RU2460801C1 - Method for detecting sanitary indicator bacteria and starter culture in meat products - Google Patents
Method for detecting sanitary indicator bacteria and starter culture in meat products Download PDFInfo
- Publication number
- RU2460801C1 RU2460801C1 RU2011114815/10A RU2011114815A RU2460801C1 RU 2460801 C1 RU2460801 C1 RU 2460801C1 RU 2011114815/10 A RU2011114815/10 A RU 2011114815/10A RU 2011114815 A RU2011114815 A RU 2011114815A RU 2460801 C1 RU2460801 C1 RU 2460801C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- bacteria
- sanitary
- starter cultures
- meat
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 35
- 239000007858 starting material Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 14
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 12
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 abstract 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 9
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 9
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 8
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 8
- 241000191965 Staphylococcus carnosus Species 0.000 description 8
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 7
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 6
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 5
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 5
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 5
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001134659 Lactobacillus curvatus Species 0.000 description 3
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 3
- 241000191996 Pediococcus pentosaceus Species 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 2
- 241000191998 Pediococcus acidilactici Species 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000405383 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 Species 0.000 description 2
- 241000201788 Staphylococcus aureus subsp. aureus Species 0.000 description 2
- 241000191973 Staphylococcus xylosus Species 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical compound ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- OKBPCTLSPGDQBO-UHFFFAOYSA-L disodium;dichloride Chemical compound [Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-] OKBPCTLSPGDQBO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 235000020995 raw meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Изобретение обеспечивает комплексное выявление санитарно-показательных бактерий (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes), регламентированных СанПиНом 2.3.2.1078-01 и стартовых культур родов Lactobacillus, Staphylococcus, Pediococcus в мясных продуктах. Питательная среда содержит пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, глюкозу, твин-80, натрий фосфорнокислый, магний сернокислый, железо сернокислое, дистиллированную воду. Идентификацию осуществляют посредством метода ПЦР-анализа с электрофоретической схемой детекции [2, 3, 7].The invention relates to biotechnology and can be used in microbiology. The invention provides a comprehensive identification of sanitary-indicative bacteria (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes), regulated by SanPiN 2.3.2.1078-01 and starter cultures of the genera Lactobacillus, Staphylococcus, Pediococcus in meat products. The nutrient medium contains peptone, meat extract, yeast extract, glucose, tween-80, sodium phosphate, magnesium sulfate, iron sulfate, distilled water. Identification is carried out by the method of PCR analysis with an electrophoretic detection scheme [2, 3, 7].
Обеспечение безопасности пищевых продуктов является важной частью санитарно-эпидемиологического благополучия населения. Некачественные пищевые продукты, в т.ч. мясные продукты, могут привести к заболеваниям различной этиологии. Для предотвращения риска возникновения заболеваний, вызываемых бактериями видов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, которые могут присутствовать в мясных продуктах, необходимо проводить их своевременное выявление, включающее выявление с помощью среды обогащения и идентификацию на основе молекулярно-генетических методов исследования.Ensuring food safety is an important part of the sanitary and epidemiological well-being of the population. Poor-quality food products, including meat products can lead to diseases of various etiologies. To prevent the risk of diseases caused by bacteria of the species Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, which may be present in meat products, it is necessary to carry out their timely identification, including identification using an enrichment medium and identification based on molecular genetic research methods.
При изготовлении ферментированных (сырокопченых и сыровяленых) мясных продуктов для гарантии безопасности предусматривается добавление в рецептуру эффективных ингибиторов в отношении санитарно-показательной микрофлоры - стартовых культур, относящихся к родам Lactobacillus, Staphylococcus и Pediococcus. Чтобы контролировать процесс развития стартовых культур, необходимо проводить их мониторинг на всем протяжении технологического процесса. Поэтому так же, как и для санитарно-показательных бактерий необходим простой и доступный способ выявления бактерий родов Lactobacillus, Staphylococcus и Pediococcus в мясных продуктах для последующей их идентификации молекулярно-генетическими методами исследования.In the manufacture of fermented (uncooked and uncooked) meat products, to ensure safety, it is planned to add effective inhibitors to the sanitary-indicative microflora in the formulation - starter cultures belonging to the genera Lactobacillus, Staphylococcus and Pediococcus. To control the process of development of starter cultures, it is necessary to monitor them throughout the process. Therefore, just as for sanitary-indicative bacteria, a simple and affordable way to detect bacteria of the genera Lactobacillus, Staphylococcus and Pediococcus in meat products for their subsequent identification by molecular genetic methods is necessary.
