RU2322499C2 - Method of preparing immobilized biocatalyst and biocatalyst for production of alcohol-containing drinks - Google Patents
Method of preparing immobilized biocatalyst and biocatalyst for production of alcohol-containing drinks Download PDFInfo
- Publication number
- RU2322499C2 RU2322499C2 RU2006113768/13A RU2006113768A RU2322499C2 RU 2322499 C2 RU2322499 C2 RU 2322499C2 RU 2006113768/13 A RU2006113768/13 A RU 2006113768/13A RU 2006113768 A RU2006113768 A RU 2006113768A RU 2322499 C2 RU2322499 C2 RU 2322499C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biocatalyst
- immobilized
- cells
- alcohol
- yeast
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 154
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 154
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 152
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 63
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 40
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 36
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims abstract description 28
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims abstract description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 47
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 36
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 36
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 23
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 abstract description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 62
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 34
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 33
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 28
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 16
- 239000000495 cryogel Substances 0.000 description 15
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 14
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 10
- 235000019993 champagne Nutrition 0.000 description 10
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 6
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 6
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 6
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 6
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000020095 red wine Nutrition 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 235000019674 grape juice Nutrition 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 235000015040 sparkling wine Nutrition 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 235000020097 white wine Nutrition 0.000 description 5
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- YCCILVSKPBXVIP-UHFFFAOYSA-N 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol Chemical compound OCCC1=CC=C(O)C=C1 YCCILVSKPBXVIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000750042 Vini Species 0.000 description 4
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 4
- 229940099690 malic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 4
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 3
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 3
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 3
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 3
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 3
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 3
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 102200129509 rs186996510 Human genes 0.000 description 3
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 3
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 241000093727 Berzelia alopecuroides Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011552 Rhamnus crocea Nutrition 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000020094 liqueur Nutrition 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000015096 spirit Nutrition 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000000724 Berberis vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical compound OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000581835 Monodora junodii Species 0.000 description 1
- 239000011837 N,N-methylenebisacrylamide Substances 0.000 description 1
- 244000171263 Ribes grossularia Species 0.000 description 1
- 235000002357 Ribes grossularia Nutrition 0.000 description 1
- 241000235072 Saccharomyces bayanus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001042 autoregulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013124 brewing process Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 235000019985 fermented beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical class [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Catalysts (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к пищевой биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе клеток дрожжей, включенных в матрицу гелевого носителя, с помощью которых осуществляют сбраживание различных сред для получения спиртосодержащих напитков.The invention relates to food biotechnology, specifically to immobilized biocatalysts based on yeast cells included in a matrix of a gel carrier, with the help of which fermentation of various media is carried out to obtain alcohol-containing drinks.
Использование клеток дрожжей в иммобилизованном состоянии позволяет использовать многократно одни и те же клетки микроорганизмов и, таким образом, избежать необходимости решения проблемы постоянной утилизации накапливающейся биомассы. К тому же, применение клеток дрожжей в иммобилизованном виде позволяет повысить их устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов (высокие концентрации накапливающегося спирта, сильное закисление среды и др.), обеспечить более длительное и эффективное проведение процесса с их участием, упростить удаление дрожжевого осадка и улучшить показатели готовой продукции
Главными характеристиками любого способа получения биокатализатора на основе иммобилизованных живых клеток являются длительность и условия подготовки биомассы к иммобилизации и получения самого биокатализатора.The main characteristics of any method for producing a biocatalyst based on immobilized living cells are the duration and conditions of preparing the biomass for immobilization and obtaining the biocatalyst itself.
Основными характеристиками любого иммобилизованного биокатализатора для приготовления спиртосодержащих напитков являются его бродильная активность и период полуинактивации в процессе его эксплуатации и хранения. Бродильную активность иммобилизованных клеток оценивают по максимальной концентрации спирта (г/л), которая накапливается в сбраживаемой среде при оптимальной концентрации гранул биокатализатора, при производстве вин и пива, и по максимальному давлению углекислого газа (МПа) - при производстве игристых напитков.The main characteristics of any immobilized biocatalyst for the preparation of alcohol-containing drinks are its fermentation activity and the half-inactivation period during its operation and storage. The fermentation activity of immobilized cells is estimated by the maximum alcohol concentration (g / l), which accumulates in the fermented medium at the optimal concentration of biocatalyst granules, in the production of wines and beer, and by the maximum pressure of carbon dioxide (MPa) in the production of sparkling drinks.
Периодом полуинактивации считается отрезок времени, в течение которого иммобилизованный биокатализатор теряет половину своей исходной метаболической активности при его многократном использовании или длительном хранении.The half-inactivation period is considered to be the length of time during which the immobilized biocatalyst loses half of its initial metabolic activity during its repeated use or long-term storage.
Эти основные характеристики способов получения биокатализаторов и самих биокатализаторов используются для их сравнительного анализа.These main characteristics of the methods for producing biocatalysts and the biocatalysts themselves are used for their comparative analysis.
Среди известных способов иммобилизации дрожжей, разработанных с целью получения биокатализаторов для производства спиртосодержащих напитков, наибольшее распространение получили методы включения дрожжей в матрицы гелевых носителей. При этом в качестве носителей чаще всего используются гели природных полимеров: К-каррагинана и Са-альгината.Among the known methods for the immobilization of yeast, developed with the aim of obtaining biocatalysts for the production of alcohol-containing drinks, the most widely used methods are the inclusion of yeast in the matrix of gel carriers. At the same time, the gels of natural polymers: K-carrageenan and Ca-alginate are most often used as carriers.
Согласно способу получения биокатализатора на основе К-каррагинанового геля [патент US № 6,217,916 (2001) Immobilized-cell carrageenan bead production and a brewing process utilizing carrageenan bead immobilized yeast cells; кл. С 12 С 011/07], биомассу дрожжей смешивают с 3% раствором К-каррагинана в 1,5 г/л растворе KCl, полученную смесь нагревают до 40°С при постоянном перемешивание и по каплям вносят в стерильное растительное масло. Далее систему быстро охлаждают до 5°С и добавляют равный объем стерильного раствора KCl (22 г/л), необходимого для затвердевания гранул биокатализатора. Полученную смесь оставляют расслаиваться, а затем верхнюю органическую фазу удаляют и проводят промывку гранул биокатализатора несколько раз тем же раствором KCl до полного отсутствия масла на поверхности гранул. Общее время получения биокатализатора не определено.According to a method for producing a biocatalyst based on a K-carrageenan gel [US Pat. No. 6,217,916 (2001) Immobilized-cell carrageenan bead production and a brewing process utilizing carrageenan bead immobilized yeast cells; class C 12 C 011/07], the yeast biomass is mixed with a 3% solution of K-carrageenan in a 1.5 g / l KCl solution, the resulting mixture is heated to 40 ° C with constant stirring and dropwise added to sterile vegetable oil. Then the system is quickly cooled to 5 ° C and an equal volume of a sterile KCl solution (22 g / l) is added, which is necessary for the hardening of the biocatalyst granules. The resulting mixture was allowed to delaminate, and then the upper organic phase was removed and the granules of the biocatalyst were washed several times with the same KCl solution until there was no oil on the surface of the granules. The total time to obtain the biocatalyst is not defined.
Иммобилизованный биокатализатор, полученный согласно этому способу, предназначен для получения пива. При проведении сбраживания пивного сусла в течение 22 ч с использованием этого биокатализатора накапливается максимальная концентрация спирта - 50,9 г/л.The immobilized biocatalyst obtained according to this method is intended to produce beer. When fermenting beer wort for 22 hours using this biocatalyst, the maximum alcohol concentration is accumulated - 50.9 g / l.
Несмотря на простоту данного способа получения иммобилизованного биокатализатора к его недостаткам следует отнести необходимость применения повышенной температуры (40°С) и последующего резкого охлаждения системы, отрицательно сказывающихся на жизнеспособности дрожжевых клеток. К недостаткам самого биокатализатора согласно данным авторов разработки следует отнести низкую механическую прочность К-каррагинанового геля и постепенное его растворение в отсутствие избытка ионов калия в среде, сопровождающееся существенным увеличением числа выходящих из носителя клеток. Появление свободных клеток в среде и остатков постепенно разрушающегося носителя создают проблему, связанную с необходимостью их удаления из продукта брожения.Despite the simplicity of this method of obtaining an immobilized biocatalyst, its disadvantages include the need to use an elevated temperature (40 ° C) and subsequent sharp cooling of the system, which negatively affects the viability of yeast cells. The disadvantages of the biocatalyst itself, according to the authors of the development, are the low mechanical strength of the K-carrageenan gel and its gradual dissolution in the absence of excess potassium ions in the medium, accompanied by a significant increase in the number of cells leaving the carrier. The appearance of free cells in the medium and the remains of a gradually degrading carrier create a problem associated with the need to remove them from the fermentation product.
