RU2334233C1 - Method for forecasting preterm labour in presence of urogenital infection - Google Patents
Method for forecasting preterm labour in presence of urogenital infection Download PDFInfo
- Publication number
- RU2334233C1 RU2334233C1 RU2006144597/15A RU2006144597A RU2334233C1 RU 2334233 C1 RU2334233 C1 RU 2334233C1 RU 2006144597/15 A RU2006144597/15 A RU 2006144597/15A RU 2006144597 A RU2006144597 A RU 2006144597A RU 2334233 C1 RU2334233 C1 RU 2334233C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pregnancy
- tlr2
- forecasting
- preterm labour
- urogenital infection
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 15
- 102000008228 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 claims abstract 4
- 108010060888 Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 claims abstract 4
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 claims description 12
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 claims description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 208000006399 Premature Obstetric Labor Diseases 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 8
- 101150076937 TLR2 gene Proteins 0.000 description 8
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 8
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 6
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 6
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 210000004037 cervical canal epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000007778 menstrual function Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006893 Fetal Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 206010063412 Gestational oedema Diseases 0.000 description 2
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 2
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002692 epidural anesthesia Methods 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 2
- 210000002640 perineum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UVITTYOJFDLOGI-UHFFFAOYSA-N (1,2,5-trimethyl-4-phenylpiperidin-4-yl) propanoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(OC(=O)CC)CC(C)N(C)CC1C UVITTYOJFDLOGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYCCWYAFNPAQC-UHFFFAOYSA-N 2-[dodecyl(methyl)azaniumyl]acetate Chemical compound CCCCCCCCCCCCN(C)CC(O)=O BMYCCWYAFNPAQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000001362 Fetal Growth Retardation Diseases 0.000 description 1
- 206010070531 Foetal growth restriction Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010020852 Hypertonia Diseases 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035138 Placental insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010036603 Premature rupture of membranes Diseases 0.000 description 1
- 206010037601 Pyelonephritis chronic Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 201000006368 chronic pyelonephritis Diseases 0.000 description 1
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 208000002296 eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 208000030941 fetal growth restriction Diseases 0.000 description 1
- 230000002650 habitual effect Effects 0.000 description 1
- 230000037417 hyperactivation Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002632 myometrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000028742 placenta development Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к акушерству и, в частности, касается прогнозирования преждевременных родов и, соответственно, ведения беременности.The present invention relates to obstetrics and, in particular, relates to the prediction of preterm birth and, accordingly, pregnancy management.
Доказано, что инфекция является частой причиной прерывания беременности. В настоящее время среди причин невынашивания беременности доминируют инфекции, передаваемые половым путем и иммунные нарушения в организме женщины (Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. Москва, Триада-Х, 2000, с.50).It has been proven that infection is a common cause of abortion. Currently, among the causes of miscarriage, sexually transmitted infections and immune disorders in the body of a woman dominate (Sidelnikova V.M. Habitual loss of pregnancy. Moscow, Triada-X, 2000, p.50).
Известен способ прогнозирования преждевременных родов путем определения уровня провоспалительного цитокина ИЛ-6 в слизи цервикального канала на сроках 28-35 недель (Тетруашвили Н.К., Сухих Г.Т. Роль цитокинов в невынашивании беременности. Материалы V Российского форума «Мать и дитя», Москва, 2003, с.231-232). Однако этот способ сложен в осуществлении: методически трудно определять цитокины в слизи, помимо этого цитокины могут быть частично инактивированы антителами, что снижает информативность способа. Этот способ принят за ближайший аналог.A known method for predicting preterm birth by determining the level of the pro-inflammatory cytokine IL-6 in the mucus of the cervical canal for periods of 28-35 weeks (Tetruashvili N.K., Sukhikh G.T. Role of cytokines in miscarriage. Materials of the V Russian forum "Mother and child" Moscow, 2003, p.231-232). However, this method is difficult to implement: it is methodologically difficult to determine cytokines in the mucus, in addition, cytokines can be partially inactivated by antibodies, which reduces the information content of the method. This method is taken as the closest analogue.
