatter) - показатель бокового светорассеяния, который отражает оптическую неоднородность цитоплазмы клеток, характер клеточных включений и «гранулярность» клетки.
Для реализации изобретения были проведены исследования in vitro для определения влияния тестируемых наночастиц на клетки тест-культур
При проведении измерений исследуемых показателей (см. вышеуказанные пункты 1-7) были использованы образцы первичных культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и мононуклеарных клеток - лимфоцитов (МНК) с суспензиями тестируемых наночастиц по примерам:
Для ММСК тест-культур измерения проводят на образцах в соответствии с примерами 1-3:
Пример 1. В культуральных флаконах (по 5 мл ростовой среды в каждом) содержатся ММСК тест-культуры и суспензии наночастиц SiO2 соответственно при концентрации наночастиц в суспензиях: 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.%.
Пример 2. В культуральных флаконах (по 5 мл ростовой среды в каждом) содержатся ММСК тест-культуры и суспензии с наночастиц бентонита, интеркалированного ионами церия (Ce3+), соответственно при концентрации наночастиц в суспензиях: 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.%.
Пример 3. В культуральных флаконах (по 5 мл ростовой среды в каждом) содержатся ММСК тест-культуры и суспензии наночастиц бентонита, интеркалированного ионами серебра (Ag+), соответственно при концентрации наночастиц в суспензиях: 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.%.
Для МНК тест-культур измерения проводят на образцах в соответствии с примерами 4-6:
Пример 4. В культуральных флаконах (по 5 мл ростовой среды в каждом) содержатся МНК тест-культуры и суспензии наночастиц SiO2 соответственно при концентрации наночастиц в суспензиях: 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.%.
Пример 5. В культуральных флаконах (по 5 мл ростовой среды в каждом) содержатся МНК тест-культуры и суспензии наночастиц бентонита, интеркалированного ионами церия (Ce3+), соответственно при концентрации наночастиц в суспензиях: 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.%.
Пример 6. В культуральных флаконах (по 5 мл ростовой среды в каждом) содержатся МНК тест-культуры и суспензии наночастиц бентонита, интеркалированного ионами серебра (Ag+), соответственно при концентрации наночастиц в суспензиях: 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.%.
При проведении исследований используют контрольные образцы первичных культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и мононуклеарных клеток (МНК) - лимфоцитов по примерам 7 и 8.
Пример 7. В культуральном флаконе содержится ММСК тест-культуры (без наночастиц), ростовая среда - 4,95 мл и деионизованная вода - 50 мкл.
Пример 8. В культуральном флаконе содержится МНК тест-культуры (без наночастиц), ростовая среда - 4,95 мл и деионизованная вода - 50 мкл.
В соответствии с примерами 1-8 для определения влияния тестируемых наночастиц на первичные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), выделенные из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека, и мононуклеарные клетки (МНК) - лимфоциты, выделенные из периферической крови человека, были проведены тесты in vitro по показателям (см. пункты 1-7), а именно: по жизнеспособности клеток (цитотоксичность); по нарушению функций митохондрий клеток; по производству активных форм кислорода (АФК); по определению состояния лизосомального компартмента клеток; по определению соотношения некротических и апоптотических клеток; по внутриклеточному накоплению наночастиц с применением для этих целей флуоресцентных маркеров (красителей) и проточной цитофлуориметрии.
Используемые для реализации тестов in vitro приборы и оборудование, материалы и вещества, методы и тесты, тестируемые наночастицы и клетки тест-культур и способы их получения описаны выше.
На рисунках 1-8 и в таблицах 1-4 приведены результаты измерений указанных выше показателей (см. выше пункты 1-7). Приведены результаты репрезентативного эксперимента для каждого из тестируемых образцов (n=3) по примерам 1-8.
Результаты исследований по оценке жизнеспособности ММСК тест-культур представлены на рис.1.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на жизнеспособность ММСК определяли в соответствии с пунктом 2.
При исследовании установлено, что все тестируемые наночастицы по примерам 1-3 при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.% проявляют цитотоксичность, при этом для наночастиц по примеру 1 снижение жизнеспособности клеток (количества живых клеток, %) составляет около 25%, тогда как для наночастиц по примерам 2 и 3 снижение жизнеспособности составляет почти 75%.
