RU232306U1 - Планарный электрохимический биочип для выявления онкологических или вирусных заболеваний - Google Patents
Планарный электрохимический биочип для выявления онкологических или вирусных заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- RU232306U1 RU232306U1 RU2024133453U RU2024133453U RU232306U1 RU 232306 U1 RU232306 U1 RU 232306U1 RU 2024133453 U RU2024133453 U RU 2024133453U RU 2024133453 U RU2024133453 U RU 2024133453U RU 232306 U1 RU232306 U1 RU 232306U1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- electrode
- biochip
- aptamer
- oncological
- gold
- Prior art date
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 21
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 13
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 238000005234 chemical deposition Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 11
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 36
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 15
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 8
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- -1 potassium ferricyanide Chemical compound 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 2
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 1
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical class O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000004070 electrodeposition Methods 0.000 description 1
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 1
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N n,n-diethyl-5-iminobenzo[a]phenoxazin-9-amine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=[NH2+])C2=C1 SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 238000004365 square wave voltammetry Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Полезная модель относится к области биотехнологии. Описан планарный электрохимический биочип для выявления онкологических или вирусных заболеваний, состоящий из диэлектрической подложки, на которую нанесены вспомогательный электрод, электрод сравнения и рабочий электрод. Электроды выполнены трехслойными, состоящими из подстилающего медного слоя, на который химическим осаждением нанесено два слоя золота, а на поверхности рабочего электрода иммобилизован ДНК-аптамер, специфичный к заданному белку – биомаркеру заболевания. Техническим результатом является высокая точность результатов измерений, что достигается с помощью двойного золочения поверхности электрода. 8 ил., 1 пр.
Description
Полезная модель относится к области биотехнологии, а именно к электрохимическим биочипам для выявления онкологических или вирусных заболеваний.
Известен электрохимический чип DRP-220AT (DropSens, Испания, dropsens.com), представляющий собой керамическую подложку (3,4×1,0×0,05 см) с нанесенными на нее тремя электродами. Рабочий электрод - золотой; вспомогательный электрод ‒ золотой; электрод сравнения - серебряный. Поверхность рабочего электрода модифицируют ДНК аптамером, специфичным к определяемому аналиту. После этого наносят исследуемый образец на поверхность рабочего электрода и проводят измерения с помощью потенциостата. Для оценки результата определяют изменение электрохимического сигнала на рабочем электроде до и после связывания мишени с модифицированной поверхностью рабочего электрода. Использование данного электрохимического чипа приводит к смещению потенциалов регистрации аналитического сигнала в отрицательную область относительно золотого электрода, что влияет на десорбцию биослоев ДНК-аптамеров и искажает измеряемый сигнал при повторных измерениях и уменьшает воспроизводимость полученных результатов.
Известен патент (WO 2023049324, опубл. 30.03.23г., G01N27/327), в котором описывается сенсор, на котором как минимум один рабочий электрод может быть исполнен из золота, углерода или иного подходящего материала. Для регистрации отклика системы предлагается редокс-активный аптамер, где в качестве редокс-метки заявлен метиленовый синий. Природа сигнала в присутствии аналита связана с изменением дистанции между ней и поверхностью рабочего электрода при образовании комплекса аптамер-лиганд. Примечательно, что, наряду с возможностью использования широкого ряда аптамеров для определения различных целевых объектов, авторы предполагают только «signal-off» механизм. Патент (WO 2023043540 A1, опубл. 23.03.23г., G12Q1/70) раскрывает метод электрохимического определения вирусов, в частности, SARS-CoV-2 в аэрозолях, жидкостях, в т.ч. биологических (кровь, слюна), а также устройство для детекции вирусов и способ его изготовления с использованием молекул специфичного к аналиту аптамера. Субстрат для биораспознающего слоя может быть исполнен из золота методом электроосаждения, напыления и т.