RU2325439C2 - Мутанты синтетазы ацетооксикислот, устойчивые к обратной связи - Google Patents
Мутанты синтетазы ацетооксикислот, устойчивые к обратной связи Download PDFInfo
- Publication number
- RU2325439C2 RU2325439C2 RU2006102024/13A RU2006102024A RU2325439C2 RU 2325439 C2 RU2325439 C2 RU 2325439C2 RU 2006102024/13 A RU2006102024/13 A RU 2006102024/13A RU 2006102024 A RU2006102024 A RU 2006102024A RU 2325439 C2 RU2325439 C2 RU 2325439C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- nucleotide sequence
- amino acids
- ahas
- specified
- Prior art date
Links
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 54
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims abstract description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 6
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- -1 acetooxy Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 18
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 14
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 14
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 12
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 241000187434 Streptomyces cinnamonensis Species 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl propionaldehyde Natural products CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 3
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VUQLHQFKACOHNZ-UHFFFAOYSA-N 2-Aceto-2-hydroxybutanoate Chemical compound CCC(O)(C(C)=O)C(O)=O VUQLHQFKACOHNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 2-oxobutanoate Chemical compound CCC(=O)C([O-])=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- SVFOIXMRMLROHO-SRVKXCTJSA-N Asp-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SVFOIXMRMLROHO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Chemical group 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N Gly-Ile-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 1
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003680 valines Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, обладающий активностью синтетазы ацетооксикислот (AHAS) и кодируемый полипептид. Последовательности приведены в описании. Раскрыто применение полипептида для ферментативного получения энантиомерно обогащенных аминокислот с разветвленной цепью. Описаны вектор, обеспечивающий экспрессию синтетазы аминокислот (AHAS) в клетках Corynebacterium и микроорганизм Corynebacterium, несущий указанный вектор. Раскрыт праймер для получения с помощью ПЦР метода кодирующей нуклеотидной последовательности. Описан гибридизационный зонд для обнаружения указанных нуклеотидных последовательностей. Раскрыт способ создания рекомбинантных полипептидов, где указанную нуклеотидную последовательность подвергают мутагенезу. Затем клонируют в пригодном векторе и переносят в пригодную экспрессионную систему. Обнаруживают и выделяют образовавшиеся полипептиды. Описан рекомбинантный полипептид, полученный указанным способом, и его применение для ферментативного получения энантиомерно обогащенных аминокислот с разветвленной цепью. Данное изобретение позволяет увеличить производство аминокислот с разветвленной цепью путем ферментации. 11 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к специфическим нуклеиновым кислотам и полипептидам, кодируемым этими нуклеиновыми кислотами, а также к их применению. Полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, служат для увеличения производства аминокислот с разветвленной цепью путем ферментации.
В частности, в настоящем изобретении предложены нуклеотидные последовательности, кодирующие мутанты синтетазы ацетооксикислот (AHAS), сами мутантные ферменты и способ ферментативного производства аминокислот с разветвленной цепью с использованием этих ферментов в специфических хозяевах, в которых происходит экспрессия генов, кодирующих модифицированную синтетазу ацетооксикислот (AHAS).
Известно, что аминокислоты можно получать ферментативным путем с использованием штаммов коринебактерий, прежде всего с использованием Corynebacterium glutamicum. Поскольку эти продукты имеют большое значение, постоянно ведутся работы по совершенствованию метода их производства. Усовершенствования метода могут касаться технических сторон процесса ферментации, таких, например, как перемешивание и обеспечение кислородом, или состава питательных сред, например концентрации сахара в процессе ферментации, или обработки продукта, например, с помощью ионообменной хроматографии, или присущей микроорганизму продуктивности.
Для улучшения продуктивности этих микроорганизмов применяют методы мутагенеза, селекции и отбора мутантов. Таким путем получают штаммы, которые обладают устойчивостью к антиметаболитам, таким, например, как аналог изолейцина гидроксамат изолейцина (Kisumi M, Komatsubara S, Sugiura М, Chibata I, Journal of Bacteriology, 110, 1972, сс.761-763), аналог валина 2-тиазолаланин (Tsuchida Т, Yoshinanga F, Kubota К, Momose H., Agricultural and Biological Chemistry, Japan, 39, 1975, сс.1319-1322) или аналоги лейцина α-аминобутираты (Ambe-Ono Y, Sato К, Totsuka К, Yoshihara Y, Nakamori S., Bioscience Biotechnology Biochemistry, 60, 1996, сс.1386-1387), или которые являются ауксотрофами в отношении обладающих важной регуляторной функцией метаболитов и продуцируют, например, аминокислоты с разветвленной цепью (Tsuchida Т, Yoshinaga F, Kubota K, Momose H, Okumura S., Agricultural and Biological Chemistry, 1975; Nakayama K, Kitada S, Kinoshita S., Journal of General and Applied Microbiology, Japan, 7, 1961, сс.52-69; Nakayama К, Kitada S, Sato Z, Kinoshita., Journal of General and Applied Microbiology, Japan, 7, 191?, cc.41-51).
В течение ряда лет для улучшения продуцирующих аминокислоты с разветвленной цепью штаммов Corynebacterium glutamicum применяют также методы рекомбинантной ДНК, с помощью которых амплифицируют отдельные гены биосинтеза аминокислот с разветвленной цепью и исследуют влияние на их производство. Обзор работ в этой области можно найти среди прочего у Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria" в: Biology of Industrial Microorganisms, под ред. Domain и Solomon, изд-во Benjamin Cummings, London, UK, 1985, cc.115-142), Hilliger (BioTec, 2, 1991, cc.40-44), Eggeling (Amino Acids, 6, 1994, cc.261-272), Jetten и Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology, 15, 1995, cc.73-103), Sahm и др. (Annuals of the New York Academy of Science, 782, 1996, сс.25-39) и Eggeling и др., Journal of Biotechnology, 56, 1997, сс.168-180).
Аминокислоты с разветвленной цепью L-изолейцин, L-валин и L-лейцин находят среди прочего применение в фармацевтической промышленности, медицине и в кормах для животных. Одним из ферментов, имеющих решающее значение для синтеза всех трех аминокислот в бактериях, является синтетаза ацетооксикислот (AHAS). Она катализирует две реакции, приводящие к образованию предшественников трех аминокислот.