Исследование наночастиц по примерам 1-3 при концентрации тестируемых наночастиц 1·10-3 мас.% и 1·10-4 мас.% показывает, что уменьшение концентрации наночастиц приводит к увеличению (сохранению) жизнеспособности клеток практически до исходного уровня, соответствующего жизнеспособности контрольного образца (пример 7).
Результаты исследований по оценке нарушений функций митохондрий ММСК представлены на рис.2.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на функции митохондрий ММСК определяли в соответствии с пунктом 3.
При исследовании установлено, что наночастицы по примеру 1 не влияют на количество ММСК, в которых выявляются (детектируются) митохондрии (клетки, окрашенные MitoTracker, %). Однако при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.% по примеру 1 отмечается достоверное снижение средней интенсивности внутриклеточной флуоресценции маркера (MitoTracker/кл, усл.ед.), что свидетельствует об уменьшении трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) тестируемых клеток.
При исследовании установлено, что наночастицы по примерам 2 и 3 при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.% вызывают уменьшение доли ММСК, в которых выявляются митохондрии (клетки, окрашенные MitoTracker, %), а их трансмембранный потенциал (ΔΨm) снижался дозозависимо при увеличении концентрации тестируемых наночастиц.
Результаты исследований по оценке производства активных форм кислорода (АФК) в ММСК представлены на рис.3.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на производство активных форм кислорода (АФК) в ММСК определяли в соответствии с пунктом 4.
При исследовании установлено, что по примерам 1-3 доля ММСК (клетки, окрашенные H2DCF-DA, %), в которых детектировались активные формы кислорода (АФК), была невелика и не превышала 3%. По примерам 2 и 3 доля ММСК (клетки, окрашенные H2DCF-DA, %), в которых детектировались активные формы кислорода (АФК), дозозависимо уменьшалась при снижении концентрации наночастиц.
По примеру 1 доля ММСК (клетки, окрашенные H2DCF-DA, %), в которых детектировались активные формы кислорода (АФК), была больше при концентрации наночастиц 1·10-3 мас.% (по сравнению с примерами 2 и 3).
Значимого изменения средней интенсивности флуоресценции маркера (H2DCF-DA/кл, усл.ед.) в ММСК не обнаружено.
Результаты исследований по оценке состояния лизосомального компартмента ММСК представлены на рис.4.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на состояние лизосомального компартмента ММСК определяли в соответствии с пунктом 5.
При исследовании установлено, что по примерам 1, 2 и 3 при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.% наблюдается значительное увеличение количества ММСК, в которых детектируются лизосомы (клетки, окрашенные LisoTracker, %), при концентрации наночастиц 1·10-3 мас.% этот эффект был менее выраженным. Количество детектируемых лизосом дозозависимо уменьшается при снижении концентрации наночастиц.
Средняя интенсивность внутриклеточной флуоресценции лизосомального маркера (LisoTracker/кл, усл.ед.) не изменялась или незначительно колебалась относительно значений в контроле (пример 7) при всех исследованных концентрациях наночастиц.
Результаты исследований по оценке соотношения апоптотических и некротических ММСК представлены в таблице 1.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на соотношение апоптотических и некротических ММСК определяли в соответствии с пунктом 6.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примеру 1 при концентрации 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.% практически (значимо) не оказали влияния на живые клеток (живые клетки, %). Отношение некроз/апоптоз (пример 1) находилось в пределах от 3,2 до 4,4, а для контрольного примера 7 (без наночастиц) отношение некроз/апоптоз - 4,3.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примерам 2 и 3 при концентрации 1·10-2 мас.% индуцировали значительное уменьшение доли живых клеток (%).
Необходимо отметить, что основным путем клеточной гибели был некроз, как без воздействия наночастиц (пример 7), так и после воздействия наночастиц (примеры 1-3).
Отношение некроз/апоптоз существенно увеличивалось после воздействия наночастиц на клетки по примерам 2 и 3 при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.% (по примеру 3) и при концентрации наночастиц 1·10-3 мас.% (по примерам 2 и 3).
