RU2333957C1 - METHOD FOR CONSTRUCTING RECOMBINANT STRAIN OF Staphylococcus carnosus - Google Patents
METHOD FOR CONSTRUCTING RECOMBINANT STRAIN OF Staphylococcus carnosus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2333957C1 RU2333957C1 RU2007106027/13A RU2007106027A RU2333957C1 RU 2333957 C1 RU2333957 C1 RU 2333957C1 RU 2007106027/13 A RU2007106027/13 A RU 2007106027/13A RU 2007106027 A RU2007106027 A RU 2007106027A RU 2333957 C1 RU2333957 C1 RU 2333957C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- staphylococcus carnosus
- thya
- nitrite
- carnosus
- Prior art date
Links
- 241000191965 Staphylococcus carnosus Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 108010025915 Nitrite Reductases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 claims abstract description 3
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 claims abstract 2
- 101150072314 thyA gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101100427060 Bacillus spizizenii (strain ATCC 23059 / NRRL B-14472 / W23) thyA1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100153154 Escherichia phage T5 thy gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100313751 Rickettsia conorii (strain ATCC VR-613 / Malish 7) thyX gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000006456 gs medium Substances 0.000 description 5
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 5
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 3
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 3
- 101100281410 Escherichia coli (strain K12) fnr gene Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 102000005497 Thymidylate Synthase Human genes 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 101150100899 nirC gene Proteins 0.000 description 1
- -1 nitrite ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000004005 nitrosamines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии и представляет собой рекомбинантный штамм - продуцент фермента нитритредуктазы для снижения концентрации остаточного нитрита в пищевых продуктах.The invention relates to the field of molecular biology, genetic engineering, biochemistry and is a recombinant strain producing nitrite reductase enzyme to reduce the concentration of residual nitrite in food products.
Наиболее распространенный способ повышения уровня транскрипции генов в бактериях рода Staphylococcus заключается в замещении промоторной части гена на более сильный промотор. Такая замена приводит к увеличению синтеза соответствующего белкового продукта [US 6436694].The most common way to increase the level of gene transcription in bacteria of the genus Staphylococcus is to replace the promoter part of the gene with a stronger promoter. Such a substitution leads to an increase in the synthesis of the corresponding protein product [US 6436694].
Нитрит натрия вводят в рецептуру мясных продуктов для придания им розово-красного цвета, ингибирования спорообразования и роста нежелательной микрофлоры, также он оказывает антиокислительное действие на липиды и участвует в образовании вкуса и аромата соленого мяса. В производстве мясных продуктов предусмотрено восстановление нитрита с помощью химических веществ и бактериальных заквасок. При допускаемых уровнях вводимого нитрита и микроорганизмов, бактериальные закваски не способны полностью восстановить нитрит, что приводит к образованию остаточного нитрита. Наряду с "положительным" действием, существует проблема остаточного нитрита, который при повышенной концентрации, является мутагеном и токсичным веществом, приводит к образованию нитрозаминов и способен вызывать метгемоглобинию [Archer D.L., 2002]. Разрешенный уровень остаточного нитрита в нашей стране составляет от 30 до 50 мг на 1 кг продукта, он не является опасным, но вносит вклад в общий пул нитрита [Жукова Г.Ф. и др., 1999]. Многочисленные работы, направленные на поиск альтернатив нитриту, не привели к желаемому результату [Adams J.B., 1997].Sodium nitrite is introduced into the formulation of meat products to give them a pink-red color, inhibition of spore formation and growth of undesirable microflora, it also has an antioxidant effect on lipids and is involved in the formation of taste and aroma of salted meat. In the production of meat products, nitrite is reduced by chemicals and bacterial starter cultures. At acceptable levels of nitrite and microorganisms introduced, bacterial starter cultures are not able to completely restore nitrite, which leads to the formation of residual nitrite. Along with the “positive” effect, there is the problem of residual nitrite, which, at elevated concentrations, is a mutagen and a toxic substance, leads to the formation of nitrosamines and can cause methemoglobinia [Archer D.L., 2002]. The allowed level of residual nitrite in our country is from 30 to 50 mg per 1 kg of product, it is not dangerous, but contributes to the total pool of nitrite [Zhukova G.F. et al., 1999]. Numerous works aimed at finding alternatives to nitrite have not led to the desired result [Adams J.B., 1997].