В пути биосинтеза валина и лейцина субстратом для AHAS является пируват. AHAS катализирует декарбоксилирование пирувата и его конденсацию с второй молекулой пирувата с образованием ацетолактата. В пути биосинтеза изолейцина AHAS катализирует взаимодействие пирувата с 2-кетобутиратом с образованием ацетогидроксибутирата. В штаммах Escherichia coli присутствуют все три изофермента AHAS. Активность изоферментов ингибируется комбинациями аминокислот, при этом наиболее сильным ингибитором является валин (De Felice M., Levinthal M., laccarino M., Guardiola J., Growth inhibition as a consequence of antagonism between related amino acids: effect of valine in Escherichia coli K12, Microbiol Rev., 43, 1979, сс.4258). AHAS I, кодируемая генами ilvBN, ингибируется валином и изолейцином, AHAS II, кодируемая ilvGM, устойчива к валину, а AHAS III, кодируемая ilvIH, ингибируется валином и изолейцином. Во всех трех случаях фермент состоит из 2 субъединиц. В AHAS I и AHAS III ингибирование обусловлено присутствием малых регуляторных субъединиц, кодируемых генами ilvN и ilvH соответственно.
В отличие от Е. coli в С. glutamicum ген ilvBN кодирует только AHAS (Keilhauer С., Eggeling L., Sahm Н., Изолейцин synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon, J. Bacteriol., 175, 1993, cc.5595-5603). Активность фермента С. glutamicum ингибируется валином, лейцином и изолейцином (Eggeling I., Cordes С., Eggeling L., Sahm Н., Regulation of acetohydroxy acid synthetase in Corynebacterium glutamicum during fermentation of alfa-ketobutyrate to L-isoleucine, Appi Microbiol Biotechnol, 25, 1987, cc.346-351). Экспрессия кластера генов ilvBNC также регулируется этими тремя аминокислотами в результате ослабления транскрипции (Morbach S., Junger С., Sahm Н., Eggeling L., Attenuation control of ilvBNC in Corynebacterium glutamicum: evidence of leader peptide formation without the presence of a ribosome binding site, J Biosci Bioeng, 90, 2000, cc.501-507).
До настоящего времени не были описаны мутации на молекулярном уровне, нарушающие регуляцию активности AHAS в Corynebacterium glutamicum.
Целью настоящего изобретения было создание модифицированной синтетазы ацетооксикислот (AHAS). В частности, AHAS, предлагаемая в настоящем изобретении, должна быть менее чувствительной к ингибирующему действию, обусловленному аминокислотами.
Эта цель достигается в соответствии с формулой изобретения. П.1 относится к определенным нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептид, который обладает рассматриваемыми отличительными признаками. Под объем п.2 подпадают сами полипептиды. П.3 и п.4 касаются хозяев, содержащих нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, или специальные праймеры или зонды для их получения с помощью ПЦР. Кроме того, в п.5 определен способ получения дополнительно улучшенных полипептидов, предлагаемых в изобретении, в то время как п.6 защищает полученные таким способом полипептиды и нуклеиновые кислоты соответственно. П.7 и п.8 относятся к конкретным применениям, а под объем п.9 подпадает способ получения аминокислот. Аналогично этому в п.10 и п.11 указаны конкретные векторы и микроорганизмы.
При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что в результате получения выделенных нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который обладает активностью синтетазы ацетооксикислот (AHAS), выбранных из ряда, включающего:
а) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:3;
б) нуклеотидную последовательность, которая содержит в положениях 21 и 22 триплет оснований, кодирующий Asp и Phe соответственно;
в) нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся в строгих условиях с нуклеотидными последовательностями, указанными в а) или б);
г) нуклеотидную последовательность, гомологичную по меньшей мере на 70% нуклеотидной последовательности, указанной в а) или б);
д) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, гомологичный на аминокислотном уровне по меньшей мере на 80% полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью, указанной в а) или б);
е) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который обладает улучшенной активностью, и/или селективностью, и/или стабильностью по сравнению с полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, указанной в а) или б), которую получают путем
I) мутагенеза нуклеиновой кислоты, указанной в а) или б),
II) встраивания путем лигирования нуклеотидной последовательности, которую можно получать, как указано в I), в пригодный вектор с последующей трансформацией пригодной экспрессионной системы, и
III) экспрессии и обнаружения имеющего решающее значение полипептида, который обладает улучшенной активностью, и/или селективностью, и/или стабильностью;
ж) нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 15 последовательных пар оснований нуклеотидных последовательностей, указанных в а)-е),
препятствия, отмеченные выше и характерные для прототипов, были успешно преодолены. Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, кодируют полипептиды, обладают пониженной чувствительностью к ингибирующему действию аминокислот по типу обратной связи по сравнению с ферментом дикого типа.
Методы улучшения с помощью мутагенеза нуклеиновых кислот, предлагаемых в изобретении, или кодируемых ими полипептидов достаточно хорошо известны специалисту в данной области. В качестве пригодных методов мутагенеза можно применять любые пригодные для этой цели методы, известные специалисту в данной области. К ним относятся, в частности, насыщающий мутагенез, неспецифический мутагенез, методы рекомбинации in vitro и сайтнаправленный мутагенез (Eigen М. и Gardiner W., Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem., 56, 1984, cc.967-978; Chen К. и Arnold F., Enzyme engineering for non-aqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media,
Bio/Technology, 9, 1991, cc. 1073-1077; Horwitz M. и Loeb L., Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Nati Acad Sci USA, 83, 1986, cc.7405-7409; Dube D. и L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry, 28, 1989, cc.5703-5707; Stemmer P.C., Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature, 370, 1994, cc.389-391 и Stemmer P.C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Nati Acad Sci USA, 91, 1994, cc.10747-10751).
Полученные новые нуклеотидные последовательности клонируют в организме-хозяине с помощью общепринятых методов, указанных ниже, и экспрессируемые при этом полипептиды обнаруживают и затем выделяют с использованием пригодных методов скрининга. Для целей обнаружения в принципе можно применять любые возможные реакции, позволяющие обнаруживать молекулы, образованные с таким полипептидом. В частности, для обнаружения образовавшихся аминокислот можно применять фотометрические тесты с определением образовавшихся (например, типа ацетолактата) или прореагировавших соединений, методы ЖХВР или ГХ. Кроме того, для обнаружения новых полипептидов, модифицированных с помощью генной инженерии, можно применять также методы обнаружения с помощью гель-электрофореза или методы обнаружения с использованием антител.
Как отмечалось выше, под объем изобретения подпадают также нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в строгих условиях с одноцепочечными нуклеотидными последовательностями, предлагаемыми в изобретении, или комплементарными им одноцепочечными нуклеотидными последовательностями.
В контексте настоящего описания понятие "в строгих условиях" следует понимать в том смысле, как оно описано у Sambrook и др. (Sambrook J.; Fritsch E.F. и Maniatis Т., Molecular cloning: a laboratory manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). Согласно настоящему изобретению под гибридизацией в строгих условиях предпочтительно подразумевается, что после выращивания в течение 1 ч с 1×SSC (150 мМ хлорид натрия, 15 мМ цитрат натрия, рН 7,0) и 0,1% ДСН (додецилсульфат натрия) при 50°С, предпочтительно при 55°С, более предпочтительно при 62°С и наиболее предпочтительно при 68°С, и более предпочтительно в течение 1 ч с 0,2×SSC и 0,1% ДСН при 50°С, предпочтительно при 55°С, более предпочтительно при 62°С и наиболее предпочтительно при 68°С, все еще обнаруживается позитивный сигнал гибридизации.
