RU2335296C1 - Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения неврологических заболеваний - Google Patents
Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения неврологических заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- RU2335296C1 RU2335296C1 RU2007123790/15A RU2007123790A RU2335296C1 RU 2335296 C1 RU2335296 C1 RU 2335296C1 RU 2007123790/15 A RU2007123790/15 A RU 2007123790/15A RU 2007123790 A RU2007123790 A RU 2007123790A RU 2335296 C1 RU2335296 C1 RU 2335296C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- epo
- cells
- low
- treatment
- drug
- Prior art date
Links
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 62
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 12
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 12
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 abstract 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 52
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 52
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 17
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 15
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 11
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 11
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 11
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 10
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 8
- 102000009854 cortexin Human genes 0.000 description 8
- 108010034906 cortexin Proteins 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 5
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 4
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000007845 axonopathy Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003550 Asthenic conditions Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101150035467 BDNF gene Proteins 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 208000008765 Sciatica Diseases 0.000 description 1
- 206010041549 Spinal cord compression Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 206010047163 Vasospasm Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000006470 autoimmune attack Effects 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000007177 brain activity Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000001966 cerebroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 208000022077 chronic encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002461 excitatory amino acid Effects 0.000 description 1
- 239000003257 excitatory amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 210000005153 frontal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000027928 long-term synaptic potentiation Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012907 medicinal substance Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000013435 necrotic lesion Diseases 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000001777 nootropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000002856 peripheral neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- -1 sugars amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Фармацевтическая композиция в качестве лекарственного средства включает низкосиалированные формы эритропоэтина с содержанием 6-8 остатков сиаловых кислот на молекулу белка. Изобретение обеспечивает расширение арсенала эффективных лекарственных средств для лечения неврологических заболеваний. 3 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, биотехнологии и фармацевтике и может быть использовано для профилактики и лечения неврологических заболеваний.
Все неврологические заболевания условно подразделяются по двум основным признакам: функциональные нарушения, когда структурные элементы органа еще не пострадали, и органические поражения, когда страдает сама структура. Если функциональные расстройства могут быть полностью восстановлены, то органические - только за счет новых элементов, старые уже повреждены. Наиболее известные органические заболевания нервной системы: болезнь Альцгеймера, Паркинсона, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, последствия инсультов, нейротравм и пр.
Многие заболевания нервной системы, включая рассеянный склероз, характеризуются повреждениями нервной ткани в результате какого-либо инфекционного или аутоиммунного процесса (рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз), перенесенных нейроинфекций (клещевой энцефалит), нарушений мозгового кровообращения (инсульт), после травмы и пр., а также повреждениями проводящих путей (аксональных связей) между нейронами (аксонопатия).
Известно применение для лечения неврологических заболеваний лекарственного препарата КОРТЕКСИН. Согласно фармацевтической статье №99/136/14 от 09.07.1998 г. КОРТЕКСИН представляет собой комплексный препарат, состоящий из полипептидного комплекса (50%) и глицина (50%).
КОРТЕКСИН применяют для больных при черепно-мозговой травме, нарушениях мозгового кровообращения, вирусных и бактериальных нейроинфекциях, астенических состояниях, энцефалопатиях различного генеза, острых и хронических энцефалитах и энцефаломиелитах, эпилепсии, нарушениях памяти, мышления, сниженной способности к обучению, надсегментарных вегетативных расстройствах различных формах детского церебрального паралича, задержке психомоторного и речевого развития у детей.
КОРТЕКСИН обладает тканеспецифическим действием на кору головного мозга, оказывает церебропротекторное (защищает мозг), ноотропное (улучшает обменные процессы нейрона), противосудорожное действие, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, стимулирует репаративные процессы в головном мозге (восстановление структуры ткани). Механизм действия Кортексина связан с его метаболической (обмен веществ) активностью: препарат регулирует соотношение тормозных и возбуждающих аминокислот, уровень серотонита и дофамина (одни из множества важных белков, регулирующих в основном внутримозговые функции), оказывает гамкергическое действие, обладает антиоксидантной активностью и способностью восстанавливать биоэлектрическую активность головного мозга. При описании действия КОРТЕКСИНА приводится достаточно широкий спектр состояний, когда препарат оказывался эффективным.
Однако эффекты КОРТЕКСИНА ограничены головным мозгом и не имеется данных о действии препарата на периферии, в частности на проводящие пути нервной системы, а именно на регенерацию аксонов. Кроме того, отсутствуют сведения об иммуномодулирующем действии КОРТЕКСИНА при аутоиммунных заболеваниях. Многие заболевания центральной нервной системы, в том числе рассеянный склероз имеют аутоиммунный механизм, а повреждение нейронов - следствие аутоиммунной атаки. Отсутствие точных биохимических характеристик препарата (действие препарата неопределенно вследствие того, что сам экстракт не может иметь формулы из-за его сложной структуры, а также в связи с вариабельностью биологических характеристик исходного сырья) не дает возможности его стандартизации. Препарат получается из потенциально небезопасного сырья (мозг крупного рогатого скота), сведения о проведении контроля на прионовую безопасность (отсутствие возбудителя губчатого энцефалита - «коровьего бешенства») отсутствуют (очевидно, этот контроль просто не производится).