В литературе отсутствуют данные о применении генетически модифицированных штаммов для снижения уровня остаточного нитрита. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".There are no data in the literature on the use of genetically modified strains to reduce the level of residual nitrite. Thus, the proposed technical solution meets the criteria: "novelty", "inventive step", "industrially applicable".
Задача изобретения состоит в получении штамма Staphylococcus carnosus - продуцента фермента нитритредуктазы для снижения концентрации остаточного нитрита в пищевых продуктах.The objective of the invention is to obtain a strain of Staphylococcus carnosus - a producer of the enzyme nitrite reductase to reduce the concentration of residual nitrite in foods.
Решение поставленной задачи достигается в способе конструирования штамма Staphylococcus carnosus продуцента фермента нитритредуктазы, предусматривающем получение промежуточного штамма thyA- с помощью триметоприма и замещение в нем промоторной части оперона, отвечающего за восстановление нитритов при дыхании.This object is achieved in a method for constructing a strain of Staphylococcus carnosus producing nitrite reductase enzyme, comprising forming an intermediate strain thyA - using trimethoprim and substitution therein operon promoter region responsible for the restoration of nitrite during breathing.
Сущность изобретения заключается в том, что в штамме Staphylococcus carnosus проводят замену исходной промоторной области нитритредуктазного оперона на более сильный промотор гена, кодирующего фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу. На основе штамма Staphylococcus carnosus B-8953 (ВКПМ, 117545, г.Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1), с помощью триметоприма, получен мутант Staphylococcus carnosus LIA-25 (thyA-), неспособный расти на среде GS без тимидина. Такой тип мутации возникает спонтанно в гене thyA и является допустимым при генетической модификации штаммов применяемых в пищевом производстве [Sasaki Y., 2004].The essence of the invention lies in the fact that in the Staphylococcus carnosus strain, the initial promoter region of the nitrite reductase operon is replaced by a stronger promoter of the gene encoding the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Based on the strain Staphylococcus carnosus B-8953 (VKPM, 117545, Moscow, 1st Road passage, 1), using trimethoprim, a mutant Staphylococcus carnosus LIA-25 (thyA - ) was obtained, unable to grow on GS medium without thymidine. This type of mutation occurs spontaneously in the thyA gene and is valid for genetic modification of strains used in food production [Sasaki Y., 2004].
Между генами nirC и nirR нитритредуктазного оперона Staphylococcus carnosus LIA-25 (thyA-) [Neubauer H. и др., 1999], вводят конструкцию, состоящую из двух элементов: гена тимидилат синтетазы(thyA) и промотора гомологичного гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (gap), оба элемента получают из хромосомы исходного штамма В-8953.Between the nirC and nirR genes of the nitrite reductase operon Staphylococcus carnosus LIA-25 (thyA - ) [Neubauer H. et al., 1999], a construct consisting of two elements is introduced: the thymidylate synthetase gene (thyA) and the promoter of the homologous glyceraldehyde-3-phosphate gene dehydrogenase (gap), both elements are obtained from the chromosome of the original strain B-8953.
Введение дополнительных элементов в хромосому осуществляют с помощью термочувствительной плазмиды рВТ2 [Bruckner R. и др., 1993], несущей конструкцию для интеграции с использованием ПЦР. Плазмида была удалена после интеграции с помощью нагревания до пермессивной температуры. Таким образом, мутантный штамм был комплементирован геном thyA и приобрел способность расти на среде GS без тимидина, а нитритредуктазный оперон оказался под контролем промотора гена gap.The introduction of additional elements into the chromosome is carried out using the thermosensitive plasmid pBT2 [Bruckner R. et al., 1993], which carries a structure for integration using PCR. The plasmid was removed after integration by heating to a constant temperature. Thus, the mutant strain was complemented by the thyA gene and acquired the ability to grow on GS medium without thymidine, and the nitrite reductase operon was under the control of the gap gene promoter.
