RU2326943C1 - Method of preparation of recombinant adenovirus of birds for vaccination against birds flu virus h5n1 - Google Patents
Method of preparation of recombinant adenovirus of birds for vaccination against birds flu virus h5n1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2326943C1 RU2326943C1 RU2006147166/13A RU2006147166A RU2326943C1 RU 2326943 C1 RU2326943 C1 RU 2326943C1 RU 2006147166/13 A RU2006147166/13 A RU 2006147166/13A RU 2006147166 A RU2006147166 A RU 2006147166A RU 2326943 C1 RU2326943 C1 RU 2326943C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- celo
- adenovirus
- gene
- recombinant
- expression cassette
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 46
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 44
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 26
- 108700032993 adenovirus CELO Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241000701796 Fowl aviadenovirus 1 Species 0.000 claims abstract 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 20
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 claims description 16
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 15
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 15
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 13
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 11
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 claims description 9
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 claims description 8
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 abstract description 15
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 abstract description 8
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 9
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000001424 embryocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010089133 GGTACC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701149 Human adenovirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии вирусов и касается оригинальной технологии получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO, содержащего ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, либо ген нейраминидазы вируса гриппа птиц под контролем эукариотического промотора, либо оба гена одновременно, и может быть использовано в ветеринарии для создания генно-инженерных рекомбинантных вакцин нового поколения.The invention relates to molecular biology, biotechnology, genetic engineering of viruses and relates to the original technology for the production of recombinant CELO avian adenovirus containing the avian influenza virus hemagglutinin gene, or avian influenza virus neuraminidase gene under the control of a eukaryotic promoter, or both genes at the same time, and can be used in veterinary medicine to create a new generation of genetically engineered recombinant vaccines.
Вирус гриппа птиц является опасным инфекционным агентом, вызывающим массовый падеж птицы. Одним из подходов к решению проблемы является создание эффективного вакцинного препарата против вируса птиц на основе инактивированного вируса. Однако инактивированные вакцины не отвечают всем требованиям эффективности и безопасности, которые предъявляются в настоящее время к вакцинам для человека и животных. В связи с этим проводят разработку кандидатных маркерных рекомбинантных вакцин на основе аденовирусных векторов человека и животных (Hum Gene Ther. 2005, V 16, p.157-168; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, V.101, p.14567-14571). Рекомбинантные аденовирусы по сравнению с другими векторными системами отличаются высокой эффективностью экспрессии трансгена в различных типах клеток, безопасностью вектора для человека и животных, накоплением рекомбинантных вирусов в клетках-продуцентах в высоком титре, индукцией как гуморального, так и клеточного иммунного ответа на трансгенный продукт в организме человека и животных, большой пакующей емкостью вектора и т.д.The bird flu virus is a dangerous infectious agent that causes massive mortality of birds. One of the approaches to solving the problem is the creation of an effective vaccine preparation against avian virus based on inactivated virus. However, inactivated vaccines do not meet all the requirements for efficacy and safety that currently apply to vaccines for humans and animals. In this regard, the development of candidate marker recombinant vaccines based on human and animal adenoviral vectors is being carried out (Hum Gene Ther. 2005, V 16, p. 157-168; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, V.101, p. 14567-14571). Compared to other vector systems, recombinant adenoviruses are characterized by high efficiency of transgene expression in various cell types, vector safety for humans and animals, accumulation of recombinant viruses in producer cells in high titer, induction of both humoral and cellular immune responses to transgenic products in the body humans and animals, large packing capacity of the vector, etc.
Создание генетической конструкции на основе аденовируса птиц CELO chicken embryo lethal orphan (аденовируса птиц 1 серотипа FAV-1) имеет ряд практических преимуществ. Вирус CELO является инфекционным агентом, но при этом вызываемая им инфекция не несет значительных экономических последствий или угрозы здоровью птицы. Данный вирус может быть выделен от здоровых цыплят и не вызывает заболевания в результате экспериментального заражения цыплят (Vaccine 2004, V.22, р.2351-2360). Рекомбинантные аденовирусы птиц CELO, экспрессирующие гены протективных (защитных) антигенов различных патогенов, обладают выраженным тропизмом по отношению к эпителиальным тканям птиц. Это позволяет осуществлять эффективную и пролонгированную экспрессию целевого гена в организме иммунизированных птиц, что, в свою очередь, приводит к формированию у них мощного специфического гуморального и цитотоксического иммунного ответа против патогена. Дополнительным преимуществом рекомбинантных аденовирусов птиц CELO является низкая себестоимость получения препаративных количеств вируса в аллантоисе куриного эмбриона - безопасной и высокотехнологичной системе, традиционно использующейся для производства вакцин. В связи с этим рекомбинантный вирус CELO был использован для клонирования гена VP2 вируса инфекционного бурсита птиц (IBDV) (Vaccine 2004, V.22, р.2351-2360) и гена гликопротеина G вируса бешенства (Микробиология, 2006, т.4, с.69-71). Полученные рекомбинантные аденовирусы CELO были использованы для вакцинации животных и птиц. Результаты экспериментов продемонстрировали, что иммунизированные животные были защищены от патогенных штаммов вирусов, что подтверждает хорошие перспективы использования рекомбинантного аденовируса CELO для создания векторных вакцин для использования в ветеринарии.Creating a genetic construct based on bird adenovirus CELO chicken embryo lethal orphan (
Гемагглютинин и нейраминидаза являются поверхностными антигенами вируса гриппа. Эти белки отвечают за первичное взаимодействие вируса с клеткой хозяина, характеризуются гетерогенностью и изменчивостью. Известно 16 подтипов гемагглютинина (H1-16), которые в совокупности с подтипами белка нейраминидазы (N1-9) определяют подтипы вируса гриппа. Наличие иммунного ответа организма на антигенные белки гемагглютинина и нейраминидазы привело к использованию кодирующих последовательностей вышеназванных белков при создании рекомбинантных плазмид для вакцинации человека и животных. Так, известно, что нуклеотидную последовательность гемагглютинина вируса гриппа человека клонировали в челночный плазмидный вектор. В результате гомологичной рекомбинации был получен рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа (Ad5) с целью его дальнейшего использования в качестве вакцины для человека и животных против патогенного штамма вируса гриппа (Vaccine, 2005, V 23, р.1029-1036). Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1 клонировали в человеческий аденовирус 5-го серотипа также с целью использования полученного рекомбинантного вируса как вакцины для человека, животных и птиц (Vaccine, 2006, J. of Virology, 2006, V.80, №4, p.1959-1964). В результате было показано, что рекомбинантный человеческий аденовирус 5-го серотипа, несущий экспрессирующую кассету с геном гемагглютинина вируса гриппа птиц, вызывает образование высокого уровня антител к патогенному штамму вируса в исследованных организмах. Однако, что касается вакцинации птиц, существует возможность повышения эффективности действия подобной вакцины путем использования рекомбинантного вектора на основе аденовируса птиц CELO (chicken embryo lethal orphan), для которого птица является природным хозяином.Hemagglutinin and neuraminidase are surface antigens of the influenza virus. These proteins are responsible for the primary interaction of the virus with the host cell, characterized by heterogeneity and variability. There are 16 known subtypes of hemagglutinin (H1-16), which together with the subtypes of neuraminidase protein (N1-9) determine the subtypes of influenza virus. The presence of the body's immune response to antigenic proteins of hemagglutinin and neuraminidase led to the use of coding sequences of the above proteins when creating recombinant plasmids for vaccination of humans and animals. Thus, it is known that the nucleotide sequence of the human influenza virus hemagglutinin was cloned into a shuttle plasmid vector. As a result of homologous recombination, a recombinant human adenovirus of the 5th serotype (Ad5) was obtained for the purpose of its further use as a vaccine for humans and animals against a pathogenic strain of influenza virus (Vaccine, 2005, V 23, p. 1029-1036). The H5N1 avian influenza virus hemagglutinin gene was also cloned into human adenovirus of the 5th serotype in order to use the resulting recombinant virus as a vaccine for humans, animals and birds (Vaccine, 2006, J. of Virology, 2006, V.80, No. 4, p. 1959-1964). As a result, it was shown that recombinant human adenovirus of the 5th serotype carrying an expression cassette with the avian influenza virus hemagglutinin gene causes the formation of a high level of antibodies to the pathogenic strain of the virus in the studied organisms. However, with regard to vaccination of birds, it is possible to increase the effectiveness of such a vaccine by using a recombinant vector based on bird adenovirus CELO (chicken embryo lethal orphan), for which the bird is a natural host.