Известно лекарственное вещество того же назначения по отношению к заявленному изобретению - эритропоэтин (далее - ЭПО) - гормон организма млекопитающих, в том числе человека, продуцируемый интерстициальными клетками почек и регулирующий эритропоэз у млекопитающих. Циркулирующий в крови гликопротеидный гормон ЭПО обеспечивает контроль дифференцировки клеток эритроидного ряда, т.е. представляет собой высокоспецифичный природный индуктор эритропоэза.
В 1986-1987 гг. были проведены клинические испытания рекомбинантного ЭПО (РЭПО), продуцируемого клетками млекопитающих (Eschbach J.W., Egrie J.C., Dowing M.R., et al., N.Eng.J.Med., 316. 73-78, 1987; Jelkmann W., Curr. Pharmaceut. Biotechnol., 1, 11-31, 2000), и он с успехом был введен в клиническую практику для коррекции анемии, связанной с хронической почечной недостаточностью в 1989 г., и утвердился в качестве золотого стандарта высокоспецифического лечения данного заболевания. В настоящее время РЭПО широко применяется для лечения больных в областях, связанных со стимуляцией гемо- и эритропоэза.
РЭПО обладает высокой специфичностью и действует в очень низких концентрациях при практически полном отсутствии побочных эффектов. Рекомбинантный ЭПО почти полностью идентичен природному гормону и представляет собой семейство близкородственных белков с одинаковой полипептидной цепью, включающей 165 аминокислот, ковалентно связанных с четырьмя разветвленными олигосахаридными цепями, составляющими около 40% общей массы молекулы 30400 Д. Олигосахаридные цепи терминально сиалированы, причем степень модификации, достигающая 14 остатков сиаловых кислот на молекулу ЭПО, служит доминирующим фактором, ответственным за проявление гематопоэтической активности in vivo (Strickland T.W., U.S. Patent, 5856298, 5 Jan., 1999).
В настоящее время установлено (Grasso G., Sfacteria A., Cerami A., Brines M., Neuroscientist, 10, 93-98, 2004), что РЭПО способен предотвращать спазм сосудов, развитие воспалительного процесса и индукцию апоптоза не только у кроветворных клеток, но и у многих других типов клеток - нейронов, кардиомиоцитов и пр. Показано (Jelkmann W., Current Pharmaceut. Biotechnol., 6, 65-79, 2005), что молекулы РЭПО могут преодолевать гематоэнцефалический барьер и уменьшать площадь некротического поражения коры головного мозга при инсультах, стимулировать частичную регенерацию аксонов. На моделях рассеянного склероза продемонстрирована (Sattier M.B., Merkler D., Maier К., Stadelman С., Enhreich H., Bahr M., Diem R., Cell. Death. Differ., 11, Suppl. 2, S181-92, 2004.) способность РЭПО уменьшать демиелинизацию и повреждение аксонов. Нейротропное действие РЭПО показано также для нейронов спинного мозга (церебральная ишемия, компрессия спинного мозга, ишиаз) и периферических нервных клеток. В связи с выявленными новыми свойствами РЭПО рассматривается в качестве перспективного препарата для лечения широкого спектра неврологических заболеваний, характеризующихся аксонопатией.
Как известно, рекомбинантный человеческий эритропоэтин имеет несколько изоформ. Клетки, производящие рекомбинантный эритропоэтин, синтезируют приблизительно 15 различных изоформ, отличающихся содержанием сиаловых кислот от 0 до 14 молекул на молекулу эритропоэтина. Смесь изоформ разделяется на фракции по содержанию сиаловых кислот.Фракция, содержащая изоформы (6 шт.) со средним количеством сиаловых кислот не менее 10 молекул на молекулу эритропоэтина, составляет фракцию высокосиалированного эритропоэтина (ВЭПО), который и используется в настоящее время для лечения анемии. До настоящего времени интересы производителей направлены на производство и сохранение клеточных линий, секретирующих (выделяющих) ЭПО, обладающий большим эффектом в отношении стимуляции гемо-эритропоэза. Это, в частности, достигается за счет увеличения содержания в ЭПО сиаловых кислот, заряда молекулы и продолжительности ее жизни в организме. Низкосиалированные формы ЭПО (НЭПО), являющиеся в существующих технологиях отходами производства, удаляются в процессе очистки препарата для повышения его эффективности при лечении анемий.
