RU2337358C1 - Method of spectrophotometric determination of concentration of liposomally bagged pharmaceutical preparations - Google Patents
Method of spectrophotometric determination of concentration of liposomally bagged pharmaceutical preparations Download PDFInfo
- Publication number
- RU2337358C1 RU2337358C1 RU2007112306/15A RU2007112306A RU2337358C1 RU 2337358 C1 RU2337358 C1 RU 2337358C1 RU 2007112306/15 A RU2007112306/15 A RU 2007112306/15A RU 2007112306 A RU2007112306 A RU 2007112306A RU 2337358 C1 RU2337358 C1 RU 2337358C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- concentration
- substance
- solution
- drug
- determination
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 40
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 36
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 29
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 15
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 10
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 9
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- -1 indolocarbazole nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960005544 indolocarbazole Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области исследования и анализа различных веществ, в частности фармацевтических препаратов, и может быть использовано для определения концентрации исследуемого вещества при разработке новых сложных лекарственных форм с использованием спектрофотометрического метода.The invention relates to the field of research and analysis of various substances, in particular pharmaceutical preparations, and can be used to determine the concentration of the analyte in the development of new complex dosage forms using the spectrophotometric method.
Известен способ спектрофотометрического определения концентраций различных индикаторов в воде, в соответствии с которым водный раствор очищают от механических примесей и осветляют центрифугированием, полученный раствор разделяют на равные порции по числу определяемых индикаторов и в каждую порцию добавляют дополнительные реагенты для анализа соответствующих индикаторов, а количественное содержание отдельных индикаторов в исходной пробе определяют по результатам оптических измерений каждой приготовленной порции раствора относительно величины естественного уровня фона при длинах волн, характерных для исследуемых индикаторов, при этом анализ проводят по результатам трех оптических измерений каждой смеси и измерение концентрации отдельных индикаторов при их совместном присутствии в пробе воды осуществляют интерполяционным методом по результатам трех анализов - исходной пробы без добавки и исходной пробы с двумя добавками, сначала фиксированного количества исследуемого индикатора, затем фиксированного количества воды [1].There is a method of spectrophotometric determination of the concentrations of various indicators in water, according to which the aqueous solution is purified from mechanical impurities and clarified by centrifugation, the resulting solution is divided into equal portions according to the number of determined indicators and additional reagents are added to each portion to analyze the corresponding indicators, and the quantitative content of individual indicators in the initial sample is determined by the results of optical measurements of each prepared portion of the solution relative The values of the natural background level at wavelengths characteristic of the studied indicators are analyzed, and the analysis is carried out according to the results of three optical measurements of each mixture and the concentration of individual indicators when they are combined in a water sample is carried out by the interpolation method according to the results of three analyzes - the initial sample without additives and the initial sample with two additives, first a fixed amount of the indicator under investigation, then a fixed amount of water [1].
Недостатком способа является относительно узкая область применения.The disadvantage of this method is the relatively narrow scope.
Известен также способ, который заключается в дезинтеграции липосомальных везикул нагреванием до температуры 90-100°С [3].There is also known a method which consists in the disintegration of liposomal vesicles by heating to a temperature of 90-100 ° C [3].
Недостатком этого способа является относительно низкая точность, поскольку возникает обратная интеграция везикул при остывании смеси. В результате липосомальные везикулы и мицеллы формируются заново и часть препарата попадает обратно в липосомы, поэтому в водном растворе можно измерить лишь оставшуюся часть реальной концентрации препарата.The disadvantage of this method is the relatively low accuracy, since there is a back integration of the vesicles during cooling of the mixture. As a result, liposomal vesicles and micelles are re-formed and part of the drug goes back to the liposomes, so only the remaining part of the real concentration of the drug can be measured in an aqueous solution.
Заслуживает внимания способ осаждения липосом, нагруженных препаратом с помощью протамин сульфата, с последующим спектрофотометрическим определением неинкапсулированного вещества в полученном супернатанте [5].Noteworthy is the method of deposition of liposomes loaded with the drug using protamine sulfate, followed by spectrophotometric determination of the unencapsulated substance in the obtained supernatant [5].
Однако метод имеет существенные ограничения, связанные с возможностью соосаждения определяемого вещества.However, the method has significant limitations associated with the possibility of coprecipitation of the analyte.
Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является способ, основанный на разрушении липидных везикул в водном растворе цитостатиков путем введения в него 0,05% раствора Тритон-100 и последующем флуориметрического измерения концентрации вышедшего в водный раствор препарата [4].The closest in essence to the proposed one is a method based on the destruction of lipid vesicles in an aqueous solution of cytostatics by introducing a 0.05% solution of Triton-100 into it and subsequent fluorimetric measurement of the concentration of the drug released into the aqueous solution [4].
