RU2460778C1 - Способ получения аутопробиотика на основе enterocuccus faecium, представителя индигенной микрофлоры кишечника хозяина - Google Patents
Способ получения аутопробиотика на основе enterocuccus faecium, представителя индигенной микрофлоры кишечника хозяина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2460778C1 RU2460778C1 RU2010154822/10A RU2010154822A RU2460778C1 RU 2460778 C1 RU2460778 C1 RU 2460778C1 RU 2010154822/10 A RU2010154822/10 A RU 2010154822/10A RU 2010154822 A RU2010154822 A RU 2010154822A RU 2460778 C1 RU2460778 C1 RU 2460778C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enterococcus faecium
- autoprobiotic
- faecium
- enterococcus
- culture
- Prior art date
Links
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 title claims 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 claims abstract description 35
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 13
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 claims description 5
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 claims description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 abstract description 22
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 abstract description 22
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 7
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 7
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 7
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 7
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 7
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 4
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 4
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 4
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 241000982579 Enterococcus faecium L3 Species 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 3
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 206010016766 flatulence Diseases 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241001495410 Enterococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000009924 canning Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010049056 enterocin A Proteins 0.000 description 1
- 108010049051 enterocin B Proteins 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Получают аутопробиотик на основе Enterococcus faecium выращиванием культуры в селективной питательной среде, идентификацией и отбором типичных для Enterococcus faecium колоний. Получают чистую культуру Enterococcus faecium, уточняют видовую принадлежность и содержание факторов патогенности, отбирают апатогенные клоны Enterococcus faecium и готовят из них молочнокислую закваску. Изобретение существенно сокращает время приготовления пробиотического продукта, полученного на основе аутоштаммов Enterococcus faecium, применение которого, в сравнении с аналогичными биотехнологическими пробиотиками, является эффективным и безопасным средством для лечения дисбиоза любой этиологии. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 7 пр.
Description
Изобретение относится к области микробиологии и медицины и касается получения пробиотического продукта, содержащего аутоштаммы Enlerococcus faecium, применяемого для профилактики и лечения кишечного дисбиоза.
В последние годы накоплен богатый опыт, касающийся применения пробиотиков при лечении различных нозологических форм [1, 2, 3, 4]. Опубликованы работы, описывающие успешное применение пробиотической терапии в гастроэнтерологии, пульмонологии, ревматологии, кардиологии и других разделах медицины. Подавляющее большинство работ посвящено применению пробиотиков, содержащих промышленные штаммы микроорганизмов [5, 6, 7, 8, 9].
Наряду с расширением сферы применения пробиотиков накапливаются данные о негативных проявлениях терапии препаратами или продуктами, содержащими промышленные штаммы микроорганизмов.
Микробы, выращенные искусственно, являются инородными для организма определенного человека и отторгаются вследствие биологической несовместимости. Биотехнологические пробиотики не имеют возможности внедряться внутрь биопленки кишечника и поэтому пребывают в нем транзиторно как микрофлора пищи [9]. Это признают производители пробиотиков, подтверждая, что их добавки не восполняют дефицит соответствующих содержимому пробиотика микроорганизмов, но стимулируют рост облигатной микрофлоры [10].
В настоящее время полагают, что оральный прием живых бактерий теоретически может быть ответственен за четыре типа побочных эффектов:
- развитие инфекционных процессов, обусловленных штаммами, входящими в состав пробиотиков;
- развитие метаболических расстройств;
- чрезмерная иммуностимуляция лимфатического аппарата кишечника;
- формирование новых клонов бактериальных штаммов за счет передачи генов, ответственных за экспрессию факторов патогенности.
Аутопробиотики лишены вышеперечисленных недостатков, так как они производятся на основе субстратов, полученных от макроорганизма, для которого они предназначены и обладают сродством к биопленке кишечника.
Известен способ получения аутоштаммов бифидо- и лактобактерий, включающий в себя этапы забора фекалий, выращивания бактерий и приготовления биомассы из них [11]. Однако в данной работе не проводится контроль приготовленной суспензии на активность бактерий и наличие бактериального загрязнения.