В последние годы отводится ведущая роль системе врожденного иммунитета при физиологически протекающей беременности и ее патологии. К сигнальным рецепторам врожденного иммунитета относятся Toll-подобные рецепторы (TLR), которые представляют собой семейство сигнальных молекул, распознающих консервативные молекулярные образцы различных патогенов, включая вирусы, бактерии, грибы (Abrahams Vikki M. Toll-like receptors in the cycling reproductive tract and during pregnancy. Current Woman,s Health Reviews, 2005, 1, p.37).In recent years, the leading role has been given to the system of innate immunity in physiologically occurring pregnancy and its pathology. The innate immunity signaling receptors include Toll-like receptors (TLRs), which are a family of signaling molecules that recognize conserved molecular samples of various pathogens, including viruses, bacteria, and fungi (Abrahams Vikki M. Toll-like receptors in the cycling reproductive tract and during pregnancy. Current Woman, s Health Reviews, 2005, 1, p. 37).
Известна экспрессия генов Toll-подобных рецепторов в эпителии эндометрия и эпителиальных клетках нижних отделов репродуктивной системы. Показана корреляция уровня экспрессии TLR с различными патологиями при беременности такими, как задержка внутриутробного роста плода, эклампсия (Fazeli А., Bruce С., Anumba D.O. Characterization of toll-like receptors in the female reproductive tract in humans. Human Reproduction? Vol.20, 5, 2005, p.1374).Known is the expression of Toll-like receptor genes in the endometrial epithelium and epithelial cells of the lower parts of the reproductive system. The correlation of TLR expression level with various pathologies during pregnancy, such as intrauterine growth retardation, eclampsia (Fazeli A., Bruce C., Anumba DO Characterization of toll-like receptors in the female reproductive tract in humans. Human Reproduction? Vol.20, is shown. 5, 2005, p. 1374).
Нами была поставлена задача поиска маркеров прогнозирования преждевременных родов, связанных с факторами врожденного иммунитета и с TLR при патологии беременности. Наиболее информативным методом определения экспрессии генов TLR является полимеразная цепная реакция, в качестве объекта исследования можно использовать клетки слизистой цервикального канала, легко доступные для исследования.We set the task of finding markers for predicting preterm birth associated with factors of innate immunity and with TLR in pregnancy pathology. The most informative method for determining the expression of TLR genes is polymerase chain reaction, as the object of study, you can use the cells of the mucous membrane of the cervical canal, easily accessible for research.
Задача изобретения - прогнозирование преждевременных родов для выработки тактики ведения беременности.The objective of the invention is the prediction of preterm birth to develop tactics of pregnancy.
Техническим результатом предлагаемого является повышение точности прогнозирования с использованием количественного критерия, определяющего каскад биохимических реакций, опосредованных повышенной выработкой цитокинов и соответственно простагландинов, что обуславливает гипертонус миометрия. Количественный результат достигается за счет использования в качестве количественного показателя экспрессии гена TLR2 эпителиальными клетками цервикального канала.The technical result of the proposed is to increase the accuracy of forecasting using a quantitative criterion that determines the cascade of biochemical reactions mediated by increased production of cytokines and, accordingly, prostaglandins, which causes myometrial hypertonicity. A quantitative result is achieved by using the cervical canal epithelial cells as a quantitative indicator of TLR2 gene expression.
Взяты эпителиальные клетки цервикального канала от больных с урогенитальной инфекцией и здоровых женщин на базе роддома г. Москвы № 8, кафедра акушерства и гинекологии лечебного факультета Российского Государственного Медицинского Университета.Cervical canal epithelial cells were taken from patients with urogenital infection and healthy women at the Moscow Maternity Hospital No. 8, Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Russian State Medical University.