Однако эксперименты на животных показывают, что дозы РЭПО, используемые для лечения заболеваний головного мозга, должны быть существенно выше, чем при лечении анемии (Digicaylioglu M., Lipton S.A., Nayure, 412. 641-647, 2001). Фармакологические дозы ЭПО стимулируют продукцию гиперреактивных тромбоцитов, что может приводить к тромбозам (Brines M.L., Chezzi P., Keenan S., Agnello D., de Lanerolle N.C., Cerami C., Itri L.M., Cerami A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 10526-10531, 2000). Многократное введение РЭПО может также вызвать увеличение массы красных кровяных клеток. На моделях с использованием животных показано, что ЭПО - зависимое увеличение гематокрита может вызывать и амплифицировать повреждения мозга (Xenocostas A, Cheung W.K., Farrell F.X., et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 22, 230, 2003).
С целью исключения гематопоэтического действия препарата, в результате обработки нейроминидазой были изучены защитные свойства формы эритропоэтина, полностью лишенной сиаловых кислот (асиалированный ЭПО), (Erbayraktar S., Grasso G., Sfacteria A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100. 6741-6746. 2003). Оказалось, что при очень коротком времени жизни в плазме и, как следствие, отсутствии эритроидной активности асиалированный ЭПО в фармакологических дозах проникает через гематоэнцефалический барьер, связывается с рецепторами ЭПО в коре и гиппокампе и обладает защитными свойствами, аналогичными сиалированному эритропоэтину (Brines М, Cerami A., Cerami С., U.S. Patent, 0034799 А1, 16 Feb., 2006). Недостатком подобного препарата для практического применения является очевидная технологическая сложность его получения и низкая стабильность в водных растворах.
В водных растворах эритропоэтин является очень нестабильным веществом. Концентрация гормона в препаратах составляет десятки микрограммов на мл и он легко инактивируется за счет факторов окружающей среды, в том числе за счет адгезии к поверхности сосудов из стекла и пластика.
Известен препарат ЭПО «Эритростим» (ФС 42-3656-98), содержащий альбумин сыворотки крови человека в качестве стабилизатора. Недостатками препарата являются возможность контаминации инфекционными вирусами, аллергенность для лиц с повышенной чувствительностью к препаратам белков крови, высокая стоимость апирогенных препаратов человеческого альбумина.
Из известных препаратов близким по составу к предлагаемому является водный раствор высокосиалированного ЭПО, содержащий в качестве стабилизатора низкомолекулярный декстран с молекулярной массой 30000-60000 в концентрации 6-10 мас.%. Раствор содержит также хлористый натрий, цитрат натрия и лимонную кислоту для создания изотонии и рН 6,5-7,5. Количество ЭПО составляет 5-40 мкг на мл раствора. Раствор может быть получен добавлением цитрата натрия и лимонной кислоты к плазмозаменяющему раствору «Реополиглюкин».
Наиболее близким лекарственным препаратом аналогичного назначения, выбранным в качестве прототипа, является известная («Стабилизированный водный раствор эритропоэтина» RU 2128517 С1, 04.10. 1999) фармацевтическая композиция (далее - ФК), содержащая высокосиалированный ЭПО в качестве активного вещества и раствор низкомолекулярного декстрана (реополиглюкин) в качестве стабилизатора.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала эффективных лекарственных средств для неврологических заболеваний.
Основной технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, заключается в реализации данного назначения: создании нового, более эффективного препарата для лечения неврологических заболеваний.
Данный технический результат достигается за счет того, что в известной фармацевтической композиции в качестве ее активного начала используются низкосиалированные формы эритропоэтина с содержанием 6-8 остатков сиаловых кислот на молекулу белка.
В графических материалах на диаграммах представлено:
Фиг.1 - выживаемость клеток TF1 в отсутствие G-CSF при добавлении 15 нг/мл НЭПО и ЭПО.
Фиг.2 - влияние препаратов НЭПО и ЭПО в концентрации 3 нМ на экспрессию нейротрофических факторов в культивируемых клетках астроцитов коры больших полушарий мозга крысы после инкубации в течение 4 час (белый - контроль, черный - НЭПО, серый - ЭПО).
Фиг.3 - влияние препаратов НЭПО и ЭПО на экспрессию нейротрофический факторов в коре мозга крысы через 1 час после внутрибрюшинного введения препарата (100 мкг/кг веса).
Смысл изобретения заключается в использовании изоформ эритропоэтина, обладающих низкой гематопоэтической активностью, но полностью сохраняющих способность взаимодействовать с нервными клетками.