Вторым объектом настоящего изобретения являются полипептиды, выбранные из группы, включающей
а) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью по п.1;
б) полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ. ID NO: 2 или SEQ. ID NO: 4;
в) полипептид, гомологичный по меньшей мере на 84% полипептиду, который имеет последовательность SEQ. ID NO: 2 или SEQ: ID NO. 4 и у которого активность, и/или селективность, и/или стабильность не является существенно более низкой по сравнению с полипептидом, имеющим последовательность, указанную в SEQ. ID NO: 2 или SEQ. ID NO: 4,
которые могут служить в качестве модифицированных AHAS-ферментов в пути биосинтеза при получении посредством ферментации аминокислот с разветвленной цепью, в частности, валина, лейцина и изолейцина. Как уже отмечалось, эти ферменты обладают меньшей чувствительностью к ингибированию по типу обратной связи, что позволяет достигать высоких концентраций аминокислот в ферментативном бульоне без возникновения неблагоприятных ингибирующих действий.
Третий объект настоящего изобретения касается плазмид, векторов, микроорганизмов, содержащих одну или несколько нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в изобретении.
Пригодными плазмидами или векторами в принципе могут служить любые известные специалисту в данной области плазмиды и векторы, применяемые для этой цели. Эти типы плазмид и векторов описаны у Studier и др. (Studier W.F., Rosenberg A.H., Dunn J.J.; DubendroffJ.W., Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods EnzymoL, 185, 1990, cc.61-89) или в серии проспектов, выпущенных фирмами Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech или Gibco BRL. Другие предпочтительные плазмиды и векторы описаны у: Glover D.M., DNA cloning: a practical approach, тома I-III, изд-во IRL Press Ltd., Oxford, 1985; Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, под ред. Rodriguez R.L. и Denhardt D. Т, изд-во Butterworth, Stoneham, 1988, cc.179-204; Goeddel D.V., Systems for heterologous gene expression., Methods EnzymoL, 185, 1990, cc.3-7; Sambrook J.; Fritsch E.F. и Maniatis Т., Molecular cloning: a laboratory manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.
Наиболее предпочтительные плазмиды, с помощью которых генные конструкции, содержащие нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, можно клонировать в организме-хозяине, представлены на фиг.1 и фиг.2.
Аналогично этому в изобретении предложены также микроорганизмы, содержащие одну или несколько нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в изобретении.
Микроорганизм, в котором клонируют плазмиды, содержащие нуклеотидные последовательности, предлагаемые в изобретении, можно использовать для размножения и получения достаточного количества рекомбинантного фермента. Методы, применяемые для этой цели, хорошо известны специалисту в данной области (Sambrook J.; Fritsch E.F. и Maniatis Т., Molecular cloning: a laboratory manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). К микроорганизмам, которые можно отметить в этой связи, в принципе относятся любые организмы, известные специалисту в данной области, которые пригодны для указанной цели, такие, например, как дрожжи, например Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, прокариоты, Е. coli. Bacillus subtilis или эукариоты, такие как клетки млекопитающих, клетки насекомых. Предпочтительными для этой цели являются штаммы Е. coli. Наиболее предпочтительными являются следующие штаммы: Е. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10- или НВ101. Предпочтительные плазмиды, с помощью которых клонируют генную конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, указаны выше.
Предпочтительные микроорганизмы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью из глюкозы, сахарозы, лактозы, маннозы, фруктозы, мальтозы, мелассы, крахмала, целлюлозы или глицерина и этанола. В качестве микроорганизмов можно применять представителей коринебактерий, в частности из рода Corynebacterium. В роде Corynebacterium следует прежде всего отметить вид Corynebacterium glutamicum, который, как известно специалистам в данной области, обладает способностью продуцировать энантиомерно обогащенные аминокислоты, предпочтительно L-аминокислоты.
Пригодными штаммами бактерий р. Corynebacterium, прежде всего вида Corynebacterium glutamicum, являются известные штаммы дикого типа
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
Brevibacterium flavum ATCC 14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 и
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
и полученные из них мутанты, соответственно штаммы, продуцирующие аминокислоты с разветвленной цепью, такие, например, как продуцирующие изолейцин штаммы
Corynebacterium glutamicum ATCC 14309,
Corynebacterium glutamicum ATCC 14310,
Corynebacterium glutamicum ATCC 14311,
Corynebacterium glutamicum ATCC 15168,
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871,
такие, например, как продуцирующие лейцин штаммы
Corynebacterium glutamicum ATCC 21885
Brevibacterium flavum ATCC 21889,
или такие, например, как продуцирующие валин штаммы
Corynebacterium glutamicum DSM 12455,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 9325,
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 9324,
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1763.
Нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, можно сверхэкспрессировать в пригодном хозяине. Для достижения сверхэкспрессии можно увеличивать количество копий соответствующего гена или можно вызывать мутации в промоторной и регуляторной областях или в сайте связывания рибосомы, расположенном против хода транскрипции относительно структурного гена. Таким же образом действуют кассеты экспрессии, встроенные против хода транскрипции относительно структурного гена. Кроме того, экспрессию можно дополнительно повышать в процессе ферментативного продуцирования аминокислот с разветвленной цепью с помощью индуцибельных промоторов. Экспрессию можно усиливать также за счет увеличения продолжительности жизни мРНК. Кроме того, ферментативная активность может быть усилена также путем ингибирования разложения белка фермента. При этом гены или генные конструкции либо могут находиться в различном количестве копий в плазмидах, либо их интегрируют в хромосому и амплифицируют. В альтернативном варианте сверхэкспрессия рассматриваемых генов может быть также достигнута путем изменения состава питательных сред и условий культивирования. Дополнительные рекомендации в этом отношении можно найти в US 09/471803 или его эквиваленте DE 19951708.
Следующим объектом настоящего изобретения являются праймеры для получения с помощью ПЦР или гибридизационные зонды для обнаружения нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в изобретении.
Нуклеотидные последовательности, предлагаемые в изобретении, можно применять в качестве гибридизационных зондов для РНК, кДНК и ДНК для выделения полноразмерной кДНК, кодирующей белки AHAS, и для выделения такой кДНК или генов, последовательность которых обладает высоким уровнем сходства с последовательностью, предлагаемой в настоящем изобретении.