п. В качестве редокс-метки предлагается метиленовый синий (или метилтиониния хлорид), но не ограничиваясь на нем, могут быть использованы иные электрохимически-активные метки неорганических, органических функциональных групп и их комбинаций (например, ферроцен). На примере кривых, полученных в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии до и после взаимодействия с мишенью, демонстрировался «signal-off» механизм работы сенсора. Электрохимический аптасенсор для определения фталат-содержащих соединений был представлен в патенте (US 2023288364, опубл. 14.09.2023, B82Y15/00). Слой проводящего материала электрода (Au, C, Pt, графит) предложено покрыть композитом оксида графена c включением НЧ металлов, который в дальнейшем модифицируется аптамером с меткой метиленового синего (предпочтительно), толуидинового синего, Эванса голубого, нильского синего и нейтрального красного. Метод детекции основан на регистрации вольтамперометрических кривых восстановления редокс-активной метки в дифференциально-импульсном режиме до и после инкубации с анализируемой средой. Согласно представленным данным аптасенсор функционировал по «signal-off» механизму. Недостатком данного способа является трудоемкость получения субстратной подложки электрода для модификации аптамером, что влияет на воспроизводимость детекции аналитов. Общим для всех вышеуказанных изобретений недостатком является использование редокс-меченого аптамера, получение которого требует больше временных и финансовых ресурсов, что приводит в конечном счете к удорожанию стоимости анализа. Изначально на этапе синтеза редокс-активного аптамера возникает трудность контроля выхода целевого продукта, что впоследствии может привести к разной интенсивности сигнала от аптасенсоров с иммобилизованным слоем из разных партий меченых аптамеров. В дополнение к вышесказанному, аптамеры с пришитой меткой химически менее стабильны и склонны к постепенной деградации с момента их получения, поэтому количество молекул аптамера с пришитой группой в объеме может уменьшаться. Также редокс-активные метки, не исключая метиленовый синий, заявленный в документе, требуют соблюдения условий хранения и работы, ограничивающих воздействие света. Также известен гомогенный электрохимический биосенсорный метод обнаружения раковых клеток (CN 110243891, опубл. 17.09.2019, G01N27/26), сущность которого заключается в измерении вольтамперных кривых в дифференциально-импульсном режиме редокс-активного соединения, предпочтительно, метиленового синего. Метод заключается в специфическом связывании аптамера, закреплённого на тетраэдре, организованном органическими молекулами, с мишенью в растворе, центрифугировании полученной смеси и отделении супернатанта с его дальнейшим смешением с метиленовым синим. Интенсивность пика окисления его пропорциональна количеству обнаруженных раковых клеток линии A549 рака легкого, осажденных в центрифугате, т.к. в случае их большого количества подавляющее число молекул 3D-аптамера пойдет на взаимодействие с мишенью, а в оставшемся маточном растворе количество данных тетраэдрических структур будет недостаточным для интеркаляции молекул красителя, что приводит к их нахождению в растворе в свободном состоянии и доступности к окислению на поверхности электрода и генерации интенсивного ЭХ сигнала. Таким образом, в данном случае сенсор ITO выступает только в качестве регистрации сигнала от метиленового голубого до и после введения аналита. Отличительной особенностью способа подготовки электрохимической системы является необходимость предварительной процедуры гомогенного связывания аптамера с аналитом с использованием в процессе подготовки дополнительного лабораторного оборудования, что затрудняет использование сенсора непосредственно на месте забора пробы.
Известен мультиплексный биочип для выявления опухолеассоциированных белков-биомаркеров рака легкого, который содержит подложку с нанесенными на нее шестью измерительными электродами (Патент РФ 182822, опубл. 04.09.2018г., C12Q1/68), выбранный в качестве прототипа. Кроме измерительных электродов на подложке выполнены один вспомогательный электрод и один электрод сравнения. На рабочую поверхность каждого из измерительных электродов нанесен ряд ДНК-аптамеров, специфичных к биомаркерам рака легкого. Каждый измерительный электрод, нанесенный на подложку мультиплексного электрохимического биочипа, может быть выполнен трехслойным, состоящим из медного, никилевого и золотого слоев с линейными размерами около 11×35 мм, нанесенных с помощью плоттера на поверхность из текстолита.