В предлагаемой фармацевтической композиции количество активного вещества составляет 50-500 мкг/мл или 0,005-0,05% от общей массы. Интервал содержания активного вещества обусловлен необходимым содержанием ЭПО в инъекционной форме препарата, т.е. его возможной минимальной и максимальной одноразовой дозой. Стабилизатором ЭПО в ФК может служить раствор низкомолекулярного декстрана (10%) - реополиглюкин, который использован для получения растворов низкосиалированной формы ЭПО в концентрации 50-500 мкг на мл раствора, либо другие синтетические стабилизирующие добавки, выбранные из группы, включающей полиэтиленгликоль, белки, сахара, аминокислоты и т.д. Реополиглюкин является разрешенным медицинским препаратом который благодаря высокому содержанию полисахаридов (10%) проявляет высокие стабилизирующие свойства с полным сохранением активности ЭПО. В результате, содержание активного препарата в растворах сохраняется в течение года при хранении в темном месте при 2-5°С.
Биологическая активность растворов была определена в тестах in vitro с использованием клеток TF-1 (фиг.1).
Концентрацию низкосиалированного ЭПО в водных растворах после их получения и по истечении одного года хранения определяли спектрофотометрически, исходя из значения оптической плотности субстанции при 280 нм с коррекцией на светорассеяние при 400 нм, например:
C=1,34(A280-A400),
где с - рассчитываемая концентрация ЭПО,
А280 - значение поглощения при 280 нм,
А400 - значение поглощения при 400 нм,
1,34 - коэффициент экстинкции низкосиалированного ЭПО (значение оптической плотности при 280 нм раствора с концентрацией 1 мг/мл).
Анализ показал, что содержание препарата в водном растворе после хранения при 5°С составляет 97% от номинальной.
Заявляемый препарат обладает низкой гематопоэтической активностью (порядка 10% от стандартного препарата ЭПО «Эритростим»). Исследование токсичности препарата показало, что дозы, характеризующие токсичность, не определяются: ЛД50 для мышей составляет более чем 7 мг/кг, для крыс - более чем 9 мг/кг.
Уменьшение содержания сиаловых кислот приводит к потере стабильности гормона in vivo, но не влияет на его активность in vitro. Уменьшение стабильности при лечении неврологических заболеваний является преимуществом вследствие того, что эффект препарата не аккумулируется и препарат, подействовав, разрушается обычным физиологическим путем.
В таблице 1 приведены сравнительные характеристики РЭПО и его низкосиалированной формы, которая используется в заявленной фармацевтической композиции (ФК).
| Таблица 1 | ||
| РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЭРИТРОПОЭТИН | НИЗКОСИАЛИРОВАННАЯ ФОРМА РЭПО | |
| Физические свойства | Прозрачный бесцветный раствор, слегка опалесцирующий при концентрациях более 2,5 мг/мл | Прозрачный бесцветный раствор, слегка опалесцирующий при концентрациях более 2,5 мг/мл |
| ДСН/ПААГ - Вестерн-блот | Одна нечеткая полоса около 36 кДа | Одна нечеткая полоса около 36 кДа |
| Содержание ДНК | 10 пкг на 10000 единиц ЭПО | 10 пкг на 10000 единиц ЭПО |
| Содержание углеводов | 40% | 40% |
| Содержание остатков сиаловых кислот | 10-12 на молекулу | 6-8 на молекулу |
| Изоэлектрическое фокуусирование | pl 3.2-4.5 | pl 4,1-4.8 |
| Содержание эндотоксинов | <20 единиц эндотоксина/1 мг ME ЭПО | <20 единиц эндотоксина/1 мг ЭПО |
| ВЭЖХ | Менее 0,3% олигомерных форм | Менее 0,3% олигомерных форм |
| Примесные белки (ИФА) | Менее 0,3% | Менее 0,3% |
| Удельная активность in vivo | Более 130000 ME/A280 | Менее 15000 ME/A280 |
| N-концевая последовательность | Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-ILe-(X)-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr | Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-ILe-(X)-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr |
| Пептидная карта | Соответствует международному стандарту | Соответствует международному стандарту |
Данные по активности высокосиалированного и низкосиалированного препарата, приведенные в таблице, получены нами в соответствии с рекомендациями ФС 42-3658-98 от 11.02.1999. Принципиально они соответствуют данным, приведенным в патенте US 5856298.
Сравнительное исследование нейрофизиологической активности препаратов РЭПО и низкосиалированного ЭПО проводили в экспериментах in vitro и in vivo, изучая их влияние на регуляцию экспрессии нейротофических факторов NGF и BDNF. Нейротрофины - семейство регуляторных белков нервной ткани, которые синтезируются нейронами и клетками нейроглии, и способствуют дифференцировке и поддержанию жизнеспособности и функционирования периферических и центральных нейронов. При этом используется аутокринный и паракринный механизмы регуляции. Нейротрофины регулируют нейрональную дифференцировку, индуцируют ветвление дендритов (арборизацию) и рост аксонов (спрутинг) в направлении клеток-мишеней. В зрелой нервной системе нейротрофины регулируют как краткосрочную синаптическую передачу, так и долговременное потенцирование, участвуя таким образом в обеспечении пластичности нервной системы, необходимой для ее нормального функционирования. Регуляция экспрессии нейротрофинов и их рецепторов в мозге в настоящее время рассматривается как один из самых перспективных путей воздействия на ряд патологических состояний ЦНС, связанных с дегенерацией и гибелью нейронов. В то же время известные к настоящему времени соединения, способные регулировать экспрессию нейротрофинов в мозге, например антидепрессанты, обладают негативными побочными эффектами, ограничивающими их использование.