Необходимо отметить, что стартовые культуры рода Staphylococcus выделены из мясных образцов и адаптированы к культивированию на богатой питательной среде.It should be noted that the starter cultures of the genus Staphylococcus were isolated from meat samples and adapted to cultivation in a rich nutrient medium.
Для решения этих проблем требуется создание эффективного способа выявления санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясных продуктах.To solve these problems, it is necessary to create an effective way to identify sanitary-indicative microflora and starter crops in meat products.
Известен способ выявления санитарно-показательной микрофлоры на питательной среде Луриа-Бертани [1, 4], которая характеризуется простотой изготовления и широко используется на стадии обогащения в практических лабораториях, осуществляющих молекулярно-генетические исследования. Готовят среду Луриа-Бертани по нижеследующей прописи, г/л:There is a method of identifying sanitary indicative microflora in the nutrient medium Luria-Bertani [1, 4], which is characterized by ease of manufacture and is widely used at the enrichment stage in practical laboratories conducting molecular genetic studies. Prepare Luria-Bertani's medium according to the following recipe, g / l:
Ингредиенты растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Бактерии инкубируют при 37°С в термостате в течение 18-24 ч.The ingredients are dissolved in distilled water and sterilized at 1.1 atm (121 ° C) for 15 minutes. Bacteria are incubated at 37 ° C in an incubator for 18-24 hours.
Недостатком этого способа является обедненный состав среды Луриа-Бертани. Бактериям для синтеза компонентов клеток необходимы углерод, азот, сера и фосфор плюс небольшое количество щелочных и щелочноземельных металлов, а также следовое количество микроэлементов.The disadvantage of this method is the depleted composition of the environment of Luria-Bertani. Bacteria need carbon, nitrogen, sulfur, and phosphorus plus a small amount of alkali and alkaline earth metals, as well as trace trace elements, to synthesize cell components.
Пептон является источником азота и серы, дрожжевой экстракт - витаминов группы В, хлорид натрия - ионов натрия для мембранного транспорта и поддержания оптимального осмотического давления. Однако этих компонентов достаточно лишь для удовлетворения минимальных потребностей санитарно-показательных бактерий.Peptone is a source of nitrogen and sulfur, yeast extract - vitamins of group B, sodium chloride - sodium ions for membrane transport and maintaining optimal osmotic pressure. However, these components are sufficient only to meet the minimum needs of sanitary bacteria.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа для выявления санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур является способ выявления стартовых культур на среде MRS [5, 6]. Готовят среду MRS по нижеследующей прописи, г/л:The closest analogue of the proposed method for identifying sanitary indicative microflora and starter cultures is a method for detecting starter cultures on MRS medium [5, 6]. Prepare MRS medium according to the following recipe, g / l:
Ингредиенты растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Бактерии инкубируют при 37°С в термостате в течение 18-24 ч.The ingredients are dissolved in distilled water and sterilized at 1.1 atm (121 ° C) for 15 minutes. Bacteria are incubated at 37 ° C in an incubator for 18-24 hours.
Среда MRS содержит, наряду с пептоном и дрожжевым экстрактом, ряд других необходимых для роста стартовых культур ингредиентов. В состав мясного экстракта входят такие компоненты, как азот, органические вещества, нерастворимый и свертывающий протеин, альбумоза, минеральные и др. вещества. Глюкоза является источником углерода, твин-80 - жирных кислот. Натрий гидрофосфат является источником фосфора, который встречается в природе обычно в виде фосфатов. Сульфат магния - источник щелочноземельных металлов, а сульфат марганца - микроэлементов.The MRS medium contains, along with peptone and yeast extract, a number of other ingredients necessary for the growth of starter cultures. The composition of the meat extract includes such components as nitrogen, organic substances, insoluble and coagulating protein, albumose, mineral and other substances. Glucose is a source of carbon, tween-80 - fatty acids. Sodium hydrogen phosphate is a source of phosphorus, which occurs naturally in the form of phosphates. Magnesium sulfate is a source of alkaline earth metals, and manganese sulfate is a trace element.