Известен способ получения иммобилизованного биокатализатора на основе Са-альгинатного геля [патент UA № 14902 (1997) Спосiб виробництва iгристого вина пляшкоим методом; кл. C12G 1/06], согласно которому дрожжи Saccharomyces cerevisiae раса Шампанская-83 или S.bayanus раса Севастопольская-23 культивируют в аэробных условиях при 16°С в течение 72 ч на шампанском виноматериале с добавлением тиражного ликера, содержащем суммарно 22 г/л сахарозы. Затем биомассу концентрируют и смешивают с 5%-ным водным раствором альгината натрия в пропорции 1:9. Полученную смесь вносят по каплям в 2%-ный раствор CaCl2, при этом соотношение объема вводимой смеси и осадителя составляет 1:3. Гранулы выдерживают в осадителе как минимум 2 ч, после чего их промывают дистиллированной водой. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 80 ч.There is a method of obtaining an immobilized biocatalyst based on Ca-alginate gel [patent UA No. 14902 (1997) Method for the production of sparkling wine in a danceable manner; class C12G 1/06], according to which the yeast Saccharomyces cerevisiae race Champagne-83 or S. bayanus race Sevastopol-23 is cultivated under aerobic conditions at 16 ° C for 72 hours on champagne wine material with the addition of circulation liquor containing a total of 22 g / l sucrose . Then the biomass is concentrated and mixed with a 5% aqueous solution of sodium alginate in a ratio of 1: 9. The resulting mixture was added dropwise to a 2% solution of CaCl 2 , while the ratio of the volume of the introduced mixture and precipitant was 1: 3. The granules are kept in the precipitator for at least 2 hours, after which they are washed with distilled water. The total time for obtaining the immobilized biocatalyst is 80 hours
Иммобилизованный биокатализатор, полученный по этому способу, предназначен для получения игристых вин. При проведении сбраживания шампанского виноматериала с добавлением тиражного ликера в течение 40 сут с использованием этого биокатализатора в бутылках накапливается максимальное давление углекислого газа - 0,48 МПа (концентрация спирта неизвестна).The immobilized biocatalyst obtained by this method is designed to produce sparkling wines. When fermenting champagne wine material with the addition of circulation liquor for 40 days using this biocatalyst, the maximum pressure of carbon dioxide is accumulated in bottles - 0.48 MPa (alcohol concentration is unknown).
Среди ряда очевидных недостатков этого способа получения иммобилизованного биокатализатора следует выделить:Among the number of obvious disadvantages of this method of obtaining an immobilized biocatalyst should be highlighted:
- выбор условий подготовки клеток к иммобилизации, а именно используется питательная среда (шампанский виноматериал), содержащая этиловый спирт, сильно ингибирующий рост дрожжей и, как следствие этого, в способе предусматривается большая продолжительность процесса культивирования клеток с целью накопления необходимой биомассы;- the choice of conditions for preparing cells for immobilization, namely, a nutrient medium (champagne wine material) is used that contains ethanol that strongly inhibits the growth of yeast and, as a result, the method provides for a longer duration of the cell cultivation process in order to accumulate the necessary biomass;
- присутствие фосфат-ионов в сбраживаемом с помощью иммобилизованного биокатализатора виноматериале приводит к выходу ионов Са2+ из структуры Са-альгината и образованию нерастворимых осадков фосфатов кальция в среде. Как следствие этого, происходит разрушение матрицы носителя, выход клеток из гранул биокатализатора и помутнение конечного продукта. Необходимость удаления свободных клеток и появляющихся осадков значительно ухудшает технологичность процесса в целом и ведет к его удорожанию.- the presence of phosphate ions in the wine material fermented with an immobilized biocatalyst leads to the release of Ca 2+ ions from the structure of Ca-alginate and the formation of insoluble precipitates of calcium phosphates in the medium. As a result of this, the matrix of the carrier is destroyed, the cells exit the granules of the biocatalyst and the turbidity of the final product. The need to remove free cells and the resulting precipitation significantly worsens the processability of the process as a whole and leads to its cost increase.
Для предотвращения выхода клеток из матрицы носителя и помутнений продуктов брожения иммобилизованные биокатализаторы на основе Са-альгинатных гелей покрывают дополнительным слоем того же геля, не содержащим клеток. Так известен способ [US Patent 6,033,887 (2000) Degidrated polysaccharide gel containing microorganisms, a sugar and a polyol for producting fermented drinks; кл C12N 11/10; C12N 1/04; C12G 1/00; С12С 11/00], согласно которому получают иммобилизованный биокатализатор с двойным слоем Са-альгинатного геля. Биомассу дрожжей, полученную при культивировании в течение 96 ч на виноматериале с 50 г/л сахара при 16°С, смешивают с 1,5%-ным раствором альгината натрия, полученную смесь по каплям вводят в раствор 0,2 М CaCl2 (рН 7). После 45 мин экспозиции гранул в растворе CaCl2 их промывают дистиллированной водой и вновь помещают в 11,5%-ный раствор альгината натрия, с последующим переносом в водный раствор CaCl2 (200 г/л). Полученные гранулы выдерживают 15 мин в растворе хлорида кальция, затем промывают водой и помещают на хранение в водный раствор винной кислоты с концентрацией 0,5 г/л при 4°С. Общее время получения биокатализатора составляет 110 ч.To prevent the exit of cells from the matrix of the carrier and turbidity of fermentation products, immobilized biocatalysts based on Ca-alginate gels are coated with an additional layer of the same gel that does not contain cells. This is a known method [US Patent 6,033,887 (2000) Degidrated polysaccharide gel containing microorganisms, a sugar and a polyol for producting fermented drinks; CL C12N 11/10; C12N 1/04; C12G 1/00; C12C 11/00], according to which an immobilized biocatalyst with a double layer of Ca-alginate gel is prepared. The yeast biomass obtained by culturing for 96 h on wine material with 50 g / l sugar at 16 ° C is mixed with a 1.5% sodium alginate solution, the resulting mixture is added dropwise to a solution of 0.2 M CaCl 2 (pH 7). After 45 minutes of exposure of the granules in a CaCl 2 solution, they are washed with distilled water and again placed in an 11.5% sodium alginate solution, followed by transfer to an aqueous CaCl 2 solution (200 g / l). The obtained granules are incubated for 15 min in a solution of calcium chloride, then washed with water and stored in an aqueous solution of tartaric acid with a concentration of 0.5 g / l at 4 ° C. The total production time of the biocatalyst is 110 hours
Иммобилизованный биокатализатор, полученный по этому способу, предназначен для получения игристых вин. При проведении сбраживания шампанского виноматериала с добавлением тиражного ликера в течение 42 сут с использованием этого биокатализатора в бутылках накапливается максимальная концентрация спирта - 21 г/л.The immobilized biocatalyst obtained by this method is designed to produce sparkling wines. During the fermentation of champagne wine material with the addition of circulation liqueur for 42 days using this biocatalyst, the maximum concentration of alcohol accumulates in bottles - 21 g / l.
Такой способ получения иммобилизованного биокатализатора характеризуется высокими расходами полимера и еще большей длительностью всего процесса получения биокатализатора в целом, чем в предыдущем способе.This method of obtaining an immobilized biocatalyst is characterized by high polymer consumption and an even longer duration of the whole process of obtaining a biocatalyst as a whole than in the previous method.
Основным недостатком самого биокатализатора, получаемого по этому способу, является то, что второй Са-альгинатный слой, не содержащий клеток, в значительной степени приводит к ухудшению массообменных процессов внутри гранул с иммобилизованными клетками, осложняется доступ субстрата и выход метаболитов, что отрицательно сказывается на жизнеспособности самих клеток, а также на органолептических характеристиках готового продукта.The main disadvantage of the biocatalyst obtained by this method is that the second cell-free Ca-alginate layer significantly deteriorates the mass transfer processes inside the granules with immobilized cells, access of the substrate and the release of metabolites are complicated, which negatively affects the viability the cells themselves, as well as on the organoleptic characteristics of the finished product.
Следует отметить, что помимо вышеуказанных общим недостатком всех иммобилизованных биокатализаторов на основе гелей природных полимеров является подверженность самой матрицы носителя биодеградации под действием различных микроорганизмов, что требует обязательного использования и хранения таких биокатализаторов в строго стерильных условиях. В связи с этим для иммобилизации дрожжей более привлекательным является использование синтетических носителей, инертных по отношению к продуктам метаболизма дрожжей, к воздействию гидролитических ферментов различных микроорганизмов и характеризующихся более высокой механической прочностью.It should be noted that in addition to the above, a common drawback of all immobilized biocatalysts based on gels of natural polymers is the susceptibility of the biodegradation carrier matrix itself to various microorganisms, which requires the mandatory use and storage of such biocatalysts under strictly sterile conditions. In this regard, for the immobilization of yeast, the use of synthetic carriers inert with respect to the products of yeast metabolism, the effects of hydrolytic enzymes of various microorganisms and characterized by higher mechanical strength is more attractive.