Недостатком метода является относительно низкая точность, вызванная образование различных мицеллярных форм определяемого препарата, что приводит к серьезным погрешностям в измерениях и вызывает трудности в интерпретации получаемых результатов. Кроме того, Тритон-100 обладает широким спектром поглощения и флуоресценции с несколькими максимумами. Способ имеет также относительно ограниченную область применения, поскольку фармпрепарат должен либо обладать собственным спектром флуоресценции в видимой области, либо быть окрашенным флуоресцентным красителем.The disadvantage of this method is the relatively low accuracy caused by the formation of various micellar forms of the drug being determined, which leads to serious measurement errors and causes difficulties in interpreting the results. In addition, Triton-100 has a wide spectrum of absorption and fluorescence with several maxima. The method also has a relatively limited scope, because the pharmaceutical product must either have its own fluorescence spectrum in the visible region, or be colored with a fluorescent dye.
Требуемый технический результат заключается в расширении области применения и повышении точности.The required technical result is to expand the scope and increase accuracy.
Требуемый технический результат достигается тем, что в способе, основанном на разрушении липосомальных везикул и последующем измерении концентрации вышедшего в водный раствор препарата цитостатика, разрушение липидных везикул проводят путем введения трехкратного объема хлороформа с последующим нагревом и центрифугированием, а измерение концентрации вышедшего в водный раствор препарата производят фотометрическим методом.The required technical result is achieved by the fact that in a method based on the destruction of liposomal vesicles and the subsequent measurement of the concentration of the cytostatic drug released into the aqueous solution, the destruction of lipid vesicles is carried out by introducing a three-fold volume of chloroform with subsequent heating and centrifugation, and the concentration of the drug released into the aqueous solution is measured photometric method.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что разрушение липидных везикул проводят в присутствии 2М раствора хлорида натрия в соотношении 1:1.In addition, the desired technical result is achieved in that the destruction of lipid vesicles is carried out in the presence of a 2M sodium chloride solution in a ratio of 1: 1.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что нагрев перед центрифугированием проводят до 50-60°С.In addition, the desired technical result is achieved in that the heating before centrifugation is carried out to 50-60 ° C.
Оптическую плотность вышедшего в водную фазу препарата определяют фотометрически по поглощению на спектрофотометре.The optical density of the drug released into the aqueous phase is determined photometrically by absorption on a spectrophotometer.
На графических изображениях представлены:On the graphic images are presented:
На фиг.1 - кривые выживаемости клеточной линии, чувствительной к воздействию препарат (фиг.1, а - липосомальная форма 1, фиг.1, б - липосомальная форма 2);Figure 1 - curves of the survival of the cell line sensitive to the effects of the drug (figure 1, a - liposomal form 1, figure 1, b - liposomal form 2);
на фиг.2 - цитотоксичность липосомальных препаратов с доксорубицином Teva в сравнении с водной формой (гормононезависимая линия аденокарциномы MDA-MB-435S);figure 2 - cytotoxicity of liposomal preparations with dova Teva in comparison with the aqueous form (hormone-independent line of adenocarcinoma MDA-MB-435S);
на фиг.3 - цитотоксичность липосомальных препаратов с гексопиранозидами ЛХС-1098аиЛХС-1110а.figure 3 - cytotoxicity of liposome preparations with hexopyranosides LHS-1098aLHS-1110a.
Способ спектрофотометрического определения концентрации липосомально инкапсулированных фармацевтических препаратов осуществляется следующим образом.The spectrophotometric method for determining the concentration of liposomally encapsulated pharmaceutical preparations is as follows.
При изготовлении липосомальных препаратов для загрузки водорастворимых фармпрепаратов применяется технология рН-градиента при инкубации на шейкерной платформе при +45°С в течение 30 мин с последующим охлаждением до +4°С. Для определения концентрации фармпрепарата, попавшего в липосомы и оставшегося внутри, липосомальные везикулы в присутствии 2М буферного раствора хлорида натрия в соотношении 1:1 разрушают (дезинтегрируют) добавлением в суспензию 3-кратного объема хлороформа, затем пробы нагревают до 50-60°С с последующим центрифугированием при 5000g в течение 5 мин.In the manufacture of liposome preparations for loading water-soluble pharmaceuticals, the pH gradient technology is used when incubated on a shaker platform at + 45 ° C for 30 minutes, followed by cooling to + 4 ° C. To determine the concentration of the pharmaceutical product that has got into the liposomes and remains inside, liposomal vesicles in the presence of a 2M buffer solution of sodium chloride in a 1: 1 ratio are destroyed (disintegrated) by adding a 3-fold volume of chloroform to the suspension, then the samples are heated to 50-60 ° C, followed by centrifugation at 5000g for 5 min.
Оптическую плотность вышедшего в водную фазу препарата определяют спектрофотометрически по поглощению на спектрофотометре, используя в качестве контроля водную фазу, полученную после проведения вышеописанных операций с липосомами без препарата.The optical density of the drug that entered the aqueous phase was determined spectrophotometrically by absorption on a spectrophotometer, using the aqueous phase obtained after the above operations with liposomes without the drug as a control.