С помощью описанного биочипа невозможно проводить точные измерения аналитического сигнала для анализируемого образца, отвечающего за распознавание целевого аналита при выявлении онкологических и вирусных заболеваний. Это связано с тем, что из никелевого слоя происходит высвобождение заряженных ионов на поверхность золотого электрода с нанесенными аптамерами. В результате этого на рабочем электроде возникает электрохимическая коррозия, которая препятствует стабильности результатов измерения. Это может привести к неверной интерпретации результатов анализа и повлиять на точность постановки диагноза онкологических и вирусных заболеваний.
Вторым недостатком аналога является отсутствие возможности его многократного использования, что также связано с возникновением электрохимической коррозии при повторном использовании электрода и неустойчивостью электрохимического сигнала.
Задачей заявленной полезной модели является повышение точности измерений для диагностики онкологических и вирусных заболеваний за счет того, что на рабочем электроде не возникает электрохимической коррозии, приводящей к нестабильности аналитического сигнала.
Поставленная задача достигается формированием однородного слоя золота на поверхности электродов, за счет двойного химического нанесения, причем повторное нанесение является последним этапом изготовления чипа и производится после покрытия чипа слоем изолирующего полимерного диэлектрика.
Предлагаемый биочип отличается от прототипа тем, что:
вместо слоя никеля используется золото, нанесенное в два слоя, что обеспечивает достаточную толщину золота (от 0,6 ± 0,2 мкм до 1,0 ± 0,2 мкм) для блокирования выхода на поверхность меди из подстилающего слоя подложки электрода и ее влияния на электрохимические измерения;
сформирована однородная поверхность электродов за счет уменьшения дефектов благодаря двойному золочению, пригодная для эффективной посадки аптамеров с уменьшением времени сорбции тиолированных аптамеров до 1 часа по сравнению с 12 часами у аналога;
возможно многократное использование биочипа при дополнительной электрохимической очистке поверхности электрода от аналита и аптамеров после измерения;
повторное золочение обеспечивает антикоррозионную устойчивость поверхности.
Электрохимическая очистка электродов для многократного использования является стандартной процедурой и заключается в том, что на рабочий электрод подается отрицательный потенциал величиной около -1,0 В относительно золотого электрода сравнения в щелочной среде при рН от 8 до 9 в течение от 1 до 5 минут.
Схема ПЗЭ с одним рабочим электродом представлена на фиг. 1. ПЗЭ состоит из диэлектрической подложки (1), на которую нанесен один рабочий электрод (РЭ) (2), один вспомогательный (3) и один электрод сравнения (4), изолирующий полимерный диэлектрический слой (5). На поверхности рабочего электрода иммобилизован ДНК-аптамер (6), специфичный к заданному белку - биомаркеру конкретного заболевания. Электроды выполнены трехслойными, состоящими из подстилающего медного слоя (7), на который химическим осаждением нанесено два слоя золота (8, 9). Вспомогательный электрод необходим для обеспечения возникновения тока на измерительных электродах, электрод сравнения необходим для измерения потенциала, происходящих на РЭ окислительно-восстановительных реакций.
На фиг. 2 внешний вид электрохимической ячейки при работе в 5-6 мл объеме раствора (а); в 150 мкл капле раствора (б). Линейные размеры подложки составляют около 14×24 мм, диаметр рабочего электрода около 2 мм, ширина вспомогательного электрода и электрода сравнения около 2 мм. Рабочий электрод модифицируется одним видом аптамера, специфичным к рецептор-связывающему домену (RBD) спайкового S-белка вируса SARS-CoV-2 или к белкам-биомаркерам раком легкого.
В отличие от прототипа, достаточно использовать один вид аптамеров для получения стабильных результатов измерений высокой точности для эффективной диагностики заболеваний.
Таким образом, техническим результатом заявленной полезной модели является высокая точность результатов измерений, что достигается с помощью двойного золочения поверхности электрода.