К недостаткам этого способа можно отнести то, что для создания селективности в отношении стартовых культур в среде используется ацетат натрия и цитрат аммония, что не позволяет использовать ее для выявления санитарно-показательных бактерий. Кроме того, применение указанных режимов стерилизации может привести к карамелизации глюкозы, снижению ее содержания в питательной среде и нехватке в качестве источника углерода для роста и развития бактерий.The disadvantages of this method include the fact that to create selectivity for starter cultures in the environment, sodium acetate and ammonium citrate are used, which does not allow it to be used to identify sanitary-indicative bacteria. In addition, the use of these sterilization modes can lead to caramelization of glucose, a decrease in its content in the nutrient medium and a shortage as a carbon source for the growth and development of bacteria.
Общим недостатком вышеперечисленных способов является то, что они не позволяют осуществлять одновременное выявление санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясных продуктах.A common disadvantage of the above methods is that they do not allow the simultaneous identification of sanitary-indicative microflora and starter crops in meat products.
Задача предлагаемого изобретения направлена на разработку способа для одновременного выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах для последующей их идентификации методом ПНР с электрофоретической схемой детекции.The objective of the invention is directed to the development of a method for the simultaneous detection of sanitary-indicative bacteria and starter cultures in meat products for their subsequent identification by the NDP method with an electrophoretic detection scheme.
Поставленная задача решается в предлагаемом способе выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах, включающем приготовление среды обогащения по прописи, контроль pH, стерилизацию, выявление санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах и их идентификацию, в котором согласно изобретению для приготовления среды по прописи в 950 мл дистиллированной воды растворяют 10,00 г пептона, 5,00 г мясного экстракта, 5,00 г дрожжевого экстракта, 1,00 г твина-80, 3,00 г натрия фосфорнокислого, 0,10 г магния сернокислого, 0,01 г железа сернокислого, среду стерилизуют при 1,1 атм в течение 15 мин, далее в 50 мл дистиллированной воды растворяют 20 г глюкозы, полученный 40%-ный раствор глюкозы стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин, затем в асептических условиях добавляют к среде и перемешивают, а для выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур, в стерильных условиях отбирают 25 г образца мясного продукта и помещают в колбу, содержащую 250 мл среды, затем инкубируют при 37°С в течение 16 ч, после чего бактерии отделяют от среды центрифугированием при 4000 об/мин, отмывают от остатков питательной среды физиологическим раствором и вновь центрифугируют при 4000 об/мин, из полученных бактериальных клеток выделяют геномную ДНК и идентифицируют с помощью ПЦР-анализа с электрофоретической схемой детекции с использованием родо- и видоспецифических праймеров для каждого искомого микроорганизма [2, 3, 7].The problem is solved in the proposed method for the detection of sanitary indicative bacteria and starter cultures in meat products, including preparation of enrichment medium according to the recipe, pH control, sterilization, detection of sanitary indicative bacteria and starter cultures in meat products and their identification, in which according to the invention for preparation of a prescription medium in 950 ml of distilled water, 10.00 g of peptone, 5.00 g of meat extract, 5.00 g of yeast extract, 1.00 g of tween-80, 3.00 g of sodium phosphate, 0.10 g of magnesium are dissolved I sulfate, 0.01 g of iron sulfate, the medium is sterilized at 1.1 atm for 15 minutes, then 20 g of glucose is dissolved in 50 ml of distilled water, the resulting 40% glucose solution is sterilized at 0.5 atm for 20 minutes Then, under aseptic conditions, they are added to the medium and mixed, and to identify sanitary indicative bacteria and starter cultures, 25 g of a sample of meat product is taken under sterile conditions and placed in a flask containing 250 ml of medium, then incubated at 37 ° C for 16 h, after which the bacteria are separated from the centrifugation medium at 4000 rpm, wash off the residual nutrient medium with saline and centrifuge again at 4000 rpm, genomic DNA is isolated from the obtained bacterial cells and identified by PCR analysis with an electrophoretic detection scheme using genus and species-specific primers for each the desired microorganism [2, 3, 7].
