RU2324187C1 - Method of preparation of samples from associated nidi of plague and arbovirus infections, for serologic tests - Google Patents
Method of preparation of samples from associated nidi of plague and arbovirus infections, for serologic tests Download PDFInfo
- Publication number
- RU2324187C1 RU2324187C1 RU2006128696/13A RU2006128696A RU2324187C1 RU 2324187 C1 RU2324187 C1 RU 2324187C1 RU 2006128696/13 A RU2006128696/13 A RU 2006128696/13A RU 2006128696 A RU2006128696 A RU 2006128696A RU 2324187 C1 RU2324187 C1 RU 2324187C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- samples
- plague
- pestis
- inactivation
- preparation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title claims description 52
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 title claims description 22
- 208000009828 Arbovirus Infections Diseases 0.000 title claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 9
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 claims description 14
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 claims description 12
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 16
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 24
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 201000003075 Crimean-Congo hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 206010010685 Congo-Crimean haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 2
- 208000000307 Crimean Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- UWNADWZGEHDQAB-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethylhexane Chemical group CC(C)CCC(C)C UWNADWZGEHDQAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 235000005770 birds nest Nutrition 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- CQBWPUJYGMSGDU-UHFFFAOYSA-N ethyl benzenecarboximidate Chemical compound CCOC(=N)C1=CC=CC=C1 CQBWPUJYGMSGDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000018791 negative regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- ISIJQEHRDSCQIU-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2,7-diazaspiro[4.5]decane-7-carboxylate Chemical compound C1N(C(=O)OC(C)(C)C)CCCC11CNCC1 ISIJQEHRDSCQIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005765 wild carrot Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики чумы и арбовирусных инфекций.The invention relates to biotechnology, in particular microbiology, and can be used for laboratory diagnosis of plague and arbovirus infections.
Yersinia pestis и ряд арбовирусов относятся к возбудителям заболеваний человека, имеющих индивидуальную и общественную опасность, тяжелое течение и высокую летальность.Yersinia pestis and a number of arboviruses are human pathogens with individual and social danger, severe course and high mortality.
С начала 90-х годов прошлого века в мире отмечается активизация природных очагов чумы и арбовирусных инфекций. В России осложнилась эпизоотологическая ситуация по чуме, активизировался эпизоотический и эпидемический процесс, вызванный арбовирусами. В настоящее время сформировались новые природные очаги арбовирусов, территориально совпадающие (сопряженные) с традиционно существующими природными очагами чумы. Важным мероприятием по предупреждению и предотвращению вспышек указанных заболеваний является эпидемиологический надзор за очагами. Осуществление эпидемиологического надзора включает в качестве основного мероприятия проведение серологического исследования материала, потенциально зараженного возбудителями чумы и арбовирусных инфекций. При этом необходимо обеспечить биологическую безопасность персонала, снизить риск его инфицирования. Этого можно добиться в ходе подготовки проб, в частности предварительной обработки (инактивации) материала. Вместе с тем не должна снижаться эффективность диагностических исследований. Следовательно, актуальным является разработка способов инактивации материала, собранного на территории сопряженных очагов чумы и арбовирусных инфекций.Since the beginning of the 90s of the last century, the activation of natural foci of plague and arbovirus infections has been noted in the world. In Russia, the epizootological situation of the plague was complicated, the epizootic and epidemic process caused by arboviruses became more active. Currently, new natural foci of arboviruses have been formed, territorially coinciding (conjugated) with traditionally existing natural foci of plague. An important measure to prevent and prevent outbreaks of these diseases is the epidemiological surveillance of foci. The implementation of epidemiological surveillance includes, as a main measure, conducting a serological study of material potentially infected with plague and arbovirus infections. At the same time, it is necessary to ensure the biological safety of personnel and reduce the risk of infection. This can be achieved during the preparation of samples, in particular preliminary processing (inactivation) of the material. However, the effectiveness of diagnostic studies should not be reduced. Therefore, it is relevant to develop methods for inactivating material collected on the territory of conjugated foci of plague and arbovirus infections.