Для получения рекомбинантных аденовирусов используют несколько способов. Первый включает направленное лигирование гена с аденовирусным геномом (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984). Так как геном аденовирусов имеет размер порядка 40000 н.п. и содержит незначительное число уникальных сайтов рестрикции, этот способ технически сложен и нерезультативен. Второй способ основан на использовании фага лямбда, который также ограничивает возможности при получении рекомбинантных аденовирусов (J. Virology, 2001, V.75, N11, p.5288-5301). Третий способ основан на клонировании целевого гена в «shuttle»-векторе, который содержит участки, гомологичные концевым фрагментам генома аденовируса, с последующей гомологичной рекомбинацией, в результате которой происходит перенос целевого гена в геномную ДНК аденовируса.Several methods are used to produce recombinant adenoviruses. The first involves targeted ligation of the gene with the adenovirus genome (T. Maniatis et al. Molecular Cloning. M: Mir, 1984). Since the adenovirus genome has a size of the order of 40,000 n.a. and contains a small number of unique restriction sites, this method is technically complicated and ineffective. The second method is based on the use of phage lambda, which also limits the ability to obtain recombinant adenoviruses (J. Virology, 2001, V.75, N11, p.5288-5301). The third method is based on the cloning of the target gene in a shuttle vector that contains regions homologous to the terminal fragments of the adenovirus genome, followed by homologous recombination, which results in the transfer of the target gene to the adenovirus genomic DNA.
Для получения рекомбинантного вируса CELO с помощью гомологичной рекомбинации используют полную геномную ДНК вируса CELO или плазмиду, содержащую полную геномную ДНК вируса CELO, а также плазмидную конструкцию, одновременно содержащую правый и левый участки генома CELO и экспрессирующую кассету из целевого гена под контролем эукариотического промотора и сигнала полиаденилирования. Экспрессирующая кассета содержится либо в левом участке генома CELO, либо в правом участке. В правом участке генома CELO из плазмидной конструкции осуществляют два вида делеций, либо в области 33358-43684 н.п., либо в области 41731-43684 н.п. в связи с ограничением пакующей емкости вирусной частицы (US, 6841158, 2005), при этом в область делеций 41731-43684 н.п. клонируют экспрессирующую кассету с одним целевым геном в связи с ограничением области до 2153 н.п.To obtain recombinant CELO virus using homologous recombination, use the full genomic DNA of the CELO virus or a plasmid containing the complete genomic DNA of the CELO virus, as well as a plasmid construct that simultaneously contains the right and left portions of the CELO genome and expresses the cassette from the target gene under the control of the eukaryotic promoter and signal polyadenylation. The expression cassette is contained either in the left region of the CELO genome, or in the right region. Two types of deletions are carried out in the right part of the CELO genome from the plasmid construct, either in the region of 33358-43684 n.a. or in the region 41731-43684 n.a. due to the limitation of the packing capacity of the viral particle (US, 6841158, 2005), while in the region of deletions 41731-43684 n.a. clone an expression cassette with one target gene due to the limitation of the region to 2153 bp
За счет гомологичных участков плазмидной конструкции с экспрессирующей кассетой и полной геномной ДНК вируса CELO в клетках Е. coli проводят гомологичную рекомбинацию, результатом которой является получение плазмиды с полным геномом CELO и включенной экспрессирующей кассетой. Полученную плазмиду путем трансфекции вводят в пермиссивную (подходящую для размножения) для вируса CELO линию клеток гепатомы петуха леггорна (leggorn male hepatoma) LMH (J. Virology 1999, V.73, p.1399-1410). Данный способ имеет ограничения в использовании, поскольку из-за большого размера генома CELO (около 44 тыс.н.п.) целевые вставки должны быть ограниченного размера, а проведение их клонирования в несколько этапов приводит к увеличению затрат на получение вакцины.Due to the homologous regions of the plasmid construct with the expression cassette and the full genomic DNA of the CELO virus, E. coli cells carry out homologous recombination, the result of which is to obtain a plasmid with the full CELO genome and the expression cassette turned on. The resulting plasmid is transfected into the permgel (leggorn male hepatoma) LMH cell line (suitable for propagation) for the CELO virus (J. Virology 1999, V.73, p. 1399-1410). This method has limitations in use, because of the large size of the CELO genome (about 44 thousand bp), the target inserts must be of a limited size, and their cloning in several stages leads to an increase in the cost of obtaining the vaccine.
Задачей изобретения является создание эффективного способа для получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO с большей емкостью для клонирования целевых генов, экспрессия которых способствует иммунизации животных, например гена гемагглютинина или (и) гена нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1 для проведения вакцинации птиц.The objective of the invention is to provide an effective method for producing recombinant bird adenovirus CELO with a larger capacity for cloning target genes, the expression of which contributes to the immunization of animals, for example, the hemagglutinin gene and / or gene for neuraminidase of the avian influenza virus H5N1 for vaccination of birds.
Поставленные задачи решаются тем, что в способе создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации против вируса гриппа птиц H5N1 выбирают геномную ДНК аденовируса птиц CELO с делегированным фрагментом, несущественным для репликации, затем конструируют плазмидную конструкцию с зонами, гомологичными нуклеотидной последовательности геномной ДНК аденовируса птиц CELO, между которыми образуют делецию в 3620 н.п. для увеличения пакующей емкости вируса CELO, в область которой клонируют, как минимум, одну экспрессирующую кассету, состоящую из промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии в эукариотических клетках, из, как минимум, одного целевого гена и из сигнала полиаденилирования. Гомологичную рекомбинацию проводят в культуре клеток гепатомы петуха леггорна (LMH), обеспечивая получение генетической конструкции рекомбинантного аденовируса, состоящего из геномной ДНК аденовируса птиц CELO, из нуклеотидной последовательности плазмидной конструкции, включающей в свою последовательность, как минимум, одну экспрессирующую кассету, при этом в культуре клеток LMH происходит сборка рекомбинантного вируса CELO с, как минимум, одной экспрессирующей кассетой. В качестве целевого гена в составе экспрессирующей кассеты используют либо ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1, либо ген нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1, либо два вышеназванных гена одновременно. Полученный рекомбинантный аденовирус птиц используют в качестве вакцины для иммунизации животных к вирусу гриппа птиц H5N1.The tasks are solved in that in the method of creating recombinant avian adenovirus for vaccination against avian influenza virus H5N1, the genomic DNA of bird adenovirus CELO with a delegated fragment that is not essential for replication is selected, then a plasmid construct with regions homologous to the nucleotide sequence between the genomic DNA of adenovirus CELO is constructed which form a deletion in 3620 n.a. to increase the packaging capacity of the CELO virus, into the region of which at least one expression cassette is cloned, consisting of a promoter that provides a high level of expression in eukaryotic cells, from at least one target gene and from a polyadenylation signal. Homologous recombination is carried out in a culture of Leghorn rooster hepatoma cells (LMH), providing the genetic construct of the recombinant adenovirus, consisting of the genomic DNA of CELO bird adenovirus, from the nucleotide sequence of the plasmid construct, which includes at least one expression cassette, while in culture recombinant CELO virus is assembled with LMH cells with at least one expression cassette. As the target gene in the expression cassette, either the H5N1 avian influenza virus virus hemagglutinin gene, the H5N1 avian influenza virus neuraminidase gene, or two of the above genes are used simultaneously. The resulting recombinant avian adenovirus is used as a vaccine for immunizing animals with the H5N1 avian influenza virus.