Модель биочипа является планарным золотым электродом (ПЗЭ) с тремя электродными зонами: рабочий электрод, электрод сравнения и вспомогательный электрод. ПЗЭ изготавливают путем нанесения на твердую подложку, которая может быть керамической, полимерной или текстолитовой, медного слоя по заданной топологии, химического осаждения золота на медные участки, нанесения защитного изолирующего полимерного диэлектрика ракельным методом на места где отсутствуют непосредственно рабочий и вспомогательный электрод и электрод сравнения и их выходы, контактирующие с адаптером измерительного прибора, промывки в щелочном растворе и повторное химическое золочение поверхностей ПЗЭ. Двойное золочение электродов предотвращает диффузию ионов меди в двойной электрический слой, сохраняя плотность иммобилизованного слоя ДНК-аптамера. Двойное золочение позволяет так же упростить процедуру подготовки ПЗЭ перед нанесением аптамера. В отличие от прототипа перед нанесением аптамера на рабочую зону впервые предложен щадящий режим очистки поверхности электрода вольтамперометрическим способом путем анодного циклирования в рабочем окне потенциалов относительного золотого электрода сравнения в разбавленных растворах серной или азотной кислот. Не используется агрессивный раствор пираньи (состоит из 3-х частей концентрированной серной кислоты и 1 части концентрированной перекиси водорода), вызывающий формирование продуктов коррозии меди на рабочей поверхности ПЗЭ.
После очистки электрод промывают очищенной водой и высушивают в токе азота. На рабочую поверхность ПЗЭ наносят один или несколько аптамеров для конкретного заболевания в зависимости от количества РЭ, модифицированных тиоловой группой и инкубируют не менее 1 часа при температуре 4°С во влажной камере. Затем ПЗЭ промывают фосфатным буфером и оставляют с каплей фосфатного буфера на рабочей поверхности до востребования, не допуская высыхания поверхности. В результате получают ПЗЭ с РЭ, покрытыми аптамерами, специфичными к биомаркерам онкологических или вирусных заболеваний.
Электрохимический биочип для выявления онкологических или вирусных заболеваний работает следующим образом. Биочип устанавливают в адаптер потенциостата и наносят каплю буфера (объем до 200 мкл) для измерений, содержащий смесь солей железосинеродистого калия и железистосинеродистого калия (ГЦФ), и измеряют анодный вольтамперометрический сигнал в рабочем окне потенциалов относительно золотого электрода. Далее биочип извлекают, промывают и наносят на рабочую поверхность ПЗЭ биоматериал, содержащий специфический биомаркер, и выдерживают его на рабочей поверхности ПЗЭ 30 минут, смывают фосфатным буфером и вновь измеряют электрохимические сигналы. По изменению электрохимического сигнала окисления ГЦФ на поверхности биочипа судят о наличии искомых биомаркеров в биологическом материале.
Таким образом, биочип с двойным золочением позволяет увеличить точность результатов измерений, сократить время подготовки биочипов и их количество при постановке диагноза онкологических и вирусных заболеваний. Пример использования устройства приведен ниже:
Определение рака легкого и SARS-CoV-2 в биоматериале с помощью биочипа. Контроль работоспособности биочипа заключается в регистрации сигнала окисления ГЦФ в фосфатном буферном растворе (ФБР) с рН 7,4 относительно золотого электрода методом дифференциальной импульсной вольтамперометрии (ДИВА) до модификации аптамером ПЗЭ и после нее. Рассчитывают уменьшение токов ГЦФ ПЗЭ в процентах до и после модификации аптамером по трем усредненным результатам, как коэффициент , по формуле [Anastasiia V. Shabalina , Darya O. Sharko , Yury E. Glazyrin, Elena A. Bolshevich, Oksana V. Dubinina, Anastasiia M. Kim, Dmitry V. Veprintsev, Ivan N. Lapin, Galina S. Zamay, Alexey V. Krat, Sergey S. Zamay, Valery A. Svetlichnyi, Anna S. Kichkailo and Maxim V. Berezovski. Development of Electrochemical Aptasensor for Lung Cancer Diagnostics in Human Blood // Sensors 2021, 21, 7851. https://doi.org/10.3390/s21237851]
, (1)
где - уменьшение тока окисления ГЦФ, %;
- средние значения интенсивностей токов окисления ГЦФ для трех ПЗЭ после иммобилизации аптамера, А;
- средние значения интенсивностей токов окисления ГЦФ для трех чистых немодифицированных ПЗЭ, А.