Известны способы инактивации Y.pestis, включающие обработку суспензий дибутиловым и диизобутиловым эфирами фосфористой кислоты (1), C,N-фосфорилированными имидатами (2), N-ацилированными фосфорсодержащими бутилтиоимидатами (3), этилбензимидатом (4), описанные в патентах. Однако перечисленные химические вещества и предложенные способы инактивации не регламентированы нормативно-методическими документами по безопасной работе с патогенами. Неизвестны эффективность их действия на Y.pestis, содержащихся в пробах из объектов внешней среды, в материале от животных и больных людей, их влияние на чувствительность и специфичность серологических реакций, а также эффективность действия в отношении арбовирусов.Known methods of inactivation of Y. pestis, including the treatment of suspensions with dibutyl and diisobutyl esters of phosphorous acid (1), C, N-phosphorylated imidates (2), N-acylated phosphorus-containing butylthioimidates (3), ethylbenzimidate (4), are described in the patent. However, the listed chemicals and the proposed methods of inactivation are not regulated by regulatory and methodological documents on the safe work with pathogens. The effectiveness of their action on Y. pestis contained in samples from environmental objects, in the material from animals and sick people, their influence on the sensitivity and specificity of serological reactions, as well as their effectiveness in relation to arboviruses, is unknown.
Известен способ предварительной обработки перед серологическим исследованием взвесей Y.pestis, проб из природных очагов чумы (суспензий внутренних органов или костного мозга животных, субстратов гнезд птиц и млекопитающих, погадок хищных птиц), а также материала от людей, больных чумой или с подозрением на заболевание. Способ регламентирован действующими санитарными правилами по безопасности работ с микроорганизмами I-II групп патогенности. Способ предусматривает инактивацию проб раствором формалина в двух режимах: использование раствора формалина в концентрации 1-2% в течение 12 ч или в концентрации 4% в течение 1 ч при комнатной температуре (5). Недостатком применения 1-2% раствора формалина является продолжительный период инактивации. Использование формалина в высокой концентрации (4%) приводит к ингибированию активности ферментов (6). Обязательным требованием является проверка бактерицидной активности формалина, требующая дополнительных временных и материальных затрат. Кроме того, эффективность вышеуказанных режимов инактивации не известна в отношении арбовирусов.A known method of pre-treatment before serological examination of suspensions of Y. pestis, samples from natural foci of plague (suspensions of internal organs or bone marrow of animals, substrates of bird nests and mammals, ridges of birds of prey), as well as material from people with plague or with suspected disease . The method is regulated by the current sanitary rules for the safety of work with microorganisms of I-II pathogenicity groups. The method involves inactivating samples with a formalin solution in two modes: using a formalin solution at a concentration of 1-2% for 12 hours or at a concentration of 4% for 1 hour at room temperature (5). The disadvantage of using a 1-2% formalin solution is the long period of inactivation. The use of formalin in high concentration (4%) leads to inhibition of enzyme activity (6). A mandatory requirement is to check the bactericidal activity of formalin, which requires additional time and material costs. In addition, the effectiveness of the above modes of inactivation is not known in relation to arboviruses.
Известен способ инактивации инфекционной активности арбовирусов раствором формалина в концентрации 1:2000 (0,05% р-р) в течение 72 ч при температуре 32°С. Вместе с тем имеются данные, что формалин в указанном разведении снижает иммуногенность препаратов, приготовленных из вирусов, что косвенно свидетельствует о возможном изменении антигенной структуры и снижении диагностической ценности материала. Недостатком способа также является длительность процесса инактивции. Неизвестна эффективность обеззараживающего действия 0,05% раствора формалина в отношении Y.pestis. В настоящее время обязательным этапом подготовки материала, содержащего Y.pestis, является инактивация 1-2% раствором формалина (6).A known method of inactivating the infectious activity of arboviruses with a formalin solution at a concentration of 1: 2000 (0.05% solution) for 72 hours at a temperature of 32 ° C. At the same time, there is evidence that formalin in the indicated dilution reduces the immunogenicity of preparations prepared from viruses, which indirectly indicates a possible change in the antigenic structure and a decrease in the diagnostic value of the material. The disadvantage of this method is the duration of the inactivation process. The effectiveness of the disinfecting action of a 0.05% formalin solution against Y. pestis is unknown. At present, the mandatory step in the preparation of material containing Y. pestis is the inactivation of a 1-2% formalin solution (6).