Изобретение поясняется чертежами, где на Фиг.1 изображен полный геном аденовируса птиц CELO с уникальным сайтом рестрикции Swa I. На Фиг.2 изображен плазмидный вектор pCBEd13kb с одним правым концевым участком генома аденовируса птиц CELO, делетированным на 3620 н.п., и экспрессирующей кассетой в месте делеции, состоящей из эукариотического промотора, полилинкера для клонирования целевых генов и сигнала полиаденилировния. На Фиг.3 показана гомологичная рекомбинация в клетках LMH между геномом аденовируса птиц CELO, гидролизованным по уникальному сайту рестрикции Swa I и плазмидной конструкцией pCBEd13kb, содержащей в своем составе экспрессирующую кассету из эукариотического промотора, целевого гена (генов) для вакцинации и сигнала полиаденилирования. На Фиг.4 изображен полный геном рекомбинантного вируса CELO, содержащий в своем составе экспрессирующую кассету из эукариотического промотора, целевого гена (генов) для вакцинации и сигнала полиаденилирования. На Фиг.5 показано наличие экспрессии целевого гена гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1 для вакцинации животных в клетках LMH, зараженных рекомбинантным вирусом CELO-HA, содержащим в своем составе экспрессирующую кассету из эукариотического промотора, целевого гена для вакцинации и сигнала полиаденилирования. При этом LMH-HA - лизат клеток линии LMH, инфицированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, LMH - лизат клеток линии LMH, инфицированных контрольным вирусом CELO-d13kb, не содержащим гена гемагглютинина, 1 - гемагглютинин вируса гриппа в количестве 3 нг на трек., 2 - гемагглютинин вируса гриппа в количестве 10 нг на трек, 3 - гемагглютинин вируса гриппа в количестве 30 нг на трек.The invention is illustrated by drawings, in which Fig. 1 depicts the complete CELO adenovirus genome with a unique Swa I restriction site. Fig. 2 shows the plasmid vector pCBEd13kb with one right end portion of the CELO avian adenovirus genome deleted at 3620 bp and expressing a cassette at the deletion site, consisting of a eukaryotic promoter, a polylinker for cloning target genes and a polyadenylation signal. Figure 3 shows homologous recombination in LMH cells between the CELO avian adenovirus genome hydrolyzed from the unique Swa I restriction site and the pCBEd13kb plasmid construct containing an expression cassette from the eukaryotic promoter, target gene (s) for vaccination and a polyadenyl signal. Figure 4 shows the complete genome of the recombinant CELO virus containing an expression cassette from a eukaryotic promoter, a target gene (s) for vaccination and a polyadenylation signal. Figure 5 shows the presence of the expression of the H5N1 avian influenza virus hemagglutinin target gene for vaccination of animals in LMH cells infected with the recombinant CELO-HA virus containing an expression cassette from the eukaryotic promoter, the target gene for vaccination and the polyadenylation signal. In this case, LMH-HA is a lysate of LMH cells infected with recombinant CELO-HA adenovirus containing the avian influenza hemagglutinin gene, LMH is a lysate of LMH cells infected with control CELO-d13kb virus that does not contain the hemagglutinin gene, 1 -
Геном аденовируса птиц CELO состоит из 43804 н.п., при этом правый концевой участок генома, который имеет размер 43685-43804 н.п. и находится после сайта рестрикции Swa I, содержит инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса в клетках, отмечен на Фиг.1 цифрой I. Удаление данного участка обеспечивает эффективное получение рекомбинантного аденовируса птиц непосредственно в клетках LMH, где происходит сборка и размножение вируса.The genome of bird adenovirus CELO consists of 43804 n.p., while the right end portion of the genome, which has a size of 43685-43804 n.p. and is located after the Swa I restriction site, contains the inverted repeats necessary for virus replication in cells, indicated by the number I in Figure 1. Removing this site ensures the efficient production of recombinant avian adenovirus directly in LMH cells where the virus is assembled and propagated.
Аналогичный участок 43685-43804 н.п. генома CELO содержится в составе плазмидной конструкции pCBEdl3kb, которая изображена на Фиг.2. Также данный вектор содержит участок генома аденовируса птиц CELO от 36278 н.п. до 40065 н.п., который обозначен цифрой II. Участки I и II являются нуклеотидными последовательностями, составляющими правый концевой участок генома CELO. Между участками генома CELO 40065 н.п. и 43685 н.п. имеется делеция в 3620 н.п., при этом ее размер больше на 1467 н.п., чем у известных прототипов. Это позволяет увеличить размер и количество целевых генов, необходимых для введения в геном аденовируса птиц CELO. По месту делеции в плазмидной конструкции pCBEd13kb клонирована экспрессионная кассета, которая обозначена на Фиг.2 цифрой III. При этом кассета состоит из эукариотического промотора (III-1), например промотора цитомегаловируса человека CMV, полилинкера с сайтами для клонирования целевых генов для вакцинации животных (III-2) и сигнала полиаденилирования, например гена бычьего гормона роста BGH p(A) (III-3).Similar plot 43685-43804 n.a. the CELO genome is contained in the plasmid construct pCBEdl3kb, which is depicted in Figure 2. This vector also contains a portion of the genome of the bird adenovirus CELO from 36278 n.a. up to 40065 n.p., which is indicated by the number II. Plots I and II are the nucleotide sequences that make up the right end portion of the CELO genome. Between regions of the
Для получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO, содержащего в своем составе экспрессирующую кассету с целевыми генами для вакцинации животных, проводят в необходимой для размножения вируса культуре клеток петуха леггорн LMH рекомбинацию, как показано на Фиг.3, между гомологичными участками II из гидролизованного генома CELO по уникальному сайту Swa I и участку II из плазмидной конструкции pCBEdl3kb.To obtain a recombinant bird adenovirus CELO, which contains an expression cassette with the target genes for vaccinating animals, recombine, as shown in Figure 3, between homologous sites II of the hydrolyzed CELO genome according to a unique Swa site I and site II of the plasmid construct pCBEdl3kb.
В результате в клетках LMH создается полный геном аденовируса птиц CELO (Фиг.4), в котором вместо участка 40065-43685 н.п. содержится экспрессионная кассета (III) с целевым геном (генами) для вакцинации животных, например генами гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1, под контролем промотора и сигнала полиаденилирования.As a result, the complete genome of bird adenovirus CELO is created in LMH cells (Figure 4), in which, instead of plot 40065-43685 n.p. contains an expression cassette (III) with the target gene (s) for vaccinating animals, for example, the H5N1 avian influenza virus hemagglutinin and neuraminidase genes, under the control of a promoter and a polyadenylation signal.