Кроме того, нуклеотидные последовательности, предлагаемые в изобретении, можно применять в качестве праймеров, с помощью которых с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно создавать ДНК генов, кодирующих AHAS. К ним относятся смысловые и антисмысловые праймеры, обеспечивающие кодирование соответствующих аминокислотных последовательностей или комплементарных последовательностей ДНК. В принципе пригодные праймеры можно создавать методами, известными специалисту в данной области. Конструирование праймеров, предлагаемых в изобретении, осуществляют на основе сравнения с известными последовательностями ДНК или путем трансляции аминокислотных последовательностей, обнаруженных визуально в предпочтительном кодоне рассматриваемого организма (см., например, для Streptomyces: Wright F. и Bibb M.J., Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome. Gene, 113, 1992, cc.55-65). Для этой цели можно использовать также общие отличительные признаки аминокислотной последовательности белков из так называемых суперсемейств (Firestine S.M.; Nixon A.E.; Benkovic S.J., Threading your way to protein function, Chem. Biol., 3, 1996, cc. 779-783). Дополнительную информацию касательно данного предмета можно найти у Gait M.J., Oligonucleotide synthesis: a practical approach, изд-во IRL Press Ltd., Oxford, 1984; Innis M.A., Gelfound D.H., Sninsky J.J. и White T.J., PCR Protocols: A guide to methods and applications, изд-во Academic Press Inc., San Diego, 1990. Наиболее предпочтительными являются следующие праймеры:
Такие нуклеотидные последовательности, применяемые в качестве зондов или праймеров, имеют по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 20, наиболее предпочтительно по меньшей мере 15, последовательных нуклеиновых кислот, одинаковых с нуклеиновыми кислотами, предлагаемыми в изобретении. Можно использовать также нуклеотидные последовательности, имеющие длину по меньшей мере 40 или 50 пар оснований.
Следующий вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу создания улучшенных рекомбинантных полипептидов, обладающих активностью синтетазы ацетооксикислот (AHAS), на основе нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в изобретении, заключающемуся в том, что
а) нуклеотидные последовательности подвергают мутагенезу,
б) нуклеотидные последовательности, полученные согласно а), клонируют в пригодном векторе и переносят в пригодную экспрессионную систему, и
в) обнаруживают и выделяют образовавшиеся полипептиды, обладающие улучшенной активностью, и/или селективностью, и/или стабильностью.
Под объем изобретения подпадают также рекомбинантные полипептиды или кодирующие их нуклеотидные последовательности, которые можно получать способом, аналогичным только что описанному способу.
Получение нуклеотидных последовательностей, требуемых для создания улучшенных рекомбинантных полипептидов и их экспрессии в хозяевах, описано выше и соответственно подпадает под объем изобретения.
Полипептиды и улучшенные рекомбинантные полипептиды, предлагаемые в изобретении, предпочтительно применяют для получения энантиомерно обогащенных аминокислот с разветвленной цепью, более предпочтительно валина, лейцина и изолейцина.
Кроме того, нуклеотидные последовательности и улучшенные нуклеотидные последовательности предпочтительно можно применять для создания микроорганизма, продуцирующего аминокислоты с разветвленной цепью.
Следующий вариант осуществления изобретения относится к способу продуцирования аминокислот с разветвленной цепью с использованием полипептида, предлагаемого в изобретении.
Кроме того, под объем настоящего изобретения подпадают векторы pECKA (фиг.1) или pECKA/ilvBNC (фиг.2). Кроме того, в объем настоящего изобретения включены модифицированные микроорганизмы типа DSM15652, DSM 15561 или DSM15650. Они депонированы согласно Будапештскому договору в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH), Mascheroder Weg 1b, D-38124, 4 июня 2003 г.
Для клонирования оперона ilvBNC, имеющего мутации в гене ilvN, конструировали бифункциональный вектор Escherichia coli - Corynebacterium glutamicum. Сначала из вектора рK19 удаляли сайт, распознаваемый рестриктазой BglII. Затем HindIII/HindII-фрагмент (2,7 т.п.н.) плазмиды pBL1 из Brevibacterium lactofermentum клонировали в сайте Nhel рK19. Образовавшийся плазмидный вектор pECKA (5,4 т.п.н.), обладающий способностью реплицироваться в Escherichia coli и Corynebacterium glutamicum, имел 7 уникальных сайтов клонирования, маркер устойчивости к канамицину и α-комплементацию β-галактозидазы для клонирования в Е. coli. SspI/EcoRI-фрагмент хромосомы (5,7 т.п.н.) (с концами SspI+BamHI), несущий оперон ilvBNC, клонировали в расщепленном с помощью HindII+BamHI векторе рЕСКА, в результате чего создавали плазмиду pECKAilvBNC (11,1 т.п.н.).
Встречающийся в естественных условиях ScaI/BglII-фрагмент оперона ilvBNC (770 пар оснований) заменяли фрагментом той же длины, содержащим 3-5 измененных оснований, который конструировали с помощью сайтнаправленного мутагенеза. Мишенью для сайтнаправленного мутагенеза был консервативный домен регуляторной субъединицы, кодируемый ilvN, расположенным вблизи N-конца. Мутации создавали с помощью ПЦР с учетом последовательностей мутантов AHAS Escherichia coli и Streptomyces cinnamonensis. Мутации обнаруживали путем секвенирования последовательностей.
Плазмидную ДНК выделяли из Escherichia coli и штамм Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δilvin трансформировали плазмидами pECKAilvBNC(WT), pECKAilvBNC(M8) и pECKAilvBNC(M13). Подтверждали уменьшение ингибирования AHAS, обусловленного аминокислотами с разветвленной цепью.
Понятие "выделенный" обозначает выделенный из своего естественного окружения.
В контексте настоящего изобретения оптически обогащенные (энантиомерно обогащенные, обогащенные энантиомерами) соединения обозначают смесь двух оптических изомеров (антиподов), в которой на долю одного из антиподов приходится >50 мол.%.
Подразумевается, что экспрессионные нуклеотидные последовательности включают все типы одноцепочечной или двухцепочечной ДНК, а также РНК или их смеси.
В контексте настоящего изобретения улучшение активности, и/или селективности, и/или стабильности означает, что полипептиды являются более активными, и/или более селективными, и/или более стабильными в рассматриваемых реакционных условиях. В то время как активность и стабильность ферментов в условиях промышленного применения должна, естественно, быть как можно выше, то в отношении селективности улучшение означает как то, что понижается субстратная селективность, так и то, что повышается энантиоселективность ферментов. В этой связи для того, чтобы выражение не теряло смысл в значительной степени, одно и то же выражение следует понимать с соответствующими изменениями (mutatis mutandis).