В настоящем исследовании было обследовано 56 беременных женщин: группа женщин с физиологически протекающей беременностью составляла 18 человек, группа с патологией беременности на сроках 28-35 недель - 38 человек. Процент преждевременных родов в группе здоровых беременных составил не более 1%, в то время как в группе женщин с патологией беременности он составил 70%. При изучении показателя уровня экспрессии гена TLR2 эпителиальными клетками цервикального канала беременных женщин были получены следующие результаты. Была выявлена корреляция между повышением копий кДНК, отражающее повышение уровня экспрессии гена TLR2 и процентом преждевременных родов (Фиг.1). К примеру, в группе женщин с нормально протекающей беременностью практически не наблюдалось преждевременных родов и уровень экспрессии гена TLR2 был сравнительно невысок (средний показатель составил 213796±1052,5 копий кДНК на 1000000 копий кДНК β-актина, р≤0,05). При преждевременных родах показатель уровня экспрессии гена TLR2 возрастал более чем в 5 раз и средний показатель составил 1151784±63591 копий кДНК на 1000000 копий кДНК β-актина, р<0,05. Увеличение экспрессии TLR2 с большой степенью вероятности приводит к преждевременным родам за счет гиперактивации гуморальных факторов врожденного иммунитета (провоспалительных цитокинов). На основании этих данных показатель экспрессии гена TLR2 эпителиальными клетками цервикального канала был нами обоснованно выбран для прогнозирования преждевременных родов.In this study, 56 pregnant women were examined: a group of women with a physiologically occurring pregnancy was 18 people, a group with a pathology of pregnancy at 28-35 weeks - 38 people. The percentage of preterm birth in the group of healthy pregnant women was no more than 1%, while in the group of women with pathological pregnancy it was 70%. When studying the indicator of the level of TLR2 gene expression by epithelial cells of the cervical canal of pregnant women, the following results were obtained. A correlation was found between an increase in cDNA copies, reflecting an increase in the level of TLR2 gene expression and the percentage of preterm delivery (Figure 1). For example, in the group of women with a normal pregnancy, almost no preterm birth was observed and the expression level of the TLR2 gene was relatively low (the average was 213796 ± 1052.5 copies of cDNA per 1,000,000 copies of β-actin cDNA, p≤0.05). In preterm birth, the TLR2 gene expression level increased by more than 5 times and the average value was 1151784 ± 63 591 copies of cDNA per 1,000,000 copies of β-actin cDNA, p <0.05. An increase in the expression of TLR2 with a high degree of probability leads to premature birth due to hyperactivation of humoral factors of innate immunity (pro-inflammatory cytokines). Based on these data, the indicator of TLR2 gene expression by cervical canal epithelial cells was reasonably chosen by us to predict preterm delivery.
В результате данной работы выявлены параметры, которые оказались весьма показательными и пригодными для клинических целей. Способ был разработан на основании длительного наблюдения.As a result of this work, parameters were identified that were very revealing and suitable for clinical purposes. The method was developed on the basis of long-term observation.
Заявленный способ поясняется на следующих конкретных примерах его осуществления. Пример № 1.The claimed method is illustrated by the following specific examples of its implementation. Example No. 1.
Беременная Г., 26 лет с диагнозом: 1 своевременные роды. Гестационные отеки. Угроза разрыва ригидной промежности. Эпизиотомия. Осмотр родовых путей. Эпизиоррафия.Pregnant G., 26 years old with a diagnosis of 1 timely delivery. Gestational edema. Risk of rupture of the rigid perineum. Episiotomy Inspection of the birth canal. Episiorography.
Пациентка состояла на учете с малого срока беременности (с 3 недель), условия жизни - средние, профессия - бухгалтер. Беременность протекала без осложнений. В третьем триместре отмечала отечность голеней. АД во время беременности в пределах нормы, общие анализы мочи - показатели в пределах нормы. Из соматических заболеваний в анамнезе - в детстве хронический пиелонефрит, снята с учета в подростковом периоде. Менструальная функция не нарушена: с 14 лет, по 5 дней, через 25 дней, цикл регулярный. Данная беременность первая, наступила спонтанно. Рост 162 см, вес 70 кг (до беременности 60 кг). Группа крови вторая, резус - положительная. Амбулаторно обследована на урогенитальную инфекцию методом ПЦР-диагностики - отрицательно. Родовая деятельность развивалась самостоятельно, роды протекали без родовозбуждения. В течение родов проводилось обезболивание промедолом внутримышечно. Общая продолжительность родов составила 7 ч 10 мин, без вод 6 ч 30 мин (характер околоплодных вод - светлые). Ребенок родился живой, доношенный, пол - мужской, 3950 г, 52 см. Оценка по шкале Апгар на первой минуте 8 баллов, на второй минуте 9 баллов. Мать и ребенок выписаны одновременно на 3 сутки после родов.The patient was registered with a short gestation period (from 3 weeks), living conditions were average, and the profession was an accountant. Pregnancy was uneventful. In the third trimester, swelling of the legs was noted. Blood pressure during pregnancy is within normal limits, general urine tests are indicators within normal limits. Of the somatic diseases in the history - in childhood, chronic pyelonephritis, deregistered in adolescence. Menstrual function is not impaired: from 14 years, 5 days, after 25 days, the cycle is regular. This pregnancy is the first, occurred spontaneously. Height 162 cm, weight 70 kg (before pregnancy 60 kg). Blood type two, rhesus positive. Outpatiently examined for urogenital infection by PCR diagnostics - negative. Clan activities developed independently, childbirth proceeded without labor excitement. During childbirth, promedol was anesthetized intramuscularly. The total duration of labor was 7 hours 10 minutes, without water 6 hours 30 minutes (the nature of amniotic fluid is light). The baby was born alive, full-term, gender - male, 3950 g, 52 cm. The Apgar score in the first minute is 8 points, in the second minute 9 points. Mother and baby were discharged at the same time 3 days after birth.