Первоначально регистрируют токи окисления ГЦФ для трех не модифицированных аптамером ПЗЭ, усредняют значения токов и получают . Далее проводят процедуру модификации трех ПЗЭ аптамерами, регистрируют токи окисления ГЦФ, усредняют значения токов и получают . Рассчитывают по формуле (1). Работоспособность биочипа считается удовлетворительной в случае изменения токов окисления ГЦФ () на 50±20%. Пример использования биочипа с аптамером 17 представлен на фиг. 3. (фиг. 3 А - ДИВА ГЦФ до и после модификации ПЗЭ аптамером Apt17; Б – изменение средних значений интенсивностей токов окисления ГЦФ ПЗЭ до и после модификации аптамером Apt17).
Методика определения содержания биомаркеров в пробе заключается в регистрации сигнала окисления ГЦФ относительно золотого электрода сравнения методом ДИВА до и после нанесения испытуемой пробы (плазма крови человека, модельный раствор белка RBD, слюна человека и т.д.) на рабочую зону биочипа с аптамером. В случае определения рака легкого используют биочип, модифицированный аптамером Apt17. В случае определения SARS-CoV-2 используют биочип, модифицированный аптамером Apt53.
В случае определения рака легкого человека пробы считают положительными, если наблюдается изменение токов окисления ГЦФ на 10% и более после связывания аптамера Apt17 c целевыми компонентами испытуемой пробы по сравнению с биочипом.
В случае определения SARS-CoV-2 пробы считают положительными, если наблюдается изменение токов окисления ГЦФ на 10% и более после связывания аптамера Apt53 c RBD белком испытуемой пробы по сравнению с биочипом.
ДИВА ГЦФ до и после иммобилизации белка RBD с концентрацией 2.2 мкг/мл на биочипе с Apt53 представлен на фиг. 4. для первой съемки составила 23%. (фиг. 4, А – ДИВА ГЦФ до (1) и после модификации аптамером Apt 53 ПЗЭ (2), после нанесения пробы белка RBD с концентрацией 0.0022 мг/мл (3); Б – Изменение средних значений интенсивностей токов окисления ГЦФ для не модифицированного ПЗЭ (1), модифицированного Apt 53 (2) и после нанесения пробы (3).
На фиг. 5 представлен макет чертежа ПЗЭ, использованного в примерах, где 1 – текстолитовая подложка, 2 – рабочий электрод, 3 – вспомогательный электрод, 4 – электрод сравнения, 5 – полимерный изолирующий диэлектрический слой.