Результаты исследований по оценке внутриклеточного накопления наночастиц по изменению светорассеяния ММСК представлены в таблице 2.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на внутриклеточное накопление наночастиц по изменению светорассеяния ММСК определяли в соответствии с пунктом 7.
Внутриклеточное накопление наночастиц диагностируют по появлению клеток с измененным (увеличенным) светорассеянием.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примеру 1 при концентрации 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.% не вызывают увеличения светорассеяния клеток. Количество клеток с неизменным светорассеянием находится в пределах: 99,5-99,9%, а для контрольного примера 7 (без наночастиц) - 99,8%.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примерам 2 и 3 при концентрации 1·10-2 мас.% приводят к появлению клеток с изменившимся светорассеянием, доля которых составляла не более 15% тестируемых клеток.
Результаты исследований по оценке жизнеспособности МНК (лимфоцитов) представлены на рис.5.
Влияние тестируемых наночастиц на жизнеспособность МНК определяли в соответствии с пунктом 2.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы (НЧ) по примеру 4 при концентрации 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.% не оказывали влияния на жизнеспособность клеток.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примеру 6 при концентрации 1·10-2 мас.% оказывали цитотоксическое действие (количество живых клеток составляло около 75%).
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примеру 5 при концентрации 1·10-2 мас.% приводили к гибели 3/4 общей популяции клеток.
Цитотоксический эффект при уменьшении концентрации тестируемых наночастиц снижался дозозависимо (примеры 5 и 6).
Результаты исследований по оценке нарушений функций митохондрий МНК (лимфоцитов) представлены на рис.6.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на функции митохондрий МНК определяли в соответствии с пунктом 3.
При исследовании установлено, что митохондрии клеток (клетки, окрашенные MitoTracker, %) выявляются (детектируются) в 100% живых клеток независимо от вида наночастиц (примеры 4, 5 и 6) и концентрации наночастиц: 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.%.
При этом средняя интенсивность внутриклеточной флуоресценции маркера (MitoTracker/кл, усл.ед.), свидетельствующая об изменении (уменьшении) трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm), значительно варьировалась в зависимости от вида наночастиц и их концентрации (примеры 4, 5 и 6).
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примеру 4 при концентрации 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.% значимо не влияли на трансмембранный потенциал митохондрий.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примеру 5 при концентрации 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.% вызывали дозозависимое снижение трансмембранного потенциала митохондрий. Средняя интенсивность внутриклеточной флуоресценции маркера (MitoTracker/кл, усл.ед.) по примеру 5 при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.% составляла около 18 усл.ед., в контроле (без наночастиц) (пример 8) - около 75 усл.ед.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примеру 6 при концентрации 1·10-2 мас.% вызывали понижение трансмембранного потенциала митохондрий, а более низкие концентрации оказывали меньший эффект, но исходный (контрольный) уровень трансмембранного потенциала клеток не достигался.
Результаты исследований по оценке производства активных форм кислорода (АФК) в МНК (лимфоцитов) представлены на рис.7.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на производство активных форм кислорода (АФК) в МНК определяли в соответствии с пунктом 4.
При исследовании установлено, что по примеру 4 выявлено увеличение количества активных форм кислорода (АФК), детектированных в клетках (интенсивность флуоресценции маркера H2DCF-DA/кл, усл.ед.) при всех концентрациях тестируемых наночастиц.
При исследовании установлено, что по примеру 5 наночастицы не влияли на количество АФК в клетках.
При исследовании установлено, что по примеру 6 выявлено уменьшение АФК в клетках (по сравнению с контролем) при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.%, в меньших концентрациях уровень АФК примерно соответствовал уровню АФК в контроле (без наночастиц) (пример 8).
Результаты исследований по оценке состояния лизосомального компартмента МНК (лимфоцитов) представлены на рис.8.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на состояние лизосомального компартмента МНК определяли в соответствии с пунктом 5.
При исследовании установлено, что лизосомы клеток (клетки, окрашенные LisoTracker, %) выявляются (детектируются) в 100% живых клеток независимо от вида тестируемых наночастиц (примеры 4, 5 и 6) и концентрации наночастиц: 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.%.