Целевой ген (гены) экспрессируется под контролем эукариотического промотора в зараженных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO клетках и белковый продукт трансгена, например гена гемагглютинина вируса гриппа птиц, обнаруживают в достаточном количестве для проведения вакцинации, как показано на Фиг.5.The target gene (s) is expressed under the control of the eukaryotic promoter in the CELO cells infected with the recombinant adenovirus of avian birds and the protein product of the transgene, for example the avian influenza hemagglutinin gene, is detected in sufficient quantities for vaccination, as shown in FIG. 5.
Основной характеристикой, отличающей новый способ получения рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации животных от описанного прототипа, является получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO, способного к репликации и упаковке при увеличенном размере вставки чужеродной ДНК в его геном непосредственно в культуре клеток LMH, минуя стадию с использованием клеток Е. coli.The main characteristic that distinguishes a new method for producing recombinant avian adenovirus for vaccination of animals from the described prototype is the production of recombinant CELO avian adenovirus capable of replication and packaging with an increased size of the insertion of foreign DNA into its genome directly in the LMH cell culture, bypassing the stage using E cells .coli.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Создание плазмидной конструкции pCBEdl3kb с участками генома CELO и получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO с большим размером вставки чужеродной ДНК к п.1 формулы изобретения.Example 1. Creating a plasmid construct pCBEdl3kb with parts of the CELO genome and obtaining recombinant CELO avian adenovirus with a large insert size of foreign DNA to claim 1 of the claims.
Фрагмент генома аденовируса CELO, который изображен на Фиг.1, от 36278 н.п. до 40065 н.п. амплифицируют при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Клонирование полученного фрагмента проводят в плазмидном векторе pBluescript II KS(+) («Fermentas», Латвия) по сайтам для рестриктаз ClaI и KpnI (№ ER 0141, ER 0521 «Fermentas», Латвия) (Т.Маниатис и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984). Наличие вставки подтверждают с помощью рестрикционного анализа, используя рестриктазы Xhol и Xbal. Из полученного плазмидного вектора pBS-CELO-R указанный фрагмент аденовирусного генома субклонируют в плазмиде pCBEdlRV (Мол. Генетика, микробиология и вирусология, 2002, №2, стр.30-35), несущей фрагмент генома аденовируса CELO 43685-43804 н.п. по сайтам для рестриктаз KpnI и Есо32I. Рестрикционный анализ проводят по сайтам XhoI, XbaI и Есо32I. В полученный челночный плазмидный вектор pCBEdlRVnew, который содержит правый фрагмент генома вируса CELO с делецией размером 3620 н.п., по сайту Есо32I клонируют экспрессирующую кассету из плазмиды pcDNA 3.1.Zeo + (Invitrogen, США), гидролизованной по сайтам Bg1II и PvuII (№ ER 0081, ER 0631 «Fermentas», Латвия) и обработанной фрагментом Кленова (Klenow fragment №ЕР0051 «Fermentas», Латвия). Рестрикционный анализ полученной плазмидной конструкции проводят по сайтам Есо32I и XbaI. Новая плазмидная конструкция pCBEdl3kb изображена на Фиг.2, содержит экспрессирующую кассету с промотором области Е1 цитомегаловируса человека CMV, полилинкером для клонирования целевых генов для вакцинации животных и сигналом полиаденилирования гена бычьего гормона роста BGH p(A), а также участки генома вируса CELO 36278-40065 н.п. и 43685-43804 н.п. с увеличенным объемом вставки чужеродной ДНК до 3620 н.п..A fragment of the genome of the adenovirus CELO, which is depicted in Figure 1, from 36278 N. p. up to 40065 bp amplified using the method of polymerase chain reaction (PCR). Cloning of the obtained fragment is carried out in the plasmid vector pBluescript II KS (+) (Fermentas, Latvia) at ClaI and KpnI restriction enzyme sites (No. ER 0141, ER 0521 Fermentas, Latvia) (T. Maniatis et al. Methods of genetic engineering Molecular Cloning (Moscow: Mir, 1984). The presence of the insert is confirmed by restriction analysis using restriction enzymes Xhol and Xbal. From the obtained plasmid vector pBS-CELO-R, the indicated fragment of the adenovirus genome is subcloned into plasmid pCBEdlRV (Mol. Genetics, Microbiology and Virology, 2002, No. 2, pp. 30-35) carrying the fragment of the adenovirus CELO 43685-43804 n.p. on sites for restriction enzymes KpnI and Eco32I. Restriction analysis is carried out on the sites XhoI, XbaI and Eco32I. The resulting shuttle plasmid vector pCBEdlRVnew, which contains the right fragment of the CELO virus genome with a deletion of 3620 bp, clones an expression cassette from the pcDNA 3.1.Zeo + plasmid (Invitrogen, USA) hydrolyzed at the Bg1II and PvuII sites at the Eco32I site. ER 0081, ER 0631 “Fermentas”, Latvia) and processed Klenov fragment (Klenow fragment No. EP0051 “Fermentas”, Latvia). Restriction analysis of the obtained plasmid construct is carried out at the sites Eco32I and XbaI. The new plasmid construct pCBEdl3kb is depicted in FIG. 2, contains an expression cassette with the human cytomegalovirus CMV E1 region promoter, a polylinker for cloning target genes for vaccination of animals and a signal for polyadenylation of the bovine growth hormone gene BGH p (A), as well as parts of the CELO27 virus genome 36 40065 n.p. and 43685-43804 n.a. with an increased insertion volume of foreign DNA up to 3620 n.p.
Геном аденовируса птиц CELO, показанный на Фиг.1, гидролизуют по уникальному сайту рестрикции Swa I с целью удаления участка с 43567 н.п. по 43804 н.п., содержащего инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса CELO. Плазмидную конструкцию pCBEdl3kb совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной рестриктазой Swa I, котрансфецируют в клетки гепатомы петуха леггорна LMH методом кальциево-фосфатной преципитации (J. Gen. Virol., 1977). В результате гомологичной рекомбинации, которая показана на Фиг.3 между фрагментом гидролизованного вирусного генома CELO и фрагментом этого же генома 36278-40065 н.п., находящимся в плазмидной конструкции, в клетках LMH получают полный рекомбинантный вирус CELO (Фиг.4), рекомбинантность которого подтверждают с помощью метода ПЦР.The CELO bird adenovirus genome shown in FIG. 1 is hydrolyzed at the unique Swa I restriction site in order to remove a 43567 bp site. 43804 n.p. containing inverted repeats necessary for replication of the CELO virus. The plasmid construct pCBEdl3kb, together with CELO virus DNA digested with Swa I restriction enzyme, is cotransfected into hepatoma cells of leggorn LMH rooster by calcium phosphate precipitation (J. Gen. Virol., 1977). As a result of homologous recombination, which is shown in FIG. 3 between the fragment of the hydrolyzed viral CELO genome and the fragment of the same genome 36278-40065 bp located in the plasmid construct, complete recombinant CELO virus is obtained in LMH cells (Figure 4), recombinance which is confirmed by PCR.
Пример 2. Получение и клонирование кДНК-копии гена гемагглютинина вируса гриппа птиц в плазмидной конструкции pCBEd13kb к п.2 формулы изобретения.Example 2. Obtaining and cloning a cDNA copy of the hemagglutinin gene of avian influenza virus in the plasmid construct pCBEd13kb to claim 2.
Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц получают путем амплификации кДНК, синтезированной методом ОТ-ПЦР (Reverse Tpanscription System «Invitrogene» №12236014, USA) на матрице РНК, выделенной из вируса гриппа птиц штамма A/duck/Novosibirsk/56/2005(H5N1) с использованием TRIZOL («Invitrogene» №15596-018, USA). Для ПЦР используют олигонуклеотиды, фланкирующие полный ген гемагглютинина 5'-caatgatggagaaaatagtgcttct и 5'-gaccttaaatgcaaattctgcattgtaac, подобранные согласно последовательности гена гемагглютинина штамма (gene bank DQ234078.1). Реакцию амплификации проводят в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкг кДНК, 10 пкМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl (рН 8,8 при 25°С), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ, по 2,5 мМ) и 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы под вазелиновым маслом при следующих условиях: 94°С - 5 мин; 5 циклов: 58°С - 2 мин, 72°С - 20 с и 94°С - 30 с; 20 циклов: 58°С - 30 с, 72°С - 20 с и 94°С - 30 с; затем 58°С - 5 мин и 72°С - 10 мин. Продукт амплификации обрабатывают хлороформом, переосаждают этиловым спиртом и растворяют в бидистиллированной воде. Фрагмент ДНК, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, клонируют в плазмидном векторе pGEM-T Easy («Promega» № A 1360). Клонирование проводят согласно протоколу, приложенному к набору для клонирования ПЦР-продуктов pGEM-T Easy.The avian influenza virus hemagglutinin gene is obtained by amplification of cDNA synthesized by RT-PCR (Reverse Tpanscription System "Invitrogene" No. 12236014, USA) on an RNA template isolated from avian influenza virus strain A / duck / Novosibirsk / 56/2005 (H5N1) with using TRIZOL ("Invitrogene" No. 15596-018, USA). For PCR, oligonucleotides flanking the complete hemagglutinin gene 5'-caatgatggagaaaatagtgcttct and 5'-gaccttaaatgcaaattctgcattgtaac, selected according to the sequence of the hemagglutinin gene strain (gene bank DQ234078.1), are used for PCR. The amplification reaction is carried out in 25 μl of the reaction mixture containing 2 μg of cDNA, 10 pcM of each primer, 67 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 15 mM ammonium sulfate, 2.5 mM magnesium chloride, 0.01 % Tween-20, a mixture of deoxynucleotide triphosphates (dATP, dTTP, dTTP and dGTP, 2.5 mmol) and 1 unit. Taq DNA polymerase under liquid paraffin under the following conditions: 94 ° C for 5 minutes; 5 cycles: 58 ° С - 2 min, 72 ° С - 20 s and 94 ° С - 30 s; 20 cycles: 58 ° C - 30 s, 72 ° C - 20 s and 94 ° C - 30 s; then 58 ° C for 5 minutes and 72 ° C for 10 minutes. The amplification product is treated with chloroform, reprecipitated with ethanol and dissolved in bidistilled water. A DNA fragment carrying the avian influenza virus hemagglutinin gene is cloned into the pGEM-T Easy plasmid vector ("Promega" No. A 1360). Cloning is carried out according to the protocol attached to the pGEM-T Easy PCR product cloning kit.
Полученной лигированной смесью трансформируют клетки Е. coli DH5α C1Rb-методом. Трансформированные клетки отбирают на агаризованной среде LB с антибиотиком ампициллином (40 мкг/мл). Плазмидную ДНК выделяют методом щелочного лизиса, анализируют с помощью рестриктаз EcoRI, Eco32I, NcoI (№ ER 0271, ER 0301, ER 0571 «Fermentas», Латвия) и отбирают клоны, несущие плазмиду ожидаемого размера (4750 н.п.). Первичную структуру клонированного фрагмента в полученной плазмиде pGEM-HA подтверждают рестрикционным картированием по эндонуклеазам рестрикции Bg1I и Есо52I (№ER0071, ER0331 «Fermentas», Латвия) и секвенированием по методу Сэнгера.The obtained ligation mixture transforms E. coli cells with the DH5α C1Rb method. Transformed cells were selected on LB agar medium with the antibiotic ampicillin (40 μg / ml). Plasmid DNA was isolated by alkaline lysis, analyzed using restriction enzymes EcoRI, Eco32I, NcoI (No. ER 0271, ER 0301, ER 0571 Fermentas, Latvia) and clones carrying the plasmid of the expected size (4750 np) were selected. The primary structure of the cloned fragment in the obtained plasmid pGEM-HA was confirmed by restriction mapping for restriction endonucleases Bg1I and Eco52I (No. ER0071, ER0331 Fermentas, Latvia) and sequencing by the Sanger method.
Для получения плазмидной конструкции рСВЕd13kb/НА кДНК-копию гена гемагглютинина (НА) из плазмиды pGEM-HA, гидролизованной по сайту NotI (№ ЕР 0591 «Fermentas», Латвия) и обработанной фрагментом Кленова, клонируют в векторе pCBEd13kb по сайту для рестриктазы Eco32I под контроль CMV-промотора и сигнала полиаденилирования. Наличие гена гемагглютинина в полученной конструкции pCBEd13kb/HA подтверждают рестрикционным анализом при использовании эндонуклеазы KpnI и методом ПЦР.To obtain the plasmid construct pCBEd13kb / HA cDNA copy of the hemagglutinin gene (HA) from the pGEM-HA plasmid hydrolyzed at the NotI site (No. EP 0591 Fermentas, Latvia) and processed with the Klenov fragment, cloned in the pCBEd13kb vector for the Eco restriction enzyme32 site control of the CMV promoter and polyadenylation signal. The presence of the hemagglutinin gene in the resulting pCBEd13kb / HA construct was confirmed by restriction analysis using KpnI endonuclease and PCR.
Пример 3. Получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO-HA, содержащего ген гемагглютинина вируса гриппа птиц к п.2 формулы изобретения.Example 3. Obtaining recombinant avian adenovirus CELO-HA containing the hemagglutinin gene of avian influenza virus to claim 2 of the claims.
Геном аденовируса птиц CELO, показанный на Фиг.1, гидролизуют по уникальному сайту рестрикции Swa I с целью удаления участка с 43567 н.п. по 43804 н.п., содержащего инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса CELO. Плазмидную конструкцию с геном гемагглютинина вируса гриппа птиц pCBEd13kb/HA совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной рестриктазой Swa I, котрансфецируют в клетки гепатомы петуха леггорна LMH методом кальциево-фосфатной преципитации (J. Gen. Virol., 1977). В результате гомологичной рекомбинации, которая показана на Фиг.3 между фрагментом гидролизованного вирусного генома CELO и фрагментом этого же генома 36278-40065 н.п., находящимся в плазмидной конструкции, в клетках LMH получают полный рекомбинантный вирус CELO-HA, несущий экспрессирующую кассету челночного вектора с геном гемагглютинина вируса гриппа птиц под контролем промотора CMV и сигнала полиаденилирования BGH. Данный рекомбинантный вирус показан на Фиг.4. Анализ индивидуальных вирусных бляшек на наличие вставки гена гемагглютинина проводят методом ПЦР.The CELO bird adenovirus genome shown in FIG. 1 is hydrolyzed at the unique Swa I restriction site in order to remove a 43567 bp site. 43804 n.p. containing inverted repeats necessary for replication of the CELO virus. A plasmid construct with the avian influenza virus hemagglutinin gene pCBEd13kb / HA together with CELO virus DNA digested with Swa I restriction enzyme is co-transfected into leggorn LMH rooster hepatoma cells by calcium phosphate precipitation (J. Gen. Virol., 1977). As a result of homologous recombination, which is shown in FIG. 3 between the fragment of the hydrolyzed viral CELO genome and the fragment of the same genome 36278-40065 bp located in the plasmid construct, the complete recombinant CELO-HA virus carrying the shuttle expression cassette is obtained in LMH cells vectors with avian influenza virus hemagglutinin gene under the control of the CMV promoter and BGH polyadenylation signal. This recombinant virus is shown in Figure 4. The analysis of individual viral plaques for the presence of the hemagglutinin gene insert is carried out by PCR.