Способ получения иммобилизованного биокатализатора на основе полиакриламидного геля (ПААГ) [Patent FRA № 75 24509 (1977) Precede enzymatique utilisant des microorganismes inclus; кл. С12C 11/14, C12D 1/00, 3/00] предполагает суспендирование при 15°С дрожжевой биомассы, полученной в результате культивирования в течение 48 ч на солодовом сусле, содержащей 50 г/л глюкозы, в 50 мМ фосфатном буфере, в 100 мл которого содержится 8,2 г мономеров (акриламида и N, N-метилен-бис-акриламида). В качестве катализатора сополимеризации используют 200 мг персульфата аммония и 40 мкл N, N-N', N'-тетраметилендиамина. Полимеризация проходит также при 15°С в течение 2-5 минут. Далее полученный гелевый блок, содержащий иммобилизованные клетки, отмывают дистиллированной водой от остатков полимеризационной среды и разрезают на гранулы произвольной формы и размером 2-4 мм. Общее время получения биокатализатора составляет 55 ч.A method for producing an immobilized polyacrylamide gel biocatalyst (PAG) [Patent FRA No. 75 24509 (1977) Precede enzymatique utilisant des microorganismes inclus; class C12C 11/14, C12D 1/00, 3/00] involves suspending at 15 ° C the yeast biomass obtained by culturing for 48 h on malt wort containing 50 g / l glucose in 50 mM phosphate buffer, in 100 ml of which contains 8.2 g of monomers (acrylamide and N, N-methylene-bis-acrylamide). As a copolymerization catalyst, 200 mg of ammonium persulfate and 40 μl of N, N-N ', N'-tetramethylenediamine are used. The polymerization also takes place at 15 ° C for 2-5 minutes. Next, the obtained gel block containing immobilized cells is washed with distilled water from the remnants of the polymerization medium and cut into granules of arbitrary shape and 2-4 mm in size. The total time to obtain the biocatalyst is 55 hours
Иммобилизованный биокатализатор, полученный по этому способу, предназначен для получения вина. При проведении сбраживания виноградного сока в течение 50 ч с использованием этого биокатализатора в вине накапливается максимальная концентрация спирта - 35,7 г/л.The immobilized biocatalyst obtained by this method is designed to produce wine. When fermenting grape juice for 50 hours using this biocatalyst, the maximum concentration of alcohol is accumulated in wine - 35.7 g / l.
Главным недостатком способа получения этого иммобилизованного биокатализатора является токсичность для живых клеток условий формирования полимерной матрицы носителя, так как при инициации сополимеризации одновременно протекает большое число химических реакций как между ингредиентами полимеризационной смеси, так и между компонентами смеси и поверхностью клеток микроорганизмов. В результате модификации подвергается и сама клетка, и свойства гелевой матрицы. Число жизнеспособных клеток в результате такой иммобилизации резко снижается. Гетерогенная пористость матрицы, которая при этом образуется, обеспечивает неравномерное снабжение иммобилизованных клеток субстратом и отвод метаболитов, особенно большие диффузионные проблемы возникают во внутренних областях гелевой матрицы, вследствие чего происходит быстрое отмирание иммобилизованных клеток, локализованных в центральной части гранул биокатализатора.The main disadvantage of the method for producing this immobilized biocatalyst is the toxicity for living cells of the conditions for the formation of the polymer matrix of the carrier, since a large number of chemical reactions simultaneously occur between the ingredients of the polymerization mixture and between the components of the mixture and the surface of microorganism cells when copolymerization is initiated. As a result of the modification, both the cell itself and the properties of the gel matrix are exposed. The number of viable cells as a result of such immobilization is sharply reduced. The heterogeneous porosity of the matrix, which is formed in this case, provides an uneven supply of immobilized cells with a substrate and removal of metabolites, especially large diffusion problems arise in the inner regions of the gel matrix, as a result of which the immobilized cells located in the central part of the biocatalyst granules quickly die off.
Поливиниловый спирт (ПВС), являясь синтетическим полимером тоннажного производства, относится к числу наиболее привлекательных полимеров для получения иммобилизованных клеток микроорганизмов, что обусловлено сочетанием таких его качеств как нетоксичность, высокая химическая и микробиологическая стабильность, высокая пористость, обеспечивающая благоприятные условия для массообменных процессов [В.И.Лозинский. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, 71, (6) 559-585 (2002); Lozinsky V.I., Plieva F.M. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. Enzyme Microb. Technol. 23 (3-4), 227-242 (1998)]. Формирование гелевого носителя происходит при замораживании и последующем оттаивании раствора полимерного гелеобразователя. Отсутствие в среде формирования носителя каких-либо реагентов, токсичных для клеток, позитивно отличает криогель ПВС от полиакриламидного геля.Polyvinyl alcohol (PVA), being a synthetic polymer of tonnage production, is one of the most attractive polymers for producing immobilized microorganism cells, due to a combination of its qualities such as non-toxicity, high chemical and microbiological stability, high porosity, which provides favorable conditions for mass transfer processes [В .I. Lozinsky. Cryogels based on natural and synthetic polymers: production, properties and applications. // Advances in Chemistry, 71, (6) 559-585 (2002); Lozinsky V.I., Plieva F.M. Poly (vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. Enzyme Microb. Technol. 23 (3-4), 227-242 (1998)]. The formation of a gel carrier occurs during freezing and subsequent thawing of a solution of a polymer gelling agent. The absence of any reagents toxic to the cells in the carrier formation medium positively distinguishes PVA cryogel from polyacrylamide gel.
Известен способ получения иммобилизованного биокатализатора для производства спиртосодержащих игристых напитков [патент РФ № 2239658 (2004) Способ получения биокатализатора для производства спиртосодержащих игристых напитков; кл. C12N 11/04; C12G 1/073], согласно которому биомассу дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы Харьковская-39 наращивают в течение 72 ч на бродильной смеси, содержащей 50 г/л сахара. Полученную биомассу отделяют центрифугированием, промывают виноматериалом, суспендируют (10 г) в 11%-ном водном растворе ПВС (90 г) и формируют при -20°С замороженные сферические гранулы диаметром 2 мм с помощью криогранулятора [патент РФ № 2036095 (1992). Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем]. Гранулы после формирования в криогрануляционной установке в среде охлаждающей гидрофобной жидкости (гексана, петролейного эфира, уйтспирита и др.) и выдержки в замороженном состоянии в течение 12 ч размораживают, промывают стерильным физиологическим раствором и далее выдерживают в течение 2 ч при 20°С в виноматериале, содержащем 9,5-11,0 об.% спирта и 0,005 г/л специально введенного ауторегуляторного фактора d-1 (2-(4-гидроксифенил)-этанола), подавляющего рост и, таким образом, предотвращающего выход клеток из гранул биокатализатора. Общее время получения биокатализатора составляет 120 ч.A known method of producing an immobilized biocatalyst for the production of alcohol-containing sparkling drinks [RF patent No. 2239658 (2004) A method for producing a biocatalyst for the production of alcohol-containing sparkling drinks; class C12N 11/04; C12G 1/073], according to which the biomass of yeast Saccharomyces cerevisiae race Kharkovskaya-39 is increased for 72 hours on a fermentation mixture containing 50 g / l sugar. The resulting biomass is separated by centrifugation, washed with wine material, suspended (10 g) in an 11% aqueous PVA solution (90 g) and frozen spherical granules with a diameter of 2 mm are formed at -20 ° C using a cryogranulator [RF patent No. 2036095 (1992). Device for forming spherical granules from a material based on aqueous systems]. Granules after forming in a cryogranulation unit in a cooling hydrophobic liquid medium (hexane, petroleum ether, mineral spirits, etc.) and holding in a frozen state for 12 hours are thawed, washed with sterile saline and then kept for 2 hours at 20 ° C in wine material containing 9.5-11.0 vol.% alcohol and 0.005 g / l of specially introduced autoregulatory factor d-1 (2- (4-hydroxyphenyl) ethanol), which inhibits growth and, thus, prevents cells from escaping from the biocatalyst granules . The total biocatalyst production time is 120 hours.
Иммобилизованный биокатализатор, полученный по этому способу, предназначен для получения шампанского. При проведении сбраживания шампанского виноматериала в течение 30 сут с использованием этого биокатализатора в бутылках накапливается максимальное давление углекислого газа 0,47 МПа, а концентрация спирта составляет 87,4 г/л.The immobilized biocatalyst obtained by this method is designed to produce champagne. When fermenting champagne wine material for 30 days using this biocatalyst, the maximum carbon dioxide pressure of 0.47 MPa is accumulated in bottles and the alcohol concentration is 87.4 g / l.
