RU2460800C2 - Способ ферментативного получения пента-n-ацетилхитопентаозы - Google Patents
Способ ферментативного получения пента-n-ацетилхитопентаозы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2460800C2 RU2460800C2 RU2010132799/10A RU2010132799A RU2460800C2 RU 2460800 C2 RU2460800 C2 RU 2460800C2 RU 2010132799/10 A RU2010132799/10 A RU 2010132799/10A RU 2010132799 A RU2010132799 A RU 2010132799A RU 2460800 C2 RU2460800 C2 RU 2460800C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nodc
- gene
- escherichia coli
- mesorhizobium loti
- acetylglucosaminyl transferase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- DPTYILOGADPXRZ-RXDSZOQSSA-N Penta-N-acetylchitopentaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@@H]([C@H](O)[C@H](C=O)NC(=O)C)[C@H](O)CO)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 DPTYILOGADPXRZ-RXDSZOQSSA-N 0.000 title claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 241000589195 Mesorhizobium loti Species 0.000 claims abstract description 33
- 108010056664 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 26
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 claims abstract description 19
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 13
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 13
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000894008 Azorhizobium Species 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000970829 Mesorhizobium Species 0.000 description 1
- 210000004460 N cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000589157 Rhizobiales Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимического синтеза. Способ включает биосинтез пента-N-ацетилхитопентаозы in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5a высокой плотности, с помощью экспрессируемого в клетках этих бактерий рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803. Причем для осуществления биосинтеза in vivo проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5a гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации гена NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о., амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC и используют ее для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом, при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу, количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества, который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой. 5 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биохимического синтеза, а непосредственно к способу получения хитоолигосахаридов. Известен способ получения хитоолигосахаридов путем фрагментации биополимера хитина, выделенного из природных источников (панцири ракообразных, кутикула насекомых, клеточные стенки грибов) (Cabrera J.C., Van Cutsem P. Preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization higher than 6 by acid or enzymatic degradation of chitosan // Biochemical engineering Journal. 2005. V.25. P.165-172). Недостатками известного способа являются его высокая стоимость и трудоемкость, поскольку он предполагает очистку, фракционирование и последующее определение структуры полученных продуктов. Известен способ получения хитоолигосахаридов посредством химического синтеза (Boons G.J. Strategies in oligosaccharide synthesis // Tetrahedron. 1996. V.52, P.1095-1121). Недостатками известного способа являются многоэтапность процесса синтеза, а также необходимость стабилизировать полученные промежуточные продукта синтеза, что делает нецелесообразным получение хитоолигосахаридов со степенью полимеризации более трех остатков N-ацетилглюкозамина. Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения хитоолигосахаридов, заключающийся в биосинтезе с помощью генетически модифицированных бактерий Escherichia coli, несущих плазмиду с клонированным геном NodC, который кодирует рекомбинантный фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу бактерий Azorhizobium caulidans, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti, который принимается за прототип (US №20090082307, Мкл A61K 31/715, C12P 19/18, A01N 43/04, A61P 3/10, A61P 9/00, A61P 31/04, A61P 31/12, A61P 25/00, A61P 35/00, A01P 21/00, C07H 1/00, 2009). Недостатком известного способа является невозможность получения олигомеров хитина, состоящих более чем из четырех остатков N-ацетилглюкозамина.
Решаемая изобретением задача - биологический синтез более длинных олигомеров хитина с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, кодируемого геном NodC почвенной бактерии Mesorhizobium loti 1803. Заявленный способ позволяет осуществить биосинтез олигомеров хитина с определенной химической структурой - пента-N-ацетилхитопентаозы - in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в клетках Escherichia coli DH5α с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы бактерии Mesorhizobium loti 1803.
Поставленная задача решается тем, что способ ферментативного получения олигомеров хитина, предполагающий биосинтез этих соединений in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5α высокой плотности с помощью экспрессируемого в клетках этих бактерий рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, отличается тем, что при биосинтезе in vivo получают олигомеры хитина, состоящие из пяти остатков N-ацетилглюкозамина, для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5α гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации генов NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о., амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH и EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находится под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом, при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу, количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества, который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой.
Заявителем не выявлены источники информации, содержащие сведения о технических решениях, идентичных заявленному изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».