Для изучения экспрессии гена TLR2 была использована следующая методика, которая состояла из нескольких этапов: получение клеток цервикального канала, выделение из полученных клеток рибонуклеиновой кислоты (РНК), синтез на матрице РНК копии дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) и проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Херингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Москва, Мир, 1999).The following technique was used to study TLR2 gene expression, which consisted of several stages: obtaining cervical canal cells, isolating ribonucleic acid (RNA) from the obtained cells, synthesizing a copy of deoxyribonucleic acid (cDNA) on the RNA matrix, and conducting polymerase chain reaction (PCR) ( Herington S., McGee J. Molecular Clinical Diagnostics (Methods. Moscow, Mir, 1999).
Клетки слизистой цервикального канала берут общепринятым способом гинекологическим ершиком и отмываются от слизи культуральной средой Игла с помощью центрифугирования (1500 об/мин, 10 мин). Осадок, содержащий клетки, разбавляют культуральной средой Игла объемом 100 мкл и используют в работе.The cells of the mucous membrane of the cervical canal are taken in the generally accepted manner by a gynecological brush and washed from the mucus with the Eagle culture medium by centrifugation (1500 rpm, 10 min). The pellet containing cells was diluted with 100 μl Eagle culture medium and used in the work.
К полученным суспензиям добавляют равный объем лизирующего гуанидинтиоционатного буфера (4М гуанидинтиоционат (ДиаМ, РФ), 0,25 mМ цитрат Na pH 7 (Sigma, США), 0,5% лаурилсаркозин (Serva, США), 0,1М 2-меркаптоэтанол (Merck, ФРГ). Лизат, полученный через 15 минут инкубации при комнатной температуре, смешивают с 14 мкл AcONa 3М, рН 5,0 (Реахим, РФ), затем добавляют 1/2 общего объема фенола (рН 5,2) и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Далее в пробирку с образцом добавляют 1/3 общего объема хлороформа и 20 мкл ацетата Na, встряхивают в течение 5 мин и центрифугируют при 10000 об./мин в течение 10 мин. Водную фазу отбирают в пробирку с 140 мкл изопропилового спирта и проводят инкубация при температуре -70°С в течение 4-х часов. Далее пробы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут. Осадок промывают 200 мкл 80% этилового спирта, растворяют в 20 мкл дистиллированной (без РНК) воды и хранят при -70°С.An equal volume of lysing guanidine thiocyanate buffer (4 M guanidine thiocyanate (DiaM, RF), 0.25 mM citrate Na pH 7 (Sigma, USA), 0.5% lauryl sarcosine (Serva, USA), 0.1 M 2-mercaptoethanol ( Merck, Germany) The lysate obtained after 15 minutes of incubation at room temperature is mixed with 14 μl of AcONa 3M, pH 5.0 (Reachim, RF), then 1/2 of the total volume of phenol (pH 5.2) is added and incubated at room temperature for 5 minutes, Next, 1/3 of the total volume of chloroform and 20 μl of Na acetate are added to the sample tube, shaken for 5 minutes and centrifuged for at 10,000 rpm for 10 minutes, the aqueous phase was taken into a test tube with 140 μl of isopropyl alcohol and incubated at -70 ° C for 4 hours, then the samples were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes. The precipitate is washed with 200 μl of 80% ethyl alcohol, dissolved in 20 μl of distilled (without RNA) water and stored at -70 ° C.
Количество полученной РНК оценивают с помощью электрофоретического разделения в 0,8% агарозном геле в присутствии маркеров с известной молекулярной массой (0,1-0,5 мкг).The amount of RNA obtained is estimated by electrophoretic separation on a 0.8% agarose gel in the presence of markers with a known molecular weight (0.1-0.5 μg).