Однако, несмотря на стабильность криогеля ПВС в средах для брожения и уменьшение количества свободных клеток, присутствующих в готовом шампанском, данный способ имеет ряд существенных недостатков:However, despite the stability of the PVA cryogel in fermentation media and the decrease in the number of free cells present in the finished champagne, this method has several significant disadvantages:
- большая длительность процесса получения биокатализатора, обусловленная, в основном, длительным ростом самой биомассы, необходимой для иммобилизации (72 ч). Использование для наращивания биомассы дрожжей виноматериала, содержащего до 10 об.% этилового спирта, как известно, существенно ингибирующего рост клеток, приводит, с одной стороны, к очень медленному и потому продолжительному по времени накоплению необходимого количества биомассы, а с другой стороны, клетки, выращенные в таких неблагоприятных условиях, быстро теряют свою жизнеспособность в процессе их иммобилизации;- the long duration of the process of obtaining the biocatalyst, due mainly to the prolonged growth of the biomass itself, necessary for immobilization (72 hours). The use of wine material for the growth of yeast biomass containing up to 10 vol.% Ethyl alcohol, which is known to significantly inhibit cell growth, leads, on the one hand, to a very slow and therefore long-term accumulation of the required amount of biomass, and on the other hand, the cells grown in such adverse conditions, quickly lose their viability in the process of their immobilization;
- для реактивации клеток и восстановления их жизнеспособности перед иммобилизацией, согласно способу, дрожжи необходимо обрабатывать свежим виноматериалом, что ведет к расходу самого виноматериала и увеличению общего времени получения биокатализатора;- to reactivate the cells and restore their viability before immobilization, according to the method, the yeast must be processed with fresh wine material, which leads to the consumption of wine material and an increase in the total time for biocatalyst production;
- использование для формирования гранул криогрануляционной установки, заполненной гидрофобной жидкостью с низкой температурой, в которую через раскапывающее устройство вносят суспензию клеток в растворе ПВС, приводит к необходимости последующего тщательного удаления с поверхности гранул гидрофобной пленки, образующейся за счет остаточных количеств гидрофобной жидкости, перекрывающей доступ к иммобилизованным клеткам, находящихся внутри гранул, всех гидрофильных (водных) растворов, в том числе и среды для брожения. Для удаления гидрофобной пленки с поверхности гранул в процессе получения биокатализатора по этому способу специально предусмотрена стадия отмывки гранул физиологическим раствором после их размораживания. Сама стадия увеличивает продолжительность процесса в целом, а в результате образуются сточные воды, содержащие гидрофобную жидкость и подлежащие дополнительной дорогостоящей очистке, что ведет к удорожанию процесса получения биокатализатора в целом. Необходимость использования самой гидрофобной жидкости (гексана, петролейного эфира, уйтспирита и др.), обладающих пожароопасностью и токсичностью для людей, обслуживающих процесс, является серьезным недостатком способа получения биокатализатора с помощью криогрануляционной установки. Такие жидкости требуют особых условий пожарной техники безопасности и вентиляции помещений при работе с ними и их хранении;- the use of a cryogranulation unit filled with a hydrophobic liquid with a low temperature to form granules, into which a suspension of cells in a PVA solution is introduced through a digging device, leads to the need for subsequent careful removal of a hydrophobic film from the surface of the granules, which is formed due to residual quantities of a hydrophobic liquid that blocks access to immobilized cells inside the granules of all hydrophilic (aqueous) solutions, including the medium for fermentation. To remove a hydrophobic film from the surface of the granules in the process of obtaining a biocatalyst according to this method, a stage of washing the granules with physiological saline after defrosting is specially provided. The stage itself increases the duration of the process as a whole, and as a result wastewater is formed containing hydrophobic liquid and subject to additional expensive treatment, which leads to an increase in the cost of the process of obtaining the biocatalyst as a whole. The need to use the most hydrophobic liquid (hexane, petroleum ether, mineral spirits, etc.), which have a fire hazard and toxicity to people serving the process, is a serious drawback of the method of producing a biocatalyst using a cryogranulation unit. Such liquids require special fire safety and ventilation conditions when working with them and storing them;
- для предотвращения выхода иммобилизованных клеток из матрицы носителя их выдерживают 2 ч при 20°С в виноматериале, специально вводя в него d1-фактор (2-(4-гидроксифенил)-этанол). Присутствие последнего в гранулах биокатализатора сохраняется при последующем их использовании в процессах брожения, плюс к тому, d1-фактор диффундирует из объема гранул в среду и остается в готовом продукте, что само по себе негативно сказывается на его органолептических характеристиках;- to prevent the exit of immobilized cells from the matrix of the carrier they are kept for 2 hours at 20 ° C in the wine material, specially introducing the d1-factor (2- (4-hydroxyphenyl) ethanol) into it. The presence of the latter in the biocatalyst granules is preserved during their subsequent use in fermentation processes, plus the d1 factor diffuses from the granule volume into the medium and remains in the finished product, which in itself negatively affects its organoleptic characteristics;
- сама обработка биокатализатора d1-фактором приводит к дополнительным расходам виноматериала и увеличению времени получения готового биокатализатора. Кроме того, дополнительная обработка d1-фактором в указанной концентрации (0,005 г/л) не полностью устраняет проблему выхода клеток из матрицы носителя (свободные клетки присутствуют в готовом продукте в концентрации 5×104 кл/мл), а более высокие концентрации d1-фактора приводят к гибели иммобилизованных дрожжевых клеток;- the processing of the biocatalyst by the d1 factor leads to additional costs of wine material and an increase in the time for obtaining the finished biocatalyst. In addition, additional treatment with the d1-factor at the indicated concentration (0.005 g / l) does not completely eliminate the problem of cell exit from the carrier matrix (free cells are present in the finished product at a concentration of 5 × 10 4 cells / ml), and higher concentrations of d1- factor lead to the death of immobilized yeast cells;
- иммобилизованный биокатализатор, полученный согласно этому способу, может быть использован только для получения игристых напитков.- the immobilized biocatalyst obtained according to this method can only be used to obtain sparkling drinks.
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по типу используемого носителя (ПВС) и предназначению получаемого биокатализатора принято за прототип.This technical solution as the closest to the claimed type of media used (PVA) and the purpose of the resulting biocatalyst is taken as a prototype.
Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного и менее продолжительного способа получения иммобилизованного биокатализатора, а также самого биокатализатора с новыми свойствами, предназначенного для получения более широкого спектра спиртосодержащих напитков.The objective of the invention is to create a more effective and less long-term method of obtaining an immobilized biocatalyst, as well as the biocatalyst itself with new properties, designed to produce a wider range of alcohol-containing drinks.
Поставленная задача решается тем, что биомассу дрожжей, выращенную строго до конца логарифмической фазы роста в течение 12-18 ч на среде, не содержащей этиловый спирт, смешивают с раствором поливинилового спирта, замораживают в среде воздуха при -15÷-80°С, выдерживают при той же температуре в течение 12-16 ч и размораживают при +2÷+10°С так, что готовый биокатализатор имеет следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,15÷0,9 (по сух. массе); повиниловый спирт 10÷15; водная фаза - до 100.The problem is solved in that the yeast biomass grown strictly up to the end of the logarithmic growth phase for 12-18 hours on a medium that does not contain ethanol is mixed with a solution of polyvinyl alcohol, frozen in air at -15 ÷ -80 ° C, and kept at the same temperature for 12-16 hours and thawed at + 2 ÷ + 10 ° C so that the finished biocatalyst has the following composition (in wt.%): yeast biomass 0.15 ÷ 0.9 (by dry weight) ;
Использование питательных сред, не содержащих этанол, позволяет избежать его ингибирующего воздействия на рост клеток дрожжей и существенно сократить время накопления максимального количества биомассы клеток для иммобилизации и, следовательно, значительно сократить длительность всего процесса получения биокатализатора.The use of nutrient-free media containing ethanol avoids its inhibitory effect on the growth of yeast cells and significantly reduces the accumulation time of the maximum amount of cell biomass for immobilization and, therefore, significantly reduces the duration of the entire biocatalyst production process.
Культивирование клеток строго до конца логарифмической фазы роста обеспечивает, с одной стороны, накопление к этому моменту времени в среде необходимого для иммобилизации количества биомассы, а с другой стороны, получение максимально продуктивных клеток.The cultivation of cells strictly up to the end of the logarithmic growth phase ensures, on the one hand, the accumulation of the necessary amount of biomass by this moment of time in the medium, and, on the other hand, the production of the most productive cells.
После выращивания проводят концентрирование (сгущение) биомассы для ее подготовки к включению в матрицу полимерного носителя. Такое концентрирование проводят известными приемами, например центрифугированием.After cultivation, biomass is concentrated (thickened) to prepare it for inclusion in the matrix of the polymer carrier. This concentration is carried out by known methods, for example by centrifugation.
Иммобилизация биомассы осуществляется путем ее суспендирования в растворе ПВС с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) в атмосфере воздуха, а не гидрофобной жидкости, при определенных условиях, что приводит к формированию прочного полимерного криогеля, содержащего включенную в него матрицу клеток дрожжей. В ходе криогенной обработки получаемому биокатализатору может быть придана любая необходимая форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, трубок и др. Для этого суспензия биомассы в растворе гелеобразователя замораживается в соответствующей форме.The biomass is immobilized by suspending it in a PVA solution followed by cryogenic treatment (freezing, keeping in a frozen state and thawing) in an atmosphere of air rather than a hydrophobic liquid, under certain conditions, which leads to the formation of a durable polymer cryogel containing a matrix of cells yeast. During the cryogenic treatment, the resulting biocatalyst can be given any desired shape, in particular the shape of spherical granules, irregularly shaped particles, gel blocks, discs, sheets, tubes, etc. For this, the biomass suspension in the gel-forming solution is frozen in the appropriate form.