Техническим результатом при осуществлении изобретения является комплексное выявление санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах.The technical result in the implementation of the invention is the integrated identification of sanitary indicative bacteria and starter cultures in meat products.
Чувствительность среды определяли по росту тест-штаммов: Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (ВКПМ B-6646), Escherichia coli K 12 С 600 (ВКПМ B-1010), Proteus vulgaris ATCC 13315 (ВКПМ В-1667), Salmonella typhimurium LT2 (ВКПМ В-3533), Listeria monocytogenes 766 (ГИСК им Л.А.Тарасевича), Lactobacillus curvatus 1 (ВКПМ В-8889), Lactobacillus plantarum 21 (ВКПМ В-8654), Pediococcus acidilactici 34 (ВКПМ В-8887), Pediococcus pentosaceus 28 (ВКПМ В-8888), Staphylococcus carnosus 108 (ВКПМ В-8953), Staphylococcus xylosus 45 (ВКПМ В-8945). Сравнительная характеристика чувствительности заявляемой среды и сред прототипов представлена в табл.1.The sensitivity of the medium was determined by the growth of test strains: Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (VKPM B-6646), Escherichia coli K 12 C 600 (VKPM B-1010), Proteus vulgaris ATCC 13315 (VKPM B-1667), Salmonella typhimurium LT2 (VKPM B-3533), Listeria monocytogenes 766 (GISK named L A.A. Tarasevich), Lactobacillus curvatus 1 (VKPM B-8889), Lactobacillus plantarum 21 (VKPM B-8654), Pediococcus acidilactici 34 (VKPM B-8887), Pediococcus pentosaceus 28 (VKPM B-888ococn stapaph VKPM B-8953), Staphylococcus xylosus 45 (VKPM B-8945). Comparative characteristics of the sensitivity of the claimed environment and environments of the prototypes are presented in table 1.
Приведенные данные свидетельствуют, что заявляемая среда является более чувствительной и эффективной, т.к. на ней наблюдался рост всех тест-штаммов, а на среде MRS только стартовых культур. На среде Луриа-Бертани рост стартовых культур отсутствовал, однако наблюдался активный рост санитарно-показательных бактерий.The above data indicate that the claimed environment is more sensitive and effective, because on it, growth of all test strains was observed, and on MRS medium, only starter cultures. In the Luria-Bertani environment, there was no growth in starter cultures, but there was an active growth in sanitary-indicative bacteria.
Была изучена возможность практического использования заявляемого способа выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясном сырье и готовых ферментированных продуктах (табл.2).The possibility of practical use of the proposed method for identifying sanitary indicative bacteria and starter cultures in raw meat and finished fermented products was studied (Table 2).
Объектами исследования служили охлажденная свинина (длиннейшая мышца спины) и 2 образца ферментированного мясного продукта. В первом случае ферментация осуществлялась бактериями Lactobacillus plantarum 21 (ВКПМ В-8654), Staphylococcus carnosus 108 (ВКПМ В-8953) (образец №1), во втором - Lactobacillus curvatus 1 (ВКПМ В-8889), Staphylococcus carnosus 108 (ВКПМ В-8953), Pediococcus pentosaceus 28 (ВКПМ В-8888) (образец №2).The objects of study were chilled pork (the longest muscle of the back) and 2 samples of fermented meat product. In the first case, fermentation was carried out by the bacteria Lactobacillus plantarum 21 (VKPM B-8654), Staphylococcus carnosus 108 (VKPM B-8953) (sample No. 1), in the second - Lactobacillus curvatus 1 (VKPM B-8889), Staphylococcus carnosus 108 (VKPM Bn-8889) -8953), Pediococcus pentosaceus 28 (VKPM B-8888) (sample No. 2).