Концентрация препарата рассчитывается по формуле Бугера-Ламберта-Бера [6]:The concentration of the drug is calculated by the formula of Bouguer-Lambert-Bera [6]:
где А(λ) - оптическая плотность (поглощение), нм;where A (λ) is the optical density (absorption), nm;
l - оптический путь, см;l is the optical path, cm;
См - молярная концентрация вещества, выраженная в моль/л;C m is the molar concentration of the substance, expressed in mol / l;
'Е - молярный коэффициент экстинкции, М-1 см-1;'E is the molar extinction coefficient, M -1 cm -1 ;
откуда СM=Аλ)/'El.whence C M = A λ) / 'El.
Способ дает возможность количественного определения веществ в двух- и мультикомпонентных системах, то есть, если липосомальный препарат включает не одно, а смесь действующих веществ. Тогда если компоненты препарата не вступают между собой в химические реакции, оптическая плотность раствора представляет собой сумму оптических плотностей компонентов и расчет концентраций компонентов А и В происходит при решении системы уравнений:The method enables the quantitative determination of substances in two- and multicomponent systems, that is, if the liposomal preparation includes not one, but a mixture of active substances. Then if the components of the drug do not enter into chemical reactions with each other, the optical density of the solution is the sum of the optical densities of the components and the concentration of components A and B is calculated when solving the system of equations:
ОткудаWhere from
Для некоторых веществ значения коэффициента экстинкции хорошо известны, и при измерениях нужно только точно воспроизвести условия, в которых они были получены. Для других веществ необходимо рассчитывать молярный коэффициент экстинкции. Это можно сделать, взяв точную навеску и приготовив раствор вещества с известной концентрацией Сcm. Рекомендуется снять спектр водного раствора с известной концентрацией вещества, а затем приступать к измерениям на длине волны, соответствующей одному из максимумов поглощения.For some substances, the values of the extinction coefficient are well known, and in the measurements it is only necessary to accurately reproduce the conditions in which they were obtained. For other substances, the molar extinction coefficient must be calculated. This can be done by taking an accurate sample and preparing a solution of a substance with a known concentration of C cm . It is recommended to take the spectrum of an aqueous solution with a known concentration of a substance, and then proceed with measurements at a wavelength corresponding to one of the absorption maximums.
Молярный коэффициент экстинкции рассчитывается по формулеThe molar extinction coefficient is calculated by the formula
'Е=A(λ)/Сcml'E = A (λ) / C cm l
Или
где A(λ) - оптическая плотность (поглощение), нм;where A (λ) is the optical density (absorption), nm;
Mr - молекулярная масса вещества, моль;M r is the molecular weight of the substance, mol;
mв-ва - масса навески сухого вещества, г;m in-va - the mass of a sample of dry matter, g;
Vp-pa - объем раствора, л.V p-pa is the volume of solution, l.
Закон Бугера-Ламберта-Бера [6] не выполняется в случаях, когда зависимость A(λ) от СM отклоняется от линейной. Для того чтобы расчет концентрации фармпрепаратов по результатам фотометрического измерения поглощения был правомерен, должны соблюдаться несколько условий:The Bouguer-Lambert-Beer law [6] is not satisfied in cases where the dependence of A (λ) on С M deviates from the linear one. In order for the calculation of the concentration of pharmaceuticals according to the results of the photometric measurement of absorption to be valid, several conditions must be met:
а) измеряющий световой пучок является монохроматическим;a) the measuring light beam is monochromatic;
б) молекулы вещества распределены по всему объему равномерно (истинный раствор) и их количество в невозбужденном состоянии не меняется в ходе измерения;b) the molecules of the substance are distributed uniformly throughout the entire volume (true solution) and their number in the unexcited state does not change during the measurement;
в) молекулы вещества не изменяют характер взаимодействий между собой и с молекулами растворителя при определяемой концентрации;c) the molecules of a substance do not change the nature of interactions between themselves and with solvent molecules at a determined concentration;
г) ослабление выходящего светового пучка происходит только за счет поглощения фотонов, люминесценция, светорассеяние, отражение и т.д. не оказывают существенного влияния на регистрируемый выходящий поток;d) the attenuation of the outgoing light beam occurs only due to the absorption of photons, luminescence, light scattering, reflection, etc. do not significantly affect the registered output stream;
д) измеряющий монохроматический пучок не приводит к фотохимическим превращениям молекул вещества (для фотодинамических агентов метод имеет ограничения).e) the measuring monochromatic beam does not lead to photochemical transformations of the molecules of the substance (for photodynamic agents, the method has limitations).
В случае отклонений от закона Бугера-Ламберта-Бера необходимо строить градуировочные графики и рассчитывать относительную ошибку абсорбционного анализа. Например, соотношение между ошибками измерения оптической плотности (ΔАλ) и пропусканием раствора вещества (ΔТ) выражаетсяIn case of deviations from the Bouguer-Lambert-Beer law, it is necessary to build calibration graphs and calculate the relative error of the absorption analysis. For example, the ratio between the errors in measuring the optical density (ΔA λ ) and the transmission of a solution of a substance (ΔT) is
Для оценки достоверности полученных данных с применением разработанного нами метода проводили контрольные измерения количества инкапсулированного в липосомы вещества с применение следующих методов.To assess the reliability of the obtained data using the method developed by us, control measurements of the amount of a substance encapsulated in liposomes were carried out using the following methods.