Известен способ получения биомассы аутоштамма лактобактерий, наиболее близкий к заявляемому изобретении [12]. В известном способе для получения аутоштаммов лактобактерий отбирают пробу нативного материала у конкретного человека и осуществляют ее посев на селективную питательную среду без разведения. После подтверждения принадлежности полученных микроорганизмов лактобактерий без четкой видовой идентификации производился повторный пассаж выделенных клеток на селективной питательной среде для выращивания чистой культуры.
Для сохранения активности клеток к полученной культуре добавлялся консервант на основе сахарозно-желатиновой среды. Однако реально, в соответствии с изложенной в патентной заявке процедурой выделить чистую культуру лактобактерий невозможно (лактобактерии включают более 11 различных родов). Предложенный в заявке протокол может позволить получить лишь набор бактериальных штаммов с непредсказуемыми последствиями для пациента.
В отличие от прототипа в настоящей патентной заявке предлагается выделение отдельных клонов энтерококков с последующим анализом каждого из выделенных клонов на наличие в их геноме нежелательных генетических детерминант [13], а также на отсутствие гемолитической активности на кровяном агаре и способность сбраживать молоко. Таким образом, аутопробиотик оказывается генетически и физиологически охарактеризован.
Другим важным отличием настоящей заявки от прототипа является второй этап работы, на котором для пациента с аутопробиотическим штаммом приготавливают пробиотический продукт, основой которого является закваска аутоштамма Enterococcus faecium.
Выбор Enterococcus faecium в качестве пробиотика обусловлен несколькими причинами [14]:
- опыт успешного использования энтерококков в качестве стартерных культур при приготовлении пищевых продуктов и в качестве пробиотиков;
- способность вырабатывать широкий спектр витаминов, в том числе являющихся ростовыми факторами для бифидобактерий и лактобацилл кишечника;
- штаммы Enterococcus faecium, в отличие от другого распространенного вида энтерококков Enterococcus faecalis, существенно реже содержат гены патогенности;
- выбранные апатогенные штаммы Enterococcus faecium наиболее отвечают стандартам генетической безопасности [15], в отличие от другого распространенного вида энтерококков Enterococcus faecalis, существенно реже содержат гены патогенности;
- устойчивость штаммов энтерококков к соляной кислоте (в желудке) и желчным кислотам (в двенадцатиперстной кишке);
- высокая технологичность штаммов энтерококков, устойчивость в широком диапазоне температур, устойчивость к высушиванию, высоким концентрациям солей;
- устойчивость к антибиотикам, в частности к сульфаниламидам, гентамицину и стрептомицину, что делает возможным назначение их на фоне антибактериальной терапии;
- способность ряда штаммов Enterococcus faecium вырабатывать мощные бактериоцины (энтероцин A и энтероцин B), что является важным для подавления избыточного роста условно-патогенной флоры у больных с дисбиозом.
Заявленный способ поясняется многочисленными примерами конкретных исследований, проведенных в реальных условиях и разных режимах на лабораторной базе НИИ Экспериментальной Медицины СЗО РАМН и клинической базе СПб. ГУЗ «Городская больница №26».
Примеры приготовления аутопробиотика на основе Enterococcus faecium
Новизна предлагаемого оригинального способа приготовления молочнокислой закваски заключается в том, что предлагаемый продукт получают из собственного (аутопробиотического) штамма Enterococcus faecium - обитателя желудочно-кишечного тракта конкретного пациента. Способ отличается тем, что после отбора характерных по морфологии колоний и перед непосредственно получением продукта осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с определением вида энтерококка и генетических детерминант патогенности, что предлагается впервые. Данный способ обеспечивает абсолютную безопасность готового продукта для человека. Способ отличается высокой скоростью получения готовой закваски (4-6 суток с момента взятия материала).
Для выделения индигенных энтерококков из фекалий для создания аутопробиотических молочнокислых заквасок необходимо:
1. Осуществить высев бактерий из фекалий пациента на селективные среды.
2. Идентифицировать выделенные штаммы до рода.
3. Осуществить ПЦР для определения вида энтерококка и возможного содержания факторов патогенности.
4. Произвести отбор клонов, удовлетворяющих требованиям генетической безопасности и физиологической функциональности.