С помощью опытной среды и среды Луриа-Бертани в охлажденной свинине были выявлены Escherichia coli и Staphylococcus aureus. При использовании среды MRS в качестве среды обогащения эти бактерии не были выявлены, т.к. ацетат натрия и цитрат аммония ингибировали их рост. Другие санитарно-показательные и стартовые культуры в исследуемой охлажденной свинине не были обнаружены.Using the experimental and Luria-Bertani media, Escherichia coli and Staphylococcus aureus were detected in chilled pork. When using the MRS medium as an enrichment medium, these bacteria were not detected, because sodium acetate and ammonium citrate inhibited their growth. Other sanitary indicative and starter cultures were not found in the chilled pork under study.
В изучаемых ферментированных мясных продуктах были обнаружены стартовые культуры Lactobacillus spp. и Staphylococcus carnosus для образца №1 и Lactobacillus spp., Staphylococcus carnosus и Pediococcus spp. для образца №2 с помощью предлагаемой среды и среды MRS. Малокомпонентный состав среды Луриа-Бертани не позволил выявить эти бактерии. Присутствие санитарно-показательных бактерий в готовых ферментированных продуктах не было выявлено. Идентификация бактерий, выявленных как на заявляемой среде, так и на средах-прототипах, осуществлялась с помощью ПЦР-анализа с электрофоретической схемой детекции с использованием родо- и видоспецифических праймеров для каждого искомого вида микроорганизма [2, 3, 7].In the studied fermented meat products, Lactobacillus spp starter cultures were found. and Staphylococcus carnosus for sample No. 1 and Lactobacillus spp., Staphylococcus carnosus and Pediococcus spp. for sample No. 2 using the proposed environment and the environment MRS. The low-component composition of the Luria-Bertani medium did not allow these bacteria to be detected. The presence of sanitary indicative bacteria in the finished fermented products was not detected. Identification of bacteria detected both on the claimed medium and on prototype media was carried out using PCR analysis with an electrophoretic detection scheme using rhodo- and species-specific primers for each desired microorganism type [2, 3, 7].
Предлагаемый способ выполняется следующим образом.The proposed method is as follows.
Первый этап заключается в приготовлении среды.The first step is to prepare the medium.
В 950 мл дистиллированной воды растворяют 10,00 г пептона; 5,00 г мясного экстракта; 5,00 г дрожжевого экстракта; 1,00 г твина-80; 3,00 г натрия фосфорнокислого; 0,10 г магния сернокислого; 0,01 г железа сернокислого; контролируют pH при помощи pH-метра (pH 7,0±0,2), стерилизуют в автоклаве при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. С целью исключения карамелизации глюкозы во время стерилизации отдельно готовят 40%-ный раствор глюкозы: 20 г глюкозы растворяют в 50 мл дистиллированной воды, стерилизуют при 0,5 атм (112°С) в течение 20 мин. Затем в асептических условиях к среде добавляют 50 мл раствора глюкозы, перемешивают. Среду можно хранить в холодильнике до 2-х месяцев.10.00 g of peptone are dissolved in 950 ml of distilled water; 5.00 g of meat extract; 5.00 g of yeast extract; 1.00 g of Tween-80; 3.00 g of sodium phosphate; 0.10 g of magnesium sulfate; 0.01 g of iron sulfate; control the pH with a pH meter (pH 7.0 ± 0.2), sterilize in an autoclave at 1.1 atm (121 ° C) for 15 minutes. In order to exclude caramelization of glucose during sterilization, a 40% glucose solution is separately prepared: 20 g of glucose is dissolved in 50 ml of distilled water, sterilized at 0.5 atm (112 ° C) for 20 minutes. Then, under aseptic conditions, 50 ml of glucose solution is added to the medium and mixed. The medium can be stored in the refrigerator for up to 2 months.
Затем проводят второй этап - выявление санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах на питательной среде.Then the second stage is carried out - the identification of sanitary-indicative bacteria and starter cultures in meat products on a nutrient medium.