Пример 4. Определение уровня экспрессии гемагглютинина в клетках, трансфицированных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO-HA к п.2 формулы изобретения.Example 4. Determination of the level of expression of hemagglutinin in cells transfected with recombinant bird adenovirus CELO-HA to claim 2.
Для определения функциональной активности экспрессирующей ген гемагглютинина кассеты в составе рекомбинантного генома аденовируса CELO-HA используют метод Вестерн-блоттинга. Клетки линии LMH инфицируют рекомбинантным вирусом CELO-HA, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц в дозе 5 БОЕ/кл. Через 2 суток клетки отмывают и приготавливают образцы лизатов, которые фракционируют электрофорезом в ПААГ-ДСН. По окончании электрофоретического разделения перенос белков на PVDF-мембрану проводят в полусухой буферной системе. Далее мембрану отмывают и блокируют 1% Twin 20, ночь при 4°С. Затем мембрану инкубируют в течение 2 часов при 37°С при покачивании в рабочем растворе моноклональных антител, конъюгированных с пероксидазой. Специфический комплекс антиген-антитело после отмывки детектируют окраской ECL (Amersham, США). На Фиг.5 показано, что в опытном образце LMH-HA по сравнению с отрицательным контрольным образцом LMH имеется продукт гена гемагглютинина. По результатам денситометрического анализа определяют уровень экспрессии гена гемагглютинина в клетках линии LMH, инфицированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц. Уровень экспрессии составляет около 6 нг гемагглютинина на 20 мкг общего цитоплазматического белка.To determine the functional activity of the cassette expressing the hemagglutinin gene as part of the recombinant CELO-HA adenovirus genome, Western blotting is used. Cells of the LMH line are infected with the recombinant CELO-HA virus containing the avian influenza hemagglutinin gene at a dose of 5 PFU / cell. After 2 days, the cells are washed and samples of lysates are prepared, which are fractionated by electrophoresis in SDS page-SDS. At the end of electrophoretic separation, the transfer of proteins to the PVDF membrane is carried out in a semi-dry buffer system. Next, the membrane is washed and blocked with 1% Twin 20, overnight at 4 ° C. Then the membrane is incubated for 2 hours at 37 ° C while swaying in a working solution of monoclonal antibodies conjugated with peroxidase. A specific antigen-antibody complex after washing is detected by ECL staining (Amersham, USA). Figure 5 shows that in the prototype LMH-HA compared to the negative control sample LMH there is a product of the hemagglutinin gene. Based on the results of densitometric analysis, the expression level of the hemagglutinin gene in LMH cells infected with the recombinant CELO-HA adenovirus containing the avian influenza hemagglutinin gene is determined. The expression level is about 6 ng of hemagglutinin per 20 μg of total cytoplasmic protein.
Пример 5. Применение рекомбинантного аденовируса птиц, полученного по заявленному способу для вакцинации птиц, инфицированных CELO-HA к п.2 формулы изобретения.Example 5. The use of recombinant avian adenovirus obtained by the claimed method for vaccination of birds infected with CELO-HA to claim 2 of the claims.
Определение проводят на 45-ти однодневных цыплятах, разделенных на три группы по 15 голов в каждой: в 1 группе проводят интраназальную инфекцию вирусом CELO-HA в дозе 108 БОЕ/птица; во 2 группе - интраназальную инфекцию вирусом CELO дикого типа в дозе 108 БОЕ/птица; в 3 группе - интраназальное введение 1×PBS.The determination is carried out on 45 one-day-old chickens, divided into three groups of 15 animals each: in the 1st group, an intranasal infection with the CELO-HA virus is carried out at a dose of 10 8 PFU / bird; in group 2 - intranasal infection with wild-type CELO virus at a dose of 10 8 PFU / bird; in group 3 - intranasal administration of 1 × PBS.
На 21 день после инфекции у всех цыплят берут кровь на анализ. Определение титра антител к вирусу гриппа птиц проводят согласно «Методическим рекомендации по определению титра антител к вирусу гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации», ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья», ФГУ «ВНИИЗЖ», Владимир - 2005. Титр гемагглютинирующих антител у инфицированных вирусом CELO-НА цыплят составил 1:8-1:16 (1 группа). В контрольных группах (№№2, 3) титр гемагглютинирующих антител составил 1:4-1:8. Это свидетельствует о том, что введение вируса CELO-HA, содержащего ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, однодневным цыплятам вызывает образование высокого уровня антител к вирусу гриппа птиц H5N1, т.е. с помощью рекомбинантного аденовируса птиц CELO-HA осуществляется вакцинация.On day 21 after infection, all chickens are bled for analysis. Determination of the titer of antibodies to avian influenza virus is carried out according to the “Methodological recommendations for determining the titer of antibodies to avian influenza virus in the reaction of inhibition of hemagglutination”, FGU “Federal Health Center”, FGU “ARRIAH”, Vladimir - 2005. The titer of hemagglutinating antibodies in infected with the CELO virus - ON chickens amounted to 1: 8-1: 16 (1 group). In the control groups (No. 2, 3), the titer of hemagglutinating antibodies was 1: 4-1: 8. This suggests that the introduction of the CELO-HA virus containing the avian influenza virus hemagglutinin gene to day-old chickens causes the formation of a high level of antibodies to the H5N1 avian influenza virus, i.e. Using recombinant bird adenovirus CELO-HA vaccination is carried out.
Пример 6. Получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO-NA, содержащего ген нейраминидазы вируса гриппа птиц к п.3 формулы изобретения.Example 6. Obtaining recombinant avian adenovirus CELO-NA containing the gene for avian influenza virus neuraminidase to claim 3 of the claims.
Ген нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1 получают путем амплификации кДНК, синтезированной методом ОТ-ПЦР (Reverse Tpanscription System «Invitrogene» №12236-014, USA) на матрице РНК, выделенной из вируса гриппа птиц штамма A/duck/Novosibirsk/56/2005(H5N1) с использованием TRIZOL («Invitrogene» №15596-018, USA). Для ПЦР используют олигонуклеотиды, фланкирующие полный ген нейраминидазы, подобранные согласно последовательности гена нейраминидазы данного штамма (gene bank DQ234078.1). Фрагмент ДНК, несущий ген нейраминидазы вируса гриппа птиц, клонируют в плазмидный вектор pGEM-T Easy («Promega» № А 1360). Клонирование проводят согласно протоколу, приложенному к набору для клонирования ПЦР-продуктов pGEM-T Easy. Таким образом получают плазмиду pGEM-NA.The H5N1 avian influenza virus neuraminidase gene is obtained by amplification of cDNA synthesized by RT-PCR (Reverse Tpanscription System "Invitrogene" No. 12236-014, USA) on an RNA template isolated from avian influenza virus strain A / duck / Novosibirsk / 56/2005 ( H5N1) using TRIZOL (Invitrogene No. 15596-018, USA). For PCR, oligonucleotides flanking the complete neuraminidase gene selected according to the sequence of the neuraminidase gene of this strain (gene bank DQ234078.1) are used. A DNA fragment carrying the avian influenza virus neuraminidase gene is cloned into the pGEM-T Easy plasmid vector ("Promega" No. A 1360). Cloning is carried out according to the protocol attached to the pGEM-T Easy PCR product cloning kit. Thus, the plasmid pGEM-NA is obtained.