В реакции обратной транскрипции используют 0,2 мкг РНК. Реакционная смесь содержит dNTP в концентрации 2,5 mM каждого нуклеотида (СибЭнзим, РФ), 10 н молей random гексамеров (Синтол, РФ), 10 н молей TLR2-специфического праймера (Синтол, РФ) и 10 ед. ревертазы M-MLV (СибЭнзим, РФ). Проводят отжиг random гексамеров и специфического праймера на матрице мРНК при температуре 75°С в течение 3-х мин. Остальные компоненты реакции добавляют при температуре +4°С. Дальнейшую инкубацию проводят при температуре 37°С в течение 1 ч, инактивацию фермента проводят при 94°С в течение 5 мин. Полученную кДНК хранят при -70°С.0.2 μg of RNA is used in the reverse transcription reaction. The reaction mixture contains dNTP at a concentration of 2.5 mM each nucleotide (SibEnzyme, RF), 10 n moles of random hexamers (Synthol, RF), 10 n moles of TLR2-specific primer (Synthol, RF) and 10 units. M-MLV revertase (SibEnzyme, RF). Random hexamers and a specific primer are annealed on an mRNA matrix at a temperature of 75 ° C for 3 minutes. The remaining reaction components are added at a temperature of + 4 ° C. Further incubation is carried out at a temperature of 37 ° C for 1 h, inactivation of the enzyme is carried out at 94 ° C for 5 min. The resulting cDNA was stored at -70 ° C.
В качестве контроля прохождения реакции обратной транскрипции и для стандартизации метода используют ПЦР-систему на определение экспрессии гена β-актина.As a control of the reverse transcription reaction and to standardize the method, a PCR system for determining the expression of the β-actin gene is used.
Полимеразную цепную реакцию в реальном времени ставят с использованием наборов реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I (Синтол, Россия) и специфических праймеров. В готовую смесь добавляют по 2 мкл кДНК, полученной при реакции обратной транскрипции.Real-time polymerase chain reaction is performed using reagent kits for PCR-RV in the presence of SYBR Green I (Synthol, Russia) and specific primers. 2 μl of the cDNA obtained from the reverse transcription reaction is added to the finished mixture.
Условия прохождения ПЦР со специфическими праймерами к гену β-актину и гену TLR2 были смоделированы с помощью программы VectorNTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК, опубликованными в базе данных Gene Bank. Отрицательным контролем служит проба с реакционной смесью, не содержащая мРНК.PCR conditions with specific primers for the β-actin gene and TLR2 gene were modeled using the VectorNTI 8.0 program in accordance with mRNA sequences published in the Gene Bank database. A negative control is a sample with a reaction mixture that does not contain mRNA.
ПЦР в реальном времени проводят на приборе АНК-16 (Синтол, РФ) по следующей схеме (94°С 15 с и 60°С 50 с) 40 циклов.Real-time PCR is performed on an ANK-16 device (Synthol, RF) according to the following scheme (94 ° C for 15 s and 60 ° C for 50 s) for 40 cycles.
Полученные результаты анализируют с помощью лицензированной программы, прилагающейся к прибору АНК-16. Расчет количества копий TLR2 проводится относительно 1×106 копий β-актина.The results obtained are analyzed using a licensed program attached to the ANK-16 instrument. The calculation of the number of copies of TLR2 is carried out relative to 1 × 10 6 copies of β-actin.
У данной пациентки число копий кДНК TLR2 составляло 212750 относительно 1×106 копий кДНК β-актина.In this patient, the number of copies of TLR2 cDNA was 212750 relative to 1 × 10 6 copies of β-actin cDNA.
Пример № 2.Example No. 2.
Беременная Т. 28 лет с диагнозом 1 срочные роды. Гестационные отеки. ОГА. Уреаплазмоз. Носитель ВПГ. Угроза разрыва промежности. Эпизиотомия. Медицинский сон. Эпизиоррафия.Pregnant T. 28 years old with a diagnosis of 1 urgent delivery. Gestational edema. RSA. Ureaplasmosis. The carrier of HSV. The threat of rupture of the perineum. Episiotomy Medical dream. Episiorography.