Согласно изобретению заявленные белковые последовательности и нуклеотидные последовательности включают также последовательности, гомологичные (за исключением встречающейся в естественных условиях вырожденности генетического кода) более чем на 91%, предпочтительно более чем на 92, 93 или 94%, более предпочтительно более чем на 95 или 96% и наиболее предпочтительно более чем на 97, 98 или 99%, одной из указанных последовательностей, при условии, что сохраняются механизм действия или функция такой последовательности. В контексте настоящего описания понятие "гомология" (или идентичность) можно определять согласно уравнению Н(%)=[1-V/X]×100, где Н обозначает гомологию, Х обозначает общее количество нуклеотидов/аминокислот в последовательности, с которой производят сравнение, и V обозначает количество несовпадающих нуклеотидов/аминокислот в предназначенной для сравнения последовательности и в последовательности, с которой производится сравнение. В каждом случае экспрессионные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, включают все последовательности, которые, по-видимому, могут существовать, с учетом вырожденности генетического кода.
Подразумевается, что литературные источники, упомянутые в настоящем документе, включены в описание в качестве ссылки.
Примеры:
1. Конструирование плазмидного вектора рЕСКА
Для клонирования оперона ilvBNC С. glutamicum, имеющего мутации в гене ilvN, и для его сверхэкспрессии конструировали бифункциональный вектор, обладающий способностью реплицироваться в Escherichia coli и в Corynebacterium glutamicum. Сначала из вектора рK19 (Pridmore R.D., New and versatile cloning vectors with kanamycin-resistance marker. Gene, 56, 1987, cc.309-312) удаляли сайт, распознаваемый рестриктазой BglII. Плазмиду рK19 расщепляли с помощью BglII, затупляли концы с помощью полимеразы Кленова и повторно встраивали путем лигирования. После лигирования клетки DH5α E. coli трансформировали полученной в результате лигирования смесью и отбирали трансформанты, несущие образовавшуюся плазмиду рK19В на агаровых планшетах, содержащих канамицин (20 мг/л). Удаление сайта BglII из рK19В подтверждали путем обработки выделенной плазмидной молекулы с помощью BglII (такое удаление позволяло в дальнейшем осуществлять субклонирование фрагмента, несущего ген ilvN, в новом сконструированном векторе pECKA.) Затем HindIII/HindII-фрагмент (2,7 т.п.н.) плазмиды pBL1 из Brevibacterium lactofermentum с затупленными с помощью полимеразы Кленова концами клонировали в сайте NheI с затупленными концами плазмиды рK19В. Образовавшийся плазмидный вектор pECKA (5,4 т.п.н.) обладал способностью реплицироваться в Escherichia coli и Corynebacterium glutamicum, содержал 7 уникальных сайтов клонирования (HindII, SalI, BamHI, SmaI, AvaI, KpnI, SacI), маркер устойчивости к канамицину и α-комплементацию β-галактозидазы для клонирования в Е. coli. Его рестрикционная и генетическая карты представлены на фиг.1.
2. Клонирование оперона ilvBNC в векторе pECKA
Фрагмент хромосомы С. glutamicum длиной 5,7 т.п.н., несущий оперон ilvBNC, получали путем расщепления плазмиды рKK5 (Keilhauer С., Eggeling L., Sahm H., Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon, J. Bacteriol., 175, 1993, cc.5595-5603) с помощью рестриктаз SspI и BamHI. Фрагмент встраивали путем лигирования в расщепленный с помощью HindII+BamHI вектор pECKA, полученную в результате лигирования смесь использовали для трансформации штамма Е. coli DH5α. Трансформанты отбирали на агаровых планшетах, содержащих канамицин (30 мг/л). Структуру образовавшейся плазмиды pECKAilvBNC (11,1 т.п.н.) подтверждали с помощью рестрикционного анализа. Рестрикционная и генетическая карты плазмиды pECKAilvBNC представлены на фиг.2.
3. Конструирование олигонуклеотидного праймера для мутагенеза гена ilvN
Осуществляли сравнительный анализ известной аминокислотной последовательности регуляторной субъединицы AHAS, кодируемой геном ilvN С glutamicum (GenBank, регистрационный номер L09232), и известных аминокислотных последовательностей регуляторных субъединиц AHAS из Streptomyces cinnamonensis (GenBank, регистрационный номер AF175526) и из Escherichia coli (GenBank, регистрационный номер АЕ0116769, секция 15 полного генома). Ранее были описаны несколько мутаций в Escherichia coli и Streptomyces cinnamonensis, обусловливающих устойчивость к валину (Vyazmensky M., Sella С., Barak Z., Chipman D.M., Isolation and characterization of subunits of acetohydroxy acid synthase isozyme III and reconstitution of the holoenzyme, Biochemistry, 35, 1996, cc.10339-10346; 
Janata J., 
Felsberg J., 
Mutations in two distinct regions of acetolactate synthase regulatory subunit from Streptomyces cinnamonensis result in the lack of sensitivity to end-product inhibition, Biochem Biophys Res Commun, 266, 1999, cc.162-166). В некоторых штаммах, имеющих указанный фенотип, мутация, приводящая к аминокислотной замене глицина на аспартат в положении 20 (согласно нумерации в последовательности Е. coli), была обнаружена как в Е. coli, так и в S. cinnamonensis, в частично консервативном домене вблизи N-конца белка:
| С. glutamicum | (SEQ. ID NO: 10) |
MANSDVTRHILSVLVQDVDGIISRVSGMFTRRAFNLVSLVSAKTETHGINRITVV
VD
| S. cinnamonensis | (SEQ. ID NO: 11) |
MS----TKHTLSVLVENKPGVLARITALFSRRGFNIDSLAVGVTEHPDISRITIVVN
| E. coli | (SEQ. ID NO: 12) |
MQNTTHDNVILELTVRNHPGVMTHVCGLFARRAFNVEGILCLPIQDSDKSHIWL
LVN
При создании изобретения конструировали вырожденный олигонуклеотидный праймер ILVNM1 (SEQ. ID NO: 7), предназначенный для сайтнаправленного мутагенеза гена ilvN C.glutamicum. Этот праймер позволял обеспечивать интродукцию мутаций в ген ilvN в положениях триплетов нуклеотидов, соответствующих аминокислотам глицину, изолейцину и изолейцину в положениях 20-22 регуляторной субъединицы AHAS С. glutamicum:
Праймер ILVNM1 (SEQ. ID NO: 7):
Нуклеотиды, измененные по сравнению с нуклеотидами последовательности дикого типа, выделены жирным шрифтом. В триплетах 20 и 22 имеются два вырожденных положения (G или А и А или Т, соответственно).
4. Сайт направленный мутагенез гена ilvN
Сайт направленный мутагенез встречающегося в естественных условиях ScaI/BglII-фрагмента оперона ilvBNC С. glutamicum (770 пар оснований) осуществляли с помощью ПЦР с использованием 4 олигонуклеотидных праймеров (Ito W., Ishiguro H., Kurosawa Y., A general method for introducing a series of mutations into cloned DNA using the polymerase chain reaction. Gene, 102, 1991, cc.67-70).