Claims (1)
- Планарный электрохимический биочип для выявления онкологических или вирусных заболеваний, состоящий из диэлектрической подложки, на которую нанесены вспомогательный электрод, электрод сравнения и рабочий электрод, выполненные трехслойными, состоящими из подстилающего медного слоя, на который химическим осаждением нанесено два слоя золота, а на поверхности рабочего электрода иммобилизован ДНК-аптамер, специфичный к заданному белку – биомаркеру заболевания.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU232306U1 true RU232306U1 (ru) | 2025-03-06 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU179185U1 (ru) * | 2016-12-30 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Институт химии и химических технологий" Сибирского Отделения Российской академии наук - обособленное подразделение ФИЦ КНЦ СО РАН | Мультиплексная система для диагностики онкологических заболеваний |
| RU182822U1 (ru) * | 2016-12-30 | 2018-09-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук - обособленное подразделение ФИЦ КНЦ СО РАН | Мультиплексный электрохимический биочип для выявления опухолеассоциированных белков-биомаркеров рака легкого |
| WO2021030517A1 (en) * | 2019-08-15 | 2021-02-18 | University Of Cincinnati | Electrochemical aptamer-based sensors on nanoporous gold |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU179185U1 (ru) * | 2016-12-30 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Институт химии и химических технологий" Сибирского Отделения Российской академии наук - обособленное подразделение ФИЦ КНЦ СО РАН | Мультиплексная система для диагностики онкологических заболеваний |
| RU182822U1 (ru) * | 2016-12-30 | 2018-09-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук - обособленное подразделение ФИЦ КНЦ СО РАН | Мультиплексный электрохимический биочип для выявления опухолеассоциированных белков-биомаркеров рака легкого |
| WO2021030517A1 (en) * | 2019-08-15 | 2021-02-18 | University Of Cincinnati | Electrochemical aptamer-based sensors on nanoporous gold |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Wang W. et al. Aptamer biosensor for protein detection using gold nanoparticles.Analytical Biochemistry. 2008. V.373(2), P. 213-219. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Electrochemical sensor for simultaneous determination of uric acid, xanthine and hypoxanthine based on poly (bromocresol purple) modified glassy carbon electrode | |
| Duan et al. | A CRISPR-Cas12a powered electrochemical sensor based on gold nanoparticles and MXene composite for enhanced nucleic acid detection | |
| Choukairi et al. | Electrochemical detection of uric acid and ascorbic acid: Application in serum | |
| Wu et al. | Label-free detection of DNA using a light-addressable potentiometric sensor modified with a positively charged polyelectrolyte layer | |
| US6063259A (en) | Microfabricated thick-film electrochemical sensor for nucleic acid determination | |
| US10852274B2 (en) | Differential circuit for background correction in electrochemical measurements | |
| KR20170065015A (ko) | 헤모글로빈 측정용 전기화학센서 및 그 제조방법 | |
| CN113866235B (zh) | 一种基于封闭式双极电极的电化学发光-比色双模式传感检测装置及其构建方法和应用 | |
| EP2359146A1 (en) | Non-enzymatic electrochemical method for simultaneous determination of total hemoglobin and glycated hemoglobin | |
| Siciliano et al. | Development of an MIP based electrochemical sensor for TGF-β1 detection and its application in liquid biopsy | |
| CN112378971B (zh) | 一种CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器及其应用 | |
| Evtugyn et al. | Potentiometric DNA sensor based on electropolymerized phenothiazines for protein detection | |
| Erdem et al. | Voltammetric detection of miRNA hybridization based on electroactive indicator-cobalt phenanthroline | |
| Wei et al. | An electrochemical biosensor for detection of PML/RARA fusion gene using capture probe covalently immobilized onto poly-calcon carboxylic acid modified glassy carbon electrode | |
| Bilge et al. | Electrochemical sensor for the analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the presence of cytosine using pencil graphite electrode | |
| RU232306U1 (ru) | Планарный электрохимический биочип для выявления онкологических или вирусных заболеваний | |
| Abbaspour et al. | A cyclodextrin host–guest recognition approach to a label-free electrochemical DNA hybridization biosensor | |
| KR20140110795A (ko) | 산화환원 순환을 이용한 바이오센서 스트립 | |
| Kalakonda et al. | Biosensors-An Insight into the Electrochemical and Optical Biosensors. | |
| CA2401830A1 (en) | Quantification of target moleclues present in a liquid | |
| Jiang et al. | Performance of an amperometric biosensor for the determination of hemoglobin | |
| JPH04118554A (ja) | 電気化学的酵素測定方法およびバイオセンサ | |
| US20080251393A1 (en) | Electrochemical sensor, kit comprising said sensor and process for the production thereof | |
| González-López et al. | Genosensor on gold films with enzymatic electrochemical detection of a SARS virus sequence | |
| Wang et al. | Selective determination of uric acid in the presence of ascorbic acid using a penicillamine self-assembled gold electrode |