Известны способы приготовления антигенов арбовирусов для серологических реакций, включающие инактивацию путем обработки Трис-буфером, метиленовым синим, прогреванием в определенных режимах. Однако они не всегда обеспечивают надежность инактивации (7).Known methods for the preparation of arbovirus antigens for serological reactions, including inactivation by treatment with Tris buffer, methylene blue, heating in certain modes. However, they do not always ensure the reliability of inactivation (7).
Наиболее близким к заявляемому способу является способ приготовления антигенов арбовирусов для серологических реакций (7).Closest to the claimed method is a method of preparing arbovirus antigens for serological reactions (7).
Способ приготовления антигенов арбовирусов для серологических реакций, описанный в методическом документе федерального уровня, включает инактивацию инфекционной активности вирусов путем обработки β-пропиолактоном в концентрации 0,05-0,1% в двух режимах при 37°C в течение 8-10 часов и при +4°С в течение 96 часов. Контроль качества инактивации инфекционной активности арбовирусов проводят заражением клеточных культур или мышей-сосунков полученной суспензией. Отсутствие цитопатогенного эффекта в культуре клеток и гибели мышей-сосунков свидетельствует об отсутствии жизнеспособных вирусов,The method for preparing arbovirus antigens for serological reactions described in the federal level methodological document involves inactivating the infectious activity of viruses by treating β-propiolactone at a concentration of 0.05-0.1% in two modes at 37 ° C for 8-10 hours and at + 4 ° C for 96 hours. The quality control of inactivation of the infectious activity of arboviruses is carried out by infection of cell cultures or sucker mice with the resulting suspension. The absence of a cytopathogenic effect in cell culture and death of sucker mice indicates the absence of viable viruses,
Использование β-пропиолактона в заданных режимах обеспечивает надежность инактивации арбовирусов и высокую чувствительность серологических реакций. Условия применения β-пропиолактона не предусматривают необходимости контроля его бактерицидной активности. Однако неизвестна эффективность использования β-пропиолактона для инактивации возбудителя чумы.The use of β-propiolactone in predetermined modes ensures the reliability of inactivation of arboviruses and high sensitivity of serological reactions. The conditions for the use of β-propiolactone do not provide for the need to control its bactericidal activity. However, the effectiveness of using β-propiolactone to inactivate the plague pathogen is unknown.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, показал, что сведений о способе, позволяющем инактивировать материал, доставленный из сопряженных природных очагов Y.pestis и арбовирусов, для подготовки его к серологическому исследованию не обнаружено.An analysis of the state of the art by the applicant, including a search by patents and scientific and technical sources of information, showed that no information was found on a method for inactivating material delivered from paired natural foci of Y. pestis and arboviruses to prepare for serological testing.
Задачей изобретения является разработка способа подготовки проб, одновременно содержащих возбудителей чумы и арбовирусных инфекций, обеспечивающего безопасность работы персонала и эффективность диагностического исследования.The objective of the invention is to develop a method for the preparation of samples simultaneously containing pathogens of plague and arbovirus infections, ensuring the safety of personnel and the effectiveness of diagnostic studies.
Изобретение предлагает оптимальный вариант способа подготовки проб, одновременно содержащих бактериальные (возбудитель чумы) и вирусные агенты (арбовирусы).The invention provides an optimal variant of a method for preparing samples simultaneously containing bacterial (plague pathogen) and viral agents (arboviruses).
Сущность изобретения заключается в том, что исследуемые пробы обрабатывают β-пропиолактоном путем внесения в них до конечной концентрации 0,1% при +37°С в течение 8-10 часов.The essence of the invention lies in the fact that the test samples are treated with β-propiolactone by introducing them to a final concentration of 0.1% at + 37 ° C for 8-10 hours.