5. Депонировать индивидуальные штаммы энтерококков в криохранилище.
6. Получить молочнокислую закваску.
Пример 1. Посев материала для выделения энтерококков
Для выделения аутопробиотических энтерококков из фекалий необходимо не менее 0,5 г материала (желательно - 5,0 г), при жидком стуле - слой не менее 1-2 см от дна посуды. Доставку необходимо осуществить не позднее 2 часов после отбора материала. Затем в стерильных условиях к 1 г материала добавить 9 мл стерильного фосфатного буфера (физиологический раствор хлорида натрия с добавлением фосфатов натрия двух- и однозамещенных, смешанных в пропорции, необходимой для создания pH 7,4).
Суспензию фекалий в разведении 1:10 высевают в количестве 100 мкл на селективную среду для энтерококков (энтерококк-агар). Культивировать в течение 24-48 часов при температуре 37°C. На этой среде вырастают главным образом энтерококки, реже стафилококки. Кроме того, учитывая особенности культуральных свойств Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis, можно проводить ориентировочную идентификацию энтерококков до вида. На Фиг.1 представлен рост колоний: Enterococcus faecalis чаще всего темные, бордового цвета, а колонии Enterococcus faecium сирене-розового цвета со светлым ободком.
Пример 2. Идентификация чистой культуры Enterococcus sp.
Идентификацию отдельных колоний осуществляют на основании не только морфологических, но и микроскопических свойств. Выбирают типичные для Enterococcus faecium три отдельные колонии (сирене-розового цвета со светло-розовым ободком) и отсевают их на новую чашку Петри с плотной средой МРС секторами с целью получения чистой культуры. Культивируют в течение 24 часов при 37°C. Микроскопируют препараты из чистых культур бактерий, окрашивая по методу Грама. При световой микроскопии Enterococcus faecium имеют округлую форму и располагаются в виде коротких цепочек с тенденциями к агрегации. Чистые культуры направляют на генетический анализ.
Пример 3. Уточнение видовой принадлежности и исследование на наличие факторов патогенности при помощи ПЦР
Для оценки молекулярно-генетических характеристик штаммов из индивидуальных колоний энтерококков экспресс-методом выделяют хромосомную ДНК, после чего производят ПЦР. Для предлагаемого экспресс-выделения ДНК чистую бактериальную культуру с чашки Петри (5-10 колоний) суспендируют в 50-100 мкл стерильной дистиллированной воды и кипятят 10 минут. Затем центрифугируют при 8000 об/мин. Надосадок, содержащий ДНК бактерии, используют для ПЦР (30 циклов при температуре отжига 57°C). Для генетического анализа с помощью ПЦР, с помощью компьютерной программы «BLAST» [16] были сконструированы уникальные праймеры для определения вида Enterococcus и на гены его патогенности (таблица 1), что позволяет для дальнейшего получения безопасного продукта выделять апатогенные штаммы.
Детекцию результатов ПЦР осуществляют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Соответственно, для подготовки аутопробиотиков отбирают бактериальные клоны, относящиеся к Enterococcus faecium (продукт 658 нуклеотидные пары - далее - «нп») и не содержащие ни одного из перечисленных в таблице 1 генов патогенности.