Средняя интенсивность внутриклеточной флуоресценции лизосомального маркера (LisoTracker/кл, усл.ед.), свидетельствующая об активности лизосом, незначительно варьировалась относительно значений в контроле (пример 8) при всех исследованных концентрациях наночастиц. Однако отмечается увеличение активности лизосом по примеру 4 и некоторое снижении их активности по примеру 6 при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.%.
Результаты исследований по оценке соотношения апоптотических и некротических МНК (лимфоцитов) представлены в таблице 3.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на соотношение апоптотических и некротических МНК определяли в соответствии с пунктом 6.
Необходимо отметить, что основным путем клеточной гибели был апоптоз, как без воздействия наночастиц (пример 8), так и после воздействия наночастиц (примеры 4-6), причем клетки в контроле (без наночастиц) (пример 8) также демонстрировали достаточно высокий уровень апоптотической гибели.
При исследовании установлено, что по примеру 4 наночастицы значимо не влияли на долю апоптотических клеток, которая находилась в пределах 15,1-16,5%. По примерам 5 и 6 наночастицы при концентрации 1·10-2 мас.% дополнительно индуцировали апоптоз в клетках (соответственно - 32,6% и 31,1%).
Необходимо отметить, что при общем низком уровне некротической гибели клеток наночастицы по примеру 5 при концентрации 1·10-2 мас.% и 1·10-3 мас.% индуцировали значительную некротическую гибель клеток (соответственно - 20,7% и 2,3%).
Результаты исследований по оценке внутриклеточного накопления наночастиц по изменению светорассеяния МНК (лимфоцитами) представлены в таблице 4.
Влияние тестируемых наночастиц (НЧ) на внутриклеточное накопление наночастиц по изменению светорассеяния МНК определяли в соответствии с пунктом 7.
Внутриклеточное накопление наночастиц диагностируют по появлению клеток с измененным (увеличенным) светорассеянием.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примеру 4 при концентрации 1·10-2; 1·10-3; 1·10-4 мас.% не вызывают значимого увеличения светорассеяния клеток. Количество клеток с неизмененным светорассеянием находится в пределах: 88,8-90,2%, для контрольного примера 8 (без наночастиц) - 89,1%.
При исследовании установлено, что тестируемые наночастицы по примерам 5 и 6 при концентрации 1·10-2 мас.% приводят к значительному уменьшению клеток с неизмененным светорассеянием (соответственно - 39,2% и 59,9%), а при меньших концентрациях наночастиц (1·10-3 и 1·10-4 мас.%) доля клеток с измененным (увеличенным) светорассеянием уменьшается, возвращаясь к уровню контроля (82,1-83,7%).
Таким образом, разработан способ оценки in vitro биологического влияния тестируемых наночастиц на клетки тест-культур по важнейшим показателям жизнедеятельности клеток.
В качестве клеток тест-культур используются первичные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и мононуклеарных клеток крови (лимфоцитов), которые являются принципиальными клеточными элементами, определяющими физиологическую тканевую регенерации и репарацию, иммунный ответ организма на чужеродные воздействия. Эти важнейшие клеточные популяции позволяют имитировать элементы клеточной системы человека и комплексно оценивать возможный биомедицинский риск воздействия наночастиц на уровне всего организма.
Используемые при реализации изобретения тестируемые наночастицы: наночастицы диоксида кремния (SiO2), наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами серебра (Ag+) или ионами церия (Ce3+), являются перспективными наноматериалами для медицинских, фармакологических, косметологических и технических целей. Тестируемые наночастицы позволяют оценивать различные уровни их биологического воздействия на клетки тест-культур по выбранным показателям жизнедеятельности клеток.