Авторами впервые установлена бактерицидная активность β-пропиолактона в отношении взвесей Y.pestis и проб из внутренних органов животных, содержащих Y.pestis, а также разработан режим инактивации проб, содержащих чумной микроб, а именно при 37°C в течение 6-8 часов.The authors first established the bactericidal activity of β-propiolactone against suspensions of Y. pestis and samples from the internal organs of animals containing Y. pestis, and also developed a mode of inactivation of samples containing the plague microbe, namely at 37 ° C for 6-8 hours.
Режим подготовки проб из сопряженных очагов разработан с учетом комплексного состава. Кроме микроорганизмов в пробах содержатся дополнительные компоненты (белки, липиды, липополисахариды и пр.) из внутренних органов млекопитающих и материала от больных людей. Они нестандартны по составу и могут, взаимодействуя с β-пропиолактоном, снижать его бактерицидную активность.The mode of preparation of samples from conjugated foci was developed taking into account the complex composition. In addition to microorganisms, the samples contain additional components (proteins, lipids, lipopolysaccharides, etc.) from the internal organs of mammals and material from sick people. They are non-standard in composition and can, interacting with β-propiolactone, reduce its bactericidal activity.
В заявляемом способе предложен конкретный режим его выполнения:In the claimed method, a specific mode of its implementation is proposed:
1. β-пропиолактон вносят в пробы до конечной концентрации 0,1% по объему.1. β-propiolactone is added to the samples to a final concentration of 0.1% by volume.
2. Пробы выдерживают при 37° в течение 8-10 часов.2. Samples are kept at 37 ° for 8-10 hours.
Способ подготовки проб осуществляют следующим образом.The method of sample preparation is as follows.
Кусочки внутренних органов животных (печень, легкие, селезенка), добытых в сопряженных очагах, измельчают, добавляют физиологический раствор в определенной пропорции; отбирают надосадочную жидкость; к полученной взвеси добавляют β-пропиолактон до получения конечной концентрации в пробе 0,1%; смесь выдерживают при 37°C в течение 8-10 часов.Pieces of the internal organs of animals (liver, lungs, spleen), obtained in the conjugated foci, are crushed, physiological saline is added in a certain proportion; supernatant is taken; β-propiolactone is added to the resulting suspension to obtain a final concentration in the sample of 0.1%; the mixture is kept at 37 ° C for 8-10 hours.
Контроль эффективности инактивации проводят в соответствии с действующими нормативно-методическими документами. Для контроля качества инактивации бактерий проводят высев полученной суспензии на плотные и жидкие питательные среды и заражают лабораторных животных. По истечении срока наблюдения за зараженными животными суспензии, приготовленные из внутренних органов, высевают на указанные питательные среды. Отсутствие роста бактерий свидетельствует об отсутствии жизнеспособных микроорганизмов в исследуемом материале. Контроль качества инактивации инфекционной активности арбовирусов проводят заражением клеточных культур или мышей-сосунков полученной суспензией.Monitoring the effectiveness of inactivation is carried out in accordance with current regulatory and methodological documents. To control the quality of bacterial inactivation, the suspension obtained is plated on solid and liquid nutrient media and the laboratory animals are infected. At the end of the observation period for infected animals, suspensions prepared from internal organs are seeded onto the indicated nutrient media. The absence of bacterial growth indicates the absence of viable microorganisms in the test material. The quality control of inactivation of the infectious activity of arboviruses is carried out by infection of cell cultures or sucker mice with the resulting suspension.
Полученные инактивированные пробы используют для постановки серологических реакций, при этом обеспечивается высокая специфичность и чувствительность ИФА для обнаружения в пробах Y.pestis и возбудителей арбовирусных инфекций.The obtained inactivated samples are used for staging serological reactions, while ensuring high specificity and sensitivity of ELISA for detection in samples of Y. pestis and pathogens of arbovirus infections.
Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения.The invention is illustrated by examples of its implementation.