Существенным отличием заявляемого изобретения является новое сочетание технологических операций, которое ранее известно не было, а именно: получение для иммобилизации биомассы в строго определенных условиях, обеспечивающих высокую целевую метаболическую активность клеток, а также проведение иммобилизации включением клеток в полимерный криогель в сторогом их соотношении и реализация этого процесса на воздухе при соблюдении определенных условиях формирования криогеля с макропористой структурой, которые обеспечивают надежное удерживание клеток матрицей носителя и позволяют варьировать форму получаемого биокатализатора, предназначенного для производства спиртосодержащих напитков. Изменение заявляемых условий получения биокатализатора (подготовки клеток к иммобилизации, температуры замораживания и размораживания системы "клетки:полимер", время ее выдерживания в замороженном состоянии, а также соотношение между ее компонентами) ведет к ухудшению прочностных характеристик биокатализатора и метаболической активности иммобилизованных клеток.A significant difference of the claimed invention is a new combination of technological operations that was not previously known, namely: obtaining for immobilization of biomass under strictly defined conditions, providing high target metabolic activity of cells, as well as carrying out immobilization by incorporating cells into a polymer cryogel in their ratio and implementation of this process in air under certain conditions of formation of a cryogel with a macroporous structure, which provide reliable retention vanie carrier matrix cells and allow to vary the shape of the resulting biocatalyst for the production of alcohol beverages. Changes in the claimed conditions for obtaining a biocatalyst (preparing cells for immobilization, the temperature of freezing and thawing of the "cell: polymer" system, the time it is kept frozen, and the ratio between its components) leads to a deterioration in the strength characteristics of the biocatalyst and the metabolic activity of immobilized cells.
Вторым объектом изобретения является иммобилизованный биокатализатор, полученный согласно заявляемому способу, для производства различных спиртосодержащих напитков (шампанского, белого и красного вина, пива и др.).The second object of the invention is an immobilized biocatalyst obtained according to the claimed method for the production of various alcohol-containing drinks (champagne, white and red wine, beer, etc.).
Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является способность биокатализатора сбраживать широкий спектр сред, в том числе недоброды, и осуществлять биологическое кислотопонижение сусел, обеспечивая при этом получение принципиально разных спиртосодержащих напитков.A significant technical result of the claimed invention is the ability of the biocatalyst to ferment a wide range of media, including maladies, and to carry out biological acid reduction of the wort, while ensuring the receipt of fundamentally different alcohol-containing drinks.
Заявляемый способ получения биокатализатора обеспечивает максимальное сохранение жизнеспособности иммобилизованных клеток, что позволяет биокатализатору характеризоваться высокой бродильной активностью, а именно продуцировать до 135 г/л этанола и накапливать давление углекислого газа до 0,56 МПа, а также при этом иметь период полуинактивации при хранении в замороженном состоянии 24 месяца, а при многократной эсплуатации - 150 суток.The inventive method for producing a biocatalyst provides maximum preservation of the viability of immobilized cells, which allows the biocatalyst to be characterized by high fermentation activity, namely, to produce up to 135 g / l of ethanol and to accumulate carbon dioxide pressure up to 0.56 MPa, and also have a half-inactivity period when stored in frozen condition 24 months, and with multiple operation - 150 days.
Получаемый биокатализатор имеет макропористую структуру, обеспечивающую благоприятные условия для массообменных процессов, и может быть многократно применен для получения спиртосодержащих напитков.The resulting biocatalyst has a macroporous structure that provides favorable conditions for mass transfer processes, and can be repeatedly used to obtain alcohol-containing drinks.
Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.The following are specific examples of the implementation of the proposed technical solution.
Пример 1. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса Шампанская-39, включенных в криогель ПВС, для получения игристых вин классическим методом.Example 1. Obtaining an immobilized biocatalyst and a biocatalyst based on yeast cells Saccharomyces cerevisiae race Champagne-39, included in the PVA cryogel, to obtain sparkling wines by the classical method.
Дрожжи S.cerevisiae раса Шампанская-39 культивируют строго до конца логарифмической фазы роста в течение 18 ч при 22°С на среде, не содержащей этиловый спирт, следующего состава (г/л): глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 2,0; хлорид натрия - 1,0; сульфат аммония - 2,0; сульфат магния - 1,0; дигидрофосфат калия - 13,5; рН 5,6.Yeast S.cerevisiae race Champanskaya-39 is cultivated strictly until the end of the logarithmic growth phase for 18 hours at 22 ° C on a medium containing no ethyl alcohol, of the following composition (g / l): glucose - 2.5; yeast extract - 2.0; sodium chloride - 1.0; ammonium sulfate - 2.0; magnesium sulfate - 1.0; potassium dihydrogen phosphate - 13.5; pH 5.6.
20 г биомассы дрожжей, полученной после отделения от культуральной жидкости центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин), смешивают с 980 г 15%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе дистиллированной воды, до получения однородной массы. Полученную смесь раскапывают в иммунологические 96-луночные планшеты по 0,2 мл, замораживают при -25°С, выдерживают в замороженном состоянии 16 ч, а затем оттаивают при +2°С и, таким образом, получают биокатализатор с цилиндрической формой гранул, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,17 (по сух. массе); полимер 15; водная фаза - до 100. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 40 ч.20 g of yeast biomass obtained after separation from the culture fluid by centrifugation (10 min, 10,000 rpm) is mixed with 980 g of a 15% PVA solution prepared on the basis of distilled water until a homogeneous mass is obtained. The resulting mixture was digested into immunological 96-well tablets of 0.2 ml, frozen at -25 ° C, kept frozen for 16 hours, and then thawed at + 2 ° C and, thus, a biocatalyst with a cylindrical shape of granules having the following composition (in wt.%): yeast biomass 0.17 (dry weight); polymer 15; the aqueous phase is up to 100. The total time for obtaining the immobilized biocatalyst is 40 hours
Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для получения игристых вин. При проведении сбраживания в течение 28 сут шампанского виноматериала с добавлением тиражного ликера, содержащего суммарно 25 г/л сахара и 98 г/л спирта, с использованием этого биокатализатора в бутылках накапливается дополнительно 23 г/л спирта (таким образом, общая концентрация спирта составляет в конце брожения - 121 г/л), а давление углекислого газа составляет 0,56 МПа. При микроскопировании образцов шампанского, полученного после брожения, концентрация свободных клеток составляет 50 кл/мл.The resulting immobilized biocatalyst is designed to produce sparkling wines. During the fermentation for 28 days of champagne wine material with the addition of circulation liqueur containing a total of 25 g / l of sugar and 98 g / l of alcohol, using this biocatalyst, an additional 23 g / l of alcohol accumulates in bottles (thus, the total alcohol concentration is end of fermentation - 121 g / l), and the pressure of carbon dioxide is 0.56 MPa. Microscopic examination of champagne samples obtained after fermentation, the concentration of free cells is 50 cells / ml.
Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 18 месяцев.The half-inactivation period of such a biocatalyst when stored in the frozen state is 18 months.
Пример 2. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей Saccharomyces vini, включенных в криогель ПВС, для получении белых вин.Example 2. Obtaining an immobilized biocatalyst and a biocatalyst based on Saccharomyces vini yeast cells included in the PVA cryogel to obtain white wines.
Дрожжи Saccharomyces vini 47-K культивируют строго до конца логарифмической фазы роста в течение 17 ч при 26°С на среде, не содержащей этанола, а именно на пивном сусле с концентрацией сухих веществ 10%.The yeast Saccharomyces vini 47-K is cultured strictly until the end of the logarithmic growth phase for 17 hours at 26 ° C in an ethanol-free medium, namely beer wort with a solids concentration of 10%.
100 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (10 мин, 10000 об/мин), смешивают с 900 г 11%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе физиологического раствора, до получения однородной массы. Полученную смесь выливают ровным слоем на противень с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,5 см, замораживают при -15°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч, оттаивают при +10°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,9 (по сух. массе); полимер 10; водная фаза - до 100. Гель разрезают на гранулы (0,5×0,5 мм) и используют в процессе брожения. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 36 ч.100 g of yeast biomass obtained after centrifugation (10 min, 10,000 rpm) is mixed with 900 g of an 11% PVA solution prepared on the basis of physiological saline until a homogeneous mass is obtained. The resulting mixture was poured in an even layer on a baking sheet with sides 3 cm high to obtain gel blocks 0.5 cm high, frozen at -15 ° C, kept frozen for 15 hours, thawed at + 10 ° C and, thus, obtain a biocatalyst, having the following composition (in wt.%): yeast biomass 0.9 (by dry weight);
Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для приготовления белого вина. При проведении сбраживания виноградного сока с концентрацией сахара 215 г/л, полученного из винограда сорта "Рислинг", в течение 12 сут с использованием этого биокатализатора в емкости для брожения накапливается 100,2 г/л спирта. При микроскопировании образцов полученного вина концентрация свободных клеток составляет 100 кл/мл.The resulting immobilized biocatalyst is intended for the preparation of white wine. When fermenting grape juice with a sugar concentration of 215 g / l, obtained from Riesling grapes, 100.2 g / l of alcohol is accumulated in the fermentation tank for 12 days using this biocatalyst. When microscoping samples of the resulting wine, the concentration of free cells is 100 cells / ml.
Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 22 месяца.The half-inactivation period of such a biocatalyst when stored in the frozen state is 22 months.
Пример 3. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей Saccharomyces vini 47-К, включенных в криогель ПВС, для получения красных вин.Example 3. Obtaining an immobilized biocatalyst and a biocatalyst based on Saccharomyces vini 47-K yeast cells included in PVA cryogel to produce red wines.
Дрожжи Saccharomyces vini 47-K культивируют, как описано в Примере 2. 40 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (15 мин, 8000 об/мин), смешивают с 960 г 12,5%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 6,4), до получения однородной массы. Полученную смесь заливают в прямоугольную металлическую форму с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,3 см, замораживают при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч, оттаивают при +10°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,35 (по сух. массе); полимер 12; водная фаза - до 100. Гель разрезают на гранулы (0,3×0,5 мм) и используют в процессе брожения. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 34 ч.Saccharomyces vini 47-K yeast was cultured as described in Example 2. 40 g of yeast biomass obtained after centrifugation (15 min, 8000 rpm) was mixed with 960 g of a 12.5% PVA solution prepared on the basis of 50 mm K-phosphate buffer (pH 6.4) until smooth. The resulting mixture is poured into a rectangular metal mold with sides 3 cm high to obtain gel blocks 0.3 cm high, frozen at -20 ° C, kept frozen for 15 hours, thawed at + 10 ° C and, thus, obtain a biocatalyst, having the following composition (in wt.%): yeast biomass 0.35 (by dry weight); polymer 12; the aqueous phase is up to 100. The gel is cut into granules (0.3 × 0.5 mm) and used in the fermentation process. The total time for obtaining the immobilized biocatalyst is 34 hours
Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для приготовления красного вина. При проведении сбраживания виноградного сока с концентрацией сахара 270 г/л, полученного из винограда сорта "Каберне Савиньон и Саперави", в течение 18 сут с использованием этого биокатализатора в емкости для брожения накапливается 135 г/л спирта. При микроскопировании образцов полученного вина концентрация свободных клеток составляет 1×102 кл/мл.The resulting immobilized biocatalyst is intended for the preparation of red wine. When fermenting grape juice with a sugar concentration of 270 g / l obtained from Cabernet Sauvignon and Saperavi grapes, 135 g / l of alcohol is accumulated in the fermentation tank for 18 days using this biocatalyst. When microscoping samples of the resulting wine, the concentration of free cells is 1 × 10 2 cells / ml.
Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 19 месяцев.The half-inactivation period of such a biocatalyst when stored in the frozen state is 19 months.
Пример 4. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S.cerevisiae phv bayanus, включенных в криогель ПВС, для устранения недобродов с высокой концентрацией спиртаExample 4. Obtaining an immobilized biocatalyst and a biocatalyst based on yeast cells S. cerevisiae phv bayanus included in the PVA cryogel to eliminate malformations with a high alcohol concentration
Дрожжи S.cerevisiae phv bayanus культивируют строго до конца логарифмической фазы роста в течение 16 ч при 28°С на среде, не содержащей этанола, а именно на пивном сусле с концентрацией сухих веществ 10%.The yeast S. cerevisiae phv bayanus is cultivated strictly until the end of the logarithmic growth phase for 16 hours at 28 ° C in an ethanol-free medium, namely beer wort with a solids concentration of 10%.
17 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (15 мин, 8000 об/мин), смешивают с 983 г 15%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе 100 мМ Na-фосфатного буфера (рН 6,8), до получения однородной массы. Полученную смесь выливают на противень с высотой бортов 3 см для получения гелевых листов высотой 0,2 см, замораживают при -80°С, выдерживают в замороженном состоянии 10 ч, оттаивают при +8°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,15 (по сух. массе); полимер 14,75; водная фаза - до 100. Полученный биокатализатор в виде гелевого листа сворачивают в трубку и помещают в емкость для брожения. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 35 ч.17 g of yeast biomass obtained after centrifugation (15 min, 8000 rpm) are mixed with 983 g of a 15% PVA solution prepared on the basis of 100 mM Na-phosphate buffer (pH 6.8) until a homogeneous mass is obtained. The resulting mixture was poured onto a baking sheet with a side height of 3 cm to obtain gel sheets with a height of 0.2 cm, frozen at -80 ° C, kept frozen for 10 hours, thawed at + 8 ° C, and thus, a biocatalyst having the following composition (in wt.%): yeast biomass 0.15 (by dry weight); polymer 14.75; the aqueous phase is up to 100. The resulting biocatalyst in the form of a gel sheet is rolled up into a tube and placed in a fermentation tank. The total time for obtaining the immobilized biocatalyst is 35 hours
Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для сбраживания недобродов. При проведении дображивания виноматериала, содержащего 106 г/л спирта, полученного при сбраживании виноградного сока с высоким содержанием сахара свободными клетками, в течение 20 сут с использованием этого биокатализатора в емкости для брожения накапливается дополнительно 5,5 г/л спирта, и его суммарная концентрация составляет 111,5 г/л. При микроскопировании образцов полученного вина концентрация свободных клеток составляет 1×103 кл/мл.The resulting immobilized biocatalyst is intended for fermentation of maladies. When fermenting wine material containing 106 g / l of alcohol obtained by fermenting grape juice with high sugar content by free cells for 20 days using this biocatalyst, an additional 5.5 g / l of alcohol accumulates in the fermentation tank, and its total concentration is 111.5 g / l. When microscoping samples of the resulting wine, the concentration of free cells is 1 × 10 3 cells / ml.
Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 20 месяцев.The half-inactivation period of such a biocatalyst when stored in the frozen state is 20 months.
Пример 5. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S. cerevisiae phv bayanus, включенных в криогель ПВС, для устранения недобродов, полученных после сбраживания на холодуExample 5. Obtaining an immobilized biocatalyst and a biocatalyst based on the yeast cells S. cerevisiae phv bayanus included in the PVA cryogel to eliminate the maladies obtained after fermentation in the cold
Получение иммобилизованного биокатализатора проводят, как описано в Примере 4. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 35 ч.Obtaining an immobilized biocatalyst is carried out as described in Example 4. The total time for obtaining an immobilized biocatalyst is 35 hours
Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для сбраживания недобродов. При проведении дображивания виноматериала, содержащего 82,8 г/л спирта, полученного при сбраживании виноградного сока свободными клетками на холоду, в течение 20 сут с использованием этого биокатализатора в емкости для брожения накапливается дополнительно 22,8 г/л спирта, и его суммарная концентрация составляет 105,6 г/л. При микроскопировании образцов полученного вина концентрация свободных клеток составляет 0,9×103 кл/мл.The resulting immobilized biocatalyst is intended for fermentation of maladies. When fermenting wine material containing 82.8 g / l of alcohol obtained by fermenting grape juice with free cells in the cold for 20 days using this biocatalyst, an additional 22.8 g / l of alcohol accumulates in the fermentation tank, and its total concentration is 105.6 g / l. When microscoping samples of the resulting wine, the concentration of free cells is 0.9 × 10 3 cells / ml.
Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 21 месяц.The half-inactivation period of such a biocatalyst when stored in the frozen state is 21 months.
Пример 6. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S.cerevisiae W96, включенных в криогель ПВС, для получения пива.Example 6. Obtaining an immobilized biocatalyst and a biocatalyst based on the yeast cells of S. cerevisiae W96 included in the PVA cryogel to produce beer.
Дрожжи S.cerevisiae W96 культивируют строго до конца логарифмической фазы роста при 28°С в течение 12 ч на среде, не содержащей этанола, а именно на пивном сусле с концентрацией сухих веществ 11%.The yeast S.cerevisiae W96 is cultivated strictly until the end of the logarithmic growth phase at 28 ° C for 12 hours in an ethanol-free medium, namely, beer wort with a solids concentration of 11%.