1. Метод хроматографического разделения незагруженной в липосомы фракции вещества от включенного в липосомы препарата с последующим фотометрическим определением незагруженной фракции (пример 1).1. The method of chromatographic separation of unloaded in liposome fractions of a substance from a preparation included in liposomes with subsequent photometric determination of unloaded fractions (example 1).
2. Биологический тест, основанный на оценке цитотоксической активности инкапсулированного препарата (пример 2).2. Biological test based on the assessment of the cytotoxic activity of the encapsulated drug (example 2).
В зависимости от природы инкапсулируемого в липосому вещества (сродства к водной фазе) патентуемый метод определения предполагает возможность оценки концентрации широкого спектра соединений, обладающих различным индексом гидрофильно/гидрофобного баланса).Depending on the nature of the substance encapsulated in the liposome (affinity for the aqueous phase), the patented method of determination implies the possibility of assessing the concentration of a wide range of compounds with different hydrophilic / hydrophobic balance indices).
1. Для оценки соединений гидрофильной природы достаточным является количественное фотометрическое определение концентрации препарата в водной фазе, причем в широком диапазоне поглощения (220-620 нм).1. To assess compounds of hydrophilic nature, quantitative photometric determination of the concentration of the drug in the aqueous phase is sufficient, and in a wide absorption range (220-620 nm).
2. Для оценки соединений гидрофобной природы достаточным является количественное фотометрическое определение концентрации препарата в органической фазе хлороформа, в диапазоне поглощения (330-620 нм).2. To assess compounds of hydrophobic nature, quantitative photometric determination of the concentration of the drug in the organic phase of chloroform in the absorption range (330-620 nm) is sufficient.
3. Для оценки соединений амфифильной природы необходимо количественное фотометрическое определение концентрации препарата в обоих фазах, в диапозоне поглощения (330-620 нм).3. To evaluate compounds of amphiphilic nature, a quantitative photometric determination of the concentration of the drug in both phases, in the absorption range (330-620 nm) is necessary.
Сужение диапазона длин волн, в которых можно проводить количественное определение концентрации вещества, обусловлено тем фактом, что липиды, стерины и жирные кислоты, входящие в состав липосом, также экстрагируются в органическую фазу применяемого растворителя и поглощают в диапазоне от 260 до 310 нм. Это может внести существенную ошибку в измерения и затруднить интерпретацию полученных результатов.The narrowing of the wavelength range in which the concentration of the substance can be quantified is due to the fact that the lipids, sterols and fatty acids that make up the liposomes are also extracted into the organic phase of the solvent used and absorb in the range from 260 to 310 nm. This can introduce a significant error in the measurements and complicate the interpretation of the results.
Во всех случаях необходимо проводить измерение контрольных образцов (липосом без препарата) по вышеприведенной схеме.In all cases, it is necessary to measure control samples (liposomes without preparation) according to the above scheme.
Пример 1. Определение содержания доксорубицина в липосомальных препаратах ССЛ-Доксорубицин и АТЛ-25-ДоксорубицинExample 1. Determination of the content of doxorubicin in liposome preparations SSL-Doxorubicin and ATL-25-Doxorubicin
Для определения концентрации загруженного доксорубицина дезинтеграция липосомальных препаратов производилась добавлением 3-кратного объема хлороформа при нагревании до 60°С с последующим центрифугированием при 5000g в течение 5 мин. Это делали следующим образом: в 1,5 мл пробирки эппендорф разливали по 100 мкл образцов липосомальной суспензии, разбавленных 1:1 2М раствором NaCl и для контроля - по 100 мкл раствора доксорубицина известной концентрации в 2М растворе NaCl. Далее добавляли в пробирки по 300 мкл хлороформа (производитель - «Борис Авогадро»), нагревали до 60°С и центрифугировали при 5000 g.To determine the concentration of loaded doxorubicin, liposome preparations were disintegrated by adding a 3-fold volume of chloroform when heated to 60 ° C, followed by centrifugation at 5000g for 5 min. This was done as follows: 100 μl of samples of liposome suspension diluted 1: 1 with 2M NaCl solution was poured into 1.5 ml tubes of Eppendorf and, for control, 100 μl of a solution of doxorubicin of known concentration in a 2M NaCl solution. Then 300 μl of chloroform (manufacturer - Boris Avogadro) was added to the tubes, heated to 60 ° C and centrifuged at 5000 g.