Пример 1.Example 1
Кусочки внутренних органов (печень, легкие, селезенка) павших белых мышей, зараженных штаммом Y.pestis 231, помещают в стерильную ступку, измельчают, приливают примерно 2 мл 0,9% физиологического раствора рН 7,2, перемешивают и отбирают через стерильную марлевую салфетку пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Мерной пипеткой замеряют количество жидкости, доводят объем до 5 мл стерильным физиологическим раствором. К полученной взвеси добавляют цельный β-пропиолактон до получения конечной концентрации в пробе 0,1%. Смесь выдерживают при +37°С в течение 8-10 часов. Для контроля эффективности инактивации проводят высев на 2 чашки с агаром LB, в 2 пробирки с бульоном LB, заражают биопробных животных - по 2 белые мыши. В течение 5 суток наблюдают за появлением роста на питательных средах и за лабораторными животными. На 6 сутки животных забивают, кусочками органов (печень, селезенка, легкие, сердце) делают посевы отпечатками на питательные среды (2 чашки с агаром LB, 1 пробирка с бульоном LB для посева крови из сердца). За посевами наблюдают 5 суток. В ходе контроля на всех средах роста чумного микроба не отмечено. Данные об инактивации взвесей чумного микроба и проб из внутренних органов животных, зараженных Y.pestis 231, приведены в таблице 1.Pieces of internal organs (liver, lungs, spleen) of fallen white mice infected with Y. pestis 231 strain are placed in a sterile mortar, crushed, about 2 ml of 0.9% physiological saline pH 7.2 are added, mixed and removed through a sterile gauze cloth Pasteur pipette into a sterile tube. Using a measuring pipette, measure the amount of liquid, adjust the volume to 5 ml with sterile saline. To the resulting suspension add whole β-propiolactone to obtain a final concentration in the sample of 0.1%. The mixture is maintained at + 37 ° C for 8-10 hours. To control the effectiveness of inactivation, seeding is carried out on 2 cups with LB agar, in 2 test tubes with LB broth, and 2 test mice are infected with biological samples. Within 5 days, the appearance of growth on nutrient media and laboratory animals is monitored. On the 6th day, animals are slaughtered, pieces of organs (liver, spleen, lungs, heart) are inoculated with culture media (2 cups with LB agar, 1 tube with LB broth for sowing blood from the heart). Crops are monitored for 5 days. During control, no plague microbe was observed on all growth media. Data on the inactivation of plague microbe suspensions and samples from the internal organs of animals infected with Y. pestis 231 are shown in table 1.
Инактивированную взвесь используют для постановки иммуноферментного анализа (ИФА) на наличие антигена (FI), образующегося при культивировании Y.pestis при 37°С. Для сравнения параллельно проводили постановку ИФА с аналогичными пробами, обработанными 2% раствором формалина. Результаты контроля специфичности и чувствительности ИФА отражены в таблице 2. В качестве анализируемых объектов использованы пробы, приготовленные из внутренних органов лабораторных животных, зараженных штаммом Y.pestis 231, взвеси штамма Y.pestis 231, выращенного при 37°С (положительный контроль) и 28°С (отрицательный контроль). Сравнительный анализ продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность ИФА с пробами, инактивированными заявляемым способом.An inactivated suspension is used to perform an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the presence of antigen (FI) formed during the cultivation of Y. pestis at 37 ° C. For comparison, ELISA was performed in parallel with similar samples treated with a 2% formalin solution. The results of the specificity and sensitivity control of ELISA are shown in Table 2. Samples prepared from the internal organs of laboratory animals infected with Y. pestis 231 strain, suspension of Y. pestis 231 strain grown at 37 ° C (positive control) and 28 were used as the analyzed objects. ° C (negative control). A comparative analysis showed high sensitivity and specificity of ELISA with samples inactivated by the claimed method.
Пример 2 (модельный эксперимент).Example 2 (model experiment).