100 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (10 мин, 6000 об/мин), смешивают с 900 г 11%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе стерильной водопроводной воды до получения однородной массы. Полученную смесь раскапывают в иммунологические 96-луночные планшеты со сферическим дном по 0,1 мл, замораживают при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 12 ч, оттаивают при +4°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,9 (по сух. массе); полимер 10; водная фаза - до 100. Полученный биокатализатор в виде гелевого листа сворачивают в трубку и помещают в емкость для брожения. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 30 ч.100 g of yeast biomass obtained after centrifugation (10 min, 6000 rpm) are mixed with 900 g of an 11% PVA solution prepared on the basis of sterile tap water until a homogeneous mass is obtained. The resulting mixture was instilled into immunological 96-well plates with a 0.1 ml spherical bottom, frozen at -20 ° C, kept frozen for 12 hours, thawed at + 4 ° C, and thus, a biocatalyst having the following composition was obtained ( in wt.%): yeast biomass 0.9 (by dry weight);
Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для приготовления пива. При проведении сбраживания пивного сусла с концентрацией сухих веществ 12% в газлифт-реакторе в течение 22 ч с использованием этого биокатализатора накапливается 55 г/л спирта. При микроскопировании образцов полученного вина свободные клетки отсутствуют.The resulting immobilized biocatalyst is intended for the preparation of beer. When fermenting beer wort with a solids concentration of 12% in a gas lift reactor for 22 hours using this biocatalyst, 55 g / l of alcohol is accumulated. When microscoping samples of the resulting wine, free cells are absent.
Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 24 месяца.The half-inactivation period of such a biocatalyst when stored in the frozen state is 24 months.
Пример 7. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S. cerevisiae phv bayanus, включенных в криогель ПВС, для биологического кислотопонижения виноградного сусла.Example 7. Obtaining an immobilized biocatalyst and a biocatalyst based on the cells of the yeast S. cerevisiae phv bayanus included in the PVA cryogel for biological acid reduction of grape must.
Биологическим кислотопонижением называют процесс яблочно-молочнокислого брожения, протекающего одновременно со спиртовым. Оно проводится для улучшения органолептических характеристик виноматериалов с высоким содержанием яблочной кислоты, которая конвертируется в молочную кислоту.Biological acid reduction is the process of malate-lactic acid fermentation, which occurs simultaneously with alcohol. It is carried out to improve the organoleptic characteristics of wine materials with a high content of malic acid, which is converted to lactic acid.
Дрожжи S.cerevisiae phv bayanus культивируют строго до конца логарифмической фазы роста при 28°С в течение 16 ч на среде, не содержащей этанола, а именно на солодовом сусле с концентрацией сухих веществ 10%.The yeast S. cerevisiae phv bayanus is cultivated strictly until the end of the logarithmic growth phase at 28 ° С for 16 h in a medium containing no ethanol, namely, malt wort with a solids concentration of 10%.
50 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (10 мин, 6000 об/мин), смешивают с 950 г 11,5%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе стерильной водопроводной воды до получения однородной массы. Полученную смесь раскапывают в иммунологические 96-луночные планшеты со сферическим дном по 0,1 мл, замораживают при -30°С, выдерживают в замороженном состоянии 14 ч, оттаивают при +8°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,45 (по сух. массе); полимер 10,9; водная фаза - до 100. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 36 ч.50 g of yeast biomass obtained after centrifugation (10 min, 6000 rpm) are mixed with 950 g of an 11.5% PVA solution prepared on the basis of sterile tap water until a homogeneous mass is obtained. The resulting mixture was digested into immunological 96-well plates with a spherical bottom of 0.1 ml, frozen at -30 ° C, kept frozen for 14 hours, thawed at + 8 ° C, and thus, a biocatalyst having the following composition was obtained ( in wt.%): yeast biomass of 0.45 (dry weight); polymer 10.9; the aqueous phase is up to 100. The total time for obtaining the immobilized biocatalyst is 36 hours
Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для сбраживания и биологического кислотопонижения виноградного сусла. При проведении сбраживания и кислотопонижения виноградного сусла, приготовленного из винограда сорта "Рислинг", содержащего 8,42 г/л яблочной кислоты, при 20°С в течение 14 сут с использованием этого биокатализатора получается белое сухое вино, содержащее 85,2 г/л спирта, 1,45 г/л молочной кислоты и пониженную концентрацию яблочной кислоты (6,98 г/л). При микроскопировании образцов полученного вина свободные клетки составляют 60 кл/мл.The resulting immobilized biocatalyst is intended for fermentation and biological acid reduction of grape must. Fermentation and acid reduction of grape must made from Riesling grapes containing 8.42 g / l malic acid at 20 ° C for 14 days using this biocatalyst yields a white dry wine containing 85.2 g / l alcohol, 1.45 g / l of lactic acid and a reduced concentration of malic acid (6.98 g / l). When microscoping samples of the resulting wine, free cells are 60 cells / ml.
Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 18 месяцев.The half-inactivation period of such a biocatalyst when stored in the frozen state is 18 months.
Пример 8. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S.cerevisiae phv bayanus, включенных в криогель ПВС, для биологического кислотопонижения сусла.Example 8. Obtaining an immobilized biocatalyst and a biocatalyst based on the yeast cells of S. cerevisiae phv bayanus included in the PVA cryogel for biological acidification of the wort.
Получение иммобилизованного биокатализатора проводят как описано в Примере 7. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 36 ч.Obtaining an immobilized biocatalyst is carried out as described in Example 7. The total time for obtaining an immobilized biocatalyst is 36 hours
Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для сбраживания и биологического кислотопонижения ягодного сусла. При проведении сбраживания и кислотопонижения ягодного (крыжовникового) сусла, содержащего 14,1 г/л яблочной кислоты, при 20°С в течение 7 сут с использованием этого биокатализатора получается ягодное вино, содержащее 45 г/л спирта, 3,5 г/л молочной кислоты и пониженную концентрацию яблочной кислоты (11,8 г/л). При микроскопировании образцов полученного вина свободные клетки составляют 110 кл/мл.The obtained immobilized biocatalyst is intended for fermentation and biological acid reduction of berry wort. When fermentation and acid reduction of berry (gooseberry) wort containing 14.1 g / l of malic acid at 20 ° C for 7 days using this biocatalyst yields berry wine containing 45 g / l of alcohol, 3.5 g / l lactic acid and a reduced concentration of malic acid (11.8 g / l). When microscoping samples of the resulting wine, free cells are 110 cells / ml.
Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 17 месяцев.The half-inactivation period of such a biocatalyst when stored in the frozen state is 17 months.
Пример 9. Свойства биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу.Example 9. The properties of the biocatalyst obtained according to the claimed method.
На фиг.1 представлены микрофотографии поверхности гранул иммобилизованного биокатализатора, полученного согласно способу-прототипу (а) и согласно заявляемому способу (Пример 1), иллюстрирующие различия в структуре гелей, получаемых разными способами. Макропоры носителя, получаемого по заявляемому способу, формирование которого происходит на воздухе, существенно больше размера пор носителя, полученного по способу-прототипу, формирование которого идет в среде гидрофобной жидкости. Эта разница в структуре носителей обеспечивает лучший массообмен для клеток, иммобилизованных по заявляемому способу. Наблюдается существенно меньшее вымывание клеток из носителя, полученного согласно заявляемому способу, несмотря на больший размер пор в нем по сравнению с прототипом. Эти различия обусловлены тем, что в процессе брожения углекислый газ, накапливающийся внутри носителя способа-прототипа из-за недостаточно хороших условий массообмена, разрывает под давлением стенки мелких пор носителя, и клетки выходят из матрицы. В случае заявляемого способа разрыв стенок больших пор матрицы носителя отсутствует.Figure 1 presents micrographs of the surface of the granules of an immobilized biocatalyst obtained according to the prototype method (a) and according to the claimed method (Example 1), illustrating the differences in the structure of gels obtained in different ways. Macropores of the carrier obtained by the present method, the formation of which takes place in air, is significantly larger than the pore size of the carrier obtained by the prototype method, the formation of which is in the environment of a hydrophobic liquid. This difference in the structure of the carriers provides the best mass transfer for cells immobilized by the present method. There is a significantly smaller leaching of cells from the carrier obtained according to the claimed method, despite the larger pore size in it compared to the prototype. These differences are due to the fact that during the fermentation process, carbon dioxide that accumulates inside the carrier of the prototype method due to insufficiently good mass transfer conditions breaks up the walls of the carrier’s small pores under pressure, and the cells exit the matrix. In the case of the proposed method, there is no gap in the walls of the large pores of the carrier matrix.
В Табл.1 и Табл.2 представлены органолептические характеристики соответственно белого и красного вина, приготовленного с использованием свободных клеток и иммобилизованного биокатализатора, полученного по заявляемому способу. Представленные результаты подтверждают высокое качество спиртосодержащих напитков, получаемых с использованием заявляемого иммобилизованного биокатализатора.Table 1 and Table 2 show the organoleptic characteristics of white and red wine, respectively, prepared using free cells and an immobilized biocatalyst obtained by the present method. The presented results confirm the high quality of alcohol-containing drinks obtained using the inventive immobilized biocatalyst.