где СM - молярная концентрация вещества, выраженная в моль/л,where C M is the molar concentration of the substance, expressed in mol / l,
А(495) - оптическая плотность (поглощение) при 495 нм,And (495) - optical density (absorption) at 495 nm,
'Е - коэффициент экстинкции доксорубицина, равный 10650 М-1 см-1,'E is the extinction coefficient of doxorubicin equal to 10650 M -1 cm -1 ,
l - толщина образца (оптический путь), см.l is the thickness of the sample (optical path), see
Результаты расчетов приведены в табл.1 в графе «Концентрация цитостатика, μМ».The calculation results are shown in table 1 in the column "Cytostatic concentration, μM".
В случае сложных лекарственных форм цитостатиков, одни из которых представляют собой липосомальные препараты, при изучении их цитотоксического и цитостатического эффекта необходимо учитывать несколько факторов, оказывающих влияние на эти эффекты. Основной из них - это концентрация загруженного агента, которая должна быть по возможности максимальной от исходной концентрации препарата в буфере при получении суспензии. В то же время по данным литературы число молекул доксорубицина в одной липосоме составляет 103-104 и концентрация препарата в липосомальной суспензии не может превышать 200 μМ на мл.In the case of complex dosage forms of cytostatics, some of which are liposomal preparations, when studying their cytotoxic and cytostatic effects, several factors affecting these effects must be taken into account. The main one is the concentration of the loaded agent, which should be as high as possible from the initial concentration of the drug in the buffer upon receipt of the suspension. At the same time, according to the literature, the number of doxorubicin molecules in one liposome is 10 3 -10 4 and the concentration of the drug in the liposome suspension cannot exceed 200 μM per ml.
Было определено, что в случае больших величин концентрации происходит спонтанное вытекание агента из везикул наружу. По нашим данным для получения устойчивого цитотоксического эффекта in vitro достаточно концентрации инкапсулированного цитостатика 50-100 μM на мл, однако для достижения хорошего противоопухолевого эффекта in vivo концентрации должны быть выше.It was determined that in the case of large concentrations, spontaneous leakage of the agent from the vesicles to the outside occurs. According to our data, to obtain a stable in vitro cytotoxic effect, a concentration of 50-100 μM per ml of encapsulated cytostatic is sufficient, but to achieve a good antitumor effect in vivo, the concentrations should be higher.
Пример 2. Определение содержания индолокарбазол-нуклеозидпроизводных в липосомальных препаратах с расчетом коэффициента экстинкции.Example 2. Determination of the content of indolocarbazole nucleoside derivatives in liposome preparations with the calculation of the extinction coefficient.
В этом примере требовалось снять спектры и рассчитать коэффициенты экстинкции нуклеозидпроизводных. Молярные коэффициенты экстинкции рассчитывали по формуле (6)In this example, it was required to take the spectra and calculate the extinction coefficients of the nucleoside derivatives. The molar extinction coefficients were calculated by the formula (6)
'E=A(λ)Vp-pa/Mr mв-ваl 'E = A (λ) V p-pa / M r m a l-va
Далее по той же методике, что и в Примере 1, проводили измерения оптической плотности на длине волны, соответствующей максимуму поглощения, и рассчитывали концентрации препаратов. Результаты измерений иллюстрируются данными, приведенными в Таблице 2.Further, by the same methodology as in Example 1, we measured the optical density at a wavelength corresponding to the absorption maximum, and calculated drug concentrations. The measurement results are illustrated by the data shown in Table 2.
Пример 3. Контрольный эксперимент по проверке концентрации инкапсулированного в липосомы препаратаExample 3. Control experiment to verify the concentration of the drug encapsulated in liposomes
Липосомальный препарат (200 мкл суспензии) наносят на колонку с Sephadex G25 (2 мл), предварительно уравновешенную фосфатно-солевым буфером (рН 7.4). Элюцию липосомальной фракции проводят в объеме 0.3 объема колонки фосфатно-солевым буфером, при наличие проточного фотометра проводят дополнительный контроль полноты элюции по измерению поглощения на 280 нМ. Неинкапсулированную часть вещества (низкомолекулярное соединение (меньше 1 кДа)) элюируют дополнительно 1.5 мл элюирующего буфера. Собранную фракцию не включенного в липосому вещества определяют фотометрически по формуле (1)The liposomal preparation (200 μl of suspension) is applied to a column with Sephadex G25 (2 ml), previously equilibrated with phosphate-buffered saline (pH 7.4). The elution of the liposomal fraction is carried out in a volume of 0.3 column volume with phosphate-buffered saline; in the presence of a flow-through photometer, additional monitoring of the elution completeness is carried out by measuring the absorption at 280 nM. The unencapsulated part of the substance (low molecular weight compound (less than 1 kDa)) is eluted with an additional 1.5 ml of elution buffer. The collected fraction of a substance not included in the liposome is determined photometrically by the formula (1)
A(λ)='ElCн,A (λ) = 'ElC n ,
где Сн - молярная концентрация вещества, не включенного в липосомы, моль/л (М),where C n is the molar concentration of a substance not included in liposomes, mol / l (M),
откуда Сн=Аλ)/'Elwhence C n = A λ) / 'El