Из сырья и готовых мясных продуктов, в т.ч. ферментированных, отбирают 25 г образца и помещают в колбу, содержащую 250 мл среды, затем инкубируют при 37°С в течение 16 ч. Бактерии отделяют от среды центрифугированием при 4000 об/мин. Затем бактерии отмывают от остатков питательной среды физиологическим раствором и вновь центрифугируют при 4000 об/мин. Из полученных бактериальных клеток выделяют геномную ДНК, которую идентифицируют с помощью ПЦР-анализа с электрофоретической схемой детекции с использованием родо- и видоспецифических праймеров для каждого искомого микроорганизма [2, 3, 7].From raw materials and prepared meat products, including fermented, 25 g of the sample is taken and placed in a flask containing 250 ml of medium, then incubated at 37 ° C for 16 hours. Bacteria are separated from the medium by centrifugation at 4000 rpm. Then the bacteria are washed from the remains of the nutrient medium with physiological saline and again centrifuged at 4000 rpm. Genomic DNA is isolated from the obtained bacterial cells, which is identified by PCR analysis with an electrophoretic detection scheme using rhodo- and species-specific primers for each desired microorganism [2, 3, 7].
При подготовке пробы ДНК-матрицы (выделение ДНК) использовался набор «AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit» компании Axygen Scientific, Inc. США. Подбор праймеров для ПЦР-анализа осуществляли, используя литературные данные, а также применяли готовые наборы для амплификации компании «Литех», Россия. При проведении ПЦР-реакции использовали набор реагентов для ПЦР амплификации ДНК «GenPak PCR Core» компании «Изоген», Москва. ПЦР-реакцию проводили в объеме 25 мкл в стандартных пластиковых пробирках объемом 0,5 мл (Sarstedt, Германия) на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Для визуализации ампликонов 10 мкл ПЦР-продукта разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Результаты регистрировали с помощью фотодокументирующей системы Vitran. Размер фрагментов определяли в сравнении с «100 bp ДНК маркером М 15», от 100-1000 п.н.When preparing a DNA template sample (DNA isolation), the AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit by Axygen Scientific, Inc. was used. USA. Primers for PCR analysis were selected using literature data, and ready-made amplification kits were used for Litech, Russia. During the PCR reaction, a set of reagents for PCR amplification of DNA “GenPak PCR Core” from Isogen, Moscow was used. The PCR reaction was carried out in a volume of 25 μl in standard plastic tubes with a volume of 0.5 ml (Sarstedt, Germany) on a Tertsik thermocycler (DNA technology, Russia). To visualize amplicons, 10 μl of the PCR product was separated by electrophoresis in 2% agarose gel, followed by staining with ethidium bromide (0.5 μg / ml). The results were recorded using a Vitran photo-recording system. The size of the fragments was determined in comparison with the “100 bp DNA marker M 15”, from 100-1000 bp
Полученные результаты доказывают, что заявляемый способ позволяет упростить стадию обогащения за счет исключения использования двух сред для отдельного культивирования санитарно-показательных бактерий видов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes и стартовых культур родов Lactobacillus, Staphylococcus, Pediococcus в мясных продуктах, расширить ассортимент сред обогащения, а также снизить материальные затраты, связанные с приготовлением двух видов сред. Использование молекулярно-генетических методов при проведении бактериологического анализа позволит существенно сократить длительность анализа, а также более точно оценить санитарно-гигиеническую картину мясных продуктов.The obtained results prove that the claimed method allows to simplify the enrichment stage by eliminating the use of two media for separate cultivation of sanitary-indicative bacteria of the species Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes and starter cultures of the genera Lactobacillus, Staphylococcus Ped products, expand the range of enrichment media, as well as reduce the material costs associated with the preparation of two types of media. The use of molecular genetic methods during bacteriological analysis will significantly reduce the duration of the analysis, as well as more accurately assess the sanitary-hygienic picture of meat products.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011114815/10A RU2460801C1 (en) | 2011-04-15 | 2011-04-15 | Method for detecting sanitary indicator bacteria and starter culture in meat products |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011114815/10A RU2460801C1 (en) | 2011-04-15 | 2011-04-15 | Method for detecting sanitary indicator bacteria and starter culture in meat products |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2460801C1 true RU2460801C1 (en) | 2012-09-10 |
Family