В модельном эксперименте при подготовке проб, одновременно содержащих возбудителей чумы и арбовирусных инфекций (вирус Конго Крымской геморрагической лихорадки), кусочки внутренних органов (печень, легкие, селезенка) павших белых мышей, зараженных штаммом Y.pestis 231, помещают в стерильную ступку, измельчают, приливают примерно 2 мл 0,9% физиологического раствора рН 7,2, вносят суспензии клещей, инфицированных арбовирусами (вирус Конго Крымской геморрагической лихорадки - ККГЛ), перемешивают и отбирают через стерильную марлевую салфетку пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Далее подготовка проб и постановка ИФА, контроль эффективности инактивации проводятся аналогично примеру 1. Результаты контроля специфичности и чувствительности ИФА отражены в таблице 2. Сравнительный анализ продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность ИФА с пробами, инактивированными заявляемым способом.In a model experiment, when preparing samples simultaneously containing plague and arbovirus infections (Congo virus of the Crimean hemorrhagic fever), pieces of internal organs (liver, lungs, spleen) of fallen white mice infected with Y. pestis 231 strain are placed in a sterile mortar, crushed, approximately 2 ml of a 0.9% saline solution of pH 7.2 is added, suspensions of ticks infected with arboviruses (Congo virus of the Crimean hemorrhagic fever - CCHF) are added, mixed and the pasteur is taken through a sterile gauze cloth WCSS pipetted into a sterile tube. Further, the preparation of samples and the staging of ELISA, monitoring the effectiveness of inactivation is carried out analogously to example 1. The results of monitoring the specificity and sensitivity of ELISA are shown in table 2. A comparative analysis showed high sensitivity and specificity of ELISA with samples inactivated by the claimed method.
Как видно из примеров, заявляемый способ обеспечивает эффективную инактивацию проб и позволяет надежно выявлять в серологических реакциях наличие возбудителей чумы и арбовирусных инфекций в пробах из сопряженных природных очагов.As can be seen from the examples, the inventive method provides effective inactivation of samples and allows you to reliably detect the presence of plague pathogens and arbovirus infections in serological reactions in samples from conjugated natural foci.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении уровня безопасности работы персонала с материалом, содержащим одновременно возбудителей чумы и арбовирусных инфекций, и сохранении ценности проб для лабораторной диагностики. Предложенный способ обеспечивает высокую специфичность и чувствительность ИФА для диагностики Y.pestis по наличию антигена FI, и по наличию специфических антигенов арбовирусов.The technical result from the use of the invention is to increase the level of safety of personnel with material containing both causative agents of plague and arbovirus infections, and preserving the value of samples for laboratory diagnosis. The proposed method provides high specificity and sensitivity of ELISA for the diagnosis of Y. pestis by the presence of the FI antigen, and by the presence of specific arbovirus antigens.
Присутствие в пробе дополнительных компонентов (белков, липидов, липополисахаридов и пр.) не снижает эффективность инактивации.The presence in the sample of additional components (proteins, lipids, lipopolysaccharides, etc.) does not reduce the inactivation efficiency.
Кроме того, способ позволяет обеззаразить и провести обнаружение возбудителя чумы и арбовирусов в пробах малых объемов (микролитры), обеспечивает предварительную обработку перед серологическим исследованием взвесей микроорганизмов, проб из природных очагов (суспензий внутренних органов или костного мозга животных, субстратов гнезд птиц и млекопитающих, погадок хищных птиц), а также материала от больных людей, или лиц с подозрением на заболевание.In addition, the method allows you to disinfect and detect the causative agent of plague and arboviruses in samples of small volumes (microliters), provides preliminary processing before serological examination of suspensions of microorganisms, samples from natural foci (suspensions of internal organs or bone marrow of animals, substrates of bird and mammalian nests, riddles birds of prey), as well as material from sick people, or people with a suspected illness.