Абсолютное количество вещества, не включенного в липосомы, определяют по следующей формуле:The absolute amount of a substance not included in liposomes is determined by the following formula:
Н=Сн·Vэ·Мr N = Sn · V e · M r
Где H - количество вещества, не включенного в липосомы (г)Where H is the amount of substance not included in liposomes (g)
Сн - молярная концентрация в-ва, не включенного в липосомы, моль/л (М),C n - molar concentration of v-va, not included in liposomes, mol / l (M),
Vэ - объем элюата, содержащего неинкапсулированное вещество,V e - the volume of the eluate containing the unencapsulated substance,
Mr - молекулярная масса вещества,M r is the molecular weight of the substance,
Количество вещества, включенного в липосомы, определяют по формуле (5)The amount of substance included in the liposomes is determined by the formula (5)
где А - количество вещества, включенного в липосомы,where A is the amount of substance included in liposomes,
Т - общее количество вещества (г), взятое для получения липосом,T is the total amount of substance (g) taken to obtain liposomes,
К - пересчетный коэффициент, равный отношению объему суспензии липосом, взятых для исследования количественного содержания инкапсулированного компонента (V1) к тотальному объему раствора полученных липосом (V2) k=V1/V2,K is a conversion factor equal to the ratio of the volume of the suspension of liposomes taken to study the quantitative content of the encapsulated component (V 1 ) to the total volume of the solution of the obtained liposomes (V 2 ) k = V 1 / V 2 ,
Н - количество вещества, не включенного в липосомы (г),N is the amount of substance not included in liposomes (g),
Данный метод контроля имеет ограничения и может быть применен для соединений гидрофильной и амфифильной природы.This control method has limitations and can be used for compounds of hydrophilic and amphiphilic nature.
Пример 4. Контрольный эксперимент по оценке цитотоксической активности липосомально инкапсулированного препаратаExample 4. A control experiment to assess the cytotoxic activity of a liposomally encapsulated drug
Метод тестирования цитотоксического эффекта фармпрепаратов in vitro - МТТ позволяет определить концентрацию цитотоксического агента, необходимую для того, чтобы половина клеток в живой культуре погибла (IC50).The method of testing the cytotoxic effect of pharmaceutical preparations in vitro - MTT allows you to determine the concentration of the cytotoxic agent necessary for half of the cells in a living culture to die (IC 50 ).
Метод является относительным и основан на данных, полученных при оценке цитотоксической активности липосомальных форм препаратов с разным уровнем инкапсуляции (загрузки). Данный контрольный тест является правомочным для оценки точности получаемых количественных результатов с применением патентуемого метода, поскольку имеется четкая зависимость цитотоксического эффекта препарата от его концентрации. Данный метод контроля может быть применен для соединений гидрофильной, гидрофобной и амфифильной природы.The method is relative and based on data obtained by evaluating the cytotoxic activity of liposomal forms of drugs with different levels of encapsulation (loading). This control test is eligible for assessing the accuracy of the quantitative results obtained using the patented method, since there is a clear dependence of the cytotoxic effect of the drug on its concentration. This control method can be applied to compounds of hydrophilic, hydrophobic and amphiphilic nature.
1. Липосомальную фракцию, полученную после инкапсуляции препарата в липосомы, очищают от неинкапсулированного вещества согласно методу, описанному в примере №1.1. The liposomal fraction obtained after encapsulation of the drug in liposomes is purified from unencapsulated substance according to the method described in example No. 1.
2. Снимают кривые цитотоксичности двух липосомальных фракций препарата, отличающихся разной степенью инкапсулирования последнего, используя клеточную линию, чувствительную к воздействию препарата. Для сравнительной количественной оценки содержания препарата в липосомах используют показатель титра липосомального препарата, при котором гибнет 50% клеточной популяции (Ic50) (фиг.1).2. Take the cytotoxicity curves of two liposome fractions of the drug, characterized by varying degrees of encapsulation of the latter, using a cell line sensitive to the effects of the drug. For a comparative quantitative assessment of the content of the drug in liposomes, an indicator of the titer of the liposome preparation is used, in which 50% of the cell population dies (Ic 50 ) (Fig. 1).
Вычисляют корреляционный коэффициент K, равныйCalculate the correlation coefficient K equal to
где X1 - титр липосомального препарата 1,where X1 is the titer of liposome preparation 1,
Х2 - титр липосомального препарата 2.X2 - titer of
Такое же соотношение оценивали с помощью патентуемого нами способа определения концентрации инкапсулированного препарата.The same ratio was estimated using our patented method for determining the concentration of an encapsulated preparation.
где С1 - концентрация инкапсулированного препарата в липосомальной форме 1,where C1 is the concentration of the encapsulated drug in liposome form 1,
С2 - концентрация инкапсулированного препарата в липосомальной форме 2.C2 is the concentration of the encapsulated drug in
Сравнение полученных корреляционных показателей K1 и K2 показало что данные величины различаются менее чем на 7% (таблица 1, фиг.2, 3).A comparison of the obtained correlation indices K1 and K2 showed that these values differ by less than 7% (table 1, figures 2, 3).