Для культивируемых нейроглиальных клеток коры больших полушарий крысы показано, что в концентрации 3 нМ происходит статистически достоверная стимуляция экспрессии как BDNF, так и NGF в 2-5 раз по сравнению с контролем через 1 и 4 часа после введения препаратов. Наиболее высокая стимуляция экспрессии нейротрофического фактора BDNF через 4 часа после введения отмечена для низкосиалированной формы ЭПО, которая составила 340% от контроля (Фиг.2).
Аналогичный результат был получен при исследовании влияния препаратов на экспрессию NGF и BDNF в коре головного мозга in vivo. Через час после введения РЭПО и его низкосиалированной формы происходит статистически достоверная стимуляция экспрессии обоих нейротрофинов в 2-3 раза (Фиг.3).
Пример 1 (изготовление лекарственной формы)
К реополиглюкину добавляют цитрат натрия и лимонную кислоту с доведением рН раствора до 6,5-7,5 и затем добавляют субстанцию низкосиалированной формы эритропоэтина. Полученный раствор подвергают стерилизующему фильтрованию с использованием фильтровальных элементов Millex (Millipore) 0,22 мкм. Полученные растворы помещают в ампулы из нейтрального стекла или стеклянные флаконы из дрота вместимостью 3-5 мл. Ампулы и флаконы закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками.
Пример 2
Для исследования цитопротекторной активности низкосиалированного ЭПО в сравнении с РЭПО использовали человеческую эритролейкозную клеточную линию TF-1, которая применяется для тестирования различных цитокинов (IL-3, IL-5, GM-CSF, ЕРО), NGF, TGF-B. Эти универсальные клетки могут быть использованы как в пролиферативном, так и в антиапоптотическом вариантах теста для определения биологической активности экзогенных клеточных регуляторов.
Клетки TF-1, как и другие клетки эритроидного ряда, содержат 2 типа эритропоэтиновых рецепторов (EpoR) - высокоаффинный (EpoR2) и низкоаффинный (EpoR1). Рецептор EpoR2 характерен только для эритроидных клеток. EpoR1 обнаружен в клетках различного происхождения: кардиомиоцитах, периферических нейронах, клетках головного мозга (нейроны, глиальные клетки, астроциты) и т.д. (Leist M., Chezzi P., Grasso G., Bianchini R.,et al., Science, 305, 239-242). Наличием низкоаффинных рецепторов (EpoR1) объясняется, по-видимому, антиапоптотическое действие Еро на неэритроидные клетки как in vitro, так и in vivo.
Препараты ЭПО исследовали в пролиферативном тесте (MTS-test - CellTiter 96 Aqueous Solution Cell Proliferation Assay, Promega). Цитопротекторная активность препаратов изучалась при удалении из среды культивирования GM-CSF.
Клетки TF-1 рассевали в 96-луночные платы по 10000 клеток на лунку в среде следующего состава: RPMI 1640, 10 mM HEPES, 20 тМ глюкоза, 2% FCS и инкубировали при 37°С, 5% CO2 3 суток с различными концентрациями препаратов. Количество живых клеток в лунках определяли после окрашивания MTS и анализа результатов считывания на Мультискане при 650 нм. Показано, что наблюдается линейная зависимость выживаемости клеток TF-1 в диапазоне концентраций обоих препаратов ЭПО от 0,05 до 5 МЕ/мл. При этом цитопротекторная активность низкосиалированного ЭПО на 30-50% выше, чем у его высокосиалированной формы (Фиг.1).
Пример 3
Первичную культуру клеток нейроглии получали согласно стандартной методике. Крыс линии Sprague-Dowly возраста 1-3 дня забивали с помощью углекислотной асфиксии (15 минут) и помещали на 1 минуту в 80% водный раствор этанола. Далее все операции проводили в асептических условиях при температуре 4-7°С. Выделенный мозг помещали в раствор Хэнкса и далее выделяли кору больших полушарий, освобождая ткань от оболочек. Выделенную ткань один раз промывали раствором Хэнкса и переносили в среду MEM/F12 (1:1), содержащую 20% эмбриональной сыворотки коровы и 2 мМ L-глютамина. Ткань диссоциировали на отдельные клетки механически. Полученную клеточную суспензию один раз промывали средой того же состава с помощью центрифугирования при 200 g. Клетки засевали плотностью 200 тыс.клеток/см2 на обработанные поли-L-лизином культуральные флаконы площадью 75 см2. Культивирование клеток проводили в CO2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха, в среде MEM/F12, содержащей 15% эмбриональной сыворотки коровы, 6 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глютамин, 25 мг/л инсулина, 100 мг/л трансферрина, 20 нМ прогестерона, 100 нМ путресцина и 30 нМ селенита натрия, 100 мкг/мл гентамицина. Культуральную среду меняли каждые 3-4 дня. Пересев клеток проводили после достижения монослоя в соотношении 1:3 (время достижения монослоя 1.5-2 недели).