| Таблица 1 | |||
| Последовательность ДНК праймеров и размеры продуктов ПЦР для детекции видовой принадлежности и генов патогенности энтерококков | |||
| Название генов | Последовательность ДНК праймеров (5' to 3') | Размер ПЦР продуктов (нп) | |
| «E.faecium» | F | TTGAGGCAGACCAGATTGACG | 658 |
| R | ACGCATTGCTTTTCCATC | ||
| Esp | F | TTGCTAATGCTAGTCCACGACC | 933 |
| R | GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA | ||
| spr E | F | GCGTCAATCGGAAGAATCAT | 233 |
| R | CGGGGAAAAAGCTACATCAA | ||
| fsr B | F | TTTATTGGTATGCGCCACAA | 316 |
| R | TCATCAGACCTTGGATGACG | ||
| asal | F | CCAGCCAACTATGGCGGAATC | 529 |
| R | CCTGTCGCAAGATCGACTGTA | ||
| cylA | F | ACTCGGGGATTGATAGGC | 688 |
| R | GCTGCTAAAGCTGCGCTT | ||
| cylM | F | GATTGGAATGTGGGAATCCTAA | 825 |
| R | ACTTCCGGCAACCTTTAGTGTA | ||
| efaA | F | CGTTAGCTGCTTGCGGGAATC | 735 |
| R | CCATACTACGTTTATCGACAC | ||
| Esp | F | AGCGGGAACAGGTCACAAAGCG | 613 |
| R | TGCGTCAACACTTGCATTGCCGA | ||
Пример 4. Получение молочнокислой закваски
Три колонии, полученные на плотной МРС среде, одной и/или нескольких выбранных чистых культур Enterococcus faecium без генов патогенности высевают на 10 мл молока («Клевер, 1,5%, стерилизованное автоклавированием при 120°C в течение 20 мин) и инкубируют в течение 24-48 час при 37-42°C до заквашивания молока. Выбирают одну пробирку с более быстрым ростом культуры, определяя это по образованию сгустка в молоке. Культуру, обладающую необходимым набором свойств направляем в криохранилище для возможного использования в будущем. Полученные 10 мл закваски из отобранной культуры энтерококков используют как посевной материал для получения большего объема закваски. Для этого засевают 10 мл закваски на 1 литр прогретого при 37°C стерильного молока. Инкубируют в течение 24-48 час при 37-42°C до заквашивания молока. Проверку культуры на наличие контаминации проверяют высевом 100 мкл закваски на трипотозный агар ("Ferak", Германия), который растирают шпателем, инкубируют в течение 24 часов при 37°C. Для сохранения полученных штаммов отбирают по 2 пробирки по 1 мл полученной чистой закваски и хранят при -75°C до года.
После получения молочнокислой закваски продукт хранят до использования в холодильнике при 4°C не более 7 дней.
Безопасность полученного продукта была проверена в экспериментальном исследовании на животных и в клиническом исследовании в группе добровольцев (10 человек). При исследовании клинических и лабораторных параметров во время применения продукта негативных проявлений выявлено не было.
Клиническое исследование применения аутопробиотика на основе Enterococcus faecium
Пример 5. Экспериментальное применение аутопробиотика у крыс с индуцированным дисбиозом
Изучение эффективности и безопасности пробиотической терапии проводилось на 12 здоровых крысах-самцах линии Вистар с индуцированным дисбиозом. Крысы были рандомизированы на 3 группы.
Четырем крысам из первой группы вводилось 0,5 мл молочнокислой закваски, содержащей 5,5×108 КОЕ/мл Enterococcus faecium L5 (генетический дериват пробиотической культуры L3, имеющий гены устойчивости к эритромицину - «Ламинолакт», ООО «Авена», Россия, Патент РФ №2227039).
Крысы второй группы (4 крысы) получали молочнокислую закваску, содержащую 108 КОЕ/мл собственных Enterococcus faecium.
Четыре крысы третьей группы получали по 0,5 мл молока.
В ходе эксперимента осуществлялось наблюдение за аппетитом, весом, характером стула и поведением лабораторных животных, проводилось микробиологическое исследование фекалий на 1- и 8-й дни наблюдения. Перед использованием собственных штаммов энтерококков проводилось их генетическая идентификация и исследование на наличие факторов патогенности методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
При рассмотрении результатов исследования оказалось, что у крыс, получавших аутопробиотик, в более короткие сроки (на 3-е сутки) против крыс, получавших Enterococcus faecium L5 (на 5-е сутки) наступили нормализация веса и аппетита. В эти же сроки наблюдалась нормализация стула.
При анализе микробиологических данных было выявлено:
- достоверное увеличение количества лактобацилл в группе, получавших аутопробиотики (от 5,17±0,7 до 7,0±0,27 lg КОЕ) (p<0,01);
- значительное увеличение бифидобактерий в группе аутопробиотической терапии (с 4,0±0,89 до 6,0±0,26 lg КОЕ);
- уменьшение количества представителей условно-патогенной флоры как в группе, получавшей аутопробиотик, так и в группе, получавшей Enterococcus faecium L5.