Предлагаемый способ ферментативного получения олигомеров хитина обеспечивает биологический синтез более длинных олигомеров хитина с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803. Заявленный способ позволяет осуществить биосинтез олигомеров хитина с определенной химической структурой - пента-N-ацетилхитопентаозы - in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в клетках Escherichia coli DH5α. Поставленная задача решается тем, что ферментативный синтез олигомеров хитина осуществляют из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli высокой плотности с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, контролирующего синтез этих соединений. Сущность заявленного способа поясняется с помощью рисунков:
рисунок 1. Амплификация гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (А). Клонирование в векторе pUC19 и рестрикционный анализ полученных клонов (Б), рисунок 2. Экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 в клетках Escherchia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC, рисунок 3. Анализ продуктов ферментативной реакции, катализируемой N-ацетилглюкозаминилтрансферазой Mesorhizobium loti 1803 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, рисунок 4. Анализ структуры продукта, синтезированного с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, методом масс-спектрометрии (MALDI-TOF), рисунок 5. Название и структура олигомера хитина, синтезированного с помощью фермента Mesorhizobium loti 1803.
Предлагаемый способ включает биосинтез in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5α высокой плотности с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, контролирующего синтез этих соединений, отличается тем, что при биосинтезе in vivo используют фермент, контролирующий синтез олигомеров, состоящих из пяти остатков N-ацетилглюкозамина. Для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5α гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации гена NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti CIAM 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о. (рисунок 1), амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH и EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находится под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (рисунок 2), при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу (рисунок 3), количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества (рисунок 4), который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой (рисунок 5).
Указанные обстоятельства, по мнению заявителя, подтверждают соответствие заявленного технического решения критерию «изобретательский уровень».
Возможность реализации предлагаемого изобретения подтверждается проведенными экспериментами и иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
1.1. Конструирование экспрессионной плазмиды.
Для конструирования экспрессионной плазмиды pUC19-NodC последовательность гена NodC Mesorhizobium loti 1803 амплифицировали методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoR1. Для амплификации использовали ризобиальную ДНК штамма ризобий Mesorhizobium loti 1803. Продукты амплификации очищали с помощью набора GIAEX II Gel Extraction Kit и клонировали в плазмиду pUC19 с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции и Т4 ДНК-лигазы.
1.2. Условия для экспрессии фермента в клетках Escherichia coli DH5α
Экспрессию рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 осуществляли в клетках Escherichia coli DH5α. Клетки штамма Escherichia coli DH5α трансформировали плазмидой pUC19-NodC. Несколькими свежими рекомбинантными колониями инокулировали 100-500 мл среды LB - 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl (рН 7.0), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), и растили при температуре 37°С, 220 об/мин на орбитальном шейкере до достижения культурой оптической плотности OD600=0,6. Экспрессию генов рекомбинантных белков индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида до конечной концентрации 1 мМ.
Пример 2.
2.1. Синтез хитоолигосахаридов in vivo.
Для синтеза хитоолигосахаридов in vivo бактериальные культуры выращивали в среде LB при температуре 37°С с добавлением ампициллина в концентрации 100 мг/л до достижения оптической плотности OD600=0,6, затем производили индукцию экспрессии белка посредством добавления изопропил-β-D-тиогалактозида. Далее в качестве источника углерода добавляли глицерол в концентрации 160 г/л и N-ацетилглюкозамин в концентрации 1 г/л в качестве субстрата для синтеза хитоолигосахаридов. Синтез хитоолигосахаридов осуществляли в клетках Escherichia coli DH5α. Выделение и очистку хитоолигосахаридов проводили из 100 мл 24- или 48-часовой бактериальной культуры. Клетки были осаждены в течение 20 минут при 3000 g, затем ресуспендированы в маленьком объеме (2 мл) и подвергнуты кипячению в течение 30 минут. При этом происходил выход синтезированных хитоолигосахаридов в культуральную среду. Хитоолигосахариды были адсорбированы на активированном угле в течение 20 минут. Смыв хитоолигосахаридов с угля проводили этиловым спиртом 50% и 70%.
2.2. Разделение и идентификация хитоолигосахаридов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Идентификацию и разделение хитоолигосахаридов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с аминофазой SUPELCOSIL™ LC-NH2 с использованием в качестве жидкой фазы системы ацетонитрил:вода (70%:30%). Структуру полученных соединений проверяли с помощью метода масс-спектрометрии.