Разработанный способ оценки in vitro биологического влияния тестируемых наночастиц на клетки тест-культур позволяет оценивать влияние вида наночастиц и их концентрации (концентрационный эффект) на показатели жизнедеятельности клеток и принимать решение о возможном биомедицинском риске использования наночастиц.
| Таблица 1 | ||||
| Оценка соотношения апоптотических и некротических ММСК после воздействия наночастиц | ||||
| Концентрация наночастиц, мас.% | Апоптотические клетки, % | Некротические клетки, % | Живые клетки, % | Некроз/Апоптоз |
| Наночастицы - Диоксид кремния (SiO2) (Пример 1) | ||||
| Без НЧ | 1,07±0,14 | 4,59±0,12 | 94,33±10,03 | 4,3 |
| НЧ, 10-2% | 1,48±0,06 | 6,43±0,29 | 92,10±0,23 | 4,4 |
| НЧ, 10-3% | 0,69±0,05 | 4,70±0,28 | 94,60±10,25 | 6,8 |
| НЧ, 10-4% | 1,16+0,18 | 3,76±0,28 | 95,07±10,45 | 3,2 |
| Наночастицы - Бентонит + ионы церия (Ce3+) (Пример 2) | ||||
| Без НЧ | 0,70±0,08 | 1,74±0,34 | 97,57±0,27 | 2,5 |
| НЧ, 10-2% | 9,22±0,56 | 13,71±1,16 | 77,07±11,66 | 1,5 |
| НЧ, 10-3% | 1,11±0,15 | 14,36±0,29 | 84,53±10,32 | 12,9 |
| НЧ, 10-4% | 1,67±0,08 | 3,07±0,12 | 95,27±10,07 | 1,8 |
| Наночастицы - Бентонит + ионы серебра (Ag+) (Пример 3) | ||||
| Без НЧ | 0,25±0,04 | 1,25±0,08 | 98,53±10,12 | 5,0 |
| НЧ, 10-2% | 1,74±0,10 | 31,27±0,42 | 67,03±10,38 | 18,0 |
| НЧ, 10-3% | 0,56±0,03 | 6,84±0,26 | 92,60±10,29 | 12,1 |
| НЧ, 10-4% | 0,45±0,04 | 2,0±30,00 | 97,53±10,03 | 4,5 |
| Таблица 2 | |
| Оценка внутриклеточного накопления наночастиц по изменению светорассеяния ММСК | |
| Концентрация наночастиц, мас.% | Клетки с неизмененным светорассеянием, % |
| Наночастицы - Диоксид кремния (SiO2) (Пример 1) | |
| Без НЧ | 99,8±0,1 |
| НЧ, 10-2% | 99,9±0,0 |
| НЧ, 10-3% | 99,5±0,1 |
| НЧ, 10-4% | 99,7±0,1 |
| Наночастицы - Бентонит + ионы церия (Ce3+) (Пример 2) | |
| Без НЧ | 98,5±0,4 |
| НЧ, 10-2% | 85,5±1,1 |
| НЧ, 10-3% | 95,9±0,1 |
| НЧ, 10-4% | 97,7±0,2 |
| Наночастицы - Бентонит + ионы серебра (Ag+) (Пример 3) | |
| Без НЧ | 98,9±0,3 |
| НЧ, 10-2% | 86,6±0,8 |
| НЧ, 10-3% | 92,8±0,3 |
| НЧ, 10-4% | 97,7±0,1 |
| Таблица 3 | |||
| Оценка соотношения апоптотических и некротических МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц | |||
| Концентрация наночастиц, мас.% | Апоптотические клетки, % | Некротические клетки, % | Апоптоз/Некроз |
| Наночастицы - Диоксид кремния (SiO2) (Пример 4) | |||
| Без НЧ | 15,1±0,27 | 0,6±0,04 | 25,8 |
| НЧ, 10-2% | 16,5±0,35 | 0,6±0,13 | 26,7 |
| НЧ, 10-3% | 16,4±0,29 | 0,4±0,03 | 39,9 |
| НЧ, 10-4% | 15,9±0,25 | 0,6±0,02 | 28,3 |
| Наночастицы - Бентонит + ионы церия (Ce3+) (Пример 5) | |||
| Без НЧ | 23,7±0,40 | 0,2±0,03 | 101,4 |
| НЧ, 10-2% | 32,6±2,17 | 20,7±0,75 | 1,6 |
| НЧ, 10-3% | 20,1±0,17 | 2,3±0,08 | 8,6 |
| НЧ, 10-4% | 20,8±0,19 | 0,7±0,15 | 32,0 |
| Наночастицы - Бентонит + ионы серебра (Ag+) (Пример 6) | |||
| Без НЧ | 19,8±0,60 | 1,3±0,05 | 15,1 |
| НЧ, 10-2% | 31,1±0,50 | 1,1±0,01 | 28,9 |
| НЧ, 10-3% | 22,1±0,65 | 0,9±0,00 | 24,4 |
| НЧ, 10-4% | 22,8±0,76 | 1,1±0,01 | 20,8 |
| Таблица 4 | |
| Оценка внутриклеточного накопления наночастиц по изменении светорассеяния МНК (лимфоцитами) | |
| Концентрация наночастиц, мас.% | Клетки с неизмененным светорассеянием, % |
| Наночастицы - Диоксид кремния (SiO2) (Пример4) | |
| Без НЧ | 89,1±0,12 |
| НЧ, 10-2% | 88,8±0,30 |
| НЧ, 10-3% | 89,9±0,17 |
| НЧ, 10-4% | 90,2±0,15 |
| Наночастицы - Бентонит + ионы церия (Ce3+) (Пример 5) | |
| Без НЧ | 82,1±0,61 |
| НЧ, 10-2% | 39,2±1,04 |
| НЧ, 10-3% | 76,4±0,24 |
| НЧ, 10-4% | 85,2±0,23 |
| Наночастицы - Бентонит + ионы серебра (Ag+) (Пример 6) | |
| Без НЧ | 83,7±0,13 |
| НЧ, 10-2% | 59,9±1,48 |
| НЧ, 10-3% | 82,6±0,70 |
| НЧ, 10-4% | 82,2±0,64 |
Claims (9)
1. Способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур, заключающийся в проведении тестов in vitro клеток тест-культур при инкубировании их с суспензиями тестируемых наночастиц для определения влияния наночастиц на производство активных форм кислорода, образование апоптотических и некротических клеток, нарушение функций митохондрий с использованием цитологических флуоресцентных маркеров с анализом на проточном цитофлуориметре и в оценке влияния наночастиц на исследуемые клетки тест-культур путем сравнения полученных показателей с соответствующими показателями контрольных образцов исследуемых клеток тест-культур, не содержащих тестируемые наночастицы, отличающийся тем, что в качестве клеток тест-культур используют первичные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделяемых из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека, и мононуклеарных клеток - лимфоцитов, выделяемых из периферической крови человека, дополнительно определяют влияние наночастиц на названные клетки тест-культур по цитотоксичности, состоянию лизосомального компартмента, внутриклеточному накоплению тестируемых наночастиц, при проведении тестов in vitro каждый показатель определения влияния наночастиц на клетки тест-культур исследуют при инкубировании их с суспензиями тестируемых наночастиц в ростовой среде в течение 12-36 ч при изменении концентрации тестируемых наночастиц от 1·10-2 до 1·10-4 мас.%, причем для получения суспензий используют 1,0% водные суспензии наночастиц и ростовые среды при их соотношениях: 1:100; 1:1000; 1:10000, и каждый показатель теста in vitro в зависимости от концентрации нананочастиц сравнивают с соответствующим показателем теста in vitro контрольного образца и оценивают влияние наночастиц на жизнедеятельность клеток по полученным показателям.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве тестируемых наночастиц используют диоксид кремния (SiO2) с размером частиц 5-12 нм; наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированные ионами серебра (Ag+), с размером частиц 20-200 нм, наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированные ионами церия (Се3+), с размером частиц 20-200 нм.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении тестов in vitro для определения влияния наночастиц на производство активных форм кислорода в клетках тест-культур используют флуоресцентный маркер - дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA) с определением количества окрашенных клеток и интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выявления апоптотических и некротических клеток в клетках тест-культур используют набор маркеров Annexin V с анализом тестируемых клеток на проточном цитофлуориметре.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что показатель нарушения функций митохондрий выявляют по изменению трансмембранного потенциала митохондрий клеток тест-культур при использовании флуоресцентного потенциал - зависимого маркера МитоТрекер Красный (MitoTracker Red 580) с определением интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что показатель цитотоксичности тестируемых наночастиц при воздействии на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки оценивают по методу МТТ-теста с использованием раствора 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида в ростовой среде.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что показатель цитотоксичности тестируемых наночастиц при воздействии на мононуклеарные клетки - лимфоциты оценивают по увеличению доли некротических клеток, выявленных при окрашивании маркером - пропидий-йодидом (PI), с анализом на проточном цитофлуориметре.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения состояния лизосомального компартмента тестируемых клеток используют флуоресцентный рН - зависимый маркер ЛизоТрекер Зеленый (LysoTracker Green DND-26) с анализом тестируемых клеток на проточном цитофлуориметре.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что для оценки внутриклеточного накопления наночастиц используют измерение бокового светорассеяния клетками тест-культур с применением проточного цитофлуориметра.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011121993/10A RU2460997C1 (ru) | 2011-06-01 | 2011-06-01 | Способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур |
| PCT/EP2012/060229 WO2012164008A1 (en) | 2011-06-01 | 2012-05-31 | Method of evaluation of the effect of nanoparticles on cell cultures |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011121993/10A RU2460997C1 (ru) | 2011-06-01 | 2011-06-01 | Способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2460997C1 true RU2460997C1 (ru) | 2012-09-10 |
Family
ID=46420066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011121993/10A RU2460997C1 (ru) | 2011-06-01 | 2011-06-01 | Способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2460997C1 (ru) |
| WO (1) | WO2012164008A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2569730C1 (ru) * | 2014-10-02 | 2015-11-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет информационных технологий, радиотехники и электроники" (МИРЭА) | Способ определения функционального состояния клетки |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9588105B1 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | Portable in vitro multi-well chamber for exposing airborne nanomaterials at the air-liquid interface using electrostatic deposition |
| US20180110804A1 (en) * | 2015-02-04 | 2018-04-26 | Nugene, Inc. | Burn, scar, and wound treatment creams |
| EP3267195B1 (en) * | 2016-07-05 | 2020-06-10 | Universidad de Salamanca | One step phagocytosis-cell activation-cell death assay |
| CN112618571B (zh) * | 2020-09-30 | 2023-04-07 | 杭州贤石生物科技有限公司 | 治疗骨科疾病的可注射水凝胶微球及其制备方法与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2007116645A (ru) * | 2007-05-04 | 2008-11-20 | Виталий Валерьевич Власенко (UA) | Способ определения биологической активности веществ природного и синтетического происхождения, а также их смесей |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8785505B2 (en) | 2005-10-28 | 2014-07-22 | The Regents Of The University Of California | Toxicology and cellular effect of manufactured nanomaterials |
| WO2008010843A2 (en) | 2005-12-09 | 2008-01-24 | The Regents Of The University Of California | Assessing the toxic potential of nanomaterials |
| US20100279289A1 (en) | 2007-05-24 | 2010-11-04 | Fanqing Frank Chen | Size-dependent biological effect of nanoparticles |
| RU2351649C1 (ru) | 2007-12-25 | 2009-04-10 | Государственный научный центр Российской Федерации-Институт медико-биологических проблем Российской академии наук | Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата |
| IT1405488B1 (it) * | 2010-09-27 | 2014-01-17 | Scuola Superiore Di Studi Universitari E Di Perfez | Cellule staminali o pluripotenti magnetizzate e loro usi |
-
2011
- 2011-06-01 RU RU2011121993/10A patent/RU2460997C1/ru not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-05-31 WO PCT/EP2012/060229 patent/WO2012164008A1/en not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2007116645A (ru) * | 2007-05-04 | 2008-11-20 | Виталий Валерьевич Власенко (UA) | Способ определения биологической активности веществ природного и синтетического происхождения, а также их смесей |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SUJATHA G et al. Cells behaviour in presence of nano-scaffolds, J Biomed Nanotechnol. 2011 Feb; 7 (1): 43-4. PFALLER T et al. The suitability of different cellular in vitro immunotoxicity and genotoxicity methods for the analysis of nanoparticle-induced events, Nanotoxicology. 2010 Mar; 4 (1): 52-72. ASHARANI PV et al. Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells, ACS Nano. 2009 Feb 24; 3 (2): 279-90. YING E et al. In vitro evaluation of the cytotoxicity of iron oxide nanoparticles with different coatings and different sizes in A3 human T lymphocytes, Sci Total Environ. 2010 Sep 15; 408 (20): 4475-81. TAUTZENBERGER A et al. Effect of functionalised fluorescence-labelled nanoparticles on mesenchymal stem cell differentiation, Biomaterials. 2010 Mar; 31 (8): 2064-71. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2569730C1 (ru) * | 2014-10-02 | 2015-11-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет информационных технологий, радиотехники и электроники" (МИРЭА) | Способ определения функционального состояния клетки |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2012164008A9 (en) | 2013-03-21 |