Пациентка состояла на учете с 17-18 недель беременности, условия жизни - средние, профессия - визажист. Во время беременности в первом триместре отмечала тошноту. Соматических заболеваний нет. Менструальная функция с 14 лет, по 5 дней, через 21-45 дней. Данная беременность первая, наступила спонтанно. Рост 166 см, вес 68,5 кг (до беременности 56 кг). Группа крови первая, резус положительный. Амбулаторно обследована на урогенитальную инфекцию методом ПЦР-диагностики, выявлен вирус простого герпеса, уреплазмоз. Родовая деятельность развивалась самостоятельно, без родовозбуждения. Учитывая роды в ночное время суток и утомленность родильницы, во время родов проводился медицинский сон - отдых. Общая продолжительность родов составила 6 ч 30 мин, без вод - 15 мин (характер околоплодных вод - светлые). Ребенок родился живой, доношенный, пол - мужской, 3320 г, 48 см. Оценка по шкале Апгар на первой минуте составила 8 баллов, на пятой минуте 9 баллов. Мать и ребенок выписаны на 3 сутки после родов.The patient was registered from 17-18 weeks of pregnancy, living conditions - average, profession - makeup artist. During pregnancy in the first trimester noted nausea. There are no somatic diseases. Menstrual function from 14 years, 5 days, after 21-45 days. This pregnancy is the first, occurred spontaneously. Height 166 cm, weight 68.5 kg (before pregnancy 56 kg). Blood type first, Rh positive. She was examined on an outpatient basis for urogenital infection by PCR diagnostics; herpes simplex virus and ureplasmosis were detected. Tribal activity developed independently, without labor stimulation. Considering childbirth at night and the puerperal fatigue, during childbirth a medical sleep was carried out - rest. The total duration of labor was 6 hours 30 minutes, without water - 15 minutes (the nature of amniotic fluid is light). The baby was born alive, full-term, gender - male, 3320 g, 48 cm. The Apgar score in the first minute was 8 points, in the fifth minute 9 points. Mother and baby were discharged 3 days after delivery.
Количество копий кДНК TLR2 у данной пациентки методом (см. пример №1) составляет 467592 относительно 1×106 копий кДНК β-актина.The number of copies of TLR2 cDNA in this patient by the method (see example No. 1) is 467592 relative to 1 × 10 6 copies of β-actin cDNA.
Пример №3.Example No. 3.
Пациентка Г. 26 лет с диагнозом: 1 преждевременные роды в 29 нед. Отягощенный гинекологический анамнез. Уреаплазмоз. Носитель ЦМВ, ВПГ. Преждевременный разрыв плодных оболочек. Хроническая плацентарная недостаточность. Низкая плацентация. Обострение хронической внутриутробной гипоксии плода. Относительная короткость пуповины. Дефект плаценты. Эпизиотомия. Ручное обследование стенок полости матки. Эпизиоррафия. Эпидуральная анестезия.Patient G., 26 years old with a diagnosis of 1 premature birth in 29 weeks. A burdened gynecological history. Ureaplasmosis. Carrier CMV, HSV. Premature rupture of membranes. Chronic placental insufficiency. Low placentation. Exacerbation of chronic fetal hypoxia. The relative shortness of the umbilical cord. Placenta defect. Episiotomy Manual examination of the walls of the uterine cavity. Episiorography. Epidural anesthesia
Пациентка состояла на учете с 18 недель беременности, условия жизни - средние, домохозяйка. Соматически не отягощена. Менструальная функция не нарушена. Данная беременность вторая, первая в 2001 году - медицинский аборт на сроке гестации 8 недель, без осложнений. Рост 165 см, вес 68,2 кг (до беременности 60 кг). Группа крови первая, резус - положительный. Амбулаторно обследована на урогенитальную инфекцию методом ПЦР-диагностики, был выявлен уреаплазмоз, носитель ЦМВ, ВПГ. Роды осложнились преждевременным разрывом плодных оболочек. Во время родовой деятельности - обострение хронической внутриутробной гипоксии плода. Общая продолжительность родов составила 6 ч 50 мин, без вод - 8 ч. Роды, учитывая срок гестации, обезболивались эпидуральной анестезией. Ребенок родился живой, недоношенный, пол - мужской, 1210 г, 37 см. Оценка по шкале Апгар на первой минуте 6 баллов, на пятой - 7 баллов. Мать выписана на 5 сутки после родов. Ребенок был переведен на второй этап выхаживания после пребывания в реанимационном отделении.The patient was registered at 18 weeks of gestation, living conditions - average, housewife. Somatically not burdened. Menstrual function is not impaired. This pregnancy is the second, the first in 2001 - medical abortion at a gestational age of 8 weeks, without complications. Height 165 cm, weight 68.2 kg (before pregnancy 60 kg). Blood type one, Rhesus positive. Outpatiently examined for urogenital infection by PCR diagnostics, ureaplasmosis, a carrier of CMV, HSV was detected. Childbirth was complicated by premature rupture of the membranes. During labor, an exacerbation of chronic fetal hypoxia. The total duration of labor was 6 hours 50 minutes, without water - 8 hours. The labor, given the gestational age, was anesthetized with epidural anesthesia. The baby was born alive, premature, gender - male, 1210 g, 37 cm. Apgar score in the first minute is 6 points, in the fifth - 7 points. Mother was discharged 5 days after birth. The child was transferred to the second stage of nursing after staying in the intensive care unit.