Полученный с помощью генетической инженерии штамм был назван Staphylococcus carnosus LIA-96 и заложен в коллекцию ВКПМ под номером В-9518. Он показал в 1,5 раза большую скорость восстановления ионов нитрита в L-среде по сравнению с исходным штаммом.The strain obtained by genetic engineering was named Staphylococcus carnosus LIA-96 and put into the VKPM collection under the number B-9518. He showed a 1.5 times greater rate of reduction of nitrite ions in the L-medium compared with the original strain.
Таким образом, уровень остаточного нитрита в сырокопченых колбасах и деликатесных мясных изделиях может быть значительно снижен при использовании штамма Staphylococcus carnosus GM, что в свою очередь приведет к уменьшению уровня риска для здоровья потребителя.Thus, the level of residual nitrite in uncooked smoked sausages and delicatessen meat products can be significantly reduced by using the Staphylococcus carnosus GM strain, which in turn will reduce the level of risk to consumer health.
Описание примеров поясняется чертежами. На фиг.1 представлена схема получения термочувствительного вектора рВТ2; на фиг.2 - схема получения плазмиды pBT-thyA-gap-nirR; на фиг.3 - схема замещения промотора оперона nir промотором гена gap в Staphylococcus carnosus LIA-25; на фиг.4 - график изменения концентрации нитрита в L-среде при культивировании штамма Staphylococcus carnosus LIA-96.Description of examples is illustrated by drawings. Figure 1 presents a diagram of a heat-sensitive vector rVT2; figure 2 - scheme for obtaining the plasmid pBT-thyA-gap-nirR; figure 3 is a substitution pattern of the nir operon promoter with the gap gene promoter in Staphylococcus carnosus LIA-25; figure 4 is a graph of the concentration of nitrite in the L-medium during the cultivation of a strain of Staphylococcus carnosus LIA-96.
Пример 1: Получение термочувствительного вектора рВТ2.Example 1: Obtaining heat-sensitive vector pBT2.
Для репликации, интеграции в геном S.carnosus и дальнейшего удаления под действием температуры была сконструирована термочувствительная плазмида рВТ2.For replication, integration into the S. carnosus genome, and further removal under the influence of temperature, a thermosensitive plasmid pBT2 was constructed.
500 мкг плазмиды pTV1ts [К.Харди, 1990] обрабатывают последовательно эндонуклеазой рестрикции PstI, Pfu полимеразой и далее эндонуклеазой рестрикции BamHI. Фрагмент размером ~4 т.п.н. лигируют с плазмидой pUC19 обработанной эндонуклеазами рестрикции Есl136II, BamHI, а также щелочной фосфатазой желудка теленка. После переосаждения лигазную смесь трансформируют в штамм E.coli XL-1 (Blue). Клоны, содержащие необходимую вставку ДНК размером ~4 т.п.н., отбирают на чашках по устойчивости к ампициллину и стандартному тесту на отсутствие активность β-галактозидазы. Плазмидную ДНК, выделенную из полученных клонов, проверяют рестрикционным анализом. Полученная плазмида названа pUC-ВТ.500 μg of plasmid pTV1ts [K. Hardy, 1990] is treated sequentially with restriction endonuclease PstI, Pfu polymerase and further with BamHI restriction endonuclease. A fragment of ~ 4 kbp ligated with plasmid pUC19 treated with restriction endonucleases Esl136II, BamHI, as well as alkaline phosphatase of the calf’s stomach. After reprecipitation, the ligase mixture was transformed into E. coli strain XL-1 (Blue). Clones containing the required ~ 4 kbp DNA insert were selected on plates for ampicillin resistance and the standard absence test for β-galactosidase activity. Plasmid DNA isolated from the obtained clones was checked by restriction analysis. The resulting plasmid is named pUC-BT.