ID=46938935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011114815/10A RU2460801C1 (en) | 2011-04-15 | 2011-04-15 | Method for detecting sanitary indicator bacteria and starter culture in meat products |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2460801C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2550135C2 (en) * | 2013-07-09 | 2015-05-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Орловский государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВПО Орел ГАУ) | Method of preliminary protein sample preparation for electrophoresis |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070259393A1 (en) * | 2006-05-02 | 2007-11-08 | Lawrence Restaino | Plating media for the presumptive identification of Listeria sp, Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii |
| WO2010035458A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | 三愛石油株式会社 | Culture medium for determining total viable cell count |
| RU2410440C1 (en) * | 2007-08-16 | 2011-01-27 | Моринага Милк Индастри Ко., Лтд. | Method and set for microorganism detection |
-
2011
- 2011-04-15 RU RU2011114815/10A patent/RU2460801C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070259393A1 (en) * | 2006-05-02 | 2007-11-08 | Lawrence Restaino | Plating media for the presumptive identification of Listeria sp, Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii |
| RU2410440C1 (en) * | 2007-08-16 | 2011-01-27 | Моринага Милк Индастри Ко., Лтд. | Method and set for microorganism detection |
| WO2010035458A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | 三愛石油株式会社 | Culture medium for determining total viable cell count |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2550135C2 (en) * | 2013-07-09 | 2015-05-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Орловский государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВПО Орел ГАУ) | Method of preliminary protein sample preparation for electrophoresis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2245179B1 (en) | Method and medium for detecting the presence or absence of staphylococcus aureus in a test sample | |
| Kuntaman et al. | Prevalence of methicillin resistant Staphylococcus aureus from nose and throat of patients on admission to medical wards of DR Soetomo Hospital, Surabaya, Indonesia | |
| CN105671197B (en) | A kind of detection method of foodborne pathogenic bacteria Listeria monocytogenes | |
| CN105175518B (en) | The bacteriocin and preparation method thereof that bacillus coagulans FM603 is generated | |
| CN101412978A (en) | Culture medium for composite enrichment of salmonella, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus, and preparation thereof | |
| US20150284764A1 (en) | Method for Determining the Sensitivity of Microorganisms to Antimicrobial Substances | |
| CN113999793A (en) | Lactobacillus plantarum with good fermentation characteristics and fragrance production function and screening method thereof | |
| US20110256584A1 (en) | Culture medium for cultivation and identification of bacteria of genus pectinatus and method for taking swab samples | |
| CN102286606A (en) | Cronobacter spp. broth medium and detection method | |
| CN114196566B (en) | Streptococcus thermophilus JMCC0033 and application thereof | |
| RU2759831C1 (en) | Nutrient medium for cultivating microorganisms from burkholderia cepacia complex | |
| RU2460801C1 (en) | Method for detecting sanitary indicator bacteria and starter culture in meat products | |
| CN111621451B (en) | Bacillus, method for detecting antibiotic residue by using bacillus and application of method | |
| CN111560451B (en) | Economical and efficient method for batch determination of intestinal tract thalli external growth and interaction rule | |
| CN111088181B (en) | Bifidobacterium breve strain BK55 and application thereof in inhibiting clostridium difficile | |
| RU2455351C1 (en) | Nutrient medium for cultivation of diphtheria bacteria | |
| RU2388489C1 (en) | Method for preparing vaccine associated against pseudomonosis and enterococcus infection of nutrias | |
| KR101747249B1 (en) | Weissella cibaria specific primer and method for detection of Weissella cibaria using the same | |
| CN109811073A (en) | Primers and their applications for early and rapid detection of Streptococcus agalactiae and Streptococcus iniae by double PCR | |
| CN111020040B (en) | Multiplex fluorescence quantitative PCR detection primer group and kit for pathogenic bacteria in dairy products and application of multiplex fluorescence quantitative PCR detection primer group and kit | |
| Park et al. | Cultivation-free sample preparation and DNA purification for direct real-time qPCR of intracellular or spore-like Coxiella burnetii in beef, goat, and lamb meat | |
| CN108486015A (en) | A kind of culture medium and its application for Prevotella copri specificity screenings | |
| Thongruck et al. | Monitoring of changes in lactic acid bacteria during production of Thai traditional fermented shrimp (Kung-Som) by culturing method and PCR-DGGE technique. | |
| WO2022141936A1 (en) | Standard reference strains of staphylococcus argenteus containing specific molecular target and detection and use thereof | |
| CN112680499A (en) | In-vitro detection kit for anaerobic microorganisms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL: 25-2012 FOR TAG: (73)D |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140416 |