Пример 6. Клиническое исследование безопасности применения аутопробиотика на основе Enterococcus faecium у добровольцев
Безопасность применения аутопробиотического продукта исследована на 10 здоровых добровольцах. В ходе исследования контролировались клинические показатели (аппетит, характер стула, наличие диспепсических расстройств, температура тела, общее самочувствие) и лабораторные данные (гематологические показатели, показатели, характеризующие функции печени, почек, поджелудочной железы). Проводился микробиологический контроль фекалий испытуемых.
Испытуемые получали молочнокислую закваску, содержащую 108 КОЕ/мл собственных энтерококков в 1 мл закваски, в дозе 100 мм/сутки - по 50 мл 2 раза в день в течение 10 дней.
В ходе проведения клинического исследования каких-либо негативных проявлений на фоне применения аутопробиотика с Enterococcus faecium выявлено не было. Все испытуемые отметили хорошие органолептические свойства (вкус, консистенцию, цвет) продукта.
Пример 7. Применения аутопробиотика на основе Enterococcus faecium в клинической практике
Эффективность применения заявляемого продукта исследована на группе пациентов, страдающих синдромом раздраженной толстой кишки (СРК). Обследованы 50 пациентов с СРК в возрасте от 22 до 55 лет.
С целью объективизации исследования пациенты методом случайной выборки были распределены в 2 группы:
- пациенты первой группы (25 человек) получали молочнокислую закваску, содержащую 108 КОЕ/мл собственных энтерококков {Enterococcus faecium) в 1 мл закваски, в дозе 100 мл/сутки - по 50 мл 2 раза в день в течение 10 дней);
- пациенты второй группы получали молочнокислую закваску, содержащую Enterococcus faecium L3, в титре 108 КОЕ/мл) в дозе 100 мл/сутки (по 50 мл 2 раза в день в течение 10 дней).
Клиническая оценка влияния пробиотической терапии на состояние пациентов с СРК проводилась на основании динамики выраженности таких характерных для СРК симптомов, как выраженность боли в животе, дискомфорт в эпигастральной области, метеоризма, характеристика стула по Бристольской шкале (БШ). Так же оценивалась сохранность аппетита, общее самочувствие по оценке пациентом.
При контрольном обследовании пациентов после курса лечения отмечалось значительное улучшение по всем клиническим показателям в обеих группах, что соответствует данным научных исследований [17-18]. В то же время в динамике некоторых показателей двух групп сравнения наблюдались достоверные различия. Так, в группе добровольцев, получавших аутопробиотик, достоверно менее выраженным был метеоризм (основной причиной которого является избыточный рост условно-патогенной флоры). Динамика этого показателя в группе аутопробиотика составила от 2,45±0,12 до 0,62±0,16 балла против 2,33±0,11 и 1,33±0,17 балла в группе получавших Enterococcus faecium 13. Так же на фоне применения заявляемого продукта значительно менее выраженными стали такие клинические проявления СРК, как боль в животе (0,41±0,15 против 0,87±0,15 балла в группе Enterococcus faecium L3), чувство тяжести в животе (0,37±1,14 против 0,79±1,17 балла).
При микробиологическом исследовании состояния кишечного микробиоценоза наблюдаемых пациентов было выявлено, что как после курса лечения молочнокислой закваски на основе штамма Enterococcus faecium L3, так и после лечения аутопробиотиком состояние микрофлоры достоверно улучшилось.
Более значимые изменения произошли после проведения курса аутопробиотической терапии:
1. Отмечается достоверное снижение количества условно-патогенных энтеробактерий с 0,87±0,38 до 0,12±0,12 (p=0,04).
2. Достоверно увеличилось количество бифидобактерий с 7,79±0,28 до 8,95±0,04 (p=0,0009).
3. Достоверно увеличилось количество лактобацилл с 7,83±0,21 до 8,95±0,04 (p=0,0007).
4. Достоверно увеличилось количество энтерококков с 4,91±0,11 до 5,83±0,20 (p=0,002).
5. Достоверно увеличилось количество E.Coli с 6,12±0,19 до 6,41±0,17 (p=0,005).