500 мкг плазмиды pUC18 последовательно обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI и HincII, фрагментом Кленова и лигазой фага Т4. После переосаждения лигазную смесь трансформируют в штамм E.coli XL-1 (Blue). Полученная плазмида названа pUC18-dMCS.500 μg of pUC18 plasmid is sequentially treated with BamHI and HincII restriction endonucleases, a Klenov fragment and T4 phage ligase. After reprecipitation, the ligase mixture was transformed into E. coli strain XL-1 (Blue). The resulting plasmid was named pUC18-dMCS.
По 200 мкг наибольших по молекулярной массе фрагментов, полученных при обработке плазмид pUC-BT и pUC18-dMCS эндонуклеазами рестрикции Seal и EcoRI, лигируют между собой. После переосаждения лигазную смесь трансформируют в штамм Е. coli C600. Полученная плазмида названа рВТ2 (фиг.1).200 μg of the highest molecular weight fragments obtained by processing plasmids pUC-BT and pUC18-dMCS with restriction endonucleases Seal and EcoRI are ligated to each other. After reprecipitation, the ligase mixture was transformed into E. coli strain C600. The resulting plasmid is named pBT2 (FIG. 1).
Пример 2: Получение конструкции для замещения промотора оперона nir и ее введение в состав рВТ2.Example 2: Obtaining a construct to replace the promoter of the nir operon and its introduction into the composition of pBT2.
500 мкг плазмиды pUC-nirC2-thyA последовательно обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI и Есо31I, параллельно 500 мкг плазмиды pUC-gap-nirR последовательно обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BglII и Есо31I. Получившиеся наибольшие по размеру фрагменты лигируют между собой. После переосаждения лигазную смесь трансформируют в штамм E.coli XL-1 (Blue). Полученная плазмида названа pUC-nirC2-thyA-gap-nirR.500 μg of the plasmid pUC-nirC2-thyA was sequentially treated with BamHI and Eco31I restriction endonucleases, in parallel with 500 μg of the plasmid pUC-nirC2-thyA was sequentially treated with BglII and Eco31I restriction endonucleases. The resulting largest fragments are ligated to each other. After reprecipitation, the ligase mixture was transformed into E. coli strain XL-1 (Blue). The resulting plasmid was named pUC-nirC2-thyA-gap-nirR.
По 500 мкг векторов pUC-nirC2-thyA-gap-nirR и рВТ2 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции SdaI и получившиеся наибольшие по размеру фрагменты лигируют между собой. После переосаждения лигазную смесь трансформируют в штамм E.coli XL-1 (Blue). Полученная плазмида названа pBT-thyA-gap-nirR (фиг.2).500 μg of the vectors pUC-nirC2-thyA-gap-nirR and pBT2 are treated with an SdaI restriction endonuclease and the resulting largest fragments are ligated to each other. After reprecipitation, the ligase mixture was transformed into E. coli strain XL-1 (Blue). The resulting plasmid is named pBT-thyA-gap-nirR (figure 2).
Пример 3: Получение штамма Staphylococcus carnosus - ауксотрофа по тимидину.Example 3: Obtaining a strain of Staphylococcus carnosus - auxotroph by thymidine.
Для того чтобы иметь возможность использовать в качестве селективного маркера ген, кодирующий тимидилат синтетазу, необходимо получить соответствующую ауксотрофность в штамме.In order to be able to use the gene encoding thymidylate synthetase as a selective marker, it is necessary to obtain the corresponding auxotrophy in the strain.