Для выделения тотальной РНК использовали полученные после третьего пересева клетки: плотностью 100 тыс/см2 высевали на обработанные поли-L-лизином 6-луночные культуральные планшеты в указанной культуральной среде. После достижения клетками монослоя культуральную среду заменяли на бессывороточную (указанная среда без эмбриональной сыворотки коровы). После 48 ч инкубации в среду вводили стерильные растворы (40 мкл) тестируемых соединений до конечной концентрации 3 нМ (3 параллели на точку). В качестве контроля вводили равный объем 0.9% раствора NaCl в воде. Через указанные промежутки времени отбирали культуральную среду, клетки промывали холодным фосфатно-солевым буфером и выделяли тотальную РНК фенолхлороформным методом с использованием набора YeliowSolve (Клоноген, Россия) с использованием методики производителя. Чистоту и концентрацию РНК в полученных образцах проводили спектрофотометрически и в дальнейших экспериментах использовали образцы с соотношением А260/А280≥1.6.
Для проведения обратной транскрипции отбирали 1 мкг тотальной РНК и проводили реакцию 1 час при 37°С в среде, содержащей 8 ед/мл Moloney Murine Leukemia Virus (М-MLV-)-обратную транскриптазу, 10 мМ дитиотрейтол, 800 мкМ dNTPs, случайные гексапраймеры (20 мкг/мл) и first-strand buffer (50 мМ Трис-HCl, 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl2) в объеме 25 мкл. После последующей инкубации 10 минут при 70°С образцы полученной кДНК хранили при -20°С.
Оценку уровня экспрессии BDNF мРНК проводили с использованием количественной ПЦР в реальном времени (real-time quantitative PCR, система М×3000Р, Stratagene). Применяли высокоспецифичный dsДНК-связывающий краситель SYBR green I. Реакцию проводили в смеси объемом 25 мкл, содержащей 2 мкл кДНК образца или стандарта, или 2 мкл воды (негативная проба), 250 мкМ смеси дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфаты), 2.5 мМ MgCl2,15 мМ Трис-HCl (рН 8.8), 50 мМ KCI, 0,5% глицерола, 0.1% Tween 20, интеркалирующий краситель SYBR Green I, 1 ед Taq ДНК-полимеразу с ингибирующими активность фермента антителами ("Синтол", Россия) и по 10 пмоль смысловых и антисмысловых праймеров ("Синтол", Россия; Таблица) при следующих условиях: старт - 5 минут при 95°С, затем 40 циклов, включающих плавление - 30 секунд при 95°С, отжиг - 30 сек при 68°С, элонгация - 30 секунд при 72°С с детекцией флуоресценции в конце каждого шага элонгации.
| Таблица 2 | |
| Ген | Последовательности праймеров (прямой; обратный) |
| бета-Актин | 5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3' |
| 5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3' | |
| BDNF | 5'-AGCCTCCTCTGCTCTTTCTGCTGGA-3' |
| 5'-CTTTTGTCTATGCCCCTGCAGCCTT-3' | |
| NGF | 5'-TCAGTGTGTGGGTTGGAGAT-3' |
| 5'-AGCCTGTTTGTCGTCTGTTG-3' | |
Для подтверждения специфичности продуктов амплификации после окончания амплификации образцы охлаждали до 60°С и через 20 минут получали кривые плавления нагреванием до 95°С со скоростью 0.03°С/сек с непрерывной детекцией флуоресценции. Для получения калибровочных кривых смесь кДНК образцов последовательно разбавляли водой, свободной от ДНКаз, получали стандартные растворы с известной относительной концентрацией соответствующего продукта. С использованием программного обеспечения производителя определяли номер цикла, соответствующий максимальному ускорению процесса амплификации, получали калибровочную кривую числа данных циклов от относительной концентрации продукта и определяли относительную концентрацию в неизвестном образце с последующей нормализацией по бета-актину.