Claims (1)
- Способ ферментативного получения олигомеров хитина, предполагающий биосинтез этих соединений in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5a высокой плотности, с помощью экспрессируемого в клетках этих бактерий рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, отличающийся тем, что при биосинтезе in vivo получают олигомеры хитина, состоящие из пяти остатков N-ацетилглюкозамина, для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5a гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации гена NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о., амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находятся под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом, при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу, количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества, который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010132799/10A RU2460800C2 (ru) | 2010-08-04 | 2010-08-04 | Способ ферментативного получения пента-n-ацетилхитопентаозы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010132799/10A RU2460800C2 (ru) | 2010-08-04 | 2010-08-04 | Способ ферментативного получения пента-n-ацетилхитопентаозы |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012105975/10A Division RU2517620C2 (ru) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Способ ферментативного получения пента-n-ацетилхитопентаозы и гекса-n-ацетилхитогексаозы |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010132799A RU2010132799A (ru) | 2012-02-10 |
| RU2460800C2 true RU2460800C2 (ru) | 2012-09-10 |
Family
ID=45853275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010132799/10A RU2460800C2 (ru) | 2010-08-04 | 2010-08-04 | Способ ферментативного получения пента-n-ацетилхитопентаозы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2460800C2 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113528553B (zh) * | 2021-07-07 | 2023-09-12 | 扬州日兴生物科技股份有限公司 | 一种密码子优化的n-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2057760C1 (ru) * | 1989-08-29 | 1996-04-10 | Таматсукури Корпорейшн | Олигомер хитина или хитозана и способ его получения |
| WO2001004341A1 (fr) * | 1999-07-07 | 2001-01-18 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Procede de production d'oligosaccharides |
-
2010
- 2010-08-04 RU RU2010132799/10A patent/RU2460800C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2057760C1 (ru) * | 1989-08-29 | 1996-04-10 | Таматсукури Корпорейшн | Олигомер хитина или хитозана и способ его получения |
| WO2001004341A1 (fr) * | 1999-07-07 | 2001-01-18 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Procede de production d'oligosaccharides |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Semino С.Е. Chitin oligosaccharides as candidate patterning agents in zebrafish embryogenesis, Int. J. Biol. 44, 2000, p.183-193. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010132799A (ru) | 2012-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6771644B2 (ja) | 微生物発酵によるｎ−アセチル−ｄ−グルコサミン及び／又はｄ−グルコサミン塩の製造方法 | |
| CN109988799B (zh) | 一种甘油-2-α-葡萄糖基化酶在制备2-α-甘油葡萄糖苷中的应用 | |
| CN101906449B (zh) | 芽孢表面展示系统用于n-乙酰神经氨酸生产的方法 | |
| CN112592880B (zh) | 一种产假尿苷工程菌及其应用 | |
| WO2023103578A1 (en) | A genetically engineered bacterium and a preparation method and use thereof | |
| KR101511361B1 (ko) | 헴 생산성이 증가된 재조합 대장균 및 이를 이용한 헴 생산 방법 | |
| CN112375750A (zh) | 一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷a的方法 | |
| JP2008154495A (ja) | ラクト−ｎ−ビオースｉ及びガラクト−ｎ−ビオースの製造方法 | |
| KR102186997B1 (ko) | 단백질 정제의 신규한 방법 | |
| CN108913641A (zh) | 一种重组大肠杆菌及其应用 | |
| WO2023208146A1 (zh) | 生物合成麦角硫因的方法及载体 | |
| CN108913737B (zh) | 使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法 | |
| Hu et al. | Coupled bioconversion for preparation of N-acetyl-D-neuraminic acid using immobilized N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase and N-acetyl-D-neuraminic acid lyase | |
| RU2460800C2 (ru) | Способ ферментативного получения пента-n-ацетилхитопентаозы | |
| CN102690795B (zh) | 一种灰产色链霉菌海藻糖合成酶及其编码基因和应用 | |
| WO2017174036A1 (zh) | 微生物发酵生产n-乙酰-d-氨基葡萄糖和/或d-氨基葡萄糖盐的方法 | |
| US7901912B1 (en) | Method of producing uridine 5′-diphospho-N-acetylgalactosamine | |
| RU2517620C2 (ru) | Способ ферментативного получения пента-n-ацетилхитопентаозы и гекса-n-ацетилхитогексаозы | |
| KR101957471B1 (ko) | 신규한 베타-아가레이즈 생산 유전자를 이용한 네오아가로바이오스 또는 네오아가로테트라오스의 효소적 생산방법 | |
| EP4410973A1 (en) | Recombinant yeast and application thereof | |
| CN119979503A (zh) | 磷酸二羟基丙酮磷酸酶的突变体蛋白及应用 | |
| KR20140048516A (ko) | 신규한 베타-아가레이즈 유전자 및 이를 이용한 베타-아가레이즈의 생산방법 | |
| CN107916271A (zh) | 一种重组腈水合酶的高效表达方法 | |
| CN114561431A (zh) | 氧-甲基转移酶PgmB在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用 | |
| CN113930415A (zh) | 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120805 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20140910 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160805 |