Как показывают результаты многочисленных апробаций заявленного способа, существенно сокращается время приготовления пробиотического продукта, полученного на основе аутоштаммов Enterococcus faecium, который, в сравнении с аналогичными биотехнологическими пробиотиками, является оригинальным, эффективным и безопасным средством для лечения дисбиоза любой этиологии.
Используемые источники информации
1. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И. и др. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. клин, гастроэнтерол. 2004. №3. С.83-87.
2. Ручкина И.Н., Парфенов А.И., Осипов А.Г. Особенности комплексной терапии постинфекционного синдрома раздраженного кишечника // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2007. №1-2. С.М94.
3. Суворов А.Н. Применение пробиотиков для профилактики и лечения различных заболеваний. - Санкт-Петербург, 2004. - 32 с.
4. Collins M.D., Gibson G.R. Probiotics, prebiotics and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut // Am J Clin Nutr. 1999; 69: 1052-1057.
5. Бондаренко B.M. "Острова" патогенности бактерий // Журн. микробиол. 2001. №4. С.67-74.
6. Отраслевой Стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» // ОСТ 91500.11.0004-2003, Приказ МЗ РФ №231 от 09.06.2003.
7. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б. и др. Бактериальные пробиотики: биотехнология, клиника, алгоритмы выбора. - Санкт-Петербург, 2008. - 136 с.
8. Kelly D., Conway S., Aminov R. Commensal gut bacteria: mechanism of immune modulation // Trends Immunol. 2005; 26: 326-333.
9. Boirivant M., Strober W. The mechanism of action of probiotics. Curr Opin Gastroenterol 2007; 23(6): 679-92.
10. Шендеров Б.А. «Медицинская микробная экология и функциональное питание», Том III, Москва, 2001 г.
11. Авторское Свидетельство СССР №1286212, опубликовано 30.01.87.
12. Патент РФ №2320355 C1, опубликовано 27.03.2008. «Способ получения биомассы аутоштамма лактобактерий жидкой «Лакти» (RU) - прототип.
13. Суворов А.Н., Захаренко С.М., Алехина Г.Г. Энтерококки как пробиотики выбора // Клин. питание (СПб.). 2003. №1. С.26-29.
14. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // Журн. микробиологии. 2004. №1. С.84-92.
15. ГОСТ 28566-90. Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества энтерококков. Дата издания: 01.10.2005. Дата введения в действие: 01.07.1991. ВНИИ консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП). Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-гигиеническому надзору (контролю).
16. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
17. Nobaek S, Johansson ML, Molin G, et al. Alteration of intestinal microflora is associated with reduction in abdominal bloating and pain in patients with irritable bowel syndrome. Am J Ga-stroenterol 2000; 95: 1231-38.
18. Pimentel M., Chow E.J., Lin H.C. Eradication of small intestinal overgrowth reduce symptoms of irritable bowel syndrome // Am J Gastronterol. 2000; 95: 3503-3506.