Культуру клеток наращивают в 5 мл среды GS((NH4)2HPO4 - 2,5 г/л, КН2PO4 - 1,5 г/л, NaCl - 5 г/л, MgSO4·7H2O (20% раствор) - 0,5 мл, глутамат натрия - 3 г/л, глюкоза - 3 г/л, рН 7) при t=37°C в течение 12 часов. Из полученной культуры отбирают 50 мкл и добавляют к 5 мл среды GS, содержащей 20 мкг/мл тимидина и 1,2 мг/мл триметоприма, и культивируют в течение 16 часов при t=37°C. Далее 500 мкл полученной культуры центрифугируют (n=6000 об/мин, 90 секунд), ресуспендируют в 1 мл физраствора и снова центрифугируют. Осадок ресуспендируют в 100 мкл физраствора и высевают на агаризированную GS-среду, содержащую тимидин в концентрации 20 мкг/мл, и выдерживают при 30°С до появления колоний. Отбирают наибольшие по размеру колонии и делают посев репликой на среду GS с тимидином и без тимидина. Колонии выросшие за 24 часа, но не показавшие рост в течение недели на среде с тимидином, были классифицированы как мутанты thyA-. Один из таких мутантов S.carnosus LIA-25 (thyA-25) был взят для дальнейших исследований.The cell culture is expanded in 5 ml of GS ((NH 4 ) 2 HPO 4 medium - 2.5 g / L, KH 2 PO 4 - 1.5 g / L, NaCl - 5 g / L, MgSO 4 · 7H 2 O ( 20% solution) - 0.5 ml, monosodium glutamate - 3 g / l, glucose - 3 g / l, pH 7) at t = 37 ° C for 12 hours. 50 μl was taken from the obtained culture and added to 5 ml of GS medium containing 20 μg / ml thymidine and 1.2 mg / ml trimethoprim, and cultured for 16 hours at t = 37 ° C. Next, 500 μl of the resulting culture was centrifuged (n = 6000 rpm, 90 seconds), resuspended in 1 ml of saline and centrifuged again. The precipitate was resuspended in 100 μl of saline and plated on an agarized GS medium containing thymidine at a concentration of 20 μg / ml and kept at 30 ° C until colonies appeared. The largest colonies are selected and inoculated with GS medium with thymidine and without thymidine. Colonies grown in 24 hours, but not showing growth for a week on thymidine medium, were classified as thyA - mutants. One of these mutants S.carnosus LIA-25 (thyA-25) was taken for further studies.
Пример 4: Замещение промотора оперона nir промотором гена gap в Staphylococcus carnosus LIA-25.Example 4: Substitution of the nir operon promoter with the gap gene promoter in Staphylococcus carnosus LIA-25.
Плазмиду pBT-thyA-gap-nirR трансформируют в компетентные клетки штамма S.carnosus LIA-25. Трансформанты растят в течение 48 часов при 30°С на агаризованой среде GS с добавлением хлорамфеникола (10 мкг/мл). После подтверждения фенотипа, одну колонию наращивают при 38°С в течение 12 часов в 5 мл L-среды (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl) с эритромицином (2 мкг/мл). Далее 100 мкл культуры высевают на прогретую до 38°С чашку со средой LA, содержащую эритримицин в концентрации 10 мкг/мл и растят при 38°С в течение 12 часов. Появившиеся колонии высевают путем реплики на среду LA с эритромицином (10 мкг/мл) и с эритромицином (10 мкг/мл) и хлорамфениколом (10 мкг/мл). Колонии, не выросшие на среде с хлорамфениколом и эритромицином, были проверены путем ПЦР на наличие замены промоторов гена nirR с использованием праймеров TTTTGACGTCCCTGCAGGATGGTTATGCAAAATCATAAAAC (nirC2-F) и CGTGTCGCACTGATAGGC (nirRconf-R).Plasmid pBT-thyA-gap-nirR is transformed into competent cells of S. carnosus LIA-25 strain. Transformants were grown for 48 hours at 30 ° C. on GS agar medium supplemented with chloramphenicol (10 μg / ml). After confirming the phenotype, one colony is grown at 38 ° C for 12 hours in 5 ml of L-medium (10 g / l peptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl) with erythromycin (2 μg / ml). Next, 100 μl of the culture is plated on a LA medium cup heated to 38 ° C containing erythrimycin at a concentration of 10 μg / ml and grown at 38 ° C for 12 hours. The resulting colonies are seeded by replicating on LA medium with erythromycin (10 μg / ml) and with erythromycin (10 μg / ml) and chloramphenicol (10 μg / ml). Colonies that did not grow on chloramphenicol and erythromycin medium were checked by PCR for replacement of the nirR gene promoters using the primers TTTTGACGTCCCTGCAGGATGGTTATGCAAAATCATAAAAC (nirC2-F) and CGTGTCGCACTRATAG.