Количество копий кДНК TLR2 у данной пациентки методом (см. пример № 1) составляет 1088200 относительно копий 1×106 кДНК β-актина (в 5 раз превышает средний показатель контрольной группы).The number of copies of TLR2 cDNA in this patient by the method (see example No. 1) is 1088200 relative to copies of 1 × 10 6 β-actin cDNA (5 times the average value of the control group).
Таким образом, предложенный способ достаточно практичен и пригоден для широкого клинического применения, достоверность прогноза достаточно высока и превосходит по информативности все ранее аналогичные методики. Заявленное изобретение позволяет решать важную практическую задачу оптимального прогнозирования преждевременных родов, что весьма важно в практическом отношении, и основано на конкретных показателях. Использование данного способа будет способствовать правильному ведению беременности, прогнозированию преждевременных родов.Thus, the proposed method is quite practical and suitable for widespread clinical use, the reliability of the forecast is quite high and surpasses all previously similar methods in terms of information. The claimed invention allows to solve an important practical problem of optimal prediction of premature birth, which is very important in practical terms, and is based on specific indicators. Using this method will contribute to the proper management of pregnancy, prediction of preterm birth.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006144597/15A RU2334233C1 (en) | 2006-12-14 | 2006-12-14 | Method for forecasting preterm labour in presence of urogenital infection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006144597/15A RU2334233C1 (en) | 2006-12-14 | 2006-12-14 | Method for forecasting preterm labour in presence of urogenital infection |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006144597A RU2006144597A (en) | 2008-06-20 |
| RU2334233C1 true RU2334233C1 (en) | 2008-09-20 |
Family
ID=39868095
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006144597/15A RU2334233C1 (en) | 2006-12-14 | 2006-12-14 | Method for forecasting preterm labour in presence of urogenital infection |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2334233C1 (en) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2408014C2 (en) * | 2009-03-10 | 2010-12-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Method for prediction of preterm delivery of infectious genesis |
| RU2475752C1 (en) * | 2011-09-26 | 2013-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method of predicting of pregnancy outcome in case of threat of miscarriage at late terms |
| RU2486519C1 (en) * | 2011-11-15 | 2013-06-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразви | Method for predicting premature birth and intrauterine infection |
| RU2561594C1 (en) * | 2014-06-24 | 2015-08-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for prediction of pregnancy outcome in threatened premature delivery |
| RU2578028C1 (en) * | 2014-12-23 | 2016-03-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of evaluating state of women's health when predicting physiological and complicated course of pregnancy at early stages of gestation |
| RU2620153C1 (en) * | 2016-02-10 | 2017-05-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Prediction of premature birth based on gene expression profile of innate immunity in cervical cells |
| RU2670672C1 (en) * | 2017-11-08 | 2018-10-24 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Method for prediction of preterm delivery at gestation period of 24-34 weeks |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2123698C1 (en) * | 1997-05-20 | 1998-12-20 | Дальневосточный государственный медицинский университет | Method of preclinical prediction of incompetent pregnancy |
| US6150178A (en) * | 1999-03-24 | 2000-11-21 | Avitar, Inc. | Diagnostic testing device |
-
2006
- 2006-12-14 RU RU2006144597/15A patent/RU2334233C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2123698C1 (en) * | 1997-05-20 | 1998-12-20 | Дальневосточный государственный медицинский университет | Method of preclinical prediction of incompetent pregnancy |
| US6150178A (en) * | 1999-03-24 | 2000-11-21 | Avitar, Inc. | Diagnostic testing device |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ТЕТРУАШВИЛИ Н.К. и др. Роль цитокинов в невынашивании беременности. Матер. V Российск. форума «Мать и дитя». - М., 2003, №4, с.231, 232. * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2408014C2 (en) * | 2009-03-10 | 2010-12-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Method for prediction of preterm delivery of infectious genesis |