В результате экспериментов проведено тестирование способности препаратов РЭПО и низкосиалированного ЭПО регулировать экспрессию наиболее изученных нейротрофинов BDNF (brain-derived neurotrophic factor) и NGF (nerve growth factor) в культивируемых астроцитах коры больших полушарий крысы. Для этого с использованием метода количественной ОТ-ПЦР в реальном времени (полимеразная цепная реакция продуктов обратной транскрипции) протестирована способность препаратов влиять на экспрессию на уровне мРНК генов BDNF и NGF в культивируемых астроцитах коры больших полушарий мозга крысы.
В результате проведенных исследований было показано, что при введении культуральную среду обоих препаратов в концентрации 3 нМ обнаружено сильное изменение экспрессии как BDNF, так и NGF, составляющее 2-5 раз по сравнению с контролем. Такое увеличение экспрессии является длительным и наблюдается через 4 ч после введения (Фиг.2). Наиболее значительным и длительным эффектом на увеличение экспрессии BDNF обладает препарат низкосиалированного ЭПО. По сравнению с контролем экспрессия BDNF составила 340% (Фиг.2).
Пример 4
Для сравнительного исследования влияния препаратов РЭПО и низкосиалированной формы ЭПО на экспрессию NGF и BDNF в коре головного мозга in vivo использовали самцов крыс линии Вистар, массой 200 г.Изучаемые препараты однократно вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг массы животного. Контрольным животным вводили растворитель. В каждой группе было по четыре животных. Через 1 ч после введения препарата крыс забивали с помощью углекислотной асфиксии и сразу после этого выделяли фронтальную кору мозга. Ткань замораживали в жидком CO2 и хранили при - 80°С. Выделение тотальной РНК, обратную транскрипцию и ПЦР, а также оценку уровня экспрессии нейротрофинов проводили аналогично описанному выше.
В результате проведенного исследования обнаружено, что через час после введения как РЭПО, так и низкосиалированного ЭПО, происходит статистически достоверная стимуляция экспрессии обоих нейротрофинов в 2-3 раза (фиг.3).
Таким образом, в результате проведенных исследований было показано, что при введении РЭПО и его низкосиалированного ЭПО, как in vitro так и in vivo, обнаружено сильное изменение экспрессии BDNF и NGF, составляющее 2-5 раз по сравнению с контролем. Такое увеличение экспрессии является длительным и наблюдается через как через 1 ч, так и через 4 ч после введения. Наиболее значительным и длительным эффектом на увеличение экспрессии BDNF обладает препарат низкосиалированного ЭПО.
Поддержание жизнеспособности нейронов является NGF- и BDNF-зависимым процессом, осуществляемым нейроглиальными клетками. Можно предположить, что увеличение экспрессии NGF и BDNF под действием рекомбинантного эритропоэтина и его низкосиалированной формы является одним из основных молекулярных механизмов терапевтического действия гормона на центральную нервную систему. Поскольку BDNF обладает высокой нейропротекторной и нейротрофической активностью, то на основе низкосиалированного ЭПО возможно создание фармпрепарата, проявляющего активность при нейродегенеративных заболеваниях.
Активное вещество новой фармацевтической композиции (никосиалированный ЭПО) может быть создано на основе модификации существующей технологии получения рекомбинантного ЭПО (Зеленин М.Г., Крамерова И.А., Колобков С.Л., Филякина Н.С., Филатов И.А, RU 2089611 С1, 09.10.1995) путем:
- отбора из банка клеточных линий эффективных продуцентов ЭПО с повышенным содержанием низкосиалированных форм;
- очистки и фракционирования пула ЭПО с целью более полного извлечения низкосиалированных изоформ.