Применяли следующие праймеры:
Первая ПЦР: С использованием праймеров MILVNH и MISBGL амплифицировали фрагмент А (786 пар оснований) с измененным сайтом BglII, встречающимся в естественных условиях. С использованием праймеров ILVM1 и MILVND амплифицировали фрагмент В (491 пара оснований), имеющий мутации в гене ilvN. В качестве матрицы использовали плазмиду pECKAilvBNC. Образовавшиеся ДНК-фрагменты разделяли на агарозном геле, выделяли и очищали путем осаждения.
Вторая ПЦР: С использованием праймеров MILVNH - MILVND и используемых в качестве матриц фрагментов А+В (смешанных в молярном соотношении 1:1) амплифицировали смесь, содержащую фрагмент С (803 пары оснований), имеющий мутацию в сайте BglII, и фрагмент D (803 пары оснований), имеющий мутации в гене ilvN. Эту смесь расщепляли с помощью Seal и BglII и образовавшиеся фрагменты выделяли из агарозного геля. Плазмиду pECKAilvBNC расщепляли с помощью тех же самых ферментов с получением фрагментов длиной 766 и 10334 пар оснований и более крупный фрагмент также выделяли из геля. Выделенные фрагменты смешивали и лигировали. Клетки Е. coli DH5α трансформировали полученной в результате лигирования смесью и трансформанты отбирали на планшетах с канамицином (30 мг/л). Таким методом встречающийся в естественных условиях ScaI/BclII-фрагмент хромосомы (766 пар оснований) в плазмиде pECKAilvBNC заменяли фрагментом той же длины, в котором ген ilvN мог содержать 3-5 измененных нуклеотидов.
5. Секвенирование мутантов гена ilvN
Выделяли плазмидную ДНК из полученных клонов Е. coli DH5α и секвенировали с использованием праймера SILVNH и автоматического секвенатора типа Vistra (фирма Amersham).
Праймер SILVNH:
5' GATCCTGCCGACATTCACGA 3' (SEQ. ID NO: 9)
Выделяли клоны с 2 различными последовательностями в триплетах 20-22.
Получали клоны, имеющие мутации в гене ilvN:
| Мутант | Последовательность ДНК | Положение аминокислот | ||
| 20 | 21 | 22 | ||
| WT | GGAATCATT | Gly | Ile | Ile |
| М8 | GGTGACTTT | Gly | Asp | Phe |
| М13 | GATGACTTT | Asp | Asp | Phe |
Полные последовательности гена ilvN мутантов М8 и М13 представлены в SEQ. 3 и 1 соответственно.
6. Трансформация Corvnebacterium glutamicum
Плазмидную ДНК выделяли из Escherichia coli и штамм Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ΔilvN трансформировали плазмидами pECKAilvBNC (WT), pECKAilvBNC (M8) и pECKAilvBNC (M13) с помощью метода электропорации (Liebl W., Bayeri A., Schein В., Stillner U., Schleifer K.H., High efficiency electroporation of intact Corynebacterium glutamicum cells, FEMS Microbiol. Lett., 53, 1989, cc.299-303). Трансформанты отбирали на планшетах с канамицином (30 мг/л).
7. Измерения активности AHAS и ее ингибирования валином, лейцином и изолейдином
Для измерения активности AHAS использовали штаммы С. glutamicum АТСС13032 ΔilvN, содержащие плазмиды pECKAilvBNCCWT), pECKAilvBNC (M8) и pECKAilvBNC (M13). Клетки культивировали в течение ночи в минимальной среде CGXII, собирали центрифугированием и разрушали путем облучения ультразвуком. После центрифугирования (16000×g, 30 мин) проводили измерение активности AHAS в бесклеточном экстракте. С помощью спектрофотометрического ферментного анализа проводили непрямое обнаружение ацетолактата, представляющего собой продукт реакции (Singh В.K., Stidham M.A., Shaner D.L., Assay of acetohydroxyacid synthase, Anal Biochem., 171, 1988, cc.173-179). Анализ основан на превращении конечного продукта ацетолактата в ацетоин и обнаружении ацетоина по образованию комплекса креатина и нафтола.
Результаты измерений ферментативной активности представлены в табл. 1. Для оценки ингибирования фермента валином, лейцином и изолейцином все три аминокислоты (10 мМ) добавляли по отдельности в реакционную смесь. Результаты приведены в табл. 2 и табл. 3 соответственно.
| Таблица 1 Активность AHAS |
||||||||
| Штамм/плазмида | Удельная активность AHAS (нмоли ацетоина × мин-1 × мг-1 белка) | |||||||
| С. glutamicum ATCC 13032 | 33,7±10 | |||||||
| С. glutamicum ATCC 13032 ΔlivN | 0,43 | |||||||
| С. glutamicum ATCC 13032 ΔilvN/pECKAilvBNC (WT) | 110±40 | |||||||
| С. glutamicum ATCC 13032 ΔilvN/pECKAilvBNC(M8) | 31,1±0,9 | |||||||
| С. glutamicum ATCC13032 ΔilvN/pECKAilvBNC (M13) | 40,9±13 | |||||||
| Таблица 2 Ингибирование активности AHAS |
||||||||
| Штамм/плазмида | Удельная активность AHAS в присутствии 10 мМ аминокислоты (нмоли ацетоина × мин-1 × мг-1 белка) | |||||||
| - | Val | Leu | He | |||||
| С. glutamicum ATCC13032 | 33,7 | 16,9 | 20,9 | 21,2 | ||||
| С. glutamicum ATCC13032 ΔilvN/pECKAilvBNC WT | 110 | 61,6 | 71,5 | 68,2 | ||||
| С. glutamicum ATCC13032 ΔilvN/pECKAilvBNC(MS) | 31,1 | 35,1 | 34,8 | 32,7 | ||||
| С. glutamicum ATCC13032 ΔilvN/pECKAilvBNC (M13) | 40,9 | 40,7 | 44,2 | 40,0 | ||||
| Таблица 3 Ингибирование активности AHAS в процентах |
||||||||
| Штамм/плазмида | Ингибирование (10 мМ аминокислоты) | |||||||
| Val | Leu | IIe | ||||||
| С. glutamicum ATCC13032 | 50% | 38% | 37% | |||||
| С. glutamicum ATCC13032 | 44% | 35% | 38% | |||||
| Штамм/плазмида | Ингибирование (10 мМ аминокислоты) | ||
| Val | Leu | Ile | |
| ΔilvN/pECKAilvBNC WT | |||
| С. glutamicum ATCC13032 ΔilvN/pECKAilvBNC(M8) | 0% | 0% | 0% |
| С. glutamicum ATCC13032 ΔilvN/pECKAilvBNC (M13) | 0% | 0% | 2,5% |
Claims (16)
1. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, который обладает активностью синтетазы ацетооксикислот (AHAS), выбранная из ряда, включающего
а) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ. ID No: 1 или SEQ.ID NO:3;
б) нуклеотидную последовательность гена ilvN, которая содержит в положениях 21 и 22 триплет оснований, кодирующий Asp и Phe, соответственно;
в) нуклеотидную последовательность, гибридизирующуюся в строгих условиях с нуклеотидными последовательностями, указанными в а) или б);
г) нуклеотидную последовательность, гомологичную по меньшей мере на 70% нуклеотидной последовательности, указанной в а) или б), кодирующую фермент с такой же активностью, что и полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью по п.1 (а);
д) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, гомологичный на аминокислотном уровне по меньшей мере на 80% полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью, указанной в а) или б), кодирующую фермент с такой же активностью, что и полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью по п.1 (а);
е) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который обладает улучшенной активностью и/или селективностью, и/или стабильностью по сравнению с полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, указанной в а) или б), которую получают путем
I) мутагенеза нуклеиновой кислоты, указанной в а) или б),
II) встраивания путем лигирования нуклеотидной последовательности, которую можно получать как указано в I), в пригодный вектор с последующей трансформацией пригодной экспрессионной системы, и
III) экспрессии и обнаружения имеющего решающее значение полипептида, который обладает улучшенной активностью, и/или селективностью, и/или стабильностью,
ж) полинуклеотид, содержащий по меньшей мере 15 последовательных оснований нуклеотидных последовательностей, указанных в а)-е).