На фиг.2 представлена динамика накопления давления углекислого газа при многократном использовании иммобилизованного биокатализатора, приготовленного по заявленному способу (Пример 1), в процессе вторичного брожения вина.Figure 2 presents the dynamics of the accumulation of carbon dioxide pressure during repeated use of an immobilized biocatalyst prepared according to the claimed method (Example 1), in the process of secondary fermentation of wine.
На фиг.3 представлена динамика накопления этанола в среде брожения при многократном использовании биокатализатора, приготовленного по заявленному способу (Пример 3), в процессе получения красного вина.Figure 3 presents the dynamics of the accumulation of ethanol in the fermentation medium with repeated use of the biocatalyst prepared according to the claimed method (Example 3), in the process of obtaining red wine.
Представленные данные подтверждают возможность многократного использования заявляемого иммобилизованного биоктализатора для получения спиртосодержащих напитков. Период полуинактивации биокатализатора в процессе его эксплуатации составляет до 150 сут.The data presented confirm the possibility of multiple use of the inventive immobilized bioctalizer to obtain alcohol-containing drinks. The biocatalyst half-inactivation period during its operation is up to 150 days.
Таким образом, заявляемый способ и получаемый согласно этому способу иммобилизованный биокатализатор имеют следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:Thus, the claimed method and obtained according to this method, the immobilized biocatalyst have the following advantages compared to analogues and prototype:
- заявляемый способ позволяет сократить общее время получения иммобилизованного биокатализатора в 3-4 раза;- the inventive method allows to reduce the total time for obtaining an immobilized biocatalyst by 3-4 times;
- заявляемый способ позволяет сократить ряд технологических операций (активацию клеток виноматериалом перед иммобилизацией, отмывку гранул биокатализатора от гидрофобной жидкости физраствором, и обработку клеток виноматериалом с d1-фактором после их иммобилизации), существенно сократив при этом расход виноматериала и устранив необходимость очистки сточных вод от гидрофобной жидкости;- the inventive method allows to reduce a number of technological operations (activation of cells with wine material before immobilization, washing of biocatalyst granules from hydrophobic liquid with saline solution, and processing of cells with wine material with d1 factor after their immobilization), significantly reducing the consumption of wine material and eliminating the need to treat wastewater from hydrophobic liquids;
- заявляемый способ предусматривает формирование биокатализатора на воздухе и позволяет устранить все проблемы, связанные с применением гидрофобной жидкости, имеющиеся в прототипе, существенно снизив таким образом токсичность и пожароопасность процесса получения биокатализатора, а также в отличие от прототипа возможно существенное расширение формы получаемого биокатализатора;- the inventive method provides for the formation of a biocatalyst in air and eliminates all the problems associated with the use of hydrophobic liquids present in the prototype, thereby significantly reducing the toxicity and fire hazard of the process for producing a biocatalyst, and also, unlike the prototype, a significant expansion of the form of the obtained biocatalyst is possible;
- заявляемый способ по сравнению с прототипом позволяет получать биокаталиазатор с увеличенным размером пор, обеспечивающим лучший массообмен и присутствие существенно меньшего количества свободных клеток в готовом продукте или полное их отсутствие;- the claimed method in comparison with the prototype allows you to get a biocatalyst with an increased pore size, providing better mass transfer and the presence of a significantly smaller number of free cells in the finished product or their complete absence;
- заявляемый биокатализатор может быть использован, в отличие от прототипа, для сбраживания более широкого спектра сред и, соответственно, для получения различных спиртосодержащих напитков, в том числе для устранения недобродов и биологического кислотопонижения сусел;- the inventive biocatalyst can be used, unlike the prototype, for the fermentation of a wider range of media and, accordingly, for the production of various alcohol-containing drinks, including the elimination of maladies and biological acidification of the wort;
- заявляемый биокатализатор может быть использован многократно для получения различных спиртосодержащих напитков с большим выходом накапливающегося спирта или давления углекислого газа, чем в прототипе.- the inventive biocatalyst can be used repeatedly to obtain various alcohol-containing drinks with a large yield of accumulating alcohol or carbon dioxide pressure than in the prototype.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006113768/13A RU2322499C2 (en) | 2006-04-24 | 2006-04-24 | Method of preparing immobilized biocatalyst and biocatalyst for production of alcohol-containing drinks |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006113768/13A RU2322499C2 (en) | 2006-04-24 | 2006-04-24 | Method of preparing immobilized biocatalyst and biocatalyst for production of alcohol-containing drinks |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006113768A RU2006113768A (en) | 2007-10-27 |
| RU2322499C2 true RU2322499C2 (en) | 2008-04-20 |
Family
ID=38955582
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006113768/13A RU2322499C2 (en) | 2006-04-24 | 2006-04-24 | Method of preparing immobilized biocatalyst and biocatalyst for production of alcohol-containing drinks |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2322499C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2392321C1 (en) * | 2008-12-15 | 2010-06-20 | Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Российский Государственный Университет Нефти И Газа Им. И.М. Губкина" | Production method of biocatalist for alcohol fermentation |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5070019A (en) * | 1989-03-18 | 1991-12-03 | Huels Aktiengesellschaft | Immobilization of yeast in alginate beads for production of alcoholic beverages |
| US6217916B1 (en) * | 1994-10-06 | 2001-04-17 | Labatt Brewing Company Limited | Immobilized-cell carrageenan bead production and a brewing process utilizing carrageenan bead immobilized yeast cells |
| RU2239658C1 (en) * | 2003-02-19 | 2004-11-10 | Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН | Method for preparing biocatalyst for producing alcohol-containing sparkling drinks |
-
2006
- 2006-04-24 RU RU2006113768/13A patent/RU2322499C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5070019A (en) * | 1989-03-18 | 1991-12-03 | Huels Aktiengesellschaft | Immobilization of yeast in alginate beads for production of alcoholic beverages |
| US6217916B1 (en) * | 1994-10-06 | 2001-04-17 | Labatt Brewing Company Limited | Immobilized-cell carrageenan bead production and a brewing process utilizing carrageenan bead immobilized yeast cells |
| RU2239658C1 (en) * | 2003-02-19 | 2004-11-10 | Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН | Method for preparing biocatalyst for producing alcohol-containing sparkling drinks |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЗУБОВ А.Л., ЛОЗИНСКИЙ В.И. и др. Реологические свойства криогелей поливинилового спирта, содержащих иммобилизованные клетки микроорганизмов. Инженерная энзимология. Материалы VI Всесоюзного симпозиума. Часть I. Вильнюс, 1988, с.73-74. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2392321C1 (en) * | 2008-12-15 | 2010-06-20 | Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Российский Государственный Университет Нефти И Газа Им. И.М. Губкина" | Production method of biocatalist for alcohol fermentation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006113768A (en) | 2007-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100910238B1 (en) | Mixed Continuous / Batch Fermentation Process | |
| Nedović et al. | Aroma formation by immobilized yeast cells in fermentation processes | |
| Genisheva et al. | Immobilized cell systems for batch and continuous winemaking | |
| Kosseva | Immobilization of microbial cells in food fermentation processes | |
| Bekatorou et al. | Cell immobilization technologies for applications in alcoholic beverages | |
| Divies et al. | Wine production by immobilised cell systems | |
| Nedović et al. | Beer production using immobilised cells | |
| RU2322499C2 (en) | Method of preparing immobilized biocatalyst and biocatalyst for production of alcohol-containing drinks | |
| CA2852406A1 (en) | Method involving contact between grain raw material liquid and yeast, grain raw material liquid and sparkling beverage | |
| Tataridis et al. | Production of sparkling wine with immobilized yeast fermentation | |
| CN117247844A (en) | Bacterial strain for high-yield saccharifying enzyme and preparation method and application thereof | |
| RU2239658C1 (en) | Method for preparing biocatalyst for producing alcohol-containing sparkling drinks | |
| Šmogrovičová et al. | Effect of immobilised cell concentration on beer quality in continuous fermentation | |
| Drichoutis et al. | Continuous production of wine in a tower fermentor using entrapped yeast cells in double layer alginate–chitosan beads | |
| Coldea et al. | Fermentative bioprocesses | |
| Hutchinson et al. | Cell immobilization by Gel entrapment in Ca-alginate beads for balsamic-styled vinegar production | |
| Bonin et al. | Influence of long-time continuous fermentation on yeast immobilized on foam glass | |
| AU2010333043B2 (en) | A method for wine filtration | |
| CN1492922A (en) | Fibrous inert carrier for clarification of beer and wine fermentation | |
| FR2601687A1 (en) | Process and apparatus for carrying out enzymatic reactions and application to the preparation of fermented beverages | |
| Martinez et al. | Beer and Wine Production and Bioreactor Technology | |
| Nakanishi | Beer production with immobilized yeast cells | |
| WO1990005189A1 (en) | Method for rapidly fermenting alcoholic beverages | |
| Δριχούτης et al. | Continuous production of wine in a tower fermentor using entrapped yeast cells in double layer alginate–chitosan beads | |
| JP3754850B2 (en) | Immobilization carrier, method for producing fermentation product, and fermentation product |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130425 |