Таким образом, в предложенном способе достигается требуемый технический результат, заключающийся в расширении области применения и повышении точности, поскольку исключается требование, что фармпрепарат должен либо обладать собственным спектром флуоресценции в видимой области, либо быть окрашенным флуоресцентным красителем. Отсутствие необходимости использования Тритон-100 для дезинтеграции также повышает точность измерений.Thus, in the proposed method, the required technical result is achieved, which consists in expanding the scope and increasing accuracy, since the requirement is eliminated that the pharmaceutical product must either have its own fluorescence spectrum in the visible region or be dyed with a fluorescent dye. The absence of the need to use Triton-100 for disintegration also increases the accuracy of measurements.
При этом для измерения концентрации используется спектрофотометрическое, а не флуориметрическое оборудование, например спектрофотометр Ultraspec-1100 (Amersham). Метод не требует использования дорогостоящих корреляционных спектрофотометров, поэтому стоимость оборудования для пользования им в 3-5 раз меньше, чем при использовании спектрофлуориметрического метода.In this case, spectrophotometric rather than fluorimetric equipment, for example, an Ultraspec-1100 spectrophotometer (Amersham), is used to measure the concentration. The method does not require the use of expensive correlation spectrophotometers, therefore the cost of equipment for using it is 3-5 times less than when using the spectrofluorimetric method.
Кроме того, расширяется область применения способа, поскольку реализуется возможность определения концентраций как гидрофольных, так и амфифильных и гидрофобных веществ, а также их содержания в мультикомпонентных системах, когда действующий компонент фармпрепарата представлен не одним, а двумя-тремя веществами.In addition, the scope of the method is expanding, since it is possible to determine the concentrations of both hydrophilic and amphiphilic and hydrophobic substances, as well as their content in multicomponent systems, when the active component of the pharmaceutical product is not one, but two or three substances.
Источники информацииInformation sources
1. RU 2275619 С2, G01N 21/17, 2006.1. RU 2275619 C2, G01N 21/17, 2006.
2. Goren D, Horowitz AT, Tzemach D, Tarshish M, Zalipsky S, Gabizon A. "Nuclear delivery of doxorubicin via folate-targeted liposomes with bypass of multidrug-resistance efflux pump", Clin Cancer Res. 2000 May; 6(5): 1949-57.2. Goren D, Horowitz AT, Tzemach D, Tarshish M, Zalipsky S, Gabizon A. "Nuclear delivery of doxorubicin via folate-targeted liposomes with bypass of multidrug-resistance efflux pump", Clin Cancer Res. 2000 May; 6 (5): 1949-57.
3. Gardner S.C. "Delipidation treatment for large-scale protein purification processing" Thesis for MS in Chem. Engineering, Virginia Polytechnic Inst., 1996.3. Gardner S.C. "Delipidation treatment for large-scale protein purification processing" Thesis for MS in Chem. Engineering, Virginia Polytechnic Inst., 1996.
4. Lukyanov AN, Elbayoumi ТА, Chakilam AR, Torchilin VP. "Tumor-targeted liposomes: doxorubicin-loaded long-circulating liposomes modified with anticancer antibody", J. Control Release. 2004 Nov 5; 100(1): 135-44.4. Lukyanov AN, Elbayoumi TA, Chakilam AR, Torchilin VP. "Tumor-targeted liposomes: doxorubicin-loaded long-circulating liposomes modified with anticancer antibody", J. Control Release. 2004 Nov 5; 100 (1): 135-44.
5. V.Torchilin and V.Weissig, "Liposomes 2nd eds., A Practical Approach" ed. Oxford Univercity Press, 2003, 384 pp.5. V. Torchilin and V. Weissig, "
6. Дункан А., Горди В., Джонс Н., Матсен Ф., Сандорфи К., Вест В. «Применение спектроскопии в химии». /Под ред. В.Веста. - М.: ИЛ, 1959, с.659-61.6. Duncan A., Gordy V., Jones N., Matsen F., Sandorfi K., West V. "The use of spectroscopy in chemistry." / Ed. V. Vesta. - M .: IL, 1959, p. 659-61.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007112306/15A RU2337358C1 (en) | 2007-04-03 | 2007-04-03 | Method of spectrophotometric determination of concentration of liposomally bagged pharmaceutical preparations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007112306/15A RU2337358C1 (en) | 2007-04-03 | 2007-04-03 | Method of spectrophotometric determination of concentration of liposomally bagged pharmaceutical preparations |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2337358C1 true RU2337358C1 (en) | 2008-10-27 |
Family
ID=40042135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007112306/15A RU2337358C1 (en) | 2007-04-03 | 2007-04-03 | Method of spectrophotometric determination of concentration of liposomally bagged pharmaceutical preparations |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2337358C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2711908C1 (en) * | 2019-05-22 | 2020-01-24 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Method of determining vinpocetine adsorption by liposomes |
| RU2722304C2 (en) * | 2020-01-31 | 2020-05-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Method for determining the amount of doxorubicin when released from functionalized calcium phosphate constructs |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0524788A1 (en) * | 1991-07-23 | 1993-01-27 | Wako Pure Chemical Industries Ltd | Process for lysing liposome membrane |