Claims (1)
- Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения неврологических заболеваний на основе низкосиалированных форм эритропоэтина с содержанием 6-8 остатков сиаловых кислот на молекулу белка.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007123790/15A RU2335296C1 (ru) | 2007-06-26 | 2007-06-26 | Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения неврологических заболеваний |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007123790/15A RU2335296C1 (ru) | 2007-06-26 | 2007-06-26 | Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения неврологических заболеваний |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2335296C1 true RU2335296C1 (ru) | 2008-10-10 |
Family
ID=39927718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007123790/15A RU2335296C1 (ru) | 2007-06-26 | 2007-06-26 | Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения неврологических заболеваний |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2335296C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2446834C2 (ru) * | 2010-06-15 | 2012-04-10 | Елена Александровна Лебедева | Способ лечения пострадавших с сочетанной черепно-мозговой травмой |
| RU2695334C1 (ru) * | 2018-09-25 | 2019-07-23 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Способ профилактики нарушений функций почек карбамилированным дарбэпоэтином в эксперименте |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2089611C1 (ru) * | 1995-07-13 | 1997-09-10 | Зеленин Михаил Гаврилович | Штамм сно культивируемых клеток китайского хомячка - продуцент эритропоэтина человека |
| RU2128517C1 (ru) * | 1998-07-20 | 1999-04-10 | Колобков Сергей Леонидович | Стабилизированный водный раствор эритропоэтина |
| RU2159814C2 (ru) * | 1993-08-17 | 2000-11-27 | Кирин-Амген, Инк. | Аналог эритропоэтина |
| RU2176793C2 (ru) * | 1996-09-20 | 2001-12-10 | ОРТО - МакНЕЙЛ ФАРМАСЬЮТИКАЛ, ИНК. | Способы определения in vitro биоактивности эритропоэтина |
| WO2002064085A2 (en) * | 2001-02-02 | 2002-08-22 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Treatment of neurological dysfunction comprising fructopyranose sulfamates and erythropoietin |
-
2007
- 2007-06-26 RU RU2007123790/15A patent/RU2335296C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2159814C2 (ru) * | 1993-08-17 | 2000-11-27 | Кирин-Амген, Инк. | Аналог эритропоэтина |
| RU2089611C1 (ru) * | 1995-07-13 | 1997-09-10 | Зеленин Михаил Гаврилович | Штамм сно культивируемых клеток китайского хомячка - продуцент эритропоэтина человека |
| RU2176793C2 (ru) * | 1996-09-20 | 2001-12-10 | ОРТО - МакНЕЙЛ ФАРМАСЬЮТИКАЛ, ИНК. | Способы определения in vitro биоактивности эритропоэтина |
| RU2128517C1 (ru) * | 1998-07-20 | 1999-04-10 | Колобков Сергей Леонидович | Стабилизированный водный раствор эритропоэтина |
| WO2002064085A2 (en) * | 2001-02-02 | 2002-08-22 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Treatment of neurological dysfunction comprising fructopyranose sulfamates and erythropoietin |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МАШКОВСКИЙ М.Д. Лекарственные средства. - М.: ООО «Новая Волна», 2001, т.2, с.124. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2446834C2 (ru) * | 2010-06-15 | 2012-04-10 | Елена Александровна Лебедева | Способ лечения пострадавших с сочетанной черепно-мозговой травмой |
| RU2695334C1 (ru) * | 2018-09-25 | 2019-07-23 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Способ профилактики нарушений функций почек карбамилированным дарбэпоэтином в эксперименте |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boia et al. | Neuroprotective strategies for retinal ganglion cell degeneration: current status and challenges ahead | |
| Yang et al. | IL-6 promotes regeneration and functional recovery after cortical spinal tract injury by reactivating intrinsic growth program of neurons and enhancing synapse formation | |
| AU2002239665B2 (en) | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs | |
| Önger et al. | The role of growth factors in nerve regeneration | |
| US7767643B2 (en) | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs | |
| US8673594B2 (en) | Methods for stimulating nervous system regeneration and repair by regulating arginase I and polyamine synthesis | |
| US20120142589A1 (en) | Tissue-protective cytokines for the protection, restoration and enhancement of responsive cells, tissues and organs | |
| RU2157223C2 (ru) | Трофические факторы для регенерации центральной нервной системы | |
| AU2002239665A1 (en) | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs | |
| JP2010539084A (ja) | 治療用細胞を動物の中枢神経系に投与するための方法、医薬組成物および製品 | |
| Takano et al. | Brain-derived neurotrophic factor enhances neurite regeneration from retinal ganglion cells in aged human retina in vitro | |
| DE69122472T2 (de) | Neurotropische wachstumsfaktoren, die ein homeobox-peptid enthalten | |
| JP2020533281A (ja) | デキストラン硫酸の新規使用 | |
| RU2335296C1 (ru) | Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения неврологических заболеваний | |
| AU2001259453A1 (en) | Methods for stimulating nervous system regeneration and repair by regulating arginase 1 and polyamine synthesis | |
| EP3996703A1 (en) | Use of immune modulators to improve nerve regeneration | |
| Eghbali et al. | Erythropoietin protects against retinal damage in A rat model of optic neuropathy via glial suppression | |
| WO2002006341A1 (en) | A trophic factor capable of producing a neurosalutary effect in a subject | |
| US20030022840A1 (en) | Drugs for ameliorating impaired glucose tolerance | |
| Caday et al. | Partial purification and characterization of a neurite-promoting factor from the injured goldfish optic nerve | |
| US20090291887A1 (en) | Proteins of the SDF-1-Family for the Manufacturing of a Medicament | |
| CA2629304C (en) | Combination of glycoisoforms for the treatment or prevention of septicemia, transgenic cell line that produces erythropoietin glycoisoforms, pharmaceutical composition comprising said combination | |
| Aviel et al. | Sprouting inducing activity of human sera: Low capacity in sera from patients with cranial polyneuropathy | |
| Ferreira | Characterization of Genes with Unknown Function Highly Expressed in the Spinal Cord and Dorsal Root Ganglion | |
| Milani | THE INCREDIBLE CASE OF HENRY MOLAISON− THE AMNESIAC WE WILL NOT FORGET |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180627 |