2. Полипептид, обладающий активностью синтетазы ацетооксикислот и выбранный из группы, включающей
а) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью по п.1;
б) полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ. ID NO: 2 или SEQ. ID NO: 4;
в) полипептид, гомологичный по меньшей мере на 84% полипептиду, который имеет последовательность SEQ. ID NO: 2 или SEQ: ID NO. 4 и у которого активность, и/или селективность, и/или стабильность не является существенно более низкой по сравнению с полипептидом, имеющим последовательность, указанную в SEQ. ID NO: 2 или SEQ. ID NO: 4.
3. Вектор, содержащий одну или несколько нуклеотидных последовательностей по п.1 и обеспечивающий экспрессию синтетазы аминокислот (AHAS) в клетках микроорганизма, представляющего собой микроорганизм рода Corynebacterium.
4. Вектор по п.3, представляющий собой рЕСКА.
5. Вектор по п.3, представляющий собой pECKA/ilvBNC.
6. Микроорганизм, представляющий собой микроорганизм рода Corynebacterium, включающий вектор по любому из пп.4-5 и предназначенный для получения синтетазы аминокислот (AHAS).
7. Микроорганизм по п.6, представляющий собой DSM15652.
8. Микроорганизм по п.6, представляющий собой DSM15651.
9. Микроорганизм по п.6, представляющий собой DSM15650.
10. Праймер для получения нуклеотидной последовательности по п.1 с помощью ПЦР метода.
11. Гибридизационный зонд для обнаружения нуклеотидных последовательностей по п.1.
12. Способ создания улучшенных рекомбинантных полипептидов, обладающих активностью синтетазы ацетооксикислот (AHAS), на основе нуклеотидных последовательностей по п.1, заключающийся в том, что а) нуклеотидные последовательности гена ilvN подвергают мутагенезу, б) нуклеотидные последовательности, полученные согласно а), клонируют в пригодном векторе и переносят в пригодную экспрессионную систему, и в) обнаруживают и выделяют образовавшиеся полипептиды, обладающие улучшенной активностью, и/или селективностью, и/или стабильностью.
13. Рекомбинантный полипептид, полученный способом по п.12.
14. Применение полипептидов по п.2 или 13 для ферментативного получения энантиомерно обогащенных аминокислот с разветвленной цепью.
15. Применение нуклеотидных последовательностей по п.1 для получения микроорганизма, продуцирующего аминокислоты с разветвленной цепью.
16. Способ ферментативного получения аминокислоты с разветвленной цепью, предусматривающий использование полипептида по п.2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03014640.1 | 2003-06-26 | ||
| EP20030014640 EP1491634A1 (en) | 2003-06-26 | 2003-06-26 | Feedback resistant acetohydroxy acid synthetase mutants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006102024A RU2006102024A (ru) | 2006-09-10 |
| RU2325439C2 true RU2325439C2 (ru) | 2008-05-27 |
Family
ID=33395884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006102024/13A RU2325439C2 (ru) | 2003-06-26 | 2004-06-08 | Мутанты синтетазы ацетооксикислот, устойчивые к обратной связи |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7585959B2 (ru) |
| EP (2) | EP1491634A1 (ru) |
| JP (1) | JP2007506407A (ru) |
| KR (1) | KR20060024437A (ru) |
| CN (1) | CN100523197C (ru) |
| AT (1) | ATE450611T1 (ru) |
| BR (1) | BRPI0411975A (ru) |
| DE (1) | DE602004024394D1 (ru) |
| RU (1) | RU2325439C2 (ru) |
| WO (1) | WO2005003357A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200510448B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2846710C2 (ru) * | 2021-09-29 | 2025-09-12 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант синтазы ацетогидроксикислоты и способ получения L-изолейцина с его применением |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2355763C2 (ru) * | 2006-09-13 | 2009-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот |
| WO2012014228A1 (en) | 2010-07-28 | 2012-02-02 | Abhishek Narain Singh | A method to by-pass allosteric domain activity of an enzyme so as to alter its feedback or feed-forward inhibition or activation |
| DE102011118019A1 (de) | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Evonik Degussa Gmbh | Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens |
| HUE032752T2 (en) | 2013-06-03 | 2017-10-30 | Evonik Degussa Gmbh | A method for the preparation of L-valine using recombinant corynebacteria containing propionate-inducible ilvBN operon |
| KR101720836B1 (ko) | 2014-08-05 | 2017-04-03 | 씨제이제일제당 (주) | 피드백 저항성 아세토하이드록시산 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-발린의 생산방법 |
| CN105886431B (zh) * | 2016-04-27 | 2019-05-10 | 天津科技大学 | 一株谷氨酸棒状杆菌及其高产异亮氨酸的方法 |
| WO2017194696A1 (en) | 2016-05-12 | 2017-11-16 | Danmarks Tekniske Universitet | Bacterial cells with improved tolerance to isobutyric acid |
| KR101996129B1 (ko) | 2017-07-11 | 2019-07-04 | 씨제이제일제당 (주) | 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 l-분지쇄 아미노산 생산 방법 |
| US11021697B2 (en) | 2017-07-11 | 2021-06-01 | Cj Cheiljedang Corporation | Acetohydroxy acid synthase variant, microorganism comprising the same, and method of producing L-branched-chain amino acid using the same |
| US12331300B2 (en) | 2018-12-12 | 2025-06-17 | Utilization Of Carbon Dioxide Institute Co., Ltd. | Recombinant of hydrogenophilus bacterium with enhanced ability to produce valine |
| CN110229797B (zh) * | 2019-06-05 | 2020-08-28 | 天津科技大学 | 一种乙酰羟酸合成酶及其应用 |
| KR102147381B1 (ko) * | 2019-11-22 | 2020-08-24 | 씨제이제일제당 주식회사 | 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물 |
| KR102727406B1 (ko) * | 2021-09-29 | 2024-11-08 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 |
| KR102673796B1 (ko) * | 2021-09-29 | 2024-06-10 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6A (en) * | 1836-08-10 | Thomas Blanchard | Machine for forming end pieces of plank blocks for ships | |