| RU2112775C1 (en) * | 1991-02-04 | 1998-06-10 | Астра Актиеболаг | Steroid esters or their stereoisomers, method of their synthesis, pharmaceutical composition |
| RU2139083C1 (en) * | 1998-01-22 | 1999-10-10 | Сотниченко Александр Иванович | Method of preparing preparation for directed delivery of antitumor drug in cancer cell |
| RU2275619C2 (en) * | 2003-12-01 | 2006-04-27 | Самарский государственный университет | Method for spectro-photometric determining of concentrations of different indicators in bed waters |
-
2007
- 2007-04-03 RU RU2007112306/15A patent/RU2337358C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2112775C1 (en) * | 1991-02-04 | 1998-06-10 | Астра Актиеболаг | Steroid esters or their stereoisomers, method of their synthesis, pharmaceutical composition |
| EP0524788A1 (en) * | 1991-07-23 | 1993-01-27 | Wako Pure Chemical Industries Ltd | Process for lysing liposome membrane |
| RU2139083C1 (en) * | 1998-01-22 | 1999-10-10 | Сотниченко Александр Иванович | Method of preparing preparation for directed delivery of antitumor drug in cancer cell |
| RU2275619C2 (en) * | 2003-12-01 | 2006-04-27 | Самарский государственный университет | Method for spectro-photometric determining of concentrations of different indicators in bed waters |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LUKYANOV AN et al. Tumor-targeted liposomes: doxorubicin-loaded long-circulating liposomes modified with anti-cancer antibody. J Control Release. 2004 Nov 5; 100(1):135-44. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2711908C1 (en) * | 2019-05-22 | 2020-01-24 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Method of determining vinpocetine adsorption by liposomes |
| RU2722304C2 (en) * | 2020-01-31 | 2020-05-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Method for determining the amount of doxorubicin when released from functionalized calcium phosphate constructs |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mihály et al. | Characterization of extracellular vesicles by IR spectroscopy: Fast and simple classification based on amide and CH stretching vibrations | |
| Starosta et al. | Human and bovine serum albumin time-resolved fluorescence: Tryptophan and tyrosine contributions, effect of DMSO and rotational diffusion | |
| Stubbs et al. | Microviscosity of the hydrocarbon region of the bovine retinal rod outer segment disk membrane determined by fluorescent probe measurements | |
| Mikhalyov et al. | Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences | |
| Pauletti et al. | Partition coefficients in vitro: artificial membranes as a standardized distribution model | |
| Maherani et al. | Calcein release behavior from liposomal bilayer; influence of physicochemical/mechanical/structural properties of lipids | |
| Antonov et al. | Macromolecular complexes of lysozyme with kappa carrageenan | |
| Dicko et al. | Biophysical characterization of a liposomal formulation of cytarabine and daunorubicin | |
| Zhang et al. | Determination of liposomal encapsulation efficiency using proton NMR spectroscopy | |
| Hackbarth et al. | Singlet oxygen luminescence kinetics in a heterogeneous environment—Identification of the photosensitizer localization in small unilamellar vesicles | |
| Tentori et al. | Fluorescence lifetime microscopy unveils the supramolecular organization of liposomal Doxorubicin | |
| Meyer et al. | Dynamic dialysis as a method for studying protein binding II: Evaluation of the method with a number of binding systems | |
| Ragaller et al. | Dissecting the mechanisms of environment sensitivity of smart probes for quantitative assessment of membrane properties | |
| Wu et al. | Simultaneous measurement of liposome extravasation and content release in tumors | |
| RU2337358C1 (en) | Method of spectrophotometric determination of concentration of liposomally bagged pharmaceutical preparations | |
| Uchiyama et al. | Purity determination of cyclophosphamide hydrate by quantitative 31P-NMR and method validation | |
| Bohsen et al. | Interaction of liposomes with bile salts investigated by asymmetric flow field-flow fractionation (af4): A novel approach for stability assessment of oral drug carriers | |
| Gudruman et al. | Spectrophotometric determination of bisoprolol using methyl orange as reagent | |
| Long et al. | Oral administration of M13-loaded nanoliposomes is safe and effective to treat colitis-associated cancer in mice | |
| Rokitskaya et al. | Selectivity of cation transport across lipid membranes by the antibiotic salinomycin | |
| US20110223675A1 (en) | Drug release means from liposomes and method for evaluating releasability | |
| Sousa et al. | Interactions of a non-fluorescent fluoroquinolone with biological membrane models: A multi-technique approach | |
| Coppola et al. | Design, synthesis and characterisation of a fluorescently labelled CyPLOS ionophore | |
| El Jastimi et al. | A dual‐probe fluorescence method to examine selective perturbations of membrane permeability by melittin | |
| Wu et al. | Ion quantification in liposomal drug products using high performance liquid chromatography |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130404 |