По сравнению с регламентированным в санитарных правилах по безопасности работ с микроорганизмами I-II групп патогенности способом подготовки проб, содержащих возбудитель чумы, заявляемый способ позволяет уменьшить сроки инактивации проб на 2-4 ч, таким образом сократив время получения результата диагностических серологических реакций.Compared with the method for preparing samples containing the plague pathogen regulated in the sanitary safety rules for working with microorganisms of I-II pathogenicity groups, the claimed method allows to reduce the time of inactivation of samples by 2-4 hours, thereby reducing the time for obtaining the result of diagnostic serological reactions.
Заявляемый способ разработан и апробирован в лабораториях биологической безопасности и диагностики инфекционных болезней Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб".The inventive method is developed and tested in laboratories for biological safety and diagnosis of infectious diseases of the Russian research anti-plague institute "Microbe".
Источники информацииInformation sources
1. Патент РФ №1235030, A61L 2/16, A61L 2/18, 10.05.99.1. RF patent No. 1235030, A61L 2/16, A61L 2/18, 05/10/99.
2. Патент РФ №1241688, C07F 9/40, C07F 9/24, А61K 31/66, 30.05.84.2. RF patent No. 1241688, C07F 9/40, C07F 9/24, A61K 31/66, 05.30.84.
3. Патент РФ №1389238, C07F 9/40, А61K 31/66, 07.07.86.3. RF patent No. 1389238, C07F 9/40, A61K 31/66, 07.07.86.
4. Патент РФ №1345402, A61L 2/16, 30.05.84.4. RF patent No. 1345402, A61L 2/16, 05.30.84.
5. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп безопасности. Санитарно-эпидемиологические правила. СП 1.3.1285-03.5. Safety of work with microorganisms of I-II security groups. Sanitary and epidemiological rules. SP 1.3.1285-03.
6. Майоров Н.В., Тихонов Н.Г., Адамов А.К. и др. / Матер. Всесоюз. конф. "Дезинфекция и стерилизация. Перспективы развития". - Волгоград, 1985. - С.77-78.6. Mayorov N.V., Tikhonov N.G., Adamov A.K. et al. / Mater. All-Union. conf. "Disinfection and sterilization. Prospects for development." - Volgograd, 1985. - P.77-78.
7. Выявление циркуляции арбовирусов. Методы вирусологических и серологических исследований, клинико-эпидемиологические характеристики малоизученных арбовирусных инфекций, подходы к мониторингу природных очагов арбовирусов. - Метод. рекомендации. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Вирусология. - 1991. - Т.25. - С.30-34.7. Detection of the circulation of arboviruses. Methods of virological and serological studies, clinical and epidemiological characteristics of poorly studied arbovirus infections, approaches to monitoring the natural foci of arboviruses. - Method. recommendations. // Results of science and technology. VINITI. Ser. Virology. - 1991. - T.25. - S.30-34.
Результаты инактивации взвесей Y.pestis 231, содержащих 109 м.к./мл, при 37°СTable 1
The results of the inactivation of suspensions of Y. pestis 231 containing 10 9 MK / ml, at 37 ° C
Влияние способа обеззараживания материала на результаты ИФАtable 2
The influence of the method of disinfection of the material on the results of ELISA
суспензии клещей, содержащие арбовирусы (ККГЛ)Samples, including suspensions of the internal organs of rodents infected with Y.pestis, and
mite suspensions containing arboviruses (CCHF)
суспензии клещей, содержащие арбовирусы (ККГЛ)Samples, including suspensions of the internal organs of rodents infected with Y.pestis, and
mite suspensions containing arboviruses (CCHF)
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006128696/13A RU2324187C1 (en) | 2006-08-07 | 2006-08-07 | Method of preparation of samples from associated nidi of plague and arbovirus infections, for serologic tests |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006128696/13A RU2324187C1 (en) | 2006-08-07 | 2006-08-07 | Method of preparation of samples from associated nidi of plague and arbovirus infections, for serologic tests |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2324187C1 true RU2324187C1 (en) | 2008-05-10 |
Family
ID=39800036