Claims (3)
1. Способ получения аутопробиотика на основе Enterococcus faecium, представителя индигенной микрофлоры кишечника хозяина, характеризующийся забором пробы нативного материала, посевом бактерий из фекалий пациента на селективную питательную среду и выращиванием культуры в селективной питательной среде, идентификацией и отбором типичных для Enterococcus faecium колоний, получением чистой культуры Enterococcus faecium и уточнением видовой принадлежности и содержания факторов патогенности методом полимеразной цепной реакции, отбором апатогенных клонов Enterococcus faecium, соответствующих стандартам генетической безопасности и физиологической функциональности, из которых готовят молочнокислую закваску.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отобранные апатогенные клоны Enterococcus faecium депонируют в криохранилище при температуре не выше 75°С со сроком хранения не более 1 года.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве селективной питательной среды используют энтерококк-агар.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010154822/10A RU2460778C1 (ru) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | Способ получения аутопробиотика на основе enterocuccus faecium, представителя индигенной микрофлоры кишечника хозяина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010154822/10A RU2460778C1 (ru) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | Способ получения аутопробиотика на основе enterocuccus faecium, представителя индигенной микрофлоры кишечника хозяина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010154822A RU2010154822A (ru) | 2012-07-10 |
| RU2460778C1 true RU2460778C1 (ru) | 2012-09-10 |
Family
ID=46848299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010154822/10A RU2460778C1 (ru) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | Способ получения аутопробиотика на основе enterocuccus faecium, представителя индигенной микрофлоры кишечника хозяина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2460778C1 (ru) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2505304C2 (ru) * | 2010-06-22 | 2014-01-27 | Олег Ювенальевич Кузнецов | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы |
| RU2546253C2 (ru) * | 2013-04-25 | 2015-04-10 | Владимир Ильич Симаненков | Способ получения персонифицированного аутопробиотического продукта и способ лечения синдрома раздраженной кишки с использованием этого продукта |
| RU2553372C1 (ru) * | 2014-01-27 | 2015-06-10 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ профилактики постинфекционного синдрома раздраженной кишки |
| RU2580002C1 (ru) * | 2015-05-19 | 2016-04-10 | Дмитрий Евгеньевич Денисов | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии |
| RU2734896C2 (ru) * | 2018-12-28 | 2020-10-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ приготовления аутопробиотика на основе анаэробного консорциума бактерий |
| RU2758246C1 (ru) * | 2020-12-25 | 2021-10-27 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ монотерапии гастрита, ассоциированного с инфекцией Helicobacter pylori |
| RU2766765C1 (ru) * | 2021-05-25 | 2022-03-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства" | Способ лечения функциональных заболеваний желудочно-кишечного тракта у детей |
| WO2024231722A1 (en) | 2023-05-11 | 2024-11-14 | Nikolaev Fedor | Method of producing an autoprobiotic formulation and use thereof |
| RU2835581C1 (ru) * | 2024-07-03 | 2025-02-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ подбора пробиотических и аутопробиотических штаммов микроорганизмов по устойчивости к цитостатикам при терапии колоректального рака |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2139070C1 (ru) * | 1999-03-31 | 1999-10-10 | Шендеров Борис Аркадьевич | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы |
| RU2320355C1 (ru) * | 2006-06-20 | 2008-03-27 | Людмила Егоровна Черных | Способ получения биомассы аутоштамма лактобактерий жидкой "лакти" |
| RU2329668C2 (ru) * | 2006-06-23 | 2008-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Авена" (ООО "Авена") | Композиция для обогащения потребляемых продуктов длительного хранения и способ ее приготовления |
-
2010
- 2010-12-30 RU RU2010154822/10A patent/RU2460778C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2139070C1 (ru) * | 1999-03-31 | 1999-10-10 | Шендеров Борис Аркадьевич | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы |
| RU2320355C1 (ru) * | 2006-06-20 | 2008-03-27 | Людмила Егоровна Черных | Способ получения биомассы аутоштамма лактобактерий жидкой "лакти" |