| WO2012164008A1 (en) | 2012-12-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bauer et al. | Cytotoxicity of silica nanoparticles through exocytosis of von Willebrand factor and necrotic cell death in primary human endothelial cells | |
| Kuhns et al. | Isolation and functional analysis of human neutrophils | |
| Li et al. | Discrepancy of apoptotic events in mouse hepatocytes and catalase performance: Size-dependent cellular and molecular toxicity of ultrafine carbon black | |
| RU2460997C1 (ru) | Способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур | |
| Almizraq et al. | Extracellular vesicle characteristics in stored red blood cell concentrates are influenced by the method of detection | |
| Ma et al. | Monitoring of the enzymatic degradation of protein corona and evaluating the accompanying cytotoxicity of nanoparticles | |
| Popp et al. | Autophagic response to cellular exposure to titanium dioxide nanoparticles | |
| Rampazzo et al. | Proper design of silica nanoparticles combines high brightness, lack of cytotoxicity and efficient cell endocytosis | |
| Coccini et al. | In vitro toxicity screening of magnetite nanoparticles by applying mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord lining | |
| US10768080B2 (en) | Method of purifying tumor cells using shear stress | |
| Wang et al. | Molecular profiling of dental pulp stem cells during cell differentiation by surface enhanced Raman spectroscopy | |
| Frydman et al. | Megakaryocytes respond during sepsis and display innate immune cell behaviors | |
| Murphy-Marion et al. | Titanium dioxide nanoparticles induce human eosinophil adhesion onto endothelial EA. hy926 cells via activation of phosphoinositide 3-kinase/Akt cell signalling pathway | |
| Taghavi-Farahabadi et al. | Improving the function of neutrophils from chronic granulomatous disease patients using mesenchymal stem cells’ exosomes | |
| Meesaragandla et al. | The impact of cell culture media on the interaction of biopolymer-functionalized gold nanoparticles with cells: mechanical and toxicological properties | |
| CN104059961B (zh) | 基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法 | |
| Ilvonen et al. | Distinct targeting and uptake of platelet and red blood cell‐derived extracellular vesicles into immune cells | |
| Movia et al. | The curious case of how mimicking physiological complexity in in vitro models of the human respiratory system influences the inflammatory responses. A preliminary study focused on gold nanoparticles | |
| Shafran et al. | Co-culture hydrogel micro-chamber array-based plate for anti-tumor drug development at single-element resolution | |
| Kailashiya et al. | Effects of nanoceria on human platelet functions and blood coagulation | |
| RU2390778C2 (ru) | Способ оценки агрегационной способности эритроцитов | |
| Spano et al. | Changes on lysosomal compartment during PMA-induced differentiation of THP-1 monocytic cells: Influence of type I and type IV collagens | |
| Tsurumoto et al. | Identification of nanobacteria in human arthritic synovial fluid by method validated in human blood and urine using 200 nm model nanoparticles | |
| Delcea | Brahmaiah Meesaragandla1, 2, Yesaswini Komaragiri2, 3, 4, Rabea Schlüter5, Oliver Otto2, 3, 4 & | |
| KR20140071997A (ko) | 유세포 분석을 이용한 나노 물질 위해성 평가 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130602 |