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006128696/13A RU2324187C1 (en) | 2006-08-07 | 2006-08-07 | Method of preparation of samples from associated nidi of plague and arbovirus infections, for serologic tests |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2324187C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4774177A (en) * | 1985-07-15 | 1988-09-27 | Vet-Test Partners | Immunoassay method for detection of antibodies and antigens |
| RU2118823C1 (en) * | 1993-07-13 | 1998-09-10 | Лариса Борисовна Логунова | Method of the point solid-phase immunoenzyme analysis of carnivorous plague virus antigen carrying out |
-
2006
- 2006-08-07 RU RU2006128696/13A patent/RU2324187C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4774177A (en) * | 1985-07-15 | 1988-09-27 | Vet-Test Partners | Immunoassay method for detection of antibodies and antigens |
| RU2118823C1 (en) * | 1993-07-13 | 1998-09-10 | Лариса Борисовна Логунова | Method of the point solid-phase immunoenzyme analysis of carnivorous plague virus antigen carrying out |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Выявление циркуляции арбовирусов. Методы вирусологических и серологических исследований. Клинико-эпидемиологические характеристики малоизученных арбовирусных инфекций. Подходы к мониторингу природных очагов арбовирусов. Методические рекомендации. Итоги науки и техники. ВИНИТИ, сер. Вирусология, 1991, т.25, с.30-34. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101513527B (en) | Bivalent inactivated vaccine against gosling plague and goose paramyxovirus disease and preparation method thereof | |
| CN104258386B (en) | A kind of mink viral enteritis inactivated vaccine-canine distemper live vaccine combination | |
| RU2607006C1 (en) | Test strain leptospira of interrogans serogroup icterohaemorrhagiae serovar copenhageni for detection of antibodies to l icterohaemorrhagiae | |
| CN109913396A (en) | A kind of liquid culture medium and the method for separating and culturing Mycoplasma gallisepticum using the same | |
| RU2324187C1 (en) | Method of preparation of samples from associated nidi of plague and arbovirus infections, for serologic tests | |
| CN102004151B (en) | Avian influenza virus H9 subtype hemagglutination inhibition antigen standard substance and preparation method thereof | |
| Hucko | The role of the house fly(Musca domestica L.) in the transmission of Coxiella burnetii. | |
| Gibbs et al. | Differential diagnosis of virus infections of the bovine teat skin by electron microscopy | |
| RU2416429C2 (en) | Method for producing antigen preparation of l-brucellas | |
| RU2193061C1 (en) | Nutrient medium for tuberculosis mycobacterium culturing (mbt-broth) | |
| RU2802251C1 (en) | Vaccine composition for the prevention of enzootic abortion in sheep | |
| CN111057683A (en) | Virus diluent for chick embryo inoculation and preparation method and application thereof | |
| CN106546747B (en) | A kind of detection method of interferon biological activity | |
| RU2486916C2 (en) | Method for producing brucellous l-antigen | |
| RU2492452C1 (en) | Method of control of completeness of inactivation of antirabic inactivated vaccine | |
| RU2657430C2 (en) | Method of life-time diagnostics of mycobacteriosis of large cattle | |
| RU2511042C1 (en) | STRAIN OF XH-18 VIRUS OF NUCLEAR POLYHEDROSIS OF COTTON BUDWORM Helicoverpa armigera Hbn, USED TO OBTAIN INSECTICIDE PREPARATION | |
| RU2607369C1 (en) | Method for producing pathogenic biological agent simulators | |
| RU2753972C1 (en) | New multivalent vaccine against human leptospirosis and a method for its production | |
| RU2798283C1 (en) | Chlamydia vnitibp-21 chlamydia abortus strain for the production of immunobiological medicinal products | |
| RU2735869C1 (en) | Method of determining virusocidal action of agents and methods for controlling virus of sacbrood disease | |
| RU2252031C1 (en) | Method for production of immune serum to virulent strain bacillus anthracis antigen | |
| Ellison et al. | Use of antibiotics in the preparation of canine kidney tissue culture vaccines to eliminate leptospiral infection hazards | |
| CN101972473A (en) | Preparation method of live vaccine for gosling plague and live vaccine prepared therefrom | |
| RU2737149C1 (en) | Method for long-term storage of leprosy mycobacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080808 |