| RU2329668C2 (ru) * | 2006-06-23 | 2008-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Авена" (ООО "Авена") | Композиция для обогащения потребляемых продуктов длительного хранения и способ ее приготовления |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СИМАНЕНКОВ В.И. и др. Опыт экспериментального и доклинического изучения аутопробиотиков. Материалы Всероссийской конференции гастроэнтерологов юго-западного региона, 2009, Ростов-на-Дону, 25-27 апреля, с.83-87. VELD J.H., BOSSCHAERT M.A.R., SHORTT С. Health aspects of probiotics. Food Sci. Technol. Today. 1998, v.12, N1, p.46-50. * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2505304C2 (ru) * | 2010-06-22 | 2014-01-27 | Олег Ювенальевич Кузнецов | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы |
| RU2546253C2 (ru) * | 2013-04-25 | 2015-04-10 | Владимир Ильич Симаненков | Способ получения персонифицированного аутопробиотического продукта и способ лечения синдрома раздраженной кишки с использованием этого продукта |
| RU2553372C1 (ru) * | 2014-01-27 | 2015-06-10 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ профилактики постинфекционного синдрома раздраженной кишки |
| RU2580002C1 (ru) * | 2015-05-19 | 2016-04-10 | Дмитрий Евгеньевич Денисов | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии |
| RU2734896C2 (ru) * | 2018-12-28 | 2020-10-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ приготовления аутопробиотика на основе анаэробного консорциума бактерий |
| RU2758246C1 (ru) * | 2020-12-25 | 2021-10-27 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ монотерапии гастрита, ассоциированного с инфекцией Helicobacter pylori |
| RU2766765C1 (ru) * | 2021-05-25 | 2022-03-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства" | Способ лечения функциональных заболеваний желудочно-кишечного тракта у детей |
| WO2024231722A1 (en) | 2023-05-11 | 2024-11-14 | Nikolaev Fedor | Method of producing an autoprobiotic formulation and use thereof |
| RU2835581C1 (ru) * | 2024-07-03 | 2025-02-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ подбора пробиотических и аутопробиотических штаммов микроорганизмов по устойчивости к цитостатикам при терапии колоректального рака |
| RU2850088C1 (ru) * | 2024-10-01 | 2025-11-05 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" | Способ улучшения качества жизни у пациентов с колоректальным раком, получающих химиотерапию |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010154822A (ru) | 2012-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bubnov et al. | Specific properties of probiotic strains: relevance and benefits for the host | |
| RU2460778C1 (ru) | Способ получения аутопробиотика на основе enterocuccus faecium, представителя индигенной микрофлоры кишечника хозяина | |
| CN110964655B (zh) | 一种乳双歧杆菌bl-99及其应用 | |
| RU2544054C2 (ru) | Применение молочнокислых бактерий, ингибирующих газообразующие колиформные бактерии, выделенные от новорожденных, страдающих коликами | |
| CN110144304B (zh) | 干酪乳杆菌菌株及其应用 | |
| CN112143680B (zh) | 具有抗氧化功效副干酪乳杆菌zjuids05及其应用 | |
| Lamari et al. | Selection of lactic acid bacteria as candidate probiotics and in vivo test on Artemia nauplii | |
| CN110452828B (zh) | 罗伊氏乳杆菌菌株及其应用 | |
| RU2580002C1 (ru) | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии | |
| Mansour et al. | Inhibition of Clostridium difficile in mice using a mixture of potential probiotic strains Enterococcus faecalis NM815, E. faecalis NM915, and E. faecium NM1015: novel candidates to control C. difficile infection (CDI) | |
| CN111849810A (zh) | 拮抗幽门螺旋杆菌的乳酸菌zjuids03及其应用 | |
| CN112812999A (zh) | 一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌slb01及其衍生产品和应用 | |
| RU2553372C1 (ru) | Способ профилактики постинфекционного синдрома раздраженной кишки | |
| CN114164157A (zh) | 用以抑制发炎缓解牙龈肿痛改善口腔菌群平衡的唾液乳杆菌菌株zk-88 | |
| Xu et al. | Probiotic characterization and comparison of broiler-derived lactobacillus strains based on technique for order preference by similarity to ideal solution analysis | |
| WO2024260441A1 (zh) | 一种复合菌粉制剂及其制备方法和用途 | |
| CN114164158A (zh) | 用以抑制病原菌缓解炎症调节菌群平衡动物双歧杆菌株zk-77 | |
| JP4457364B2 (ja) | 新規な乳酸菌及び当該乳酸菌を使用して加工した各種製品 | |
| Anjum et al. | Potentially probiotic Limosilactobacillus reuteri from human milk strengthens the gut barrier in T84 cells and a murine enteroid model | |
| RU2546253C2 (ru) | Способ получения персонифицированного аутопробиотического продукта и способ лечения синдрома раздраженной кишки с использованием этого продукта | |
| KR101098946B1 (ko) | 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 함유하는 사료첨가제 조성물 | |
| CN116064268A (zh) | 乳酸菌菌株的培养物及其用于抑制肠胃道病原菌生长以及促进肠道健康的用途 | |
| TWI600758B (zh) | 具免疫調節機能的植物乳桿菌及其用途 | |
| CN117721032A (zh) | 一种复合菌粉制剂及其制备方法和用途 | |
| RU2500411C2 (ru) | Способ индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий для эффективной интравагинальной терапии |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190905 Effective date: 20190905 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190905 Effective date: 20210825 |