| RU2197527C2 (ru) * | 1994-09-08 | 2003-01-27 | Америкен Цианамид Компани | Экспрессия промотора синтазы ацетооксикислот в интродуцированных генах растений |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2748418B2 (ja) * | 1988-08-03 | 1998-05-06 | 味の素株式会社 | 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物 |
| DE3942947A1 (de) * | 1989-12-23 | 1991-06-27 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-isoleucin und dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
| RU2209246C2 (ru) * | 2000-01-26 | 2003-07-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Малая субъединица изозима iii и изозим iii синтетазы ацетогидроксикислот из escherichia coli, фрагмент днк (варианты), штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-валина (варианты) и способ получения l-валина |
| PT1325135E (pt) * | 2000-10-13 | 2005-03-31 | Archer Daniels Midland Co | Gene da carboxilase do piruvato de corynebacterium resistente a retroacao |
-
2003
- 2003-06-26 EP EP20030014640 patent/EP1491634A1/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-06-08 RU RU2006102024/13A patent/RU2325439C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-06-08 CN CNB2004800179270A patent/CN100523197C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-06-08 JP JP2006515843A patent/JP2007506407A/ja active Pending
- 2004-06-08 AT AT04739686T patent/ATE450611T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-06-08 US US10/561,906 patent/US7585959B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-06-08 BR BRPI0411975-4A patent/BRPI0411975A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-06-08 DE DE602004024394T patent/DE602004024394D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2004-06-08 EP EP04739686A patent/EP1636366B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-08 KR KR1020057024680A patent/KR20060024437A/ko not_active Withdrawn
- 2004-06-08 WO PCT/EP2004/006157 patent/WO2005003357A1/en not_active Ceased
-
2005
- 2005-12-22 ZA ZA200510448A patent/ZA200510448B/xx unknown
-
2009
- 2009-07-01 US US12/496,475 patent/US20100086966A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6A (en) * | 1836-08-10 | Thomas Blanchard | Machine for forming end pieces of plank blocks for ships | |
| RU2197527C2 (ru) * | 1994-09-08 | 2003-01-27 | Америкен Цианамид Компани | Экспрессия промотора синтазы ацетооксикислот в интродуцированных генах растений |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2846710C2 (ru) * | 2021-09-29 | 2025-09-12 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант синтазы ацетогидроксикислоты и способ получения L-изолейцина с его применением |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1491634A1 (en) | 2004-12-29 |
| US20100086966A1 (en) | 2010-04-08 |
| CN1813065A (zh) | 2006-08-02 |
| ZA200510448B (en) | 2006-12-27 |
| BRPI0411975A (pt) | 2006-08-29 |
| WO2005003357A1 (en) | 2005-01-13 |
| EP1636366B1 (en) | 2009-12-02 |
| DE602004024394D1 (en) | 2010-01-14 |
| ATE450611T1 (de) | 2009-12-15 |
| KR20060024437A (ko) | 2006-03-16 |
| US7585959B2 (en) | 2009-09-08 |
| RU2006102024A (ru) | 2006-09-10 |
| US20070292914A1 (en) | 2007-12-20 |
| EP1636366A1 (en) | 2006-03-22 |
| CN100523197C (zh) | 2009-08-05 |
| JP2007506407A (ja) | 2007-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100086966A1 (en) | Feedback resistant acetohydroxy acid synthethase mutants | |
| JP4638048B2 (ja) | Ｌ−バリンを微生物により製造する方法 | |
| RU2261912C2 (ru) | Полинуклеотид, кодирующий полипептид, который имеет активность глюкозо-6-фосфатизомеразы, пдазмидный вектор экспрессии, способ увеличения интенсивности метаболизма в пентозофосфатном цикле и способ получения l-аминокислот | |
| DK2240574T3 (en) | Bacterium which produces a product of a reaction catalyzed by a protein having 2-oxoglutarate-DEPENDENT ENZYME ACTIVITY AND PROCESS FOR MAKING THE PRODUCT | |
| KR20010051289A (ko) | ｐｏｘＢ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 | |
| KR20150113965A (ko) | 발효에 의한 아미노산 생산을 위한 미생물 및 방법 | |
| CN101029310B (zh) | 经扩增zwf基因发酵制备L-氨基酸的方法 | |
| US20030175911A1 (en) | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| RU2395580C2 (ru) | Способ конструирования бактерии-продуцента (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина, бактерия-продуцент (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина и способ продукции (2s,3r,4s)-гидрокси-l-изолейцина или его соли | |
| Liu et al. | The 138th residue of acetohydroxyacid synthase in Corynebacterium glutamicum is important for the substrate binding specificity | |
| WO2019136585A1 (en) | Regulation of csr system for production of lysine and lysine-derived products | |
| RU2268941C2 (ru) | Способ производства l-аминокислот посредством ферментации | |
| KR20010051533A (ko) | 코리네형 세균을 사용한 ｌ-라이신의 발효적 제조방법 | |
| WO2005075631A1 (en) | Process for the preparation of l-amino acids with amplification of the zwf gene | |
| KR20080052593A (ko) | 미생물을 사용한 아미노산 생산 방법 | |
| US8334126B2 (en) | Coryneform host-vector systems comprising a chromosomal ALR gene which is attenuated or eliminated and methods of using | |
| EP1303624B1 (en) | Alanine racemase (alr) of corynebacterium glutamicum | |
| US6562607B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the cls gene | |
| KR20030001269A (ko) | 활성화된 ｒｅｃ-Ｄ-히단토이나제 | |
| US20030148476A1 (en) | Nucleotide sequences that code for the rplK gene and methods of use thereof | |
| KR20060129352A (ko) | ｚｗｆ 유전자의 증폭을 이용한 Ｌ-아미노산의 제조 방법 | |
| KR20010095300A (ko) | ｒｐｌＫ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및이의 사용 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100609 |