Схема процесса интеграции плазмиды pBT-thyA-gap-nirR изображена на фиг.3.The scheme of the process of integration of the plasmid pBT-thyA-gap-nirR shown in Fig.3.
Штамм, полученный с помощью вектора pBT-thyA-gap-nirR, был назван S.carnosus LIA-96.The strain obtained using the vector pBT-thyA-gap-nirR was named S. carnosus LIA-96.
Пример 5: Изучение изменения содержания нитрита в L-среде при культивировании штамма Staphylococcus carnosus LIA-96.Example 5: The study of changes in the nitrite content in the L-medium during the cultivation of a strain of Staphylococcus carnosus LIA-96.
Для оценки нитритредуктазной активности полученным продуцентом проведено культивирование штамма Staphylococcus carnosus LIA-96 в L-среде с добавлением нитрита. В L-среду, с добавлением нитрита до конечной концентрации 25 мг на 100 мл вносят штаммы S.carnosus LIA-96 или S.carnosus В-8953 до 108 клеток на 100 мл среды. Проводят культивирование в анаэробных условиях при 37°С и отбирают пробы через равные промежутки в течение 14 часов. Далее измеряют концентрацию нитрита по методике [Xu J. и др., 2000]. На фиг.4 показана динамика изменения концентрации нитрита при использовании для засева штамма-продуцента или исходного штамма.To assess nitrite reductase activity, the producer obtained cultured the Staphylococcus carnosus LIA-96 strain in L medium supplemented with nitrite. In the L-medium, with the addition of nitrite to a final concentration of 25 mg per 100 ml, strains of S. carnosus LIA-96 or S. carnosus B-8953 are added to 10 8 cells per 100 ml of medium. Cultivation is carried out under anaerobic conditions at 37 ° C and samples are taken at regular intervals for 14 hours. Next, the concentration of nitrite is measured according to the procedure [Xu J. et al., 2000]. Figure 4 shows the dynamics of changes in the concentration of nitrite when used for inoculation of a producer strain or the original strain.
В образце со штаммом-продуцентом концентрации нитрита снизилась до нулевого уровня за 12 часов, в то время как в образце с исходным штаммом это произошло при культивировании в течение 18 часов. Таким образом, штамм-продуцент снижает концентрацию нитрита быстрее в 1,5 в сравнении с традиционно используемым штаммом.In the sample with the producer strain, the nitrite concentration decreased to zero in 12 hours, while in the sample with the initial strain this occurred during cultivation for 18 hours. Thus, the producer strain reduces the concentration of nitrite faster by 1.5 in comparison with the traditionally used strain.
Рекомбинантный штамм бактерии Staphylococcus carnosus B-8953 - депонированный в коллекции ВКПМ под номером В-9518 - продуцент фермента нитритредуктазы.The recombinant strain of the bacterium Staphylococcus carnosus B-8953 - deposited in the VKPM collection under the number B-9518 - the producer of the nitrite reductase enzyme.
Список литературыBibliography
1. D.L.Archer, Evidence that ingested nitrate and nitrite are beneficial to health, Journal of Food Protection, 2002, Vol.65(5), p.872-875.1. D.L. Archer, Evidence that ingested nitrate and nitrite are beneficial to health, Journal of Food Protection, 2002, Vol. 65 (5), p. 872-875.
2. Г.Ф.Жукова, М.С.Торская, В.И.Родин, С.А.Хотимченко, N-нитрозамины и нитриты в мясе и мясных продуктах. Вопрос питания, 1999, 68, стр.32-34.2. G. F. Zhukova, M. S. Torskaya, V. I. Rodin, S. A. Khotimchenko, N-nitrosamines and nitrites in meat and meat products. The Nutrition Question, 1999, 68, pp. 32-34.
3. J.B.Adams, Food additive-additive interactions involving sulphur dioxide and ascorbic and nitrous acids: a review. Food Chemistry, 1997, Vol.59(3), p.401-409.3. J.B. Adams, Food additive-additive interactions involving sulphur dioxide and ascorbic and nitrous acids: a review. Food Chemistry, 1997, Vol. 59 (3), p. 401-409.
4. Sasaki Y., Ito Y. and Sasaki Т., "thyA as a Selection Marker in Construction of Food-Grade Host-Vector and Integration Systems for Streptococcus thermophilus", Applied And Environmental Microbiology, March. 2004, Vol.70(3) p.1858-64.4. Sasaki Y., Ito Y. and Sasaki T., "thyA as a Selection Marker in Construction of Food-Grade Host-Vector and Integration Systems for Streptococcus thermophilus", Applied And Environmental Microbiology, March. 2004, Vol. 70 (3) p. 1858-64.
5. H.Neubauer, I.Pantel, F.Gotz, "Molecular Characterization of the Nitrite-Reducing System of Staphylococcus carnosus", Journal of Bacteriology, March 1999, Vol.181(5), p.1481-1488.5. H. Neubauer, I. Pantel, F. Gotz, "Molecular Characterization of the Nitrite-Reducing System of Staphylococcus carnosus", Journal of Bacteriology, March 1999, Vol. 181 (5), p. 1481-1488.
6. R. Bruckner, E. Wagner and F. Gotz, Characterization of a sucrase gene from Staphylococcus xylosus. Journal Of Bacteriology. 1993, Vol.175, p.851-857.6. R. Bruckner, E. Wagner and F. Gotz, Characterization of a sucrase gene from Staphylococcus xylosus. Journal Of Bacteriology. 1993, Vol. 175, p.851-857.
7. Xu J., Xu X., Verstraete W. Adaptation of E.coli cell method for micro-scale nitrate measurement with the Griess reaction in culture media. J Microbiol Methods. 2000 Jun; 41(l):23-33.7. Xu J., Xu X., Verstraete W. Adaptation of E. coli cell method for micro-scale nitrate measurement with the Griess reaction in culture media. J Microbiol Methods. 2000 Jun; 41 (l): 23-33.
8. К.Харди. Плазмиды. Методы. М.: Мир, 1990.8. C. Hardy. Plasmids Methods M .: Mir, 1990.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007106027/13A RU2333957C1 (en) | 2007-02-20 | 2007-02-20 | METHOD FOR CONSTRUCTING RECOMBINANT STRAIN OF Staphylococcus carnosus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007106027/13A RU2333957C1 (en) | 2007-02-20 | 2007-02-20 | METHOD FOR CONSTRUCTING RECOMBINANT STRAIN OF Staphylococcus carnosus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2333957C1 true RU2333957C1 (en) | 2008-09-20 |
Family
ID=39867923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007106027/13A RU2333957C1 (en) | 2007-02-20 | 2007-02-20 | METHOD FOR CONSTRUCTING RECOMBINANT STRAIN OF Staphylococcus carnosus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2333957C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0805205A1 (en) * | 1996-05-02 | 1997-11-05 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Nitrate reduction system of Staphylococcus carnosus |
| US6436694B1 (en) * | 1998-01-09 | 2002-08-20 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Regulable gene expression in gram-positive bacteria |
-
2007
- 2007-02-20 RU RU2007106027/13A patent/RU2333957C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0805205A1 (en) * | 1996-05-02 | 1997-11-05 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Nitrate reduction system of Staphylococcus carnosus |
| US6436694B1 (en) * | 1998-01-09 | 2002-08-20 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Regulable gene expression in gram-positive bacteria |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NEUBAUER N et al. Molecular characterization of the nitrite-reducing system of Staphylococcus carnosus J. Bacteriol. 1999 Mar; 181(5): 1481-8. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Meulenberg et al. | Nucleotide sequence and structure of the Klebsiella pneumoniae pqq operon | |
| KR101830002B1 (en) | Strain overexpressing l-tryptophan by enhancing sub substrates supply and process for producing l-tryptophan using the same | |
| EP2445929B1 (en) | A method for transforming a bacterium belonging to the streptococcus genus by natural competence | |
| Mengin-Lecreulx et al. | Organization of the murE-murG region of Escherichia coli: identification of the murD gene encoding the D-glutamic-acid-adding enzyme | |
| Ball et al. | Expression of Serratia marcescens extracellular proteins requires recA | |
| TW201945535A (en) | Microorganism having increased glycine productivity and method for producing fermented composition using the same | |
| EP3824089B1 (en) | Nucleic acid molecules comprising a variant rpoc coding sequence | |
| US20240327884A1 (en) | Atp-prt variant with reduced feedback inhibition by histidine, and histidine-producing strain expressing same | |
| Sugimoto et al. | Hyperproduction of phenylalanine by Escherichia coli: application of a temperature-controllable expression vector carrying the repressor-promoter system of bacteriophage lambda | |
| US20240060057A1 (en) | Atp-prt variant with reduced feedback inhibition by histidine, and histidine-producing strain expressing same | |
| US20240068000A1 (en) | Atp-prt variant with reduced feedback inhibition by histidine, and histidine-producing strain expressing same | |
| US20240060104A1 (en) | Atp-prt variant with reduced feedback inhibition by histidine, and histidine-producing strain expressing same | |
| US20240060103A1 (en) | Atp-prt variant with reduced feedback inhibition by histidine, and histidine-producing strain expressing same | |
| US20060014257A1 (en) | RSF1010 derivative Mob' plasmid containing no antibiotic resistance gene, bacterium comprising the plasmid and method for producing useful metabolites | |
| Nácher-Vázquez et al. | Dextransucrase expression is concomitant with that of replication and maintenance functions of the pMN1 plasmid in Lactobacillus sakei MN1 | |
| Elischewski et al. | Pantothenate production in Escherichia coli K12 by enhanced expression of the panE gene encoding ketopantoate reductase | |
| Kamoun et al. | Two chromosomal loci involved in production of exopolysaccharide in Agrobacterium tumefaciens | |
| Jakowec et al. | Recombinant plasmid conferring proline overproduction and osmotic tolerance | |
| RU2333957C1 (en) | METHOD FOR CONSTRUCTING RECOMBINANT STRAIN OF Staphylococcus carnosus | |
| Wertheimer et al. | Structural and functional analyses of mutant Fur proteins with impaired regulatory function | |
| Weinreich et al. | Overexpression of the Tn5 transposase in Escherichia coli results in filamentation, aberrant nucleoid segregation, and cell death: analysis of E. coli and transposase suppressor mutations | |
| Şimşek et al. | Influence of growth conditions on the nisin production of bioengineered Lactococcus lactis strains | |
| JP4836440B2 (en) | Method for producing arginine using microorganisms | |
| Baliko et al. | An Escherichia coli gene in search of a function: phenotypic effects of the gene recently identified as murI | |
| ITMI952700A1 (en) | THERMOSTABLE MUTANTS OF D-M-ALPHA-CARBAMYLASE |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110221 |