Для получения плазмидной конструкции pCBEd13kbNA ДНК-копия гена нейраминидазы (NA) из плазмиды pGEM-NA, гидролизованной по сайту NotI (№ЕК0591 «Fermentas», Латвия) и обработанной фрагментом Кленова, клонируют в векторе pCBEd13kb по сайту для рестриктазы Есо32I под контроль CMV-промотора и сигнала полиаденилирования. Наличие гена нейраминидазы в полученной конструкции pCBEd13kbNA подтверждают рестрикционным анализом и методом ПЦР.To obtain the plasmid construct pCBEd13kbNA, a DNA copy of the neuraminidase gene (NA) from the plasmid pGEM-NA, hydrolyzed at the NotI site (No. ЕК0591 Fermentas, Latvia) and processed with the Klenov fragment, was cloned in the pCBEd13kb vector for the ЕV32I restriction enzyme control site ECO32I promoter and polyadenylation signal. The presence of the neuraminidase gene in the resulting pCBEd13kbNA construct was confirmed by restriction analysis and PCR.
Геном аденовируса птиц CELO (Фиг.1) гидролизуют по уникальному сайту рестрикции Swa I с целью удаления участка с 43567 н.п. по 43804 н.п., содержащего инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса CELO. Плазмидную конструкцию с геном нейраминидазы вируса гриппа птиц pCBEd13kbNA совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной рестриктазой Swa I, котрансфецируют в клетки гепатомы петуха леггорна LMH методом кальциево-фосфатной преципитации (J. Gen. Virol., 1977). В результате гомологичной рекомбинации, которая показана на Фиг.3 между фрагментом гидролизованного вирусного генома CELO и фрагментом этого же генома 36278-40065 н.п., находящимся в плазмидной конструкции, в клетках LMH получают полный рекомбинантный вирус CELO-NA, несущий экспрессирующую кассету с геном нейраминидазы вируса гриппа птиц под контролем промотора CMV и сигнала полиаденилирования BGH. Анализ индивидуальных вирусных бляшек на наличие вставки гена нейраминидазы проводят методом ПЦР.The genome of bird adenovirus CELO (Figure 1) is hydrolyzed at the unique Swa I restriction site in order to remove the site from 43567 bp 43804 n.p. containing inverted repeats necessary for replication of the CELO virus. The plasmid construct with the avian influenza virus neuraminidase gene pCBEd13kbNA together with CELO virus DNA digested with Swa I restriction enzyme is cotransfected into hepatoma cells of the leghorn rooster LMH by calcium phosphate precipitation (J. Gen. Virol., 1977). As a result of homologous recombination, which is shown in FIG. 3 between the fragment of the hydrolyzed viral CELO genome and the fragment of the same genome 36278-40065 bp located in the plasmid construct, in the LMH cells, a complete recombinant CELO-NA virus carrying the expression cassette with the avian influenza virus neuraminidase genome under the control of the CMV promoter and BGH polyadenylation signal. The analysis of individual viral plaques for the presence of a neuraminidase gene insert is carried out by PCR.
Пример 7. Получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO-HA/NA с экспрессирующей кассетой, содержащей гены гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа птиц к п.4 формулы изобретения.Example 7. Obtaining recombinant bird adenovirus CELO-HA / NA with an expression cassette containing the hemagglutinin and neuraminidase genes of avian influenza virus to claim 4.
Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц получают из плазмиды pGEM-HA (полученной согласно примеру 2), обработанной рестриктазой EcoRI. Ген НА клонируют в плазмидном векторе pIRES («Clontech», США), который для этого обрабатывают той же рестриктазой. Таким образом получают плазмиду pIRES-HA, несущую в своем составе ген гемагглютинина вируса гриппа птиц.The avian influenza virus hemagglutinin gene is obtained from plasmid pGEM-HA (prepared according to Example 2) treated with EcoRI restrictase. The HA gene is cloned in the pIRES plasmid vector (Clontech, USA), which is treated with the same restriction enzyme. In this way, the pIRES-HA plasmid is obtained that carries the avian influenza virus hemagglutinin gene.
Ген нейраминидазы вируса гриппа птиц получают из плазмиды pGEM-NA (полученной согласно примеру 6), обработанной рестриктазой NotI. Данный ген клонируют в плазмидном векторе pIRES-HA, обработанном рестриктазой NotI. Таким образом получают плазмиду pIRES-HA/NA, несущую в своем составе ген гемагглютинина и ген нейраминидазы вируса гриппа птиц одновременно. Затем плазмидную конструкцию pIRES- HA/NA обрабатывают рестриктазой XbaI и фрагментом Кленова. Фрагмент, состоящий из IRES, гена гемагглютинина вируса гриппа птиц и гена нейраминидазы вируса гриппа клонируют в векторе pCBEd13kb по сайту для рестриктазы Есо32I под контроль CMV-промотора и сигнала полиаденилирования. Наличие целевых генов нейраминидазы и гемагглютинина в полученной конструкции pCBEd13kbHA/NA подтверждают рестрикционным анализом и методом ПЦР.The avian influenza virus neuraminidase gene is obtained from plasmid pGEM-NA (prepared according to Example 6) treated with NotI restriction enzyme. This gene is cloned into the pIRES-HA plasmid vector treated with NotI restriction enzyme. Thus, the pIRES-HA / NA plasmid is obtained, which contains the hemagglutinin gene and the avian influenza virus neuraminidase gene simultaneously. The plasmid construct pIRES-HA / NA is then treated with restriction enzyme XbaI and a Klenov fragment. A fragment consisting of IRES, the avian influenza hemagglutinin gene and the influenza virus neuraminidase gene are cloned in the pCBEd13kb vector at the Eco32I restriction enzyme site under the control of the CMV promoter and polyadenylation signal. The presence of target neuraminidase and hemagglutinin genes in the resulting pCBEd13kbHA / NA construct was confirmed by restriction analysis and PCR.