| RU2475752C1 (en) * | 2011-09-26 | 2013-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method of predicting of pregnancy outcome in case of threat of miscarriage at late terms |
| RU2486519C1 (en) * | 2011-11-15 | 2013-06-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразви | Method for predicting premature birth and intrauterine infection |
| RU2561594C1 (en) * | 2014-06-24 | 2015-08-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for prediction of pregnancy outcome in threatened premature delivery |
| RU2578028C1 (en) * | 2014-12-23 | 2016-03-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of evaluating state of women's health when predicting physiological and complicated course of pregnancy at early stages of gestation |
| RU2620153C1 (en) * | 2016-02-10 | 2017-05-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Prediction of premature birth based on gene expression profile of innate immunity in cervical cells |
| RU2670672C1 (en) * | 2017-11-08 | 2018-10-24 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Method for prediction of preterm delivery at gestation period of 24-34 weeks |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006144597A (en) | 2008-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mascarenhas et al. | Management of recurrent implantation failure: British Fertility Society policy and practice guideline | |
| Cobo et al. | Noninvasive sampling of the intrauterine environment in women with preterm labor and intact membranes | |
| RU2408014C2 (en) | Method for prediction of preterm delivery of infectious genesis | |
| Bhatti et al. | The amniotic fluid cell-free transcriptome in spontaneous preterm labor | |
| RU2334233C1 (en) | Method for forecasting preterm labour in presence of urogenital infection | |
| US10184150B2 (en) | Free nucleic acids and miRNA as non-invasive method for determining embryo quality | |
| CA3166628A1 (en) | Method for predicting the likelihood of ectopic pregnancy (ep), viable intrauterine pregnancy (viup), or non-viable intrauterine pregnancy (nviup). | |
| US11149315B2 (en) | Method for predicting cervical shortening and preterm birth | |
| RU2477861C1 (en) | Early diagnostic technique in postpartum endometritis | |
| Miller et al. | Defining a role for Interferon Epsilon in normal and complicated pregnancies | |
| Sayaril et al. | Polymorphisms in proinflammatory cytokine genes, effect on gene expression and association with preterm delivery in Saudi females | |
| RU2768597C1 (en) | Method for genetic prediction of the effectiveness of in vitro fertilization in idiopathic infertility by the number of copies of ribosomal genes (genes encoding ribosomal rna) in the woman's genome | |
| CN110106237B (en) | DYS14 polymorphism detection primer and kit | |
| Gómez et al. | Endometrial Receptivity | |
| RU2646822C1 (en) | Method for predicting the performance of the in vitro fertilization program | |
| CN116179681B (en) | Circular RNAZBTB10 and its detection primers and uses | |
| RU2850917C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDE SET FOR GENOTYPING POLYMORPHIC MARKERS OF CHRONIC ENDOMETRITIS rs1042838 OF PGR GENE IN CLINICAL MATERIAL USING POLYMERASE CHAIN REACTION WITH DETECTION OF AMPLIFICATION RESULTS IN REAL TIME | |
| RU2826778C1 (en) | Method for prediction of preterm delivery in women with threatening late miscarriage and recurrent miscarriage | |
| Fatkullina et al. | Risk factors and the possibility of predicting late premature birth | |
| Zheng et al. | Novel endometrial receptivity test increases clinical pregnancy and live birth rates in patients with recurrent implantation failure: Secondary analysis of a prospective clinical trial | |
| AL-Saeedi et al. | miRNA-99a and TGFβ1 (C/G+ 915) Gene SNP in Females with Secondary Unexplained Infertility | |
| CA3124840C (en) | Uterine endometrial fluid for prediction of success in fertility treatment | |
| Viscardi et al. | P-328 The role of catastrophizing in women with endometriosis-related chronic pelvic pain: a moderated mediation model | |
| Bochen et al. | P-353 The role of endoplasmic reticulum aminopeptidases 1/2 (ERAP1/ERAP2) and cysteinyl aminopeptidase (LNPEP) in the pathomechanism of endometriosis-a study of genetic and proteomic determinants | |
| Fadhil et al. | Relationship between Serum Level and Gene Expression of IL-18 in Recurrent Miscarriage Iraqi Women Infected with Toxoplasmosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20091215 |