Геном аденовируса птиц CELO (Фиг.1) гидролизуют по уникальному сайту рестрикции Swa I с целью удаления участка с 43567 н.п. по 43804 н.п., содержащего инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса CELO. Плазмидную конструкцию с генами гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа птиц pCBEd13kbHA/NA совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной рестриктазой Swa I, котрансфецируют в клетки гепатомы петуха леггорна LMH методом кальциево-фосфатной преципитации (J. Gen. ViroL, 1977). В результате гомологичной рекомбинации, которая показана на Фиг.3 между фрагментом гидролизованного вирусного генома CELO и фрагментом этого же генома 36278-40065 н.п., находящимся в плазмидной конструкции, в клетках LMH получают полный рекомбинантный вирус CELO-HA/NA, несущий экспрессирующую кассету с генами гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа птиц и разделительной последовательностью IRES, обеспечивающей экспрессию двух генов, под контролем промотора CMV и сигнала полиаденилирования BGH. Анализ индивидуальных вирусных бляшек на наличие целевых генов проводят методом ПЦР.The genome of bird adenovirus CELO (Figure 1) is hydrolyzed at the unique Swa I restriction site in order to remove the site from 43567 bp 43804 n.p. containing inverted repeats necessary for replication of the CELO virus. The plasmid construct with the hemagglutinin and neuraminidase genes of the avian influenza virus pCBEd13kbHA / NA together with the CELO virus DNA, hydrolyzed by Swa I restriction enzyme, is co-transfected into hepatoma cells of the leghorn rooster LMH by calcium phosphate precipitation (J. Gen. Viro 1977). As a result of homologous recombination, which is shown in FIG. 3 between the fragment of the hydrolyzed viral CELO genome and the fragment of the same genome 36278-40065 bp located in the plasmid construct, in the LMH cells, a complete recombinant CELO-HA / NA virus carrying expressing cassette with hemagglutinin and neuraminidase genes of avian influenza virus and IRES dividing sequence, which provides expression of two genes, under the control of the CMV promoter and BGH polyadenylation signal. The analysis of individual viral plaques for the presence of target genes is carried out by PCR.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006147166/13A RU2326943C1 (en) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | Method of preparation of recombinant adenovirus of birds for vaccination against birds flu virus h5n1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006147166/13A RU2326943C1 (en) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | Method of preparation of recombinant adenovirus of birds for vaccination against birds flu virus h5n1 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2326943C1 true RU2326943C1 (en) | 2008-06-20 |
Family
ID=39637393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006147166/13A RU2326943C1 (en) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | Method of preparation of recombinant adenovirus of birds for vaccination against birds flu virus h5n1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2326943C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2432963C1 (en) * | 2010-05-11 | 2011-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method of obtaining peroral vaccine against rabies virus |
| RU2507258C1 (en) * | 2012-08-21 | 2014-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | Recombinant pseudo adenoviral particle based on human being adenovirus genome of 5-th serotype for induction of specific immunity to influenza virus a of h3n2 subtype and method of its use |
| RU2507257C1 (en) * | 2012-08-07 | 2014-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | Recombinant pseudo adenoviral particle based on human being adenovirus genome of 5-th serotype for induction of specific immunity to influenza virus a of h1n1 subtype and method of its use as component for vaccine production |
| RU2523599C1 (en) * | 2012-12-29 | 2014-07-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | RECOMBINANT PSEUDO-ADENOVIRUS PARTICLE BASED ON GENOME OF HUMAN ADENOVIRUS OF SEROTYPE 5, PRODUCING INFLUENZA HEMAGGLUTININ OF STRAIN A/Brisbane/59/2007(H1N1) AND METHOD OF ITS USE |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2031122C1 (en) * | 1992-09-07 | 1995-03-20 | Владимир Иванович Грабко | Method of insertion of heteroduplex dna into genome of adenovirus celo and recombinant adenoviral vector celo/puc19 |
| SU1490962A1 (en) * | 1987-06-17 | 1995-04-10 | Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср | Method of dna insertion into adenovirus genome and recombinant vector celo/puc 19 |
| US6335016B1 (en) * | 1996-04-20 | 2002-01-01 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Chicken embryo lethal orphan (CELO) virus |
| US6797506B1 (en) * | 1999-10-13 | 2004-09-28 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Recombinant, replication defective CELO virus and CELO virus DNA |
-
2006
- 2006-12-29 RU RU2006147166/13A patent/RU2326943C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1490962A1 (en) * | 1987-06-17 | 1995-04-10 | Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср | Method of dna insertion into adenovirus genome and recombinant vector celo/puc 19 |
| RU2031122C1 (en) * | 1992-09-07 | 1995-03-20 | Владимир Иванович Грабко | Method of insertion of heteroduplex dna into genome of adenovirus celo and recombinant adenoviral vector celo/puc19 |
| US6335016B1 (en) * | 1996-04-20 | 2002-01-01 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Chicken embryo lethal orphan (CELO) virus |
| US6797506B1 (en) * | 1999-10-13 | 2004-09-28 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Recombinant, replication defective CELO virus and CELO virus DNA |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2432963C1 (en) * | 2010-05-11 | 2011-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method of obtaining peroral vaccine against rabies virus |
| RU2507257C1 (en) * | 2012-08-07 | 2014-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | Recombinant pseudo adenoviral particle based on human being adenovirus genome of 5-th serotype for induction of specific immunity to influenza virus a of h1n1 subtype and method of its use as component for vaccine production |
| RU2507258C1 (en) * | 2012-08-21 | 2014-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | Recombinant pseudo adenoviral particle based on human being adenovirus genome of 5-th serotype for induction of specific immunity to influenza virus a of h3n2 subtype and method of its use |
| RU2523599C1 (en) * | 2012-12-29 | 2014-07-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | RECOMBINANT PSEUDO-ADENOVIRUS PARTICLE BASED ON GENOME OF HUMAN ADENOVIRUS OF SEROTYPE 5, PRODUCING INFLUENZA HEMAGGLUTININ OF STRAIN A/Brisbane/59/2007(H1N1) AND METHOD OF ITS USE |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schultz-Cherry et al. | Influenza virus (A/HK/156/97) hemagglutinin expressed by an alphavirus replicon system protects chickens against lethal infection with Hong Kong-origin H5N1 viruses | |
| JP5508252B2 (en) | Recombinant turkey herpesvirus containing avian influenza gene | |
| AU737243B2 (en) | Recombinant canine adenovirus (CAV) containing exogenous DNA | |
| JP6505593B2 (en) | Multivalent recombinant avian herpesvirus and vaccine for immunizing birds | |
| RU2733834C1 (en) | Artificial ectos_sc2 gene encoding an ectodomain of the sars-cov-2 coronavirus s glycoprotein with a c-terminal trimerization domain, a recombinant plasmid pstem-rvsv-ectos_sc2, which provides expression of the artificial gene, and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus rvsv-ectos_sc2, used to create a vaccine against sars-cov-2 coronavirus | |
| US5916879A (en) | DNA transcription unit vaccines that protect against avian influenza viruses and methods of use thereof | |
| US20100008952A1 (en) | Vaccines for the Rapid Response to Pandemic Avian Influenza | |
| NO341506B1 (en) | High titers of recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy | |
| JP2001511142A (en) | Recombinant live avian vaccine using avian infectious laryngotracheitis virus as a vector | |
| CN101248186A (en) | Rapid Production of Adenovirus-Free Recombinant Adenoviral Vectors | |
| Fingerut et al. | A subunit vaccine against the adenovirus egg-drop syndrome using part of its fiber protein | |
| JP4265405B2 (en) | Recombinant turkey herpesvirus and use thereof | |
| CN104962581A (en) | Recombined new castle disease virus vaccine strain for expressing African swine fever virus p72 proteins | |
| CN110066769B (en) | Avian cells for improved virus production | |
| MXPA01010273A (en) | Novel recombinant and mutant herpesviruses. | |
| RU2326943C1 (en) | Method of preparation of recombinant adenovirus of birds for vaccination against birds flu virus h5n1 | |
| CN114269939B (en) | Hantavirus antigen composition | |
| Ljungberg et al. | Effective construction of DNA vaccines against variable influenza genes by homologous recombination | |
| WO1996038565A1 (en) | RECOMBINANT HERPESVIRUS WITH THE USE OF gB GENE PROMOTER | |
| WO2007115385A2 (en) | Transfer plasmidic vector and recombinant canarypox virus | |
| CN112111467B (en) | Gene VII-type newcastle disease marker vaccine strain and preparation method and application thereof | |
| JP2002513581A (en) | Recombinant virus expressing foreign DNA encoding feline CD80, feline CTLA-4 or feline CD86 and uses thereof | |
| WO2001019968A1 (en) | Recombinant eggs and gene cloning and expression vectors based on avian adenoviruses | |
| AU775125B2 (en) | Truncated transcriptionally active cytomegalovirus promoters | |
| CN105754961A (en) | Recombinant replication-deficient adenovirus expressing avian-like H1N1 swine influenza virus HA protein and constructing method and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081230 |
|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20100326 |
|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20100622 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: PLEDGE Effective date: 20110224 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: PLEDGE FORMERLY AGREED ON 20110224 Effective date: 20110427 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: PLEDGE FORMERLY AGREED ON 20110224